專利名稱：葡萄糖調(diào)節(jié)多肽及其制備和使用方法
葡萄糖調(diào)節(jié)多肽及其制備和使用方法關(guān)于聯(lián)邦資助研究的聲明本發(fā)明在由美國國立衛(wèi)生研究院授予的SB^基金2R44GM079873-02的政府支持下完成。政府具有本發(fā)明的某些權(quán)利。相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2009年6月8日提交的美國臨時申請No. 61Λ68，193 ；2009年8月 25日提交的美國臨時申請No. 61/236，836 ；和2009年11月10日提交的美國臨時申請 No. 61Λ80，955，以及2010年2月3日提交的美國申請No. 12/699，761和PCT申請No. PCT/ US10/23106的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，這些申請都是待決的，其全部內(nèi)容在此以引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
葡萄糖調(diào)節(jié)肽是人代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)成分。已描述多種肽具有引起血糖水平增加或降低的生物效應(yīng)。甚至當它們具有相反的生物功能時，這些肽相互之間趨于高度同源。尤其當在水溶液中配制時，許多葡萄糖調(diào)節(jié)肽(包括用作治療劑的那些)通常為顯示短貯藏期的不穩(wěn)定分子。另外，許多葡萄糖調(diào)節(jié)肽具有有限的溶解度，或在重組制備過程中變的聚合，因此需要復(fù)雜的增溶和重折疊程序。可將多種化學聚合物與這類肽和蛋白質(zhì)連接以修改它們的性質(zhì)。特別感興趣的是具有靈活構(gòu)象且在水溶液中良好地與水化合的親水性聚合物。經(jīng)常使用的聚合物是聚乙二醇(PEG)。相對于其分子量，這些聚合物常常具有大的流體動力學半徑(Kubetzko，S.等OOOOMol Pharmacol, 68 1439- )，并且可引起增強的藥代動力學性質(zhì)。然而，聚合物與蛋白質(zhì)的化學偶聯(lián)需要復(fù)雜的多步過程；通常，在化學偶聯(lián)步驟之前需要制備和純化蛋白質(zhì)組分并且偶聯(lián)步驟可導致需要分離的不均一產(chǎn)物混合物的形成，導致明顯的產(chǎn)物損失。可選地，這類混合物可用作最終的藥劑產(chǎn)品，但難以標準化。 一些實例是當前銷售的用作混合物的聚乙二醇化干擾素-α產(chǎn)品(Wang，B. L.等.(1998) J Submicrosc Cytol Pathol,30 :503-9 ；Dhalluin, C.等.(2005)Bioconjug Chem,16 504-17)。這類混合物難以可再生地制造并且以其包含具有降低的治療活性或沒有治療活性的同分異構(gòu)體為特征。白蛋白和免疫球蛋白片段(諸如Fc區(qū))已用于偶聯(lián)其它的生物活性蛋白，關(guān)于半衰期或免疫原性增加具有出乎意料的結(jié)果。不幸的是，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域未能在重組表達過程中有效折疊，并易于形成被稱為包涵體的不溶性沉淀。這些包涵體必須被溶解并且功能性蛋白質(zhì)必須被復(fù)性。這是需要另外的制造步驟和通常復(fù)雜的純化程序的耗時、低效且昂貴的過程。因此，存在對可提高葡萄糖調(diào)節(jié)肽的生物性質(zhì)、藥理學性質(zhì)、安全性和/或藥學性質(zhì)的組合物和方法的顯著需要。發(fā)明概述本公開內(nèi)容涉及可用于或治療通過施用葡萄糖調(diào)節(jié)肽而改善、緩解或抑制的任何疾病、疾患或病癥的組合物和方法。具體說，本發(fā)明提供了融合蛋白組合物，所述融合蛋白組合物包含與葡萄糖調(diào)節(jié)肽(GP)連接的具有非重復(fù)序列和/或非結(jié)構(gòu)化構(gòu)象的一個或多個延伸的重組多肽(XTEN)。部分地，本公開內(nèi)容涉及包含所述融合蛋白的藥物組合物及其治療葡萄糖調(diào)節(jié)肽相關(guān)疾病、疾患或病癥的用途。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的融合蛋白，其包含與選自表1的氨基酸序列具有至少約90 %、或約95 %、或約96 %、或約97 %、或約98 %、或約99 %的同一性的葡萄糖調(diào)節(jié)肽，其中所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽與至少約100、或至少約200、或至少約400、或至少約 800、或至少約900、或至少約1000、或至少約2000、多至約3000個氨基酸殘基的延伸的重組多肽(XTEN)連接，其中所述XTEN特征在于(a)所述XTEN包含顯示與類似長度的選自表5 所示序列的氨基酸序列具有至少約90%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約 99%同一性的至少約200個連續(xù)氨基酸；(b)當通過ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法分析時，所述XTEN序列缺少預(yù)測的T細胞表位，其中所述對所述XTEN序列中表位的ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法預(yù)測基于_5、 或-6、或-7、或-8、或-9或更高的評分；(c)所述XTEN具有小于10、或小于9、或小于8、或小于7、或小于6、或小于5、或甚至更小的子序列評分；和(d)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)殘基的總和構(gòu)成所述XTEN的總氨基酸殘基的超過約90%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%。在一個實施方案中， 分離的融合蛋白的葡萄糖調(diào)節(jié)肽是人葡萄糖調(diào)節(jié)肽。在另一實施方案中，所述分離的融合蛋白包含至少第二 XTEN，其中所述融合蛋白具有表5所示的多XTEN構(gòu)型或其變體。在另一實施方案中，GPXTEN融合蛋白的XTEN序列特征在于通過GOR算法確定， 它具有大于90 %的無規(guī)卷曲形成、或約95 %、或約96 %、或約97 %、或約98 %、或約99 %的無規(guī)卷曲形成；并且通過Chou-Fasman算法確定，所述XTEN序列具有小于2%的α螺旋和 2%的β折疊。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了 GPXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于天冬酰胺和谷氨酰胺殘基總和小于所述XTEN總氨基酸序列的10%，甲硫氨酸和色氨酸殘基總和是所述XTEN總氨基酸序列的小于2 %，所述XTEN序列具有小于5 %的帶正電荷的氨基酸殘基，通過GOR算法確定所述XTEN序列具有大于90 %的無規(guī)卷曲形成、或約95 %、或約 96 %、或約97 %、或約98 %、或約99 %的無規(guī)卷曲形成；并且通過Chou-Fasman算法確定所述XTEN序列具有小于2%的α螺旋和2%的β折疊。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了 GPXTEN融合蛋白，其中所述XTEN特征在于 XTEN序列的至少約80 %、或至少約90 %、或至少約91%、或至少約92 %、或至少約93 %、或至少約94%、或至少約95 %、或至少約96 %、或至少約97 %、或至少約98 %、或至少約99 % 由非重疊序列基序組成，其中每個序列基序具有約9至約14個氨基酸殘基，并且其中任何兩個連續(xù)氨基酸殘基的序列在每個序列基序中出現(xiàn)不超過兩次，所述序列基序由選自甘氨酸(G)、丙氨酸㈧、絲氨酸⑶、蘇氨酸⑴、谷氨酸(E)和脯氨酸⑵的4至6個類型的氨基酸組成。在一些實施方案中，沒有一個類型的氨基酸構(gòu)成GPXTEN的XTEN序列的超過30 %。 在其它實施方案中，XTEN具有其中沒有三個連續(xù)氨基酸是相同的序列，除非所述氨基酸是絲氨酸，在這種情況下，不超過三個連續(xù)氨基酸是絲氨酸殘基。在其它實施方案中，XTEN 序列的至少約80 %、或約90 %、或約95 %、或約96 %、或約97 %、或約98 %、或約99 %、或 100%由非重疊序列基序組成，其中每個序列基序具有12個氨基酸殘基。在一個實施方案中，XTEN序列由非重疊序列基序組成，其中所述序列基序來自表2的一個或多個序列。在一些實施方案中，GPXTEN融合蛋白與未連接XTEN的GP相比表現(xiàn)出增強的藥代
6動力學性質(zhì)，其中增強的性質(zhì)包括但不限于更長的終末半衰期、更大的曲線下面積、血藥濃度在治療窗內(nèi)維持時間的增力卩、連續(xù)劑量之間時間的增加和隨時間的摩爾劑量的降低。在一些實施方案中，施用給受試者的GPXTEN融合蛋白的終末半衰期增加至以類似劑量施用給受試者的未連接XTEN的GP的終末半衰期的至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、 或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約8倍、或至少約10倍、或至少約20倍、或至少約40 倍、或至少約60倍、或至少約100倍。在其它實施方案中，增強的藥代動力學性質(zhì)由以下事實反映GPXTEN融合蛋白在給定時段在治療窗內(nèi)維持的血藥濃度是以類似劑量施用給受試者的未連接XTEN的GP的至少約2倍、或至少約3倍、或至少約4倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約8倍、或至少約10倍、或至少約20倍、或至少約40倍、或至少約60 倍、或至少約100倍或甚至更高。與未連接XTEN的相應(yīng)GP相比，半衰期和治療窗內(nèi)維持時間的增加允許較低頻率的給藥和施用給受試者的融合蛋白量(以摩爾當量表示)的減少。 在一個實施方案中，治療有效劑量方案導致融合蛋白的血藥水平的至少兩個連續(xù)Cmax峰和 /或Cmin谷之間的時間增加至使用類似劑量方案施用給受試者的未與融合蛋白連接的相應(yīng) GP的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍、或至少6倍、或至少8倍、或至少10 倍、或至少約20倍、或至少約40倍、或至少約60倍、或至少約100倍。在一些實施方案中，與連接了生物活性蛋白的XTEN相比，XTEN與生物活性蛋白連接時增強了生物活性蛋白的熱穩(wěn)定性，其中熱穩(wěn)定性通過在暴露于約37°C的溫度下至少約 7天之后測量生物活性的保留來確定。在前述一個實施方案中，與未連接XTEN的GP相比， 包含XTEN的GP的生物活性保留時間增加至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約 80%、至少約90%、至少約100%、或約150%、至少約200%、至少約300%或約500%。在一些實施方案中，具有至少第一XTEN的分離的融合蛋白包含GP，其中GP是人葡萄糖調(diào)節(jié)肽。在一些實施方案中，分離的融合蛋白還包含第二 XTEN，其可以與第一 XTEN相同或不同，并且其中融合蛋白具有表7所示的多XTEN構(gòu)型。在前述的一個實施方案中，第一和第二 XTEN可以各自是選自表5的序列，或者可以顯示與選自表5的序列至少約80 %、 或至少約90%、或至少約91%、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約 95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、或至少約99%或100%序列同一性。 在另一實施方案中，包含第二 XTEN序列的分離的融合蛋白具有表7所示的多XTEN構(gòu)型。在一個實施方案中，分離的融合蛋白與未連接XTEN的GP相比具有較低的免疫原性，其中免疫原性通過例如在給受試者施用類似劑量之后測量選擇性結(jié)合生物活性蛋白的 IgG抗體的生成來確定。在一些實施方案中，融合蛋白的葡萄糖調(diào)節(jié)肽和XTEN通過間隔區(qū)連接，其中所述間隔區(qū)序列包含約1至約50個氨基酸殘基，任選地包含裂解序列。在一個實施方案中，裂解序列易受蛋白酶裂解。這種蛋白酶的非限制性實例包括FXIa、FXIIa、激肽釋放酶、FVIIa, FIXa、FXa、凝血酶、彈性蛋白酶-2、粒酶 B、MMP-12、MMP-13、MMP-17 或 MMP-20、TEV、腸激酶、 鼻病毒3C蛋白酶和分選酶A(sortase A)。在一些實施方案中，構(gòu)造分離的融合蛋白使之與未與融合蛋白連接的相應(yīng)GP相比具有降低的對相應(yīng)GP的靶受體的結(jié)合親和力。在一個實施方案中，GPXTEN融合蛋白對GP的靶受體表現(xiàn)出如下范圍的結(jié)合親和力缺少XTEN的相應(yīng)GP的結(jié)合親和力的約 0.01%-30%,或約0. 1 %至約20%、或約1 %至約15%、或約2%至約10%。在另一實施方案中，GPXTEN融合蛋白對GP的靶受體的結(jié)合親和力降低至未連接XTEN的GP的最多約1/3、 或最多約1/5、或最多約1/6、或最多約1/7、或最多約1/8、或最多約1/9、或最多約1/10、 或最多約1/12、或最多約1/15、或最多約1/17、或最多約1/20、或最多約1/30、或最多約 1/50、或最多約1/100。在相關(guān)的實施方案中，親和力降低的融合蛋白可以具有降低的受體介導的清除和相應(yīng)的半衰期增加，半衰期是未連接融合蛋白的相應(yīng)GP的至少約3倍、或至少約5倍、或至少約6倍、或至少約7倍、或至少約8倍、或至少約9倍、或至少約10倍、或至少約12倍、或至少約15倍、或至少約17倍、或至少約20倍、或至少約30倍、或至少約50 倍、或至少約100倍。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了分離的GPXTEN融合蛋白，其包含與選自表35、 表36和表37的序列具有至少約80%、或至少約90%、或至少約91 %、或至少約92%、或至少約93%、或至少約94%、或至少約95%、或至少約96%、或至少約97%、或至少約98%、 或至少約99%、或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了 GPXTEN融合蛋白，其中GPXTEN在生理條件下表現(xiàn)出溶解度增加至未連接融合蛋白的GP的溶解度的至少3倍、或至少約4倍、或至少約5 倍、或至少約6倍、或至少約7倍、或至少約8倍、或至少約9倍、或至少約10倍、或至少約 15倍、或至少20倍、或至少40倍、或至少60倍。在一些實施方案中，通過尺寸排阻色譜測定，GPXTEN融合蛋白表現(xiàn)出與實際分子量相比增加的表觀分子量，其中表觀分子量是至少約100kD、或至少約150kD、或至少約 200kD、或至少約300kD、或至少約400kD、或至少約500kD、或至少約600kD、或至少約700kD， 而融合蛋白的每個GP組分的實際分子量小于約25kD。因此，GPXTEN融合蛋白的表觀分子量可以是融合蛋白的實際分子量的約4倍、或約5倍、或約6倍、或約7倍、或約8倍。在一些情況下，前述實施方案的分離的GPXTEN融合蛋白在生理條件下表現(xiàn)出大于約4、或約5、 或約6、或約7、或約8的表觀分子量因子。本發(fā)明涵蓋GPXTEN融合蛋白組合物，其包含但不限于選自表1的GP (或其片段或序列變體)、選自表5的XTEN(或其序列變體)，GP和XTEN具有選自表5的構(gòu)型。一般而言，得到的GPXTEN將保留未連接XTEN的相應(yīng)GP的至少一部分生物活性。在其它情況下， GP組分在其通過加入GPXTEN的間隔區(qū)序列內(nèi)的任選裂解序列的裂解而從XTEN釋放時具有生物活性或活性增加。在GPXTEN組合物的一個實施方案中，本發(fā)明提供了式I的融合蛋白(XTEN) X-GP- (XTEN) y I其中每次出現(xiàn)時獨立地，GP是葡萄糖調(diào)節(jié)肽；χ是0或1且7是0或1，其中 x+y彡1 ；并且XTEN是延伸的重組多肽。在一些實施方案中，XTEN在葡萄糖調(diào)節(jié)肽的N端或C端與葡萄糖調(diào)節(jié)肽融合。在一些實施方案中，分離的融合蛋白包含人葡萄糖調(diào)節(jié)肽和選自AE912、AM923、AE144和的第一 XTEN和第二 XTEN。在GPXTEN組合物的另一個實施方案中，本發(fā)明提供了式II的融合蛋白(XTEN)x-(GP)-(S)y-(XTEN)y II其中每次出現(xiàn)時獨立地，GP是葡萄糖調(diào)節(jié)肽；S是具有1至約50個氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包含裂解序列；X是0或1且y是0或1，其中x+y彡1;并且XTEN是延伸的重組多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白具有式 III (GP) - (S) x- (XTEN) - (S) y- (GP) - (S) z_ (XTEN) z III其中每次出現(xiàn)時獨立地，GP是葡萄糖調(diào)節(jié)肽；S是具有1至約50個氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包含裂解序列；X是0或1 ;y是0或1 ;z是0或1 ；并且XTEN是延伸的重組多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了分離的融合蛋白，其中融合蛋白具有式IV (XTEN) x-⑶y_ (GP)-⑶z_ (XTEN) - (GP) IV其中每次出現(xiàn)時獨立地，GP是葡萄糖調(diào)節(jié)肽；S是具有1至約50個氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包含裂解序列；X是 0或1 ;y是0或1 ;z是0或1 ；并且XTEN是延伸的重組多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了分離的融合葡萄糖調(diào)節(jié)肽，其中融合蛋白具有式V:(GP) x- (S) x- (GP) - (S) y- (XTEN) V其中每次出現(xiàn)時獨立地，GP是葡萄糖調(diào)節(jié)肽；S是具有1至約50個氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包含裂解序列；X是0或1 ;y是0或1 ；并且XTEN是延伸的重組多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了分離的融合蛋白，其中融合蛋白具有式VI (XTEN) - (S) x- (GP) - (S) y- (GP) VI其中每次出現(xiàn)時獨立地，GP是葡萄糖調(diào)節(jié)肽；S是具有1至約50個氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包含裂解序列；X是0或1 ;y是0或1 ；并且XTEN是延伸的重組多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了分離的融合蛋白，其中融合蛋白具有式VII (XTEN) - (S) x- (GP) - (S) y- (GP) - (XTEN) VII其中每次出現(xiàn)時獨立地，GP是葡萄糖調(diào)節(jié)肽；S是具有1至約50個氨基酸殘基的間隔區(qū)序列，其可任選地包含裂解序列；χ是0或1 ;y是0或1 ；并且XTEN是延伸的重組多肽。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了分離的融合蛋白，其中融合蛋白具有式VIII ((S)m-(GP) x-(S)n_(XTEN)y-(S)。)t VIII其中t是大于0的整數(shù)(1、2、3等)；m、n、0、x和y各自獨立為整數(shù)(1、2、3等)， GP是葡萄糖調(diào)節(jié)肽；S是間隔區(qū)，任選地包含裂解位點；并且XTEN是延伸的重組多肽，條件是(l)x+y > 1，(2)當t = 1時，χ > 0且7 > 0，(3)當存在不止一個GP、S或XTEN時，每個GP、XTEN或S是相同的或獨立不同的；并且當1> 1時，每個亞單位中的m、η、ο、χ 或y是相同的或獨立不同的。在一些實施方案中，治療有效劑量的式I-VIII的實施方案的融合蛋白施用給有相應(yīng)需要的受試者可以導致在融合蛋白治療窗內(nèi)維持的時間增加至以類似劑量施用給受試者的未連接XTEN的相應(yīng)GP的至少2倍、或至少3倍、或至少4倍、或至少5倍或更多。在其它情況下，治療有效劑量的式I-VIII的實施方案的融合蛋白施用給有相應(yīng)需要的受試者可以導致與以類似劑量施用的未連接XTEN的GP相比，維持治療有效劑量方案所必需的連續(xù)劑量之間時間增加至少48h、或至少72h、或至少約96h、或至少約120h、或至少約7天、 或至少約14天、或至少約21天。融合蛋白可以被設(shè)計為具有不同構(gòu)型，GP的N端至C端、XTEN和任選的間隔區(qū)序列，包括但不限于 XTEN-GP、GP-XTEN、XTEN-S-GP, GP-S-XTEN、XTEN-GP-XTEN、GP-GP-XTEN、 XTEN-GP-GP、GP-S-GP-XTEN、XTEN-GP-S-GP及其多聚體，或如表7中所示的構(gòu)型。如本文所公開的，構(gòu)型的選擇可以賦予特定的藥代動力學性質(zhì)、理化性質(zhì)或藥理性質(zhì)。在一些實施方案中，分離的融合蛋白特征在于(i)與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，它具有更長的半衰期；(ii)與以另外等同的劑量方案施用給受試者的缺少XTEN 的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的曲線下面積(AUC) ； (iii)與以另外等同的劑量方案施用給受試者的缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的治療效果； (iv)與使用另外等同的摩爾量施用給受試者的缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當所述融合蛋白以較低頻率施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的曲線下面積(AUC) ； (ν)與使用另外等同的摩爾量施用給受試者的缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當所述融合蛋白以較低頻率施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的治療效果；(vi)與以另外等同的劑量期施用給受試者的缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當累積較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的曲線下面積(AUC)；或 (vii)與以另外等同的劑量期施用給受試者的缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當累積較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的治療效果。在一個實施方案中，上文描述的式I-VIII的GPXTEN融合蛋白表現(xiàn)出生物活性是未連接融合蛋白的GP的生物活性的至少約0. 1%、或至少約0. 1%、或至少約1%、或至少約2%、或至少約3%、或至少約4%、或至少約5%、或至少約10%、或至少約20%、或至少約30%、或至少40%、或至少約50%、或至少約60%、或至少約70%、或至少約80%、或至少約90%、或至少約95%。在另一實施方案中，式I-VIII的GPXTEN融合蛋白與未與融合蛋白共價連接的相應(yīng)親本GP結(jié)合相同的受體。本發(fā)明提供了制備融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含與一個或多個延伸的重組多肽(XTEN)融合的葡萄糖調(diào)節(jié)肽，該方法包括(a)提供包含編碼所述融合蛋白的重組多核苷酸分子的宿主細胞；(b)在允許所述融合蛋白表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；和(C) 回收所述融合蛋白。在該方法的一個實施方案中，融合蛋白的葡萄糖調(diào)節(jié)肽與人葡萄糖調(diào)節(jié)肽或選自表1的序列具有至少90%序列同一性。在該方法的另一個實施方案中，所表達的融合蛋白的一個或多個XTEN與選自表5的序列具有至少約90 %、或約91 %、或約92 %、 或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約98%、或約99%至約100%序列同一性。在該方法的另一個實施方案中，為了所述融合蛋白在宿主細胞中增強的表達而對編碼XTEN的多核苷酸進行密碼子優(yōu)化。在該方法的另一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞。在該方法的另一個實施方案中，宿主細胞是大腸桿菌。在該方法的另一個實施方案中，分離的融合蛋白以基本上可溶的形式從宿主細胞的細胞質(zhì)中回收。
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本發(fā)明提供了包含選自以下的多核苷酸序列的分離的核酸(a)編碼前述實施方案任一個的融合蛋白的多核苷酸，或(b) (a)的多核苷酸的互補體。在一個實施方案中， 本發(fā)明提供了分離的核酸，其包含與以下具有至少80%序列同一性、或約85%、或至少約 90%、或約91%、或約92%、或約93%、或約94%、或約95%、或約96%、或約97%、或約 98%、或約99%至約100%序列同一性的多核苷酸序列(a)選自表35、表36和表37的類似長度的多核苷酸序列；或(b) (a)的多核苷酸的互補體。本發(fā)明提供了包含與本段所述的上述實施方案任何一個的核酸的表達載體。在一個實施方案中，前述表達載體還包含與多核苷酸序列可操作連接的重組調(diào)控序列。在另一實施方案中，前述表達載體的多核苷酸序列與編碼分泌信號序列的多核苷酸在框內(nèi)融合，所述分泌信號序列可以是原核信號序列。 在一個實施方案中，所述分泌信號序列選自0mpA、DsbA和WioA信號序列。本發(fā)明提供了可包含之前段落中公開的表達載體的宿主細胞。在一個實施方案中，宿主細胞是原核細胞。在另一實施方案中，宿主細胞是大腸桿菌。在另一實施方案中， 宿主細胞是真核細胞。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含前述實施方案的任何一個的融合蛋白和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了試劑盒，其包括包裝材料和包含前述實施方案的藥物組合物的至少第一容器以及標識所述藥物組合物以及存儲和處理條件的標簽，以及關(guān)于所述藥物組合的重建和/或施用給受試者的一張說明。本發(fā)明提供了治療受試者的葡萄糖調(diào)節(jié)肽相關(guān)病癥的方法，該方法包括對所述受試者施用治療有效量的前述實施方案任一個的融合蛋白。在該方法的一個實施方案中，葡萄糖調(diào)節(jié)肽相關(guān)病癥選自但不限于青少年糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖、急性低血糖、急性高血糖、夜間低血糖、慢性高血糖、胰高血糖素瘤、氣道的分泌疾患、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、再狹窄、神經(jīng)退行性疾病、腎衰竭、充血性心力衰竭、腎病綜合癥、肝硬化、肺水腫、高血壓和其中需要減少食物攝取的疾患、中風、腸道易激綜合癥、心肌梗塞(例如，降低發(fā)病率和/或與其相關(guān)的發(fā)病率)、中風、急性冠狀動脈綜合征(例如，以 Q波的缺乏為特征)心肌梗塞、術(shù)后代謝變化、冬眠心肌或糖尿病心肌病、尿鈉排泄不足、尿鉀濃度過高、與有毒高血容量有關(guān)的病癥或疾患(例如，腎衰竭、充血性心力衰竭、腎病綜合癥、肝硬化、肺水腫和高血壓)、多囊卵巢綜合癥、呼吸窘迫、腎病、左心室收縮功能障礙 (例如，具有異常的左心室射血分數(shù))、腸胃疾患諸如腹瀉、術(shù)后傾倒綜合癥和腸道易激綜合癥(即，經(jīng)由抑制胃竇十二指腸移行性)、危重病多發(fā)性神經(jīng)病(CIPN)、血脂異常、局部缺血后血流再灌注引起的器官組織損傷，和冠心病危險因素(CHDRF)綜合癥，和任何其它使用非修飾的葡萄糖調(diào)節(jié)肽(例如exendin-4、GLP-I或胰高血糖素)的適應(yīng)癥，或任何其它可使用GP的適應(yīng)癥(但是受試者的內(nèi)源性葡萄糖調(diào)節(jié)肽水平未必不足)。在一些實施方案中，組合物可以皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)施用。在一個實施方案中， 組合物以治療有效量施用。在一個實施方案中，所述治療有效量導致與以類似劑量施用給受試者的未連接融合蛋白的融合蛋白相應(yīng)GP相比，在融合蛋白治療窗內(nèi)維持的時間增加。 在治療窗內(nèi)維持的時間增加至未連接融合蛋白的GP的至少3倍，或者可選地是未連接融合蛋白的相應(yīng)GP的至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少 20倍、或至少約30倍、或至少約50倍、或至少約100倍。在治療方法的一些實施方案中， (i)與以另外相同的劑量方案施用的缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，施用較小摩爾量(例如，約1/2、或約1/3、或約1/4、或約1/5、或約1/6、或約1/8、或約1/100或更少)的所述融合蛋白，并且所述融合蛋白達到與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的曲線下面積和/或類似的治療效果；(ii)與使用另外相同的劑量的缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，所述融合蛋白以較低頻率(例如，每2天一次、約每7天一次、約每14天一次、約每21天一次、或約每月一次)施用，并且所述融合蛋白達到與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的曲線下面積和/或類似的治療效果；或(iii)與以另外相同的劑量方案的缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，施用累積較低摩爾量的所述融合蛋白(例如，約5%、或約10%、或約 20 %、或約40 %、或約50 %、或約60 %、或約70 %、或約80 %、或約90 % )，所述融合蛋白達到與缺少XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的曲線下面積和/或類似的治療效果。所述累積更低的摩爾量是針對至少約一周、或約14天、或約21天、或約一個月的時段的測量。在該方法的一些實施方案中，治療效果是選自以下的測量參數(shù)=HbAlc濃度、胰島素濃度、受激的C 肽、空腹血糖(FPG)、血清細胞因子水平、CRP水平、胰島素分泌和得自口服葡萄糖耐受試驗 (OGTT)的胰島素敏感指數(shù)、體重和食物消耗。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了治療疾病、疾患或病癥的方法，包括利用使用治療有效劑量方案施用的多次連續(xù)劑量的藥物組合物給受試者施用上述藥物組合物。在前述的一個實施方案中，所述治療有效劑量方案可以導致所述融合蛋白的血藥水平的至少兩個連續(xù)Cmax峰和/或Cmin谷之間的時間增加至以類似劑量方案施用給受試者的未連接所述融合蛋白的所述融合蛋白的相應(yīng)GP的至少3倍、或可選地至少4倍、或5倍、或6倍、或7倍、 或8倍、或9倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少約30倍、或至少約50倍、或至少約100 倍。在前述另一實施方案中，與使用治療有效方案施用給受試者的未連接融合蛋白的相應(yīng)生物活性蛋白組分相比，使用藥物組合物的融合蛋白的較低頻率給藥或較低總劑量(以摩爾計)施用融合蛋白導致葡萄糖調(diào)節(jié)肽相關(guān)疾病的至少一個測量參數(shù)的改善。本發(fā)明還提供了包含前述實施方案任何一個的融合蛋白的組合物在制備用于治療有相應(yīng)需要的受試者的疾病、疾患或病癥的藥劑中的用途。在前述一個實施方案中，所述疾病、疾患或病癥選自但不限于青少年糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖、急性低血糖、急性高血糖、夜間低血糖、慢性高血糖、胰高血糖素瘤、氣道的分泌疾患、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、再狹窄、神經(jīng)退行性疾病、腎衰竭、充血性心力衰竭、腎病綜合癥、 肝硬化、肺水腫、高血壓和其中需要減少食物攝取的疾患、中風、腸道易激綜合癥、心肌梗塞 (例如，降低發(fā)病率和/或與其相關(guān)的發(fā)病率)、中風、急性冠狀動脈綜合征(例如，以Q波的缺乏為特征)心肌梗塞、術(shù)后代謝變化、冬眠心肌或糖尿病心肌病、尿鈉排泄不足、尿鉀濃度過高、與有毒高血容量有關(guān)的病癥或疾患(例如，腎衰竭、充血性心力衰竭、腎病綜合癥、肝硬化、肺水腫和高血壓)、多囊卵巢綜合癥、呼吸窘迫、腎病、左心室收縮功能障礙(例如，具有異常的左心室射血分數(shù))、腸胃疾患諸如腹瀉、術(shù)后傾倒綜合癥和腸道易激綜合癥 (即，經(jīng)由抑制胃竇十二指腸移行性)、危重病多發(fā)性神經(jīng)病(CIPN)、血脂異常、局部缺血后血流再灌注引起的器官組織損傷，和冠心病危險因素(CHDRF)綜合癥，和任何其它使用非修飾的葡萄糖調(diào)節(jié)肽(例如exendin-4、GLP-I或胰高血糖素)的適應(yīng)癥，或任何其它可使用GP的適應(yīng)癥(但是受試者的內(nèi)源性葡萄糖調(diào)節(jié)肽水平未必不足)。所公開的實施方案的任何一個可以根據(jù)感興趣的應(yīng)用而單獨實施或者組合實施。通過引用并入在本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請在此通過引用的方式并入，其
1程度如同每個單獨的出版物、專利或?qū)＠暾埫鞔_且單獨地被指明而通過引用的方式并入。附圖簡述在所附權(quán)利要求中特別陳述了本發(fā)明的新穎特征。通過參考以下提出說明性實施方案的詳細說明更好地理解本發(fā)明的特征和優(yōu)勢，其中利用了本發(fā)明的原理，并且其中附圖為

圖1示出了全部以N端至C端方向描繪的示例性GPXTEN融合蛋白(圖1A_H)的示意圖。圖IA示出GPXTEN融合蛋白(100)的兩種不同構(gòu)型，每種構(gòu)型包含單個GP和XTEN， 第一種構(gòu)型具有與GP (103)的C端連接的XTEN分子(102)，并且第二種構(gòu)型具有與GP (103) 的N端連接的XTEN分子。圖IB示出GPXTEN融合蛋白(100)的兩種不同構(gòu)型，每種構(gòu)型包括單個GP、間隔區(qū)序列和XTEN，第一種構(gòu)型具有與間隔區(qū)序列(104)的C端連接的XTEN分子(102)和與GP(103)的C端連接的間隔區(qū)序列，并且第二種構(gòu)型具有與間隔區(qū)序列(104) 的N端連接的XTEN分子和與GP (103)的N端連接的間隔區(qū)序列(104)。圖IC示出GPXTEN 融合蛋白(101)的兩種不同構(gòu)型，每種構(gòu)型包含兩個分子的單個GP和一個分子的XTEN，第一種構(gòu)型具有與第一 GP的C端連接的XTEN并且第一 GP與第二 GP的C端連接，且第二種構(gòu)型處于相反方向，其中XTEN與第一 GP的N端連接并且第一 GP與第二 GP的N端連接。 圖ID示出GPXTEN融合蛋白(101)的兩種不同構(gòu)型，每種構(gòu)型包含兩個分子的單個GP、間隔區(qū)序列和一個分子的XTEN，第一種構(gòu)型具有與間隔區(qū)序列的C端連接的XTEN和與第一 GP 的C端連接的間隔區(qū)序列并且第一 GP與第二 GP的C端連接，且第二種構(gòu)型處于相反方向， 其中XTEN與間隔區(qū)序列的N端連接并且間隔區(qū)序列與第一 GP的N端連接并且第一 GP與第二 GP的N端連接。圖IE示出GPXTEN融合蛋白(101)的兩種不同構(gòu)型，每種構(gòu)型包括兩個分子的單個GP、間隔區(qū)序列和一個分子的XTEN，第一種構(gòu)型具有與第一 GP的C端連接的 XTEN和與間隔區(qū)序列的C端連接的第一 GP并且間隔區(qū)序列與第二 GP分子的C端連接，且第二種構(gòu)型處于相反構(gòu)型，NTEN與第一 GP的N端連接，第一 GP與間隔區(qū)序列的N端連接， 而間隔區(qū)序列與第二 GP分子的N端連接。圖IF示出GPXTEN融合蛋白(105)的構(gòu)型，每種構(gòu)型包含一個分子的GP和與該GP的N端和C端連接的兩個分子的XTEN。圖IG示出與兩個XTEN連接的單個GP的構(gòu)型(106)，其中第二 XTEN通過間隔區(qū)序列與GP分開。圖IH是與兩個XTEN連接的兩個GP的構(gòu)型(106)，其中第二 XTEN與第一 GP的C端和第二 GP的N 端連接，第二 GP在GPXTEN的C端。圖2是編碼圖1的相應(yīng)GPXTEN多肽的GPXTEN基因的示例性多核苷酸構(gòu)建體(圖 2A-H)的示意圖；全部以5'至3'的方向描述。在這些說明性實例中，所述基因編碼GPXTEN 融合蛋白，該GPXTEN融合蛋白具有一個GP和XTEN(200)；或一個GP、一個間隔區(qū)序列和一個XTEM200)；兩個GP和一個XTEM201)；或兩個GP、間隔區(qū)序列和一個XTEM201)；—個 GP和兩個XTEM205)；或兩個GP和兩個XTEM206)。在這些描繪中，多核苷酸編碼以下組分XTEN(202)、GP(203)和可以包含裂解序列(204)的間隔區(qū)氨基酸，所有序列在框內(nèi)連接。圖3是兩個示例性單體GPXTEN和該單體融合蛋白結(jié)合細胞表面靶受體的能力以及隨后細胞信號轉(zhuǎn)導的示意圖。圖3A示出由GP(103)和XTEN(102)組成的GPXTEN融合蛋白(100)和由與兩個XTEN(105)連接的GP組成的第二 GPXTEN融合蛋白(105)。圖示出C末端具有GP的GPXTEN (100)和C末端具有XTEN的GPXTEN (105)與細胞表面(107)上GP 的靶受體(108)的相互作用。在該情況下，當GP具有游離C端時表現(xiàn)出與受體的高親和力結(jié)合，而具有C端XTEN的GPXTEN沒有與受體緊密結(jié)合，并且解離，如圖3C所示。圖3D示出以高結(jié)合親和力結(jié)合的GPXTEN(IOO)保持與受體(106)結(jié)合并且已經(jīng)內(nèi)化到細胞中的內(nèi)體(110)，說明結(jié)合的GP的受體介導的清除并且引發(fā)細胞信號轉(zhuǎn)導(109)，描繪為斑點狀的細胞質(zhì)。圖4是XTEN的組裝、產(chǎn)生和評估中代表性步驟的示意流程圖。圖5是編碼融合蛋白的GP-XTEN多核苷酸構(gòu)建體組裝中代表性步驟的示意流程圖。單個寡核苷酸501被退火成序列基序502，例如12氨基酸基序(“12-mer”)，其隨后與含有rn^sl和KpnI限制位點的寡聚體503連接。來自文庫的其它序列基序與該12-mer退火，直到獲得期望長度的XTEN基因504。將XTEN基因克隆到填充載體(stuffer vector) 0 該載體編碼標志(Flag)序列506，隨后是兩側(cè)具有BsaI、BbsI和KpnI位點的終止序列507 禾口 exendin-4(Ex4)基因508，得到編碼XTEN-GP融合蛋白的基因500。圖6是在編碼包含生物活性蛋白(GP)和XTEN的融合蛋白的基因的組裝、其表達和作為融合蛋白回收、及其作為候選GPXTEN產(chǎn)物的評估中代表性步驟的示意流程圖。圖7是使用不同的加工策略設(shè)計Ex4XTEN表達載體的示意圖。圖7A示出編碼與生物活性蛋白Ex4編碼序列的3'端融合的XTEN的示例性表達載體。注意，該載體中不需要額外的前導序列。圖7B描繪了編碼與Ex4編碼序列的5'端融合的XTEN的表達載體， 其具有CBD前導序列和TEV蛋白酶位點。圖7C描繪了圖7B中CBD和TEV加工位點被優(yōu)化的N端前導序列(NTQ所替代的表達載體。圖7D描繪了編碼NTS序列、ΧΤΕΝ、Ex4編碼序列和第二個XTEN編碼序列的表達載體。圖8是包含與exendin-4 (Ex4)編碼序列連接的N端XTEN編碼序列的GPXTEN基因的逐步構(gòu)建，以及與XTEN的C端連接的144或^ (TEN編碼序列隨后連接的示意圖，如實施例18所描述。圖9示出包含GFP和XTEN序列的所示構(gòu)建體的表達分析結(jié)果。使用熒光板讀數(shù)器(激發(fā)395nm，發(fā)射510nm)分析表達培養(yǎng)物以測定GFP報告分子的存在量。結(jié)果以圖表表示為框須圖，指示雖然中值表達水平是“基準” CBD N端輔助結(jié)構(gòu)域(helper domain)表達水平的大約一半，但來自文庫的最佳克隆非常接近基準，表明圍繞這些序列進一步優(yōu)化是有保證的。結(jié)果還顯示，從氨基酸MA起始的文庫比從ME開始的那些具有更好的表達水平(參見實施例14)。圖10示出用于來自LCWM6、LCW547和LCW552的克隆的N端序列中第三和第四密碼子的三個隨機文庫，如實施例15所示。將文庫設(shè)計為第三和第四殘基被修飾而使得允許的XTEN密碼子的所有組合存在于這些位置。為了使每個文庫包含所有這些允許的XTEN密碼子，設(shè)計具有第三和第四殘基密碼子多樣性的編碼12個氨基酸的9對寡核苷酸、使其退火并連接到Ndel/Bsal限制酶消化的填充載體pCW0551 (填充片段-XTEN AM875-GFP)，并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21Gold(DE3)感受態(tài)細胞以獲得三個文庫LCW0569、LCW0570和LCW0571 的菌落。圖11示出如實施例15所述優(yōu)化步驟之后針對前75個克隆的GFP熒光信號的再測試的直方圖，相對于基準CBD AM875構(gòu)建體。結(jié)果指示幾個克隆目前優(yōu)于基準克隆。
圖12是為聯(lián)合N端48個氨基酸的兩個區(qū)域的密碼子優(yōu)化偏好而進行的重組方法的示意圖，如實施例16所述。該方法在XTEN蛋白的N端產(chǎn)生新的48mer，用于評估表達優(yōu)化，所述表達優(yōu)化得到可能是XTEN蛋白表達的解決方案的前導序列，其中XTEN在GP的N 端。圖13示出證實獲自XTEN N端密碼子優(yōu)化實驗的優(yōu)選密碼子表達的SDS-PAGE凝膠，與在構(gòu)建體序列的N端包含CBD前導序列的基準XTEN克隆相比較。圖14示出來自與GFP的N端融合的融合蛋白XTEN AE864的穩(wěn)定性研究的樣本的 SDS-PAGE凝膠(參見實施例24)。使GFP-XTEN在食蟹猴血漿和大鼠腎裂解物中于37°C下孵育達7天。此外，還評估了施用給食蟹猴的GFP-XTEN。在第0、1和7天提取樣本并通過 SDS PAGE分析，隨后使用Western分析檢測并使用抗GFP抗體檢測。圖15示出證實與不同長度的XTEN(即Y^8、Y144、Y72和TO6)融合的胰高血糖素的表達的SDS-PAGE凝膠，與分子量標準比較。圖16示出根據(jù)已知分子量的蛋白質(zhì)標準品測量的胰高血糖素-XTEN構(gòu)建體樣本的尺寸排阻色譜分析的結(jié)果，其中圖形輸出為吸光度對保留體積，如實施例22所述。胰高血糖素-XTEN構(gòu)建體是1)胰高血糖素；2)胰高血糖素Υ-144 ；3)胰高血糖素-TJ2 ； 和4)胰高血糖素-Υ36。結(jié)果指示表觀分子量隨著XTEN部分長度的增加而增加。圖17示出通過皮下和靜脈內(nèi)途徑對食蟹猴施用的GPXTEN Εχ4_ΑΕ864的藥代動力學結(jié)果(實驗詳情參見實施例27)。圖18示出預(yù)測人響應(yīng)于Εχ4-ΧΤΕΝ ΑΕ864的異速增長尺度律(alIometric scaling)結(jié)果，基于四個動物物種(即，小鼠、大鼠、食蟹猴和犬)的測量結(jié)果，如實施例觀所述。圖18A示出測量的終末半衰期對體重，其中在人中預(yù)測的T1/2為139h。圖18B示出測量的藥物清除對體重，其中在人中預(yù)測的清除率值為30ml/h。圖18C示出測量的分布體積對體重，在人中預(yù)測的值為5970ml。圖19示出Gcg-XTEN的生物物理表征和穩(wěn)定性研究的結(jié)果(實驗詳情參見實施例 21)。圖19A是純化蛋白質(zhì)產(chǎn)物(泳道2、的SDS-PAGE分析。在泳道1示出分子量標準，在左側(cè)標出相關(guān)大小的分子量標準。需注意，該分子的真實分子量是16305道爾頓(通過質(zhì)譜分析法證實；未示出)。由于主要氨基酸構(gòu)成的差異，在SDS-PAGE中相對于球蛋白標準品遷移慢是XTEN融合蛋白的特點。圖19B示出胰高血糖素受體(GcgR) Ca2+_流量分析的結(jié)果，比較了 Gcg-XTEN與未修飾胰高血糖素的功效。示出對于每個曲線擬合的計算的EC50。 圖19C示出反相C18HPLC分析的結(jié)果。圖19D示出制備時純化Gcg-XTEN構(gòu)建體的尺寸排阻色譜法HPLC分析的結(jié)果。圖19E示出反相C18HPLC分析的結(jié)果。圖19F示出在_80°C、 2-8°C或25°C存儲6個月后Gcg-XTEN的尺寸排阻色譜法HPLC分析的結(jié)果，三條曲線都基本上重疊。圖20示出用胰高血糖素或Gcg-XTEN給藥的犬中藥效學研究的結(jié)果(實驗詳情參見實施例29)。分別以14或12nmol/kg將胰高血糖素(圖20A)或Gcg-XTEN (圖20B)注射到空腹比格犬中(每組n = 4)，并且與安慰劑注射相比監(jiān)測血糖水平，如圖20C所示。示出相對于注射前基線的注射安慰劑、Gcg-XTEN或胰高血糖素(Gcg)后第一小時的血糖曲線下面積的差異(每組η = 4-8只動物)。指示每組的劑量水平。圖21示出服用胰高血糖素或Gcg-XTEN并用胰島素激發(fā)的犬中的藥效學研究的結(jié)果以測試在犬中Gcg-XTEN是否賦予對胰島素誘導的低血糖的暫時受控抗性(實驗詳情參見實施例30)。在實驗開始前3小時使比格犬進食，并其后之后對其禁食。在時間=0時，使動物接受劑量為0. 6nmol/kg的Gcg-XTEN或安慰劑(空心箭頭)。在6小時(圖21A)(以實心箭頭指示)或初始劑量后12小時(圖21B)(以實心箭頭指示)，使動物(每組η = 4) 接受0. 05U/kg胰島素激發(fā)以誘導低血糖。圖21C表示隨著進食-睡眠-蘇醒周期的對于人施用的假設(shè)時間線，意圖使進食-睡眠-蘇醒周期與劑量施用和該實驗的實驗設(shè)計相符合。
圖22示出服用胰高血糖素或Gcg_XTEN_Y^8(構(gòu)建體1)的藥效學實驗的結(jié)果以測試禁食結(jié)束后在食蟹猴中該化合物抑制血糖增加的能力(實驗詳情參見實施例31)。圖 22A-C示出對三只個體食蟹猴施用安慰劑或Gcg-XTEN288后血糖曲線的重疊繪圖。實心箭頭標記對動物送回食物的時間(t = 6小時)。圖23示出來自使用兩種GPXTEN融合蛋白(即，胰高血糖素于Y288 (Gcg-XTEN)連接和exendin-4與AE864(Ex4-XTEN)連接)的組合的藥效學和代謝研究的體重結(jié)果以評估小鼠中飲食誘導的肥胖模型中該組合的功效。該圖顯示在觀天持續(xù)藥物施用的過程中飲食誘導的肥胖小鼠中體重的變化。所示出的值為每組10只動物的平均值+/-SEM(安慰劑組20只動物)。圖M示出來自小鼠中飲食誘導的肥胖模型中使用單獨和兩種GPXTEN融合蛋白 (即，胰高血糖素與Y288 (Gcg-XTEN)連接和exendin-4與AE864 (Ex4_XTEN)連接)的組合的藥效學和代謝研究的空腹血糖水平的變化(實驗詳情參見實施例沈)。分組如下第 1 組 iTris 媒介物；第 2 組 Ex4-AE576，10mg/kg ；第 3 組 Ex4_AE576，20mg/kg ；第 4 組媒介物，50 % DMSO ；第5組艾塞那肽(Exenat ide),30y g/kg/天；第6組艾塞那肽，30uL/kg/ 天 +Gcg-Y28820 μ g/kg ；第 7 組 Gcg-Y288, 20 μ g/kg ；第 8 組 Gcg_Y288，40 μ g/kg ；第 9 組 Ex4-AE576 10mg/kg+Gcg_Y288 20 μ g/kg ；第 10 組 Gcg_Y288 40 μ g/kg+Ex4_AE576 20mg/ kg。該圖顯示在觀天持續(xù)藥物施用的過程中飲食誘導的肥胖小鼠中空腹血糖水平的變化。 所示出的值為每組10只動物的平均值+/_SEM(安慰劑組20只動物)。圖25示出觀天持續(xù)的Gcg-XTEN和exendin-4單獨或組合的藥物施用后飲食誘導的肥胖小鼠中甘油三酯和膽固醇水平(實驗詳情參見實施例沈)。所示出的值為每組10 只動物的平均值+/-SEM。圖沈示出食蟹猴中藥代動力學研究的結(jié)果，測試了皮下或靜脈內(nèi)施用其中不同 GFP組合物與XTEN連接的XTEN長度的作用，如實施例23所述。所述組合物是GFP-U88、 GFP-L576、GFP-AF576、GFP-Y576和AD836-GFP。將結(jié)果提供為給藥后血漿濃度對時間(h)。圖27示出如實施例34所述進行的Ex4-XTEN AE864的近UV圓二色譜。圖觀示出施用給食蟹猴的胰高血糖素-XTEN融合蛋白隨時間的血藥水平的結(jié)果， 如實施例32所述。所述施用的GPXTEN是胰高血糖素_Υ^8、胰高血糖素-Υ144和胰高血糖素-Υ72。來自胰高血糖素-Υ144給藥的結(jié)果顯示0-6小時內(nèi)血藥水平< 3倍的變化，其中在10-12小時時血藥水平從Cmax降低到IOx閾值以下。圖四示出體外細胞測定GLP-I活性的結(jié)果，比較了來自兩個商業(yè)來源的 exendin-4 (閉合三角形)和與Y288連接的exendin-4 (閉合正方形)，其中未處理的細胞 (閉合菱形)用作陰性對照(實驗詳情參見實施例35)。用虛線表示EC50。
發(fā)明詳述在描述本發(fā)明實施方案之前，要理解，這些實施方案僅作為例子而提供，并且可以采用本文描述的本發(fā)明實施方案的各種替代方案來實施本發(fā)明。本領(lǐng)技術(shù)人員現(xiàn)在將可以想到不背離本發(fā)明的許多改變、變化和替代。除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。盡管與本文描述的那些類似或等同的方法和材料可用于實施或測試本發(fā)明，但下面描述了合適的方法和材料。沖突時，以包括定義在內(nèi)的本專利說明書為準。此外，材料、方法和實例僅是示例說明性的而不旨在限制。本領(lǐng)技術(shù)人員現(xiàn)在會想到不背離本發(fā)明的許多改變、變化和替代。定義除非另外規(guī)定，如本文使用的以下術(shù)語具有歸屬于它們的含義。除非上下文另外清楚地指明，說明書和權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一個”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。例如，術(shù)語“一種細胞”包括多個細胞，包括其混合物。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文可互換使用，是指任何長度的氨基酸的聚合物。該聚合物可以是線性或分支的，其可以包含修飾的氨基酸，并且其間可以插入非氨基酸。這些術(shù)語還包括例如通過二硫鍵形成、糖基化、酯化、乙?；⒘姿峄蛉魏纹渌僮?(例如與標記組分偶聯(lián))而被修飾的氨基酸聚合物。本文使用的術(shù)語“氨基酸”指天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括但不限于甘氨酸和D或L旋光異構(gòu)體，以及氨基酸類似物和肽模擬物。使用標準的單字母或三字母密碼指定氨基酸。術(shù)語“天然L-氨基酸”表示以下氨基酸的L旋光異構(gòu)體形式甘氨酸(G)、脯氨酸 (P)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、組氨酸(H)、賴氨酸(K)、精氨酸(I )、谷氨酰胺(Q)、天冬酰胺(N)、谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)、絲氨酸(S)和蘇氨酸(T)。應(yīng)用于序列并在本文使用的術(shù)語“非天然存在的”指沒有哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的野生型或天然存在的序列的對應(yīng)物、與哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的野生型或天然存在的序列不互補、或與哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的野生型或天然存在的序列不具有高度同源性的多肽或多核苷酸序列。 例如，適當比對時，非天然存在的多肽可以與天然序列共享不超過99^^98^^95%,90%、 80%,70%,60%,50%或甚至更低的氨基酸序列同一性。術(shù)語“親水性”和“疏水性”指物質(zhì)具有的與水的親和力程度。親水性物質(zhì)對水具有強親和力，易于溶解于水、與水混合或被水潤濕，而疏水性物質(zhì)基本缺乏對水的親和力， 易于排斥水并不吸收水并且不易于溶解于水或與水混合或被水潤濕。氨基酸可以根據(jù)其疏水性來表征。已經(jīng)發(fā)展了許多量表。一個實例是由Levitt，M，等，J Mol Biol (1976) 104 59 發(fā)展的量表，其列于 Ηορρ,ΤΡ，等，Proc Natl Acad Sci U S A (1981) 78 :3824?！坝H水性氨基酸”的實例是精氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。特別關(guān)注的親水性氨基酸是天冬氨酸、谷氨酸和絲氨酸和甘氨酸?！笆杷园被帷钡膶嵗巧彼?、酪氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸。“片段”是保留至少一部分治療活性和/或生物活性的天然生物活性蛋白的截短形式?！白凅w”是與天然生物活性蛋白具有序列同源性的蛋白質(zhì)，保留了生物活性蛋白的至少
17一部分治療活性和/或生物活性。例如，變體蛋白可以與參考生物活性蛋白共享至少70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。本文使用的術(shù)語“生物活性蛋白部分”包括例如通過定點誘變、插入而有意修飾或通過突變而意外修飾的蛋白質(zhì)?！八拗骷毎卑梢允腔蛞呀?jīng)是主題載體的受體的個體細胞或細胞培養(yǎng)物。宿主細胞包括單個宿主細胞的后代。由于天然、意外或有意的突變，后代不一定與原始親代細胞完全相同(形態(tài)方面或者總DNA互補體的基因組方面)。宿主細胞包括用本發(fā)明的載體在體內(nèi)轉(zhuǎn)染的細胞。當用于描述本文公開的各種多肽時，“分離的”指已經(jīng)從其天然環(huán)境的組分鑒定和分離和/或回收的多肽。其天然環(huán)境的污染組分是通常會干擾所述多肽的診斷或治療用途的材料，并且可以包括酶、激素和其它蛋白或非蛋白溶質(zhì)。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員明顯的是， 非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段不需要“分離”以使之與其天然存在的對應(yīng)物相區(qū)分。此外，“濃縮的”、“分離的”或“稀釋的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白質(zhì)、抗體或其片段可與其天然存在對應(yīng)物相區(qū)分，因為濃度或每體積的分子數(shù)目一般大于其天然存在的對應(yīng)物。一般而言，通過重組方式制備并在宿主細胞中表達的多肽被認為是“分離的”?！胺蛛x的”多核苷酸或多肽編碼核酸或其它多肽編碼核酸是從所述多肽編碼核酸的天然來源中正常伴隨的至少一種污染核酸分子鑒定和分離的核酸分子。分離的多肽編碼核酸不同于其天然存在的形式或環(huán)境。因此，分離的多肽編碼核酸分子可與天然細胞中存在的特定多肽編碼核酸分子相區(qū)分。然而，分離的多肽編碼核酸分子包括正常表達所述多肽的細胞中含有的多肽編碼核酸分子，此時，例如，核酸分子處于不同于天然細胞核酸分子的染色體內(nèi)或者染色體外位置?！扒逗稀钡鞍缀兄辽僖粋€融合多肽，包含與天然存在不同的序列位置的區(qū)域。所述區(qū)域可以正常存在于不同的蛋白質(zhì)中并且在融合多肽中匯集在一起；或者它們可以正常存在于相同的蛋白質(zhì)中但在融合多肽中處于新的排列。嵌合蛋白可以通過例如化學合成或者通過產(chǎn)生并翻譯其中肽區(qū)域以期望關(guān)系編碼的多核苷酸來產(chǎn)生?！芭悸?lián)的”、“連接的”、“融合的”和“融合”在本文可互換使用。這些術(shù)語指通過包括化學偶聯(lián)或重組方式在內(nèi)的任何方式使兩個或多個化學元素或組分結(jié)合在一起。例如， 如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則所述啟動子或增強子與所述序列是可操作連接的。一般而言，“可操作連接”表示被連接的DNA序列是連續(xù)的，并且在閱讀相內(nèi)或框內(nèi)。 “框內(nèi)融合”指兩個或多個開放閱讀框(ORF)以保持原始ORF正確閱讀框的方式結(jié)合形成連續(xù)更長的0RF。因此，得到的重組融合蛋白是含有對應(yīng)于由原始ORF編碼的多肽的兩個或多個片段的單個蛋白質(zhì)(所述片段通常本質(zhì)上不會如此結(jié)合)。多肽上下文中，“線性序列”或“序列”是多肽中以氨基端至羧基端方向的氨基酸順序，序列中彼此鄰接的殘基在多肽一級結(jié)構(gòu)中是連續(xù)的?！安糠中蛄小笔且阎谝粋€或兩個方向包含額外殘基的多肽的一部分的線性序列?！爱愒吹摹敝秆苌耘c進行比較的實體其余部分基因型不同的實體。例如，從其天然編碼序列取出并可操作地與不同于天然序列的編碼序列連接的富含甘氨酸序列是異源的富含甘氨酸序列。術(shù)語“異源的”應(yīng)用于多核苷酸、多肽時指所述多核苷酸或多肽衍生自與進行比較的實體其余部分基因型不同的實體。術(shù)語“多核苷酸”、“核酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互換使用。它們指任何長度的核苷酸的聚合體形式，所述核苷酸是脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其類似物。多核苷酸可以具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可以發(fā)揮已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性實例基因或基因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、通過連鎖分析確定的基因座(基因座)、 外顯子、內(nèi)含子、信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運RNA、核糖體RNA、核酶、cDNA、重組多核苷酸、分支多核苷酸、質(zhì)粒、載體、任何序列的分離的DNA、任何序列的分離的RNA、核酸探針和引物。多核苷酸可以包括修飾的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸類似物。如果存在，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在聚合物組裝之前或之后進行。核苷酸序列中可以插入非核苷酸組分。多核苷酸可以在聚合之后進一步修飾，例如通過與標記組分的偶聯(lián)。術(shù)語“多核苷酸的互補體”表示與參考序列相比具有互補堿基序列和反方向的多核苷酸分子，使得互補體可以與具有完全保真性的參考序列雜交?！爸亟M的”應(yīng)用至多核苷酸時指該多核苷酸是體外克隆、限制酶消化和/或連接步驟以及產(chǎn)生可能在宿主細胞中表達的構(gòu)建體的其它程序的各種組合的產(chǎn)物。術(shù)語“基因”或“基因片段”在本文可互換使用。它們指含有能夠在被轉(zhuǎn)錄和翻譯之后編碼特定蛋白質(zhì)的至少一個開放閱讀框的多核苷酸?；蚧蚧蚱慰梢允腔蚪M或 cDNA，只要該多核苷酸含有至少一個開放閱讀框，該開放閱讀框可以涵蓋整體編碼區(qū)或其片段?！叭诤匣颉笔怯芍辽賰蓚€連接在一起的異源多核苷酸構(gòu)成的基因。“同源性”或“同源的”指兩個或多個多核苷酸序列或兩個或多個多肽序列之間的序列相似性或可互換性。當使用例如BestFit等程序來測定兩個不同氨基酸序列之間的序列同一性、相似性或同源性時，可以使用缺省設(shè)置，或者可以選擇適當?shù)脑u分矩陣例如 blosum45或blosum80來優(yōu)化同一性、相似性或同源性評分。優(yōu)選地，同源的多核苷酸是在本文定義的嚴格條件下雜交的那些序列并且與那些序列具有至少70%、或至少80%、或至少90%、或95%、或97%、或98%或99%序列同一性?！斑B接”指在兩個核酸片段或基因之間形成磷酸二酯鍵而使它們連接在一起的過程。為了使DNA片段或基因連接在一起，DNA末端必須彼此相容。在一些情況下，末端在核酸內(nèi)切酶消化之后即是相容的。然而，可能必須首先將通常由核酸內(nèi)切酶消化后產(chǎn)生的交錯末端轉(zhuǎn)化成平末端以使它們適合連接。術(shù)語“嚴格的條件”或“嚴格的雜交條件”包括提及多核苷酸將以比其它序列可檢測地更大程度(例如，超過背景至少2倍)與其靶序列雜交的條件。一般而言，雜交的嚴格性部分地參考進行洗滌步驟的溫度和鹽濃度來表示。通常，嚴格條件是如下條件其中 pH 7. 0至8. 3下的鹽濃度小于約1. 5M Na離子、通常約0. 01至1. OM Na離子濃度(或其它鹽)，并且溫度對于短的多核苷酸(例如，10至50個核苷酸)是至少約30°C并且對于長的多核苷酸(例如，大于50個核苷酸)是至少約60°C-例如，“嚴格的條件”可以包括在37°C 下50%甲酰胺、IM NaClU% SDS中雜交，以及在0. 1XSSC/1% SDS中于60至65°C下三次洗滌，每次15分鐘?？蛇x地，可以使用約65°C、60°C、55°C或42°C的溫度。SSC濃度可以從約0. 1至2XSSC變化，其中SDS以約0. 存在。這種洗滌溫度通常被選擇為比確定離子強度和PH下特定序列的熱力學熔點低約5°C至20°C。Tm是50%的靶序列與完美匹配的探針雜交時的溫度(在確定的離子強度和PH下)。計算Tm的方程和核酸雜交條件是熟知的并且可以參見 Sambrook，J.等(1989)Molecular Cloning :A Laboratory Manual，第 2 版， 第 1-3 卷，Cold Spring Harbor Press, Plainview N. Y.；特別參見第 2 卷第 9 章。通常， 使用阻斷試劑來阻斷非特異性雜交。這種阻斷試劑包括例如約100-200 μ g/ml的經(jīng)剪切和變性的鮭魚精子DNA。在特定情況下，例如對于RNA:DNA雜交，還可以使用有機溶劑，例如濃度約35-50% ν/ν的甲酰胺。對這些洗滌條件的有用改變對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員而言是明顯的。術(shù)語“百分比同一性”和“ ％同一性”應(yīng)用于多核苷酸序列時指使用標準化算法比對的至少兩個多核苷酸序列之間的殘基匹配百分比。這種算法可以標準化且可重復(fù)的方式在被比較的序列中插入空位以優(yōu)化兩個序列之間的比對，并因此實現(xiàn)兩個序列的更有意義的比較?？梢詫φw確定的多核苷酸序列長度(例如，如由特定的SEQ ID號所確定)測量百分比同一性，或者可以對較短長度例如對獲自較大的確定的多核苷酸序列的片段長度測量百分比同一性，所述片段例如是至少45、至少60、至少90、至少120、至少150、至少210或至少450個連續(xù)殘基的片段。這些長度僅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附圖或序列表中示出的序列所支持的任何片段長度可以被用來描述可被測量百分比同一性的長度。有關(guān)本文鑒定的多肽序列的“百分比(％ )氨基酸序列同一性”被定義為比對序列并引入空位(如果必要)以實現(xiàn)最大百分比序列同一性并且不將任何保守取代視為序列同一性的一部分，詢問序列中與另一個參考多肽序列或其部分的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基百分比。旨在測定百分比氨基酸序列同一性的比對可以本領(lǐng)域技術(shù)中的各種方式實現(xiàn)，例如使用公開可獲得的計算機軟件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR) 軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測量比對的適當參數(shù)，包括對被比較的序列的全長實現(xiàn)最大比對所需的任何算法?？梢詫φw確定的多肽序列長度(例如，如由特定的SEQ ID 號所確定)測量百分比同一性，或者可以對較短長度例如對獲自較大的確定的多肽序列的片段長度測量百分比同一性，所述片段例如至少15、至少20、至少30、至少40、至少50、至少70或至少150個連續(xù)殘基的片段。這些長度僅是示例性的，并且要理解，本文、表格、附圖或序列表中顯示的序列所支持的任何片段長度可以被用來描述可被測量百分比同一性的長度。本文多肽上下文中使用的術(shù)語“非重復(fù)性”指在肽或多肽序列中缺乏或有限程度的內(nèi)部同源性。例如，術(shù)語“基本上非重復(fù)的”可以指例如序列中很少或沒有四個連續(xù)氨基酸是相同的氨基酸類型，或者多肽具有10或更小的子序列評分(下文定義)，或者沒有構(gòu)成多肽序列的序列基序從N端至C端順序的模式。本文多肽上下文中使用的術(shù)語“重復(fù)性” 指肽或多肽序列中內(nèi)部同源性程度。相反，“重復(fù)的”序列可以含有短氨基酸序列的多個相同拷貝。例如，目標多肽序列可以被分成n-mer序列，并且相同序列的數(shù)目可以被計數(shù)。高度重復(fù)的序列含有大比例的相同序列，而非重復(fù)的序列含有很少的相同序列。在多肽上下文中，序列可以含有確定或可變長度的較短序列或基序的多個拷貝，其中基序本身具有非重復(fù)序列，使全長多肽是基本上非重復(fù)的。其中測量非重復(fù)性的多肽長度可以是3個氨基酸至約200個氨基酸、約6至約50個氨基酸、或約9至約14個氨基酸。多核苷酸序列的上下文中使用的“重復(fù)性”指序列內(nèi)部同源性程度，例如，給定長度的相同核苷酸序列的頻率。 重復(fù)性可以例如通過分析相同序列的頻率來測量?！拜d體”是優(yōu)選在適當宿主中自我復(fù)制的核酸分子，其將插入的核酸分子轉(zhuǎn)到宿主
20細胞中和/或在宿主細胞之間。該術(shù)語包括主要功能是將DNA或RNA插入細胞的載體，主要功能是復(fù)制DNA或RNA的復(fù)制載體，以及功能是轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA的表達載體。 還包括提供不止一種上述功能的載體?！氨磉_載體”是被引入適當宿主細胞時可以被轉(zhuǎn)錄并翻譯成多肽的多核苷酸?！氨磉_系統(tǒng)”通常表示包含可以用于產(chǎn)生期望的表達產(chǎn)物的表達載體的適合的宿主細胞。“血清降解抗性”應(yīng)用于多肽時指多肽在血液或其組分中抵抗降解的能力，血清或血漿中通常包括蛋白酶。血清降解抗性可以通過使蛋白質(zhì)與人(或視情況為小鼠、大鼠、 猴)血清或血漿通常在約37°C混合通常一定天數(shù)(例如0. 25、0.5、1、2、4、8、16天)來測量?？蓪@些時間點的樣本進行蛋白質(zhì)印跡分析，并使用抗體檢測蛋白質(zhì)?？贵w可以針對蛋白中的標簽。如果蛋白質(zhì)在印跡(western)上顯示單條帶，其中蛋白質(zhì)大小與注射蛋白質(zhì)大小相同，則沒有發(fā)生降解。在該示例性方法中，通過蛋白質(zhì)印跡或等效技術(shù)判斷50%蛋白被降解的時間點是蛋白質(zhì)的血清降解半衰期或“血清半衰期”。本文使用的術(shù)語“t1/2”指終末半衰期，計算為ln(2)/Kel。Kel是通過log濃度對時間曲線的終末線性部分的線性回歸而計算的終末消除速率常數(shù)。半衰期通常指活生物體中儲存的施用物質(zhì)的半數(shù)被正常生物過程代謝或消除所需的時間。術(shù)語“t1/2”、“終末半衰期”、“消除半衰期”和“循環(huán)半衰期”在本文可互換使用?！氨碛^分子量因子”或“表觀分子量”是相關(guān)術(shù)語，指特定氨基酸序列表現(xiàn)出的表觀分子量的相對增加或降低的量度。表觀分子量使用尺寸排阻色譜(SEC)和類似方法與球狀蛋白標準品相比較來測定，并且以“表觀kD”單位來度量。表觀分子量因子是表觀分子量和實際分子量之間的比率；后者通過基于氨基酸組成而加合組成中每種氨基酸的計算分子量來預(yù)測?！傲黧w動力學半徑”或“Mokes半徑”是分子在溶液中的有效半徑(Rh，以nm計)， 通過假設(shè)它是穿過溶液并受溶液粘性抵抗的主體來測量。在本發(fā)明的實施方案中，XTEN融合蛋白的流體動力學半徑測量與‘表觀分子量因子’相關(guān)聯(lián)，表觀分子量因子是更直觀的量度。蛋白質(zhì)的“流體動力學半徑”影響其在水溶液中的擴散速率以及其在大分子凝膠中遷移的能力。蛋白質(zhì)的流體動力學半徑由其分子量以及其結(jié)構(gòu)(包括形狀和致密度)決定。 測定流體動力學半徑的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如通過使用尺寸排阻色譜(SEC)，如美國專利No. 6，406，632和No. 7，294, 513所述。大多數(shù)蛋白質(zhì)具有球形結(jié)構(gòu)，這是蛋白質(zhì)在最小流體動力學半徑下可以具有的最致密的三維結(jié)構(gòu)。一些蛋白質(zhì)具有隨機和開放的非結(jié)構(gòu)化或‘線性’構(gòu)象，因此與類似分子量的典型球形蛋白質(zhì)相比具有大得多的流體動力學半徑?！吧項l件”指活宿主中的一組條件以及模擬活受試者那些條件的體外條件，包括溫度、鹽濃度、PH。已經(jīng)確立了用于體外分析的許多生理相關(guān)條件。一般而言，生理緩沖液包含生理濃度的鹽并且被調(diào)節(jié)至中性pH，范圍從約6. 5至約7. 8，并且優(yōu)選約7. 0至約7. 5。 許多生理緩沖液列于Sambrook等(1989)。生理相關(guān)溫度范圍從約25°C至約38°C并且優(yōu)選約:35°C至約 37"C?！胺磻?yīng)基”是可以與另一反應(yīng)基偶聯(lián)的化學結(jié)構(gòu)。反應(yīng)基的實例是氨基、羧基、巰基、羥基、醛基、疊氮基。一些反應(yīng)基可以被活化以促進與另一反應(yīng)基的偶聯(lián)。活化的實例是羧基與碳二亞胺反應(yīng)，羧基轉(zhuǎn)化為活化的酯，或者羧基轉(zhuǎn)化為疊氮化物官能。“控釋劑”、“緩釋劑”、“貯庫制劑”或“持續(xù)釋放劑”可互換使用，指與多肽在缺乏這些物質(zhì)而施用時的釋放持續(xù)時間相比能夠延長本發(fā)明多肽釋放持續(xù)時間的物質(zhì)。本發(fā)明的不同實施方案可以具有不同的釋放速率，導致不同的治療量。術(shù)語“抗原”、“靶抗原”或“免疫原”在本文可互換使用，指抗體片段或基于抗體片段的治療劑與之結(jié)合或?qū)χ哂刑禺愋缘慕Y(jié)構(gòu)或結(jié)合決定簇。本文使用的術(shù)語“有效負載”指具有生物活性或治療活性的蛋白質(zhì)或肽序列；小分子藥效團的對應(yīng)物。有效負載的實例包括但不限于細胞因子、酶、激素和血液和生長因子。 有效負載還可以包含基因融合或化學偶聯(lián)的部分，例如化療劑、抗病毒化合物、毒素或造影齊U。這些偶聯(lián)部分可以通過連接子與多肽其余部分連接，所述連接子可以是可裂解的或不可裂解的。本文使用的術(shù)語“拮抗劑”包括部分或完全阻斷、抑制或中和本文公開的天然多肽的生物活性的任何分子。用于鑒定多肽拮抗劑的方法可以包括使天然多肽與候選拮抗劑分子接觸并測量通常與天然多肽相關(guān)的一種或多種生物活性的可檢測的變化。在本發(fā)明上下文中，拮抗劑可以包括蛋白質(zhì)、核酸、糖類、抗體或降低生物活性蛋白效應(yīng)的任何其它分子。術(shù)語“激動劑”以最廣泛的含義使用并且包括模擬本文公開的天然多肽的生物活性的任何分子。適合的激動劑分子具體包括激動劑抗體或抗體片段、天然多肽的片段或氨基酸序列變體、肽、小有機分子等。用于鑒定天然多肽的激動劑的方法可以包括使天然多肽與候選激動劑分子接觸并測量通常與天然多肽相關(guān)的一種或多種生物活性的可檢測的變化?！盎钚浴背鲇诒疚哪康闹溉诤系鞍捉M分與相應(yīng)的天然生物活性蛋白一致的作用或效應(yīng)，其中“生物活性”指體外或體內(nèi)生物功能或效應(yīng)，包括但不限于受體結(jié)合、拮抗劑活性、激動劑活性或細胞或生理反應(yīng)。本文使用的“治療(treatment)”或“治療(treating) ”或“減輕(palliating)，， 或“緩解(ameliorating)”在本文可互換使用。這些術(shù)語指獲得包括但不限于治療益處和 /或預(yù)防益處的有益或期望結(jié)果的方法。所謂治療益處是指被治療的潛在疾患的消除或緩解。而且，隨著與潛在疾患相關(guān)的一種或多種生理癥狀的消除或緩解使得在受試者中觀察到改善而實現(xiàn)治療益處，盡管受試者可能依然受累于所述潛在疾患。為了預(yù)防益處，組合物可以被施用給處于發(fā)展特定疾病風險的受試者或者報告了疾病的一種或多種生理癥狀的受試者，盡管可能還未做出該疾病的診斷。本文使用的“治療效果”指生理效應(yīng)，包括但不限于人或其它動物中疾病的治愈、 緩和、緩解或預(yù)防，或者指除此以外增強人或動物的生理或精神狀態(tài)，這是由本發(fā)明融合多肽而非誘導生成針對生物活性蛋白具有的抗原表位的抗體的能力引起的。治療有效量的確定在本領(lǐng)域技術(shù)人員能力范圍內(nèi)，特別是根據(jù)本文提供的詳細公開內(nèi)容。本文使用的術(shù)語“治療有效量”和“治療有效劑量”指單獨或作為融合蛋白組合物的一部分的生物活性蛋白的量，所述生物活性蛋白一次或重復(fù)劑量施用給受試者時能夠?qū)膊顟B(tài)或病癥的任何癥狀、方面、測量參數(shù)或特征具有任何可檢測的有益效應(yīng)。這種效應(yīng)不一定絕對是有益的。本文使用的術(shù)語“治療有效劑量方案”指單獨或作為融合蛋白組合物的一部分的生物活性蛋白的連續(xù)施用劑的計劃表，其中所述劑以治療有效量給予以對疾病狀態(tài)或病癥的任何癥狀、方面、測量參數(shù)或特征產(chǎn)生持續(xù)有益的效應(yīng)。
I) 一般技術(shù)除非另外指出，本發(fā)明實踐釆用本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的免疫學、生物化學、化學、分子生物學、微生物學、細胞生物學、基因組學和重組DNA的常規(guī)技術(shù)。參見Sambr00k，J.等， “Molecular Cloning :A Laboratory Manual，，，第 3 片反，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001 ；“Current protocols in molecular biology”，F(xiàn). M. Ausubel，等編輯，1987 ； 系列“Methods in Enzymology，，，Academic Press，San Diego, CA. ；“PCR 2 :a practical approach”，M. J. MacPherson，B. D. Hames 禾口 G. R. Taylor 編輯，Oxford University Press， 1995 ；“Antibodies，a laboratory manual，，Harlow，E.禾口 Lane，D.編輯，Cold Spring Harbor Laboratory,1988 ；"Goodman & Gilman' s The Pharmacological Basis of Therapeutics，” 第 11 片反，McGraw-Hill，2005 ；禾口 Freshney，R. I.，“Culture of Animal Cells :A Manual of Basic Technique，，，第 4 片反，John Wiley & Sons，Somerset，NJ，2000， 這些參考文獻的全部內(nèi)容通過引用的方式并入本文。II)葡萄糖調(diào)節(jié)肽本發(fā)明部分涉及包含葡萄糖調(diào)節(jié)肽(GP)的融合蛋白組合物。這類組合物可用于治療或預(yù)防與葡萄糖穩(wěn)態(tài)、肥胖、胰島素抗性、血脂異常、高血壓等相關(guān)的某些疾病、疾患或病癥。在大多數(shù)發(fā)達國家，內(nèi)分泌和肥胖相關(guān)疾病或疾患已經(jīng)達到顯著的比例，并且在大多數(shù)發(fā)達國家代表大量且增加的保健負擔，這些疾病或疾患包括影響身體器官、組織和循環(huán)系統(tǒng)的多種病癥。特別關(guān)注的是內(nèi)分泌和肥胖相關(guān)疾病和疾患。這些疾病中主要的是糖尿病，它是在美國死亡的主導原因之一。將糖尿病分為兩個主要子類-I型，也稱為青少年糖尿病或胰島素依賴性糖尿病(IDDM)，和II型，也稱為成年發(fā)病型糖尿病或非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)。I型糖尿病是自身免疫疾病的一種形式，其完全或部分破壞這類受試者中胰腺的胰島素產(chǎn)生細胞，并且在他們生命期中需要使用外源性胰島素。甚至在控制良好的受試者中也可發(fā)生復(fù)發(fā)性并發(fā)癥，其中一些是危及生命的。在II型糖尿病中，進食后升高的血糖水平不能適當?shù)卮碳び梢认佼a(chǎn)生胰島素。另夕卜，周圍組織一般對胰島素的作用有抗性，并且這類受試者通常具有比正常更高的血漿胰島素水平(高胰島素血癥)，因為身體試圖克服其胰島素抗性。在晚期疾病狀態(tài)中，胰島素分泌也受損。胰島素抗性和高胰島素血癥還與兩種造成相當?shù)慕】碉L險其它的代謝失調(diào)相關(guān) 葡萄糖耐受不良和代謝性肥胖。葡萄糖耐受不良以進食前葡萄糖水平正常，而進食后趨于升高的水平(高血糖)為特征。這些個體被認為處于糖尿病和冠狀動脈疾病的較高風險。 肥胖也是稱為胰島素抗性綜合癥或“X綜合癥”(和高血壓一樣)的病癥組群、冠狀動脈疾病(動脈硬化)和乳酸酸中毒以及相關(guān)病況的風險因素。認為肥胖的致病原因是多因素的，但是一個潛在的問題是在肥胖中直到有過量的脂肪組織才使營養(yǎng)物可用性和能量消耗平衡。其它相關(guān)的疾病或疾患包括但不限于妊娠糖尿病、青少年糖尿病、肥胖、食欲過盛、飽腹感不足、代謝失調(diào)、胰高血糖素瘤、視網(wǎng)膜神經(jīng)變性過程和I型糖尿病的“蜜月期”。血脂異常經(jīng)常發(fā)生于糖尿病中，通常以血液中升高的血漿甘油三酯、低HDL(高密度脂蛋白)膽固醇、正常至升高水平的LDL(低密度脂蛋白)膽固醇和增加水平的低密度 LDL微粒為特征。血脂異常是糖尿病受試者中冠狀動脈疾病和死亡的發(fā)生率增加的主要貢獻者。葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素響應(yīng)中的大多數(shù)代謝過程受多種肽和激素的調(diào)節(jié)，并且許多這類肽和激素以及其類似物已經(jīng)用于治療代謝疾病和疾患。甚至當它們具有相反的生物功能時，這些肽中的許多仍相互之間趨于同源。葡萄糖增加肽通過肽激素胰高血糖素來例證， 而葡萄糖降低肽包括exendin-4、胰高血糖素樣肽1和胰島淀粉樣肽(amylin)。然而，使用治療肽和/或激素(甚至當通過使用小分子藥物增強時)在治療這類疾病、疾患和病癥方面取得有限的成功。特別是，劑量優(yōu)化對于用于治療代謝疾病的藥物和生物制劑(尤其是具有窄治療窗的那些)是重要的。參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)的激素(一般)和肽通常具有窄治療窗。 窄治療窗連同這類激素和肽通常具有短半衰期(這使得需要頻繁給藥以達到臨床益處)的事實導致治療這類患者的困難。雖然對治療蛋白的化學修飾(諸如聚乙二醇化)可改變其體內(nèi)清除率和隨后的血清半衰期，但這需要另外的制造步驟并產(chǎn)生不均一的最終產(chǎn)物。另夕卜，已經(jīng)報道了由長期施用引起的不可接受的副作用。任選地，通過將Fc結(jié)構(gòu)域與治療蛋白或肽融合的基因修飾增加了治療蛋白的尺寸(這降低經(jīng)由腎臟的清除率)，并促進通過 FcRn受體從溶酶體的循環(huán)。不幸的是，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域未能在重組體表達期間有效折疊且易于形成稱為包涵體的不溶性沉淀。這些包涵體必須被溶解且功能蛋白必須被復(fù)性；這是耗時、低效且昂貴的過程。因此，本發(fā)明的一方面是將參與葡萄糖穩(wěn)態(tài)、胰島素抗性和肥胖的肽(統(tǒng)稱為“葡萄糖調(diào)節(jié)肽”)并入GPXTEN融合蛋白以產(chǎn)生可用于治療葡萄糖、胰島素和肥胖疾患、疾病和相關(guān)病癥(本文稱作“葡萄糖調(diào)節(jié)肽相關(guān)疾病、疾患或病癥”)的組合物。葡萄糖調(diào)節(jié)肽可包括具有生物、治療或預(yù)防益處或功能的任何蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)用于預(yù)防、治療、調(diào)節(jié)或改善葡萄糖穩(wěn)態(tài)或胰島素抗性或肥胖疾病、疾患或病癥?？膳cXTEN連接以產(chǎn)生GPXTEN的合適的葡萄糖調(diào)節(jié)肽包括所有生物活性多肽，所述生物活性多肽增加通過胰腺β細胞的葡萄糖依賴性胰島素分泌或增強胰島素的作用或在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用。葡萄糖調(diào)節(jié)肽還可包括在胰腺β細胞中刺激胰島素原基因轉(zhuǎn)錄的所有生物活性多肽。而且，葡萄糖調(diào)節(jié)肽還可包括減緩胃排空和減少食物攝取的所述生物活性多肽。葡萄糖調(diào)節(jié)肽還可包括抑制胰高血糖素從胰島α細胞的釋放的所有生物活性多肽。表1提供了由本發(fā)明的GPXTEN融合蛋白所包含的葡萄糖調(diào)節(jié)肽的序列的非限制性列表。本發(fā)明GPXTEN組合物的葡萄糖調(diào)節(jié)肽可以是顯示與選自表1的蛋白質(zhì)序列具有至少約80 %序列同一性，或任選地81 %、82 %、 83%,84%,85%,86%,87%,88%,89%,90%,91 %,92%,93%,94%,95%,96%,97%, 98%、99%或100%序列同一性的肽。表1 來自動物物種的葡萄糖調(diào)節(jié)肽
權(quán)利要求
1.一種分離的融合蛋白，其包含與選自表1的氨基酸序列具有至少90%同一性的葡萄糖調(diào)節(jié)肽(GP)，其中所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽與至少約200個氨基酸殘基的延伸的重組多肽 (XTEN)連接，其中所述XTEN特征在于(a)所述XTEN序列包含顯示與類似長度的選自表3的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的至少約200個連續(xù)氨基酸；(b)當通過ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法分析時，所述XTEN序列缺少預(yù)測的T細胞表位，其中對所述 XTEN序列中表位的所述ΤΕΡΙΤ0ΡΕ算法預(yù)測基于_9或更高的評分；(c)所述XTEN具有小于10的子序列評分；和(d)甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、谷氨酸(E)和脯氨酸(P)殘基的總和構(gòu)成所述XTEN的總氨基酸殘基的超過約90%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白，其中所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽是人葡萄糖調(diào)節(jié)肽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離的融合蛋白，其還包含第二XTEN序列，并且其中所述融合蛋白采用表7所示的多XTEN構(gòu)型。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3任一項所述的分離的融合蛋白，其中所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽和所述 XTEN通過間隔區(qū)連接，其中所述間隔區(qū)序列包含1至約50個氨基酸殘基，并且其中所述間隔區(qū)任選地包含裂解序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項所述的分離的融合蛋白，其中所述融合蛋白與缺少所述 XTEN的相應(yīng)天然葡萄糖調(diào)節(jié)肽結(jié)合相同的靶受體，并且其中所述融合蛋白保留缺少所述 XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽的結(jié)合親和力的至少約0. 至約30%或更多。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5任一項所述的分離的融合蛋白，其包含與選自表36、表37和表 38的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的氨基酸序列。
7.—種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的分離的融合蛋白和藥學上可接受的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的融合蛋白，其根據(jù)式I構(gòu)造(XTEN)x-GP-(XTEN)y (I)其中每次出現(xiàn)時獨立地(a)x是0或1；并且(b)y是0或1，其中x+y彡1。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至6任一項所述的分離的融合蛋白，其中所述XTEN在所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽的N端或C端與所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽融合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至6和8至9任一項所述的分離的融合蛋白，其包含葡萄糖調(diào)節(jié)肽和每個與選自表5的一個或多個氨基酸序列具有至少90%同一性的第一和第二 XTEN。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至6和8至10任一項所述的分離的融合蛋白，其特征在于(i)與以類似摩爾劑量施用給受試者時的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，所述分離的融合蛋白在施用給受試者時具有更長的終末半衰期；( )與以另外等同的劑量方案施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的曲線下面積(AUC)；(iii)與以另外等同的劑量方案施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少所述XTEN 的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的治療效果；(iv)與使用另外等同的摩爾量施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當所述融合蛋白以較低頻率施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的曲線下面積(AUC)；(ν)與使用另外等同的摩爾量施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當所述融合蛋白以較低頻率施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的治療效果；(vi)與以另外等同的劑量期施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當累積較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少所述 XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的曲線下面積(AUC)；或(vii)與以另外等同的劑量期施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，當累積較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者時，所述融合蛋白達到與缺少所述 XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的治療效果。
12.—種制備融合蛋白的方法，所述融合蛋白包含與一個或多個延伸的重組多肽 (XTEN)融合的葡萄糖調(diào)節(jié)肽，所述方法包括(a)提供包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的融合蛋白的重組多核苷酸分子的宿主細胞；(b)在允許所述融合蛋白表達的條件下培養(yǎng)所述宿主細胞；和(c)回收所述融合蛋白。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述融合蛋白的葡萄糖調(diào)節(jié)肽與以下具有至少 90%序列同一性(a)人葡萄糖調(diào)節(jié)肽；或(b)選自表1的序列。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的方法，其中所述表達的融合蛋白的一個或多個XTEN 與選自表5的序列具有至少90%序列同一性。
15.根據(jù)權(quán)利要求12至14任一項所述的方法，其中編碼所述融合蛋白的多核苷酸分子包含顯示與選自表35、表36和表37的核酸序列具有至少90%序列同一性的核酸序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求12至15任一項所述的方法，其中為了所述融合蛋白在所述宿主細胞中增強的表達而對所述多核苷酸進行密碼子優(yōu)化。
17.根據(jù)權(quán)利要求12至16任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是原核細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求12至17任一項所述的方法，其中所述分離的融合蛋白以基本上可溶的形式從所述宿主細胞的細胞質(zhì)中回收。
19.一種分離的核酸，其包含編碼根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白的核苷酸序列或其互補體。
20.一種表達載體，其包含根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸。
21.一種分離的宿主細胞，其包含根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸，其中所述宿主細胞是原核宿主細胞。
22.—種治療受試者的葡萄糖調(diào)節(jié)肽(GP)相關(guān)病癥的方法，所述方法包括給所述受試者施用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述葡萄糖調(diào)節(jié)肽相關(guān)病癥選自青少年糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、肥胖、急性低血糖、急性高血糖、夜間低血糖、慢性高血糖、胰高血糖素瘤、氣道的分泌疾患、關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病、再狹窄、神經(jīng)退行性疾病、腎衰竭、充血性心力衰竭、腎病綜合癥、肝硬化、肺水腫、高血壓、中風、腸道易激綜合癥、心肌梗塞、急性冠狀動脈綜合征、術(shù)后代謝變化、冬眠心肌、糖尿病心肌病、尿鈉排泄不足、尿鉀濃度過高、多囊卵巢綜合癥、呼吸窘迫、腎病、左心室收縮功能障礙、腹瀉、術(shù)后傾倒綜合癥、危重病多發(fā)性神經(jīng)病(CIPN)、血脂異常、局部缺血后血流再灌注引起的器官組織損傷和冠心病危險因素(CHDRF)綜合癥。
24.根據(jù)權(quán)利要求22或23所述的方法，其中所述治療有效量導致維持所述融合蛋白的血藥濃度在所述融合蛋白的治療窗內(nèi)的時間是以類似量施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)天然葡萄糖調(diào)節(jié)肽的至少三倍。
25.根據(jù)權(quán)利要求22至M任一項所述的方法，其中使用治療有效劑量方案施用的所述融合蛋白的兩次或多次連續(xù)劑量施用給受試者導致與使用針對GP確立的治療劑量方案施用的未與所述融合蛋白連接的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，所述融合蛋白的血藥水平的連續(xù) Cfflax峰和/或Cmin谷之間時間增加。
26.根據(jù)權(quán)利要求22至25任一項所述的方法，其中(i)與以另外等同的劑量方案施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，將較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者，并且所述融合蛋白達到與缺少所述XTEN 的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的治療效果；( )與使用另外等同的摩爾劑量施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，所述融合蛋白以較低頻率施用給受試者，并且所述融合蛋白達到與缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的治療效果；或(iii)與以另外等同的劑量期施用給受試者的缺少所述XTEN的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽相比，將累積較小摩爾量的所述融合蛋白施用給受試者，所述融合蛋白達到與缺少所述XTEN 的相應(yīng)葡萄糖調(diào)節(jié)肽類似的治療效果。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述治療效果是選自以下的測量參數(shù)=HbAlc濃度、胰島素濃度、受激的C肽、空腹血糖(FPG)、血清細胞因子水平、CRP水平、胰島素分泌和得自口服葡萄糖耐受試驗(OGTT)的胰島素敏感指數(shù)、體重和食物消耗。
28.—種試劑盒，其包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物、標識所述藥物組合物的標簽和關(guān)于所述藥物組合物的存儲、重建和/或施用給受試者的說明。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含與延伸的重組多肽(XTEN)連接的葡萄糖調(diào)節(jié)肽的組合物、編碼所述組合物的分離的核酸和含有所述分離的核酸的載體和宿主細胞，以及制備所述組合物的方法和使用所述組合物治療葡萄糖調(diào)節(jié)肽相關(guān)疾病、疾患和病癥的方法。
文檔編號A61K38/00GK102481331SQ201080035271
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月8日
發(fā)明者J·L·克萊蘭, J·西爾弗曼, N·吉西格, V·謝爾恩伯杰, W·P·施泰姆爾, 王家威 申請人:阿穆尼克斯運營公司