專利名稱：包含肺表面活性物質(zhì)和抗氧化酶的治療組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療早產(chǎn)嬰兒的組合物。特別地，本發(fā)明涉及外源的肺表面活性物質(zhì)聯(lián)合抗氧化酶用于降低早產(chǎn)嬰兒的肺氧化性損傷和發(fā)展為支氣管肺發(fā)育異常風(fēng)險的用途。
背景技術(shù)：
人的肺由大量小的稱為肺泡的空氣囊組成，在其中進(jìn)行血液與肺的空氣空間之間的氣體交換。在健康個體中，這種交換是由包含蛋白質(zhì)的表面活性劑復(fù)合物介導(dǎo)的，所述復(fù)合物防止肺在呼氣結(jié)束時的塌陷。肺表面活性劑復(fù)合物主要由脂質(zhì)構(gòu)成，并包含少量的各種蛋白質(zhì)。這種復(fù)合物的水平不足導(dǎo)致肺的機(jī)能紊亂。這種綜合征被稱為呼吸窘迫綜合征(RDQ，而且它通常影響早產(chǎn)嬰兒。RDS的治療主要是利用外源的肺表面活性物質(zhì)制劑進(jìn)行的替代治療。外源的肺表面活性物質(zhì)目前作為在鹽水溶液中的懸浮液通過氣管內(nèi)滴注給予保持在用氧進(jìn)行機(jī)械換氣的情況下的插管的早產(chǎn)嬰兒。雖然所述治療已經(jīng)大大增加了出生后的生存率，但是經(jīng)歷RDS生存下來的幼兒具有發(fā)展為支氣管肺發(fā)育異常(BPD)的高風(fēng)險，支氣管肺發(fā)育異常(BPD)是一種損害肺發(fā)育并最終導(dǎo)致削弱的呼吸的并發(fā)癥。證據(jù)表明肺組織的氧化損傷在BPD的病理發(fā)生中起重要作用，而且高氧癥中降低的抗氧化酶活性導(dǎo)致對支氣管肺發(fā)育異常增加的敏感性。為了中和反應(yīng)性氧類的作用，已經(jīng)建議為表面活性劑制劑增補(bǔ)抗氧化酶，如過氧化物歧化酶和催化酶，早產(chǎn)嬰兒的肺中經(jīng)常缺乏這些酶。然而，至今沒有提供關(guān)于所述酶在人體中的治療有效，而不改變表面活性物質(zhì)的表面活性或?qū)е缕渌弊饔蜜E象的劑量。例如，已經(jīng)報道通過過氧化物歧化酶清除反應(yīng)性氧類可能損害吞噬細(xì)胞的殺菌活性。因此仍然需要開發(fā)一種安全藥物，其能有效地減少氧化脅迫的標(biāo)記并因此降低遭受RDS的嬰兒中BPD的風(fēng)險。發(fā)明概述第一個方面，本發(fā)明涉及一種聯(lián)合2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶和2000到4000U/kg單位劑量的催化酶的外源肺表面活性物質(zhì)，其用于預(yù)防支氣管肺發(fā)育異常(BPD)。優(yōu)選地，外源的肺表面活性物質(zhì)是經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)。優(yōu)選的經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)是豬肺磷脂(poractant alfa)，更優(yōu)選以100到200mg/kg的單位劑
量施用。第二個方面，本發(fā)明涉及一種組合-外源的肺表面活性物質(zhì)；-2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶；2000到4000U/kg單位劑量的催化酶，用于同時，順序或單獨的施用以預(yù)防支氣管肺發(fā)育異常(BPD)，優(yōu)選用于同時施用。第三個方面，本發(fā)明涉及一種藥物，其含有外源的肺表面活性物質(zhì)，與2000到 lOOOOU/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶和2000到4000U/kg單位劑量的催化酶的固定組合。所述藥物有利地為適于吸入或氣管內(nèi)施用的形式。第四個方面，本發(fā)明涉及一種試劑盒，其含有a)第一單位劑型的外源的肺表面活性物質(zhì)和藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；b)第二單位劑型的2000到10000U/kg單位劑量的Cuai過氧化物歧化酶，和任選地藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；C)第三單位劑型的 2000到4000U/kg單位劑量的催化酶，和任選的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；d)用于容納所述第一，第二和第三劑型的容器。根據(jù)一個特定的方面，過氧化物歧化酶和催化酶可以存在于單個劑型中，同時任選地和一種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。第五個方面，本發(fā)明涉及外源的肺表面活性物質(zhì)聯(lián)合2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶和2000到4000U/kg單位劑量的催化酶用于制備預(yù)防支氣管肺發(fā)育異常(BPD)的藥物的應(yīng)用。第六個方面，本發(fā)明涉及一種通過給需要的患者施用外源的肺表面活性物質(zhì)聯(lián)合 2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶和2000到4000U/kg單位劑量的催化酶來預(yù)防支氣管肺發(fā)育異常的方法。定義術(shù)語“抗氧化酶”指催化過氧化物歧化成為氧和過氧化氫的酶，該過氧化物是細(xì)胞
中主要的反應(yīng)性氧類之一?！癈U&1過氧化物歧化酶”指具有與無論是人類，牛或其他哺乳動物來源的，天然存在的Cuai過氧化物歧化酶的氨基酸序列相同的，或基本上相同的氨基酸序列，并具有這種天然存在的Cuai過氧化物歧化酶的生物學(xué)活性的蛋白?！按呋浮敝妇哂信c無論是人類，牛或其他哺乳動物來源的，天然存在的催化酶的氨基酸序列相同的，或基本上相同的氨基酸序列，并具有這種天然存在的催化酶的生物學(xué)活性的蛋白?！皢挝粍┝俊敝竼蝹€劑量中施用給患者的表面活性物質(zhì)或酶的量。對于酶，劑量表示為U/kg體重。IU定義為每分鐘催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)變的酶的量。由于早產(chǎn)嬰兒的體重為大約500克到1500克，可據(jù)此計算單位劑量。例如，2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶相當(dāng)于大約1000至Ij 15000U，而2000到4000U/kg劑量單位的催化酶相當(dāng)于大約1000到6000U。術(shù)語“支氣管肺發(fā)育異常(BPD) ”指慢性肺紊亂，亦稱慢性肺疾病(CLD)，其是未解決的或異常修復(fù)的肺損傷的結(jié)果。BPD 一般發(fā)生在極低出生體重(VLBW)的嬰兒中，其持續(xù)肺損傷，所述肺損傷是由于早期機(jī)械換氣而致的肺氧中毒和氣壓損傷的結(jié)果。術(shù)語“外源的肺表面活性物質(zhì)”指模擬可用于預(yù)防和/或治療與表面活性物質(zhì)缺乏或機(jī)能障礙相關(guān)的疾病的內(nèi)源性肺表面活性物質(zhì)的組合物。根據(jù)Wilson D (Expert Opin Pharmacother 2001，2 (9)，1479-1493)，外源的肺表面活性物質(zhì)可以分成4種不同的類型i) “天然”表面活性物質(zhì)，其是從肺或羊水回收的完整物，而不是提取物，并且具有天然，內(nèi)源表面活性物質(zhì)的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。由于它們不能被滅菌，因為加熱使親水性蛋白質(zhì)SP-A和SP-D變性，它們攜帶可能的感染風(fēng)險。這些表面活性物質(zhì)是不能商業(yè)獲得的；ii) “經(jīng)修飾的天然”表面活性物質(zhì)，其是切碎的哺乳動物肺或肺沖洗液的脂質(zhì)提取物。由于生產(chǎn)過程中使用的脂質(zhì)提取工藝，親水性蛋白質(zhì)SP-A和SP-D丟失。取決于提取方法，這些制劑具有可變含量的SP-B和SP-C，可包含非表面活性物質(zhì)脂質(zhì)，蛋白質(zhì)或其他的組分。一些市售的經(jīng)修飾的天然表面活性物質(zhì)，如Survanta(vide ultra)包含合成組分如三棕櫚酸甘油酯，二棕櫚酰磷脂酰膽堿和棕櫚酸。iii) “人工”表面活性物質(zhì)，其只是合成的化合物的混合物，主要是磷脂及其他脂質(zhì)，其被制備成模擬脂質(zhì)組成和天然表面活性物質(zhì)的行為。它們?nèi)狈Ρ砻婊钚晕镔|(zhì)載脂蛋白；iv) “重組的”表面活性物質(zhì)，其是其中添加有從動物分離的表面活性劑蛋白質(zhì)/ 肽，或通過如WO 95/3四92中描述的那些重組技術(shù)生產(chǎn)的蛋白質(zhì)/肽，或如WO 89/06657,WO 92/22315和WO 00/47623中描述的合成的表面活性劑蛋白類似物的人工表面活性物質(zhì)。術(shù)語“豬肺磷脂”指從豬肺提取的經(jīng)修飾的天然表面活性物質(zhì)，其基本上由極性脂質(zhì)組成，主要是磷脂和蛋白質(zhì)，sp-B和SP-C。豬肺磷脂可獲自商標(biāo)CUR0SURF 。術(shù)語“固定組合”指其中活性物質(zhì)處于固定的定量比例的組合?！八帉W(xué)上可接受的”指當(dāng)施用給嬰兒時，不產(chǎn)生過敏反應(yīng)或類似的不良反應(yīng)的介質(zhì)?！氨砻婊钚詣┗钚浴?，用于肺表面活性物質(zhì)制劑時，定義為降低表面張力的能力。通常利用適合的裝置如Wilhelmy Balance，脈沖氣泡表面張力計，捕獲氣泡表面張力計和毛細(xì)管表面張力計，通過測定它降低表面張力的能力來測定外源表面活性劑制品的體外功效。根據(jù)已知的方法，通過測定早產(chǎn)動物模型中的肺力學(xué)測定外源表面活性劑制品的體內(nèi)功效。術(shù)語“嚴(yán)重的RDS”指一種與孕齡和/或出生體重逆相關(guān)的嬰兒呼吸窘迫綜合征， 其根據(jù)已知的方法進(jìn)行臨床和/或放射學(xué)診斷。術(shù)語“協(xié)同的”指兩個化合物的活性高于預(yù)期的通過將給定分析中它們各自單獨活性的加和作用。附圖簡述

圖1-添加IOOmM H2O2 (對照)和1或^ig SOD以后，4個研究的經(jīng)修飾的天然肺
表面活性物質(zhì)中的H2O21濃度。平均值和SDs0對比對照*p < 0. 05 ；對比對照#p < 0. 005 ；對比對照§ ρ0· 0001。1數(shù)據(jù)是時間為0時與實驗結(jié)束時H2A濃度之間的差異。圖2-添加IOOmM H2O2 (對照)和3000或30000U CAT以后，4個研究的經(jīng)修飾的
天然肺表面活性物質(zhì)中的H2A濃度、
平均值和SDs。對比基線*p < 0. 05 ；對比基線#p < 0. 005 ；對比基線§ ρ < 0.0001。1數(shù)據(jù)是時間為0時與實驗結(jié)束時H2A濃度之間的差異。圖3-添加IOOmM H2O2 (對照)和Img SOD以及3000U CAT以后，4個研究的經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)中的H2A濃度、平均值和SDs。對基線*p < 0. 0001。1數(shù)據(jù)是時間為0時與實驗結(jié)束時H2A濃度之間的差異。發(fā)明詳述本發(fā)明基于出乎意料的發(fā)現(xiàn)，CuSi過氧化物歧化酶和催化酶，以某種劑量，協(xié)同作用于對外源肺表面活性物質(zhì)的反應(yīng)性氧類的清除活性。因此，本發(fā)明涉及一種聯(lián)合2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶和2000到4000U/kg單位劑量的催化酶的外源肺表面活性物質(zhì)，用于預(yù)防支氣管肺發(fā)育異常(BPD)。與現(xiàn)有技術(shù)相反，以要求的單位劑量，利用所述抗氧化酶沒有滅活經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)。而且，利用酶的組合可以增強(qiáng)所有表面活性物質(zhì)的清除活性，同時，如實施例1中所示，添加單個酶的作用似乎依賴于它們的組成。任何外源的肺表面活性物質(zhì)都適用于本發(fā)明，有利地，外源肺表面活性物質(zhì)選自經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)，人工表面活性物質(zhì)和重組的表面活性物質(zhì)。更有利地，可使用目前用于治療呼吸窘迫系統(tǒng)和其他肺疾病的經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)。這些表面活性物質(zhì)包括，但不限于，牛脂質(zhì)表面活性物質(zhì)BLES (BLES Biochemicals, Inc. London, Ont)，calfac ant (卡爾法坦)(InfaSUrf , 0ΝΥ, Inc. Amherst, NY, USA)，bovactant (勃法 克坦)(Al Veof ECt , BoehringerIngelheim Pharma, Ingelheim, Germany), Surfactant TA( Surfacten , Tokyo Tanabe，Japan)，豬月市憐月旨(ClirOSUrf ， Chiesi Fafmaceutici SpA, Parma, Italy), beractant ( JJliij^fi ) ( Survanta , Abbott Laboratories, Inc. , Abbott Park, IL).優(yōu)選地，經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)是豬肺磷脂。有利地，表面活性物質(zhì)單位劑量范圍為大約20mg/kg到大約300mg/kg，優(yōu)選80到 200mg/kg。當(dāng)然，應(yīng)當(dāng)理解，表面活性物質(zhì)的精確劑量將取決于下列因素如給藥途徑，患者的年齡和狀況，待治療的疾病的嚴(yán)重程度和熟練醫(yī)生已知的其他因素。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，豬肺磷脂以100到200mg/kg的單位劑量施用。抗氧化酶CuSi過氧化物歧化酶和催化酶可以是不同來源的，且可以是市售的，例如獲自 Sigma Chemical Co.，St Luis, M0, USA。 另外，可以根據(jù)已知方法通過重組技術(shù)制備這些抗氧化酶。有利地，使用2000 到 10000U/kg，優(yōu)選 2500 到 8000U/kg，更優(yōu)選 2500 到 6000U/kg 劑量的人Cuai過氧化物歧化酶。優(yōu)選使用來自紅細(xì)胞或肝臟的人CuSi過氧化物歧化酶，或者人重組CuSi過氧化物歧化酶。
有利地，使用人催化酶，以2000到4000U/kg，優(yōu)選2500到3500U/kg，更優(yōu)選 3000U/kg的劑量施用。優(yōu)選使用來自紅細(xì)胞或肝臟的人催化酶，或者人重組催化酶?？紤]到酶的分析，熟練技術(shù)人員可以確定以U表示的比活性與mg蛋白(酶)之間的對應(yīng)。外源的肺表面活性物質(zhì)與CuSi過氧化物歧化酶和催化酶以要求的劑量的組合可以順序，分開或同時施用。有利地，當(dāng)同時施用3種組分時，它們以固定的組合施用。因此，本發(fā)明還涉及一種包含所述3種活性組分的藥物，其作為固定的組合，以藥物組合物的形式，例如以溶液、分散體、懸浮液或干粉的形式。優(yōu)選地，所述組合物包含懸浮于合適的生理學(xué)容許的溶劑中的要求的組合。更優(yōu)選地，制劑包含水溶液，優(yōu)選無菌的水溶液，其也可包含pH緩沖劑，及其他藥學(xué)上可接受的賦形劑如吐溫20，吐溫85或斯潘20作為濕潤劑，和氯化鈉作為等滲劑。制劑可以存在于單位劑量容器或多劑量容器中，例如密封的安瓿瓶和小瓶，或儲存于冷凍或冷凍干燥的(凍干)條件中，只需要在使用之前立即添加無菌液體即可。優(yōu)選地，制劑以置于單次使用的小瓶中的溶解于緩沖生理鹽水(0.9% w/v氯化鈉)水溶液的無菌懸浮液提供。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，制劑包括濃度為40到80mg/ml，優(yōu)選80mg/ml 的豬肺磷脂。所要求的組合物可以已知的方式施用，例如通過氣管內(nèi)滴注，噴霧給藥，或通過噴射超聲波霧化，或一般市售的網(wǎng)孔式振動霧化器給藥。優(yōu)選地，所要求的組合通過氣管內(nèi)施用。實際上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)以這些劑量通過該途徑施用時，CuZn過氧化物歧化酶和催化酶沒有下調(diào)內(nèi)源抗氧化酶的mRNA轉(zhuǎn)錄。當(dāng)該組合物通過氣管內(nèi)滴注施用時，取決于呼吸窘迫綜合征的嚴(yán)重程度，不同的方法可能都是合適的。例如，可以通過氣管內(nèi)滴注把所述的制劑施用給處于連續(xù)或間歇性正壓換氣下的早產(chǎn)嬰兒。做為選擇，該組合的施用可以聯(lián)合非侵入的肺呼吸性治療，其包括給予正壓通氣。 術(shù)語“無創(chuàng)肺呼吸治療”指沒有使用機(jī)械通氣，而且根據(jù)這些方法，和通過使用熟練技術(shù)人員已知的設(shè)備，可包括持續(xù)正壓通氣(CPAP)，雙相氣道正壓通氣(BiPAP)，同步間歇指令通氣(SIMV)等等的呼吸治療。在一個特定的實施方案中，可以如WO 2008/148469中所述的進(jìn)行給藥，例如，通過使用置于氣管和由特別設(shè)計的鼻設(shè)備如口罩、叉或管支持呼吸的患者中的薄導(dǎo)管，根據(jù)稱為鼻持續(xù)正壓通氣的方法給藥。根據(jù)熟練技術(shù)人員已知的方法，其他傳遞方法包括灌洗，肺沖洗等等。其中懸浮有組合的活性組分的水溶液的體積取決于所需的濃度。有利地，制劑的體積應(yīng)當(dāng)不超過5. 0ml，優(yōu)選4. 5到2. 0ml，更優(yōu)選3. 5到2. 5ml。做為選擇，當(dāng)外源的肺表面活性物質(zhì)與兩種抗氧化酶分開施用時，可以獨立配制每種獨立的活性組分。在這種情況下，單獨的活性組分不必?zé)o條件地同時服用。
在分開施用的情況下，每種單獨的活性組分的制劑可以同時包裝于合適的容器中以形成試劑盒。因此，本發(fā)明還涉及一種試劑盒，其包括a)處于第一單位劑型中的外源肺表面活性物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；b)處于第二單位劑型中的2000到10000U/kg 單位劑量的Cuai過氧化物歧化酶，和任選地藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；C)處于第三單位劑型中的2000到4000U/kg單位劑量的催化酶，和任選地藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑； d)用于容納所述第一，第二和第三劑型的容器。根據(jù)一個特定的方面，過氧化物歧化酶和催化酶可以獨特的劑型提供，以及任選藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。優(yōu)選地，第一單位劑型是裝有2. 5ml的80mg/ml豬肺磷脂無菌制劑的單次使用小瓶，該無菌制劑懸浮于緩沖生理鹽水(0. 9% w/v氯化鈉)水溶液中。根據(jù)熟練醫(yī)生確定的狀況，本發(fā)明的組合物可以施用給出生后的嬰兒，本發(fā)明的組合物適于預(yù)防，延緩，減輕，阻止或抑制支氣管肺發(fā)育異常的發(fā)展。本發(fā)明組合物的適合劑量學(xué)((劑量，給藥頻率)將取決于患者的年齡和疾病的嚴(yán)重程度，而且參加的臨床醫(yī)生可以很容易地確定。劑量給藥的頻率可以改變，但是一般為每2-3天一次。在其他的實施方案中，患者的劑量給藥更頻繁，例如每6-8小時，每天兩次，或每天一次，或者更少的頻率，例如，每周兩次或甚至每周一次。在其他的實施方案中，在治療方案的初期患者的劑量給藥更頻繁，而在治療方案的后期降低頻率，例如，每隔一天一次，持續(xù)一周，接著每周兩次直到治療周期結(jié)束。取決于劑型，例如，相較于液體懸浮液，氣霧劑或干粉，患者可以連續(xù)劑量給藥持續(xù)治療周期的一段時間或整個治療周期。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合適于預(yù)防患有重型呼吸窘迫綜合征(RDQ的早產(chǎn)嬰兒的支氣管肺發(fā)育異常的發(fā)展。但是，它還可用于預(yù)防和/或治療與內(nèi)源表面活性物質(zhì)缺乏或機(jī)能障礙相關(guān)的其他疾病，例如成人的呼吸窘迫綜合征(ARDS)，急性肺損傷(ALI)和胎糞吸入綜合征(MAS)。下面的實施例更詳細(xì)的說明了本發(fā)明。實施例1-體外評估添加CuSi過氧化物歧化酶，催化酶或兩者以后經(jīng)修飾的天然表面活性物質(zhì)的清除活性這種“體外”研究的目標(biāo)是確定添加不同含量的人CuSi過氧化物歧化酶，人催化酶或兩者以后，經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)的對H2A的清除活性改變。使用4種經(jīng)修飾的天然的市售肺表面活性物質(zhì)- Infasurf (卡爾法坦；ONY，Inc. Amherst, NY,USA)是一種含有:35mg/ml 磷脂的小牛肺表面活性物質(zhì)提取物；- Curosurf (豬肺磷脂；Chiesi SpA.，Parma，Italy)是一種含有 80mg/ml 磷脂的從完整切碎的豬肺組織提取的脂質(zhì)。- Survanta (貝拉康坦；Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA)從切碎的牛肺提取物，同時添加二棕櫚酰磷脂酰膽堿，三?；视秃妥貦八嶂苽?。它包含45mg/ ml的磷脂?！?Alveofact (勃法克坦；Boehringer Ingelheim Pharma, Ingelheim,Germany)由來自牛肺沖洗液的脂質(zhì)提取物生產(chǎn)，并含有45mg/ml磷脂。人紅細(xì)胞Cu/ai過氧化物歧化酶(下文為SOD)和人紅細(xì)胞過氧化氫酶(下文為 CAT)購自 Sigma Chemical Co.，St. Louis，M0，USA。SOD 的劑量以 mg 表示。應(yīng)用的 SOD 具有每mg蛋白(酶)2500-6000U的比活性。測定選擇的天然表面活性物質(zhì)中的SOD和CAT活性。根據(jù)制造商的指導(dǎo)，使用過氧化物歧化酶分析試劑盒 (Cayman Chemical，AnnArbor，MI，USA)，測定SOD活性。該分析使用四唑鹽用于檢測由黃嘌呤氧化酶和次黃嘌呤產(chǎn)生的超氧化物自由基。利用具有450nm 濾光器的平板讀數(shù)器，通過測定96孔板中產(chǎn)生的超氧化物自由基的歧化來評估SOD活性。 1個單位的SOD定義為抑制50%的超氧化物自由基歧化所需的酶量。SOD活性表示為U/毫克磷脂表示。利用催化酶分析試劑盒 (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)確定催化酶活性，其利用CAT的過氧化物功能來確定酶活性。它基于最佳濃度的H2O2與甲醇的酶反應(yīng)。禾0用 4-氛基一3-月井基一5- 基一1，2，4-三唾(Purpald ;Aldrich chemical company, Milwaukee, WI, USA)作為發(fā)色團(tuán)，用分光光度法測定產(chǎn)生的甲醛。從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品的甲醛濃度。1個單位的CAT活性定義為25°C時，導(dǎo)致每分鐘每毫克蛋白形成l.Onmol甲醛的酶量。CAT的活性記錄為nmol/min/mg磷脂。為了測定對H2A的清除活性，相同含量的來自每種天然表面活性物質(zhì)的磷脂 (4. 72mg = IOOymol 磷脂)，用 25，50，100，250μΜ H2O2 于 37°C孵育 2 小時。然后，樣品以 16. OOOx g離心45分鐘。如Casella等所述，通過監(jiān)控ABTS[2，2，_聯(lián)氮-二-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基的形成，來測定H2O2的濃度。(Inorg Biochem 2000，79，31-40)。而且，添加SOD或CAT以后，測定4種經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)的清除活性。 特別地，分別添加Img或ang sod，和3000U或30000U cat以后，評估ο. 60mLInfasurf , ο. 50mL Curosurf ,o. 80mLSurvanta 禾口 ο· 44mL Alveofact 的清除活性。用100 μ M H2O2于37°C孵育這些樣品2小時，然后如上面報道的測定H2A的濃度。圖1報道了添加SOD以后的結(jié)果，圖2報道了添加CAT以后的結(jié)果。為了評估SOD和CAT可能的協(xié)同作用，評估了添加Img SOD和3000單位的CAT以后，0.60mL lnfasurf,0. 50mL Curosurf，0. 80mL Survanta 禾口 0. 44mL Alveofact 的清除活性。圖3報道了結(jié)果。收集的數(shù)據(jù)以平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過這些組內(nèi)的ANOVA測驗，和通過這些組間的學(xué)生氏測驗，分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。ρ < 0. 05認(rèn)為是統(tǒng)計上顯著的。從圖1可以理解，添加SOD到表面活性物質(zhì)中以后正如所料增加了 Curosurf , Survanta 和Alveofact 的清除活性。但是，sod 從 ι 到 ang，清除
活性沒有顯著改變。意外地，Infasurf 的清除活性降低。不受理論限制，我們推測sod的過量表達(dá)可通過不同的機(jī)制導(dǎo)致增加的氧化應(yīng)激的事實能解釋Inf asurf 的這種特別的表現(xiàn)，如 H2O2濃度增加，羥基形成和過氧化物介導(dǎo)的膜過氧化作用的抑制，其通過充當(dāng)基團(tuán)連鎖反應(yīng)中斷者發(fā)揮作用。從圖2可以觀察至ij，添力口 cat 以后，Infasurf , Curosurf ’Alveofact
和Survanta 的清除活性如期待的增加，盡管該后者的增加沒有達(dá)到統(tǒng)計學(xué)的顯著性。
但是，在這種情況下，CAT從3000到30000U，清除活性也沒有顯著地改變。最后，從圖3可以理解，當(dāng)添加SOD和CAT到表面活性物質(zhì)中后，在所有研究的表面活性物質(zhì)中都觀察到對H2A的清除活性很顯著的增加。而且，這種增加似乎高于單一添加SOD和CAT后所觀察到的，這表明它們的作用是協(xié)同的。實施例2- CUR0SURF 聯(lián)合Cuai過氧化物歧化酶和催化酶的體內(nèi)評估進(jìn)行體內(nèi)研究以評估用添加SOD和CAT經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)Curosurf 處理后患有RDS的早產(chǎn)羔羊中的肺組織氧化應(yīng)激。為了研究肺組織的氧化應(yīng)激，測定支氣管的吸出液(BAL)中的總的氫過氧化物 (TH)，提高的氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)，異前列烷(F2-IP)和非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(NTBI)。對患有RDS的12只早產(chǎn)羔羊(胎齡1沈+3天)進(jìn)行了研究。分娩后立即對它們插管。最初的換氣設(shè)定如下:Fi02100%, RR 60/min, PIP 16_18cm H2O, PEEP 4cm H2O0 然后，調(diào)整機(jī)械換氣用于保持PH > 7. 20，pC0235-65托耳，p0255-80托耳，Sa0285-95% )。動物連接儀器，并隨機(jī)接受天然的外源表面活性物質(zhì)(CurOSUrf ，Chiesi，Parma，Italy 200mg/kg)，或相同含量的聯(lián)合S0D(lmg/kg)和CAT (3000U/kg)的表面活性物質(zhì)。研究時間為6小時。改變pH，pC02，p02，Sa02和BE，換氣設(shè)定，肺力學(xué)(潮氣量，動態(tài)柔順性，氣道阻力)，以預(yù)定的間隔記錄平均全身血壓和肺壓力。為了研究肺組織的氧化應(yīng)激，測定支氣管的吸出液(BAL)中的總的氫過氧化物 (TH)，提高的氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)，異前列烷(F2-IP)和非轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵(NTBI)的量。使用Buonocore G等，Pediatr Res2000，47，221-224中報道的分光光度法，利用d-ROMs試劑盒(Diacron srl, Italy)測定 ΤΗ。結(jié)果以常規(guī)單位表示，(Ca rr單位ICarr單位的值等于0. 08mg/dL過氧化氫的濃度)。通過 Witko-Sarsat V 等，Kidney Int 1996，49，1304-1313 中報道的方法，在微量培養(yǎng)板讀數(shù)器上使用分光光度法測定AOPP。AOPP濃度以ymol/L氯胺T等價物表示。利用 Kime等Clin Sci 1996，91，633-638描述的方法，部分改變，通過HPLC測定NTBI水平。如前面Grosso S等Brain Dev 2008，30，391-395中所述的，添加2，6-二叔丁基對甲酚(BHT) 防止該過程中的氧化，然后測定BAL中的F2-IP。在單一基質(zhì)中測定F2-IP。添加乙醇以除去沉淀的蛋白，且添加醋酸鹽緩沖液使pH 達(dá)4. 0，用于15-F2tIsoP測定。使用比色酶免疫測定(Cayman Chemical,Ann Arbor,MI)之前，從利用C^^P-kp-Paks柱(Waters Co, Milford, ΜΑ)從代謝產(chǎn)物純化樣品。抗體是 15-F2t-IsoP(8-Iso PGF2)高特異性的。標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為3. 9到500pg/ml，而且檢測極限為 2pg/mL·用下列技術(shù)獲得來自動物的支氣管吸出樣品通過置于氣管內(nèi)導(dǎo)管中的8F規(guī)格的輸送導(dǎo)管，以便尖端延伸到管的末端外1cm，利用IOmL注射器滴注lmL/kg無菌的0. 9% 鹽水。滴注鹽水，并立即吸回到注射器中。所有的樣品通過離心澄清(IOOOrpm χ 5min)，上清液于70°C立即冷凍，并儲存用于隨后的分析。表面活性物質(zhì)施用之前和之后的1，2，4和6小時，從每個動物獲得支氣管的吸出樣品。用過量戊巴比妥殺死動物。死后，小心打開胸腔，取出氣管和肺，并置于緩沖的 10%福爾馬林浴中M小時。從兩個肺的上和下葉獲得兩個隨機(jī)肺樣本。利用常規(guī)技術(shù)制備組織用于石蠟包埋。5微米厚的切片用蘇木精-曙紅染色，并由兩名病理學(xué)者進(jìn)行盲試顯微鏡檢驗。分析收集的數(shù)據(jù)，并以平均和標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。通過這些組內(nèi)的ANOVA測驗，和通過這些組間的學(xué)生氏測驗，分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異。ρ < 0. 05認(rèn)為是統(tǒng)計上顯著的。結(jié)果證實了以測試的劑量，表面活性物質(zhì)與催化酶的組合獲得了協(xié)同相互作用。
權(quán)利要求
1.一種聯(lián)合2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶和2000到4000U/kg 單位劑量的催化酶的外源肺表面活性物質(zhì)，用于預(yù)防支氣管肺發(fā)育異常(BPD)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的外源肺表面活性物質(zhì)，其中所述的表面活性物質(zhì)是經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的外源肺表面活性物質(zhì)，其中所述的表面活性物質(zhì)選自豬肺磷脂， 卡爾法坦，勃法克坦和貝拉康坦。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的外源肺表面活性物質(zhì)，其中所述的表面活性物質(zhì)是豬肺磷脂。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的外源肺表面活性物質(zhì)，其中豬肺磷脂以100到200mg/kg的單位劑量施用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5中任一項的外源肺表面活性物質(zhì)，其中Cuai過氧化物歧化酶的單位劑量為2500到6000U/kg。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的外源肺表面活性物質(zhì)，其中催化酶的單位劑量為 2500 到 3500U/kg。
8.—種下列物質(zhì)的組合外源的肺表面活性物質(zhì)；2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶；和2000到4000U/kg單位劑量的催化酶用于同時，順序或獨立應(yīng)用，用于預(yù)防支氣管肺發(fā)育異常(BPD)。
9.一種藥物，其包括外源的肺表面活性物質(zhì)；2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶；和2000到4000U/kg單位劑量的催化酶，以固定的組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的藥物，其中所述的表面活性物質(zhì)是經(jīng)修飾的天然表面活性物質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的藥物，其中所述的表面活性物質(zhì)是豬肺磷脂。
12.根據(jù)權(quán)利要求9到11中任一項的藥物，其以藥物組合物的形式用于吸入或氣管內(nèi)施用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的藥物，其為溶于緩沖的生理鹽水(0.9% w/v氯化鈉)水溶液的無菌懸浮液的形式。
14.一種試劑盒，其包括a)處于第一單位劑型中的外源肺表面活性物質(zhì)與藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；b)處于第二單位劑型中的2000到10000U/kg單位劑量的CuSi過氧化物歧化酶，和任選地藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；c)處于第三單位劑型中的2000到 4000U/kg單位劑量的催化酶，和任選地藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑；d)用于容納所述第一，第二和第三劑型的容器。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的試劑盒，其中所述的肺表面活性物質(zhì)是經(jīng)修飾的天然肺表面活性物質(zhì)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的試劑盒，其中所述的表面活性物質(zhì)是豬肺磷脂。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用外源的肺表面活性物質(zhì)聯(lián)合抗氧化酶用于預(yù)防支氣管肺發(fā)育異常(BPD)的應(yīng)用。本發(fā)明的應(yīng)用降低了肺氧化應(yīng)激的標(biāo)記。
文檔編號A61K38/44GK102470150SQ201080034259
公開日2012年5月23日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月8日
發(fā)明者C·達(dá)尼 申請人:奇斯藥制品公司