專利名稱：糖蛋白vi的核酸調(diào)節(jié)劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般而言涉及抗血小板藥理學(xué)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含與血小板特異性蛋白糖蛋白VI(GPVI)結(jié)合并調(diào)節(jié)其活性的核酸配體。使用抑制所述核酸配體的活性以中和其藥理作用并因此恢復(fù)GPVI功能的調(diào)節(jié)劑，這些核酸配體也是活性可逆的。本發(fā)明還涉及包含核酸配體和/或調(diào)節(jié)劑的組合物以及使用這些試劑和組合物治療血小板介導(dǎo)的疾病和病癥的方法。背景血小板是小的無核血細(xì)胞，其在正常條件下相當(dāng)靜止，但通過粘附、激活、聚集和血栓形成而立即響應(yīng)血管損傷。血小板的主要功能是在組織創(chuàng)傷和內(nèi)皮下基質(zhì)暴露后阻止血液損失。眾所周知的是，血管破壞可將胞外基質(zhì)組分暴露給血液，尤其是馮維勒布蘭德因子(von Willebrand factor，VWF)、膠原、纖連蛋白、血小板反應(yīng)蛋白和層粘連蛋白。血小板與這些暴露分子之間的相互作用導(dǎo)致血小板細(xì)胞的激活。盡管早就知道血小板在止血和血栓形成中具有主要作用，但是也逐漸認(rèn)識(shí)到血小板可能在各種各樣的其它病癥(例如炎癥、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、以及免疫宿主防御)中也起到重要作用。因此，血小板受體蛋白是用于調(diào)節(jié)血小板功能以作為治療或預(yù)防血小板介導(dǎo)病癥的方法的引人關(guān)注的靶標(biāo)。糖蛋白VI(GPVI)是特別引人關(guān)注的靶標(biāo)，因?yàn)樗窃谘“迳咸禺愋员磉_(dá)的跨膜蛋白。具有胞外暴露的細(xì)胞特異性分子同時(shí)提供對(duì)治療部分的可接近性和最小(如果有的話)有害副作用的潛力，因?yàn)楸磉_(dá)概況有限。糖蛋白VI (GPVI)是主要的血小板信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)膠原受體，顯示在產(chǎn)生介導(dǎo)血小板激活的胞內(nèi)信號(hào)中起作用(Watson等，Platelets，2000，11 :252-258)。GPVI是Ig超家族的 62-65 kDa糖蛋白，由含有膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的2個(gè)Ig C2環(huán)組成，其代表潛在的藥物靶點(diǎn)。該蛋白在體內(nèi)被極高度糖基化和唾液酸化，并且在外Ig_C2-樣結(jié)構(gòu)域上發(fā)現(xiàn)單一糖基化位點(diǎn)。作為免疫球蛋白超家族成員，GPVI與天然殺傷受體有關(guān)。其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可間接通過FcR 的Y -鏈或直接通過GPVI胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域來介導(dǎo)。FcR γ -鏈含有基于免疫受體酪氨酸的激活模體，并協(xié)同非酪氨酸激酶SI和銜接子LAT和LCP2導(dǎo)致磷脂酶C2和相關(guān)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活(Lankhof 等，Thromb Haemost, 1996,75 :950-958)。已經(jīng)知道GPVI在血塊形成相關(guān)的生理及臨床事件中的重要性并得到GPVI水平與急性冠狀動(dòng)脈綜合征(ACQ和中風(fēng)事件發(fā)作的流行病學(xué)相關(guān)的支持(Bigalke等，American Heart Journal,2008,156 193-200 ；Bigalke 等，European Journal of Neurology, 2009,101 :911-915),以及在GPVI缺陷小鼠中證明的血栓形成抗性的支持(Denis等，Arteriosclerosis,Thrombosis and Vascular Biology，2007，27 :728-739)。此夕卜，Gawaz 等人已經(jīng)證明放射性標(biāo)記的GPVI可用于小鼠血管性損害的閃爍成像，因?yàn)樗c損傷區(qū)特異性結(jié)合，這表明在這些部位的膠原被暴露(Thromb Haemost.，2005，93 :910-913)。Penz 等人(FASEB J. 2005，19 :898-909)已經(jīng)證明患有頸動(dòng)脈狹窄的患者的人粥樣斑塊含有能夠激活血小板的膠原I型和III型結(jié)構(gòu)。此外，對(duì)GPVI的阻斷或GPVI的不存在能夠預(yù)防血栓形成，而對(duì)α 的阻斷則幾乎無效。同樣，用抗膠原的抗體阻斷膠原或用膠原酶降解膠原也可預(yù)防血栓形成。新近，已經(jīng)知道GPVI在血小板功能障礙和異常膠原表達(dá)相關(guān)病癥中起到更廣泛作用。這部分地因?yàn)橐韵率聦?shí)血小板在例如血栓形成的情況下在血管損傷后的粘附中，以及在各種各樣的炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子的釋放中都起作用。此外，在血小板與血管損傷部位反應(yīng)之后，隨后的血小板激活導(dǎo)致細(xì)胞因子和其它調(diào)節(jié)分子的釋放。因此，盡管可能看起來血小板異常激活相關(guān)病癥是多樣的，但這些病癥都與其對(duì)血小板功能的依賴性相關(guān)。因此， 抑制或預(yù)防血小板激活可提供有價(jià)值的治療效果。血小板介導(dǎo)的病癥包括血管病以及高危糖尿病相關(guān)的各種病癥。已證明由血小板介導(dǎo)的炎性病癥包括炎性關(guān)節(jié)炎疹和硬皮病。早就知道炎癥和白細(xì)胞活性在炎性關(guān)節(jié)病中的作用。新近，已經(jīng)鑒定了發(fā)炎關(guān)節(jié)的滑液中存在血小板(Boilard等，Science，2010，327 580-583)。此外，已經(jīng)證明在罹患炎性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)液中的血小板微粒是促炎的，通過 IL-I引發(fā)滑液成纖維細(xì)胞的細(xì)胞因子應(yīng)答。藥理和遺傳方法都證明GPVI在關(guān)節(jié)炎中的這種血小板促炎特性中起到關(guān)鍵作用。已證明與血小板表面上GPVI表達(dá)相關(guān)的其它病癥包括實(shí)驗(yàn)性腫瘤轉(zhuǎn)移(Jain等， J. Thromb Haemostasis, 2009, 7 :1713-1717)、糖尿病(Cabeza 等，2004，53 :2117-2121)和丙肝病毒感染(Zahn 等，Diabetes, 2004, 53 :2117-2121)。盡管已經(jīng)證明GPVI在血小板功能和相關(guān)生理疾病中的擴(kuò)大作用，但發(fā)現(xiàn)和開發(fā)該受體的拮抗劑的工作仍是有限的?？寡“瀵煼ǖ膹?qiáng)度及持續(xù)時(shí)間的活性控制或調(diào)節(jié)可提供顯著臨床益處。因此，本領(lǐng)域仍然需要經(jīng)設(shè)計(jì)用于特異性靶向GPVI蛋白并調(diào)節(jié)其功能的調(diào)節(jié)劑。發(fā)明概述本文描述涉及與糖蛋白VI(GPVI)特異性結(jié)合的核酸配體的組合物，使用與糖蛋白VI(GPVI)特異性結(jié)合的核酸配體及其調(diào)節(jié)劑的方法和治療。一方面，提供GPVI配體，其中所述配體包含分離的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷酸是核糖核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)核苷酸是脫氧核糖核酸。在再一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸序列GPVI配體包含核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體包含二級(jí)結(jié)構(gòu)，其包含1、2或3個(gè)莖和1、2、3 或4個(gè)環(huán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體包含二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中所述二級(jí)結(jié)構(gòu)在5’ -3’方向上包含第1莖區(qū)、第1環(huán)區(qū)、第2莖區(qū)、第2環(huán)區(qū)、第3環(huán)區(qū)、第3莖區(qū)和第4環(huán)區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體在5’ -3’方向上基本上由第1莖區(qū)、第1環(huán)區(qū)、第2莖區(qū)、第2環(huán)區(qū)、 第3環(huán)區(qū)、第3莖區(qū)和第4環(huán)區(qū)組成。
在一個(gè)實(shí)施方案中，將核酸GPVI配體二級(jí)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)為在5’ -3’方向上的第1莖、 第1環(huán)、與第2環(huán)和與第3環(huán)連接的第2莖、與第3環(huán)和與第4環(huán)連接的第3莖、和第4環(huán)。 在一個(gè)實(shí)施方案中，第2莖與第1、第2和第3環(huán)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體的第4環(huán)包含由UAA組成的第1共有序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第4環(huán)包含由(G/A)UAA組成的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，第3莖包含由G-C堿基對(duì)后接C-G堿基對(duì)組成的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體包含GC(G/A)UAAGC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸配體的第3莖和第4環(huán)包含GC(G/A)UAAGC。在又一個(gè)實(shí)施方案中，核酸配體的第3莖和第4環(huán)包含選自GCAUAAGC和GCGUAAGC的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，第3環(huán)包含序列YD，其中Y是嘧啶，D不是胞嘧啶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第3環(huán)包含序列YU、YG或YA。在再一個(gè)實(shí)施方案中，第3環(huán)包含序列UU、UG、 UA、⑶、CG或CA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第3環(huán)由序列YD組成。在一個(gè)實(shí)施方案中，第1環(huán)包含序列GAC。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸GPVI配體序列的長度為約20個(gè)核苷酸(nt)至約50nt,約20nt至約45nt,約20nt至約40nt,約20nt至約35nt,約20nt至約30nt,或約 30nt 至約 35nt0在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體包含選自 SEQ ID NO :7、SEQ IDNO :9、SEQ ID NO :11、 SEQ ID NO 12, SEQ ID N0:14和SEQ IDNO 15的分離的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中， GPVI配體包含選自SEQ ID NO J8至SEQ ID NO :33的分離的核酸序列。在再一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI 配體包含選自 EF-l-RNA、EF-2-RNA、EF-3-RNA、E2-6-RNA、EF-22-RNA 和 EF-31-RNA 的分離的RNA核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體包含選自EF-I-修飾的、EF-2-修飾的、EF-3-修飾的、E2-6-修飾的、EF-22-修飾的和EF-31-修飾的分離的RNA核酸序列。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體包含這樣的分離的核酸序列其與選自SEQ ID NO 28至 SEQ ID NO 33的序列具有至少80%同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體選自 RB424、RB426、RB427、RB428、RB429、RB430、 RB445、RB446、RB447、RB431、RB432、RB433、RB434、RB435、RB436、RB439、RB440、RB441、 RB442、RB443 和 RB444。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體選自 RB448、RB452、RB453、RB455、RB460、RB462、 RB466、RB478、RB480、RB488、EB490、RB491、RB492、RB493、RB495、RB496、RB497、RB498、 RB499、RB500、RB502、RB503、RB504、RB505、RB506、RB507、RB508、RB517、RB518、RB519、 RB520、RB521、RB522、RB523、RB524、RB525、RB526、RB527、RB528、RB531、RB532、RB533、 RB534、RB535、RB536、RB537、RB538、RB540、RB541、RB542、RB546、RB547、RB548、RB549、 RB550、RB551、RB552、RB553、RB554、RB555、RB556、RB560、RB561、RB566、RB567、RB569、 RB570、RB571。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體的分離的核酸序列包含一個(gè)或多個(gè)核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸、或核糖核苷酸與脫氧核糖核苷酸的混合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸GPVI配體序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸是經(jīng)修飾的。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸包含在2’羥基位置上的修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾選自2 ’ -0-甲基和2 ’ -氟代。在又一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸是2 ’ -0-甲基胞嘧啶、2’ -0-甲基尿苷、2’ -0-甲基腺苷或2’ -0-甲基鳥苷。在再一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸是2’氟胞苷或2’氟尿苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，包含修飾的一個(gè)或多個(gè)核苷酸選自5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤(Xantine)、4-乙?；奏?、5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基-0-甲基硫代尿苷、5-羧基甲基氨基-0-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辮苷(queosine)、肌苷、Ν6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、 N6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基-0-甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-0-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-甲硫基-Ν6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸(ν)、butoxosine、假尿嘧啶、辮苷、 2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧基丙基) 尿苷、(acp3U)和2，6_ 二氨基嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的糖部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的磷酸主鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸GPVI配體序列在其3’端包含反向胸腺嘧啶。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體包含間隔基(spacer)。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 間隔基是二醇間隔基。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體的第2環(huán)包含二醇間隔基。在又一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體的第2環(huán)由二醇間隔基組成。在再一個(gè)實(shí)施方案中，二醇間隔基由9-0-二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1-[(2_氰基乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺的摻入提供。在又一個(gè)實(shí)施方案中，二醇間隔基連接在分離的核苷酸GPVI配體序列的第一內(nèi)部核苷酸的3’端并連接在分離的核苷酸GPVI配體序列的與第1內(nèi)部核苷酸相鄰的第2內(nèi)部核苷酸的5’端。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體包含脂族氨基接頭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，月旨族氨基接頭連接在分離的核酸GPVI配體序列的5 ’端。在又一個(gè)實(shí)施方案中，脂族氨基接頭連接在分離的核酸GPVI配體序列的3 ’端。在再一個(gè)實(shí)施方案中，脂族氨基接頭通過6-(三氟乙酰氨基)己醇(2-氰基乙基-N，N-二異丙基)亞磷酰胺的摻入提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，分離的核酸GPVI配體與至少一個(gè)親水性部分連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)親水性部分是聚亞烷基二醇。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體包含與分離的核酸序列的5’端和/或3’端連接的聚亞烷基部分。在另一個(gè)實(shí)施方案中，聚亞烷基部分通過接頭而連接。在又一個(gè)實(shí)施方案中，接頭是脂族氨基接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用六碳氨基接頭，將GPVI配體與40KD聚乙二醇(PEG)部分連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，六碳氨基接頭是通過酰胺連接而與PEG部分連接。在又一個(gè)實(shí)施方案中，PEG部分是與一個(gè)或多個(gè)氨基酸例如賴氨酸連接的2個(gè)20 KD的PEG部分，其通過酰胺鍵與六碳氨基接頭連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，第1核酸GPVI配體包含硫代磷酸酯鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體與GPVI (SEQ ID NO 1)特異性結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體與GPVI的胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 2)特異性結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體的解離常數(shù)為約20納摩爾濃度(nM)或更小。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體的解離常數(shù)范圍為約400皮摩爾濃度(pM)至約 ΙΟηΜ。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體的解離常數(shù)范圍為約IOOpM至約ΙΟηΜ。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體抑制GPVI與膠原結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 核酸GPVI配體通過GPVI抑制胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用GPVI配體通過 GPVI對(duì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制包括減少肌醇三磷酸的產(chǎn)生或抑制胞內(nèi)鈣水平的波動(dòng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體抑制GPVI與膠原相關(guān)肽(CRP)和/或與 convulxin 結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體抑制GPVI與膠原和CRP 二者結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體抑制GPVI與膠原結(jié)合，但不抑制GPVI與CRP結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體抑制GPVI與膠原和CRP 二者結(jié)合，但不抑制GPVI 與 convulxin 結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體與GPVI的結(jié)合使GPVI的活性構(gòu)象穩(wěn)定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體與GPVI的結(jié)合使GPVI的失活構(gòu)象穩(wěn)定。在又一個(gè)實(shí)施方案中，核酸GPVI配體與GPVI的結(jié)合抑制GPVI與FcR γ亞基間的相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體與GPVI的結(jié)合導(dǎo)致GPVI活性受抑制或降低。在又一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體與GPVI的結(jié)合導(dǎo)致GPVI不能與FcR γ-鏈相互作用或與 FcR γ -鏈相互作用能力下降。在再一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體與血小板表面上表達(dá)的GPVI 的結(jié)合導(dǎo)致血小板粘附受抑制或降低。在再一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體與血小板表面上表達(dá)的GPVI的結(jié)合導(dǎo)致血小板激活受抑制或降低。在再一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體與血小板表面上表達(dá)的GPVI的結(jié)合導(dǎo)致血小板聚集受抑制或降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體與多種GPVI結(jié)合并降低或抑制其功能，其中所述 GPVI 變體與 SEQ ID NO :1 具有至少 80%、85%、90%、91%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI配體對(duì)GPVI的解離常數(shù)(“K/’)小于約100微摩爾濃度 (μ Μ)、小于約1 μ Μ、小于約500納摩爾濃度(nM)、小于約ΙΟΟηΜ、小于約50nM、小于約InM、 小于約500皮摩爾濃度(pM)、小于約300pM、小于約250pM或小于約200pM。第二方面，提供GPVI配體的調(diào)節(jié)劑，其中所述調(diào)節(jié)劑部分地或完全地逆轉(zhuǎn)GPVI配體的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包含分離的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包括DNA序列、RNA序列、多肽序列或其任何組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI核酸配體調(diào)節(jié)劑選自核酶、DNA酶、肽核酸(PNA)、嗎啉代核酸(MNA)和鎖定核酸(LNA)。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPVI核酸配體調(diào)節(jié)劑選自核酶、DNA酶、肽核酸(PNA)、嗎啉代核酸(MNA)和鎖定核酸(LNA)，其中所述調(diào)節(jié)劑與至少部分的GPVI核酸配體特異性結(jié)合或與之相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑選自核酸結(jié)合蛋白或肽、小分子、寡糖、核酸結(jié)合脂質(zhì)、聚合物、納米粒和微球體，其中所述調(diào)節(jié)劑與至少部分的GPVI核酸配體結(jié)合或與之相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是包含脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、或脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的混合物的核酸調(diào)節(jié)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核酸調(diào)節(jié)劑包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的脫氧核糖核苷酸和/或至少一個(gè)經(jīng)修飾的核糖核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是與至少部分的GPVI核酸配體互補(bǔ)的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是與GPVI配體中的至少部分的環(huán)互補(bǔ)的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是與核酸GPVI配體的至少第1環(huán)、第2莖和第2環(huán)互補(bǔ)的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是與GPVI配體的第3環(huán)、第3莖、第4環(huán)和第1莖互補(bǔ)的寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包含分離的核酸序列，其中所述序列的長度為約IOnt 至約30nt、約IOnt至約25nt、約IOnt至約20nt、約IOnt至約15nt或約15nt至約20nt。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸調(diào)節(jié)劑序列的一個(gè)或多個(gè)核苷酸是經(jīng)修飾的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸包含在2’羥基位置上的修飾。在另一個(gè)實(shí)施方案中，修飾選自2’-0_甲基和2’-氟代。在又一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸是2’-0_甲基胞嘧啶、2’ -0-甲基尿苷、2’ -0-甲基腺苷、2’ -0-甲基鳥苷或2’ -0-甲基胸苷。在再一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸是2’氟胞苷、2’氟尿苷、2’氟腺苷或2’ -氟鳥苷。在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸調(diào)節(jié)劑的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的修飾包括選自以下的修飾5-氟尿嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、 5_(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基-0-甲基硫代尿苷、5-羧基甲基氨基-0-甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β -D-半乳糖基辮苷、肌苷、Ν6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2，2-二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、6-甲基胞嘧啶、 Ν6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基-0-甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基-0-甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、5-甲氧基胞嘧啶、2-甲硫基-Ν6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸(ν)、butoxosine、假尿嘧啶、辮苷、 2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧基丙基) 尿苷(acp3U)和2，6_ 二氨基嘌呤。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的糖部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的磷酸主鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包含在生理?xiàng)l件下與GPVI配體的第4環(huán)雜交的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸調(diào)節(jié)劑包含序列3’ -AUU-5’。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包含在生理?xiàng)l件下與GPVI配體的第1環(huán)雜交的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸調(diào)節(jié)劑包含序列3’ CUG-5’。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包含選自SEQ ID NO :74_88的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑選自 RB416、RB417、RB418、RB419、RB420、RB421、RB422、RB423、RB513、RB514、 RB515、RB516、RB543、RB544 和 RB545。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑破壞核酸GPVI配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑使GPVI配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑破壞核酸GPVI配體的三級(jí)結(jié)構(gòu)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑使GPVI配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑與GPVI配體的結(jié)合，暴露了 GPVI配體內(nèi)的自殺位置 (suicide position)，因而破壞了 GPVI配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)并導(dǎo)致核酸GPVI配體被核酸酶的破壞增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑與GPVI配體-GPVI復(fù)合物的結(jié)合，降低或消除了 GPVI 配體與GPVI的結(jié)合。另一方面，提供調(diào)節(jié)GPVI配體活性的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供調(diào)節(jié)核酸配體對(duì)GPVI的活性的方法，即通過將GPVI配體調(diào)節(jié)劑給予已被給予核酸GPVI配體的宿主。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑可以是寡核苷酸調(diào)節(jié)劑或其衍生物，而在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑與部分的核酸GPVI配體互補(bǔ)。又一方面，提供了使用GPVI配體來調(diào)節(jié)GPVI功能的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于調(diào)節(jié)GPVI功能的方法包括給予宿主治療有效量的GPVI 配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括將GPVI配體調(diào)節(jié)劑給予宿主。另一方面，提供治療或改善血小板介導(dǎo)的疾病或病癥的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括給予有需要的宿主治療有效劑量的與GPVI結(jié)合的GPVI配體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主是經(jīng)診斷患有高危糖尿病。在再一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主是經(jīng)診斷患有轉(zhuǎn)移高危癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，血小板介導(dǎo)的疾病或病癥選自腦血管疾病、急性冠狀動(dòng)脈綜合征、糖尿病相關(guān)疾病、自身免疫炎性疾病和癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述腦血管疾病是血栓形成、血栓栓塞或短暫性缺血發(fā)作 (TIA)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，急性冠狀動(dòng)脈綜合征是因?yàn)楣跔顒?dòng)脈血栓形成、不穩(wěn)定型心絞痛或心肌梗死。在再一個(gè)實(shí)施方案中，糖尿病相關(guān)疾病是糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性發(fā)作、外周血管病、急性腎損傷或慢性腎衰竭。在另一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫炎性疾病是硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或選自銀屑病性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和強(qiáng)直性脊柱炎的炎性自身免疫病。在一個(gè)實(shí)施方案中，癌癥選自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、腦癌、骨癌和肝癌。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予GPVI配體是通過胃腸外給予、靜脈內(nèi)注射、皮內(nèi)遞送、 關(guān)節(jié)內(nèi)遞送、滑液內(nèi)遞送、鞘內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)遞送、心內(nèi)遞送、肌內(nèi)遞送、皮下遞送、眼眶內(nèi)遞送、 囊內(nèi)遞送、脊柱內(nèi)遞送、胸骨內(nèi)遞送、局部遞送、透皮糊劑遞送、直腸遞送、借助陰道或尿道栓劑遞送、腹膜遞送、經(jīng)皮遞送、借助鼻腔噴霧遞送、借助手術(shù)植入遞送、借助內(nèi)用外科涂劑 (internal surgical paint)遞送、借助輸注泵遞送或借助導(dǎo)管遞送。另一方面，提供通過給予GPVI配體治療有需要的宿主的方法，其中GPVI配體調(diào)節(jié)血小板功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，給予治療有效劑量的GPVI。在一個(gè)實(shí)施方案中，治療有效劑量降低或抑制血小板粘附和/或聚集。一方面，提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的與GPVI結(jié)合的核酸GPVI配體。一方面，提供一種藥物組合物，其包含治療有效量的調(diào)節(jié)劑，其中調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)與GPVI結(jié)合的核酸GPVI配體的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物包含GPVI配體和藥學(xué)上可接受的賦形劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是適于靜脈內(nèi)注射的液體。在又一個(gè)實(shí)施方案中，藥物組合物是適于皮下注射的液體或分散體。一方面，提供一種藥盒，其包含治療有效量的GPVI核酸配體和/或調(diào)節(jié)GPVI核酸配體的活性的調(diào)節(jié)劑。附圖簡(jiǎn)述

圖1是SELEX核酸配體選擇方法圖。圖2顯示用于進(jìn)行SELEX循環(huán)以鑒定針對(duì)GPVI的核酸配體的選擇條件。圖3顯示富含針對(duì)GPVI的核酸配體的痕量32P末端標(biāo)記的文庫的結(jié)合曲線。圖4A-B顯示在“E/F”選擇系列中在10輪選擇后的各克隆和在“E2”選擇系列中在10輪選擇后的各克隆的經(jīng)鑒定的第一隨機(jī)區(qū)(primary random region)衍生序列。圖5顯示在選擇過程中鑒定的序列的GPVI結(jié)合所需的最小預(yù)測(cè)基本序列 (primary sequence)和預(yù)測(cè)保守二級(jí)結(jié)構(gòu)。“L”是指環(huán)，“S”是指莖區(qū)。圖6是EF-3 GPVI配體與GPVI的結(jié)合圖，將3’引物退火到EF-3從而在蛋白相互作用期間掩蔽EF-3的3’固定區(qū)或不退火。圖7是比較GPVI的截短配體與原始GPVI配體EF-2和EF-3的結(jié)合曲線圖。圖8顯示若干截短的EF-3和EF-31 GPVI配體截短變體的序列和預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)。圖9顯示截短序列EF-3 T2和EF-2 T2 GPVI配體的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)和失活點(diǎn)突變的位置。圖10顯示GPVI核酸配體變體的GPVI結(jié)合測(cè)定結(jié)果。圖11顯示不同GPVI核酸配體的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)和糖取代。圖12顯示GPVI核酸配體變體的GPVI結(jié)合測(cè)定結(jié)果。圖13A-B顯示六甘醇間隔基亞磷酰胺和間隔基亞磷酰胺摻入到核酸序列的兩個(gè)核苷酸之間。圖14A-B顯示可通過接頭與GPVI配體綴合的PEG部分和綴合部分的構(gòu)型。圖15是比較EF-2和EF-3的GPVI配體截短變體與含有失活點(diǎn)突變的變體的膠原誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的百分率來表示。圖16是不同濃度的選擇GPVI核酸配體的膠原誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的百分率來表示。圖17顯示不同濃度的選擇GPVI核酸配體的CRP誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的
百分率來表示。圖18顯示不同濃度的選擇GPVI核酸配體的膠原誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的
百分率來表示。圖19顯示不同濃度的選擇GPVI核酸配體的CRP誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的
百分率來表示。圖20顯示在富含血小板的血漿中，不同濃度的GPVI配體RB571下的膠原和CRP 誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的百分率來表示。圖21是GPVI核酸配體在暴露給流動(dòng)的全血的膠原包被表面上對(duì)血小板積累的影響的圖，以失活對(duì)照配體的最大響應(yīng)％來表示。圖22顯示表明GPVI配體RB571對(duì)GPVI的結(jié)合特異性與血小板受體P2Y:、P2Y12 和PAR-I相比較的圖。圖23顯示表明GPVI配體RB571對(duì)GPVI的結(jié)合特異性與血小板受體GPlb α -vffF 相互作用或血小板血栓烷A2受體相比較的圖。圖M顯示截短序列GPVI配體EF2-T2和EF3-T2的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)以及配體與GPVI 配體調(diào)節(jié)劑RB416-423之間的互補(bǔ)性區(qū)域。圖25顯示GPVI配體EF2-T2單用或與不同濃度的不同GPVI配體調(diào)節(jié)劑聯(lián)用的膠原誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的百分率來表示。圖沈顯示GPVI配體EF3-T2單用或與不同濃度的不同GPVI配體調(diào)節(jié)劑聯(lián)用的膠原誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的百分率來表示。圖27顯示GPVI配體RB490單用或與不同濃度的不同GPVI配體調(diào)節(jié)劑聯(lián)用的膠原誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的百分率來表示。圖28顯示表明用GPVI配體調(diào)節(jié)劑RB515對(duì)GPVI核酸配體RB490的抗GPVI活性的逆轉(zhuǎn)持久性的圖。圖四顯示GPVI配體RB571的預(yù)測(cè)二級(jí)結(jié)構(gòu)及其與GPVI配體調(diào)節(jié)劑RB515的預(yù)
測(cè)相互作用。圖30顯示GPVI配體RB571單用或與不同濃度的GPVI配體調(diào)節(jié)劑RB515聯(lián)用的膠原誘導(dǎo)的和CRP誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的百分率來表示。圖31顯示在富含血小板的血漿中，GPVI配體RB571單用或與GPVI配體調(diào)節(jié)劑 RB515聯(lián)用的膠原誘導(dǎo)的和CRP誘導(dǎo)的血小板聚集圖，以對(duì)照的百分率來表示。發(fā)明詳述本發(fā)明提供與血小板膜糖蛋白VI(GPVI)結(jié)合的核酸配體的藥物組合物、配體調(diào)節(jié)劑和將其用于治療血小板介導(dǎo)的疾病和病癥的方法。還提供包含GPVI核酸配體和/或 GPVI配體調(diào)節(jié)劑的藥物制劑。A.定義本文所用的術(shù)語“約”當(dāng)用于可測(cè)值例如重量、時(shí)間、劑量等的量時(shí)，是指包括指定量的士20%或士 10%、士5%、士或士0. 的變異，因?yàn)檫@樣的變異適于進(jìn)行所公開的方法。“核酸配體”在本文中也稱為“配體”或“適配體”，是可形成三級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸，這可允許它與靶分子相互作用。“GPVI核酸配體”或“GPVI配體”或“抗GPVI配體”或“核酸 GPVI配體”是指與GPVI特異性結(jié)合的配體或適配體。這些術(shù)語是指具有在生理環(huán)境中能與預(yù)期靶分子形成復(fù)合物的特異性結(jié)合區(qū)的寡核苷酸。配體與靶分子結(jié)合的親和力是根據(jù)配體與靶分子間相互作用的解離常數(shù)(Kd)來定義的。通常，配體對(duì)其靶標(biāo)的Kd介于約InM 至約IOOnM之間。結(jié)合特異性按照配體對(duì)靶標(biāo)的比較解離常數(shù)相對(duì)于配體與環(huán)境中的其它材料或?qū)ζ胀ǖ臒o關(guān)分子的解離常數(shù)來定義。通常，配體對(duì)靶標(biāo)的Kd與對(duì)環(huán)境中的無關(guān)材料或伴隨材料的Kd相比減小10倍、50倍、100倍或200倍?！芭潴w調(diào)節(jié)劑對(duì)”或“配體調(diào)節(jié)劑對(duì)”是指包括靶分子的指定配體和能改變配體的二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)而使配體與其靶標(biāo)間的相互作用被調(diào)節(jié)的配體調(diào)節(jié)劑。調(diào)節(jié)劑可以是與部分的配體互補(bǔ)的寡核苷酸。在生理?xiàng)l件下調(diào)節(jié)劑可改變配體構(gòu)象，以使配體的靶結(jié)合能力降低 10%至 100%,20%M 100%、25%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或 100%，或 10%至100%范圍內(nèi)的任何百分率。“調(diào)節(jié)劑(mudulator) ”、“解毒劑(antidote) ”、“調(diào)節(jié)劑(regulator) ”或“控制劑 (control agent) ”是指可與本文所述的配體或適配體結(jié)合并以所需方式改變?cè)撆潴w與其靶分子間相互作用(例如通過改變配體結(jié)構(gòu))的任何藥學(xué)上可接受的物質(zhì)。本文所用的術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指活性降低、增加或某些其它可測(cè)量的變化。本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指經(jīng)聯(lián)邦或州政府管理部門批準(zhǔn)的或列于美國藥典或其它公知的藥典中用于人類的。藥物有效劑量是預(yù)防、抑制發(fā)病或治療疾病狀態(tài)(在某種程度上減輕癥狀)所需的劑量。藥物有效劑量取決于疾病類型、所用組合物、給藥途徑、所治療哺乳動(dòng)物的類型、 所考慮的指定哺乳動(dòng)物身體特點(diǎn)、同時(shí)使用的藥物和藥學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)了解的其它因素。通常，按照核酸配體和調(diào)節(jié)劑的效能給予0. lmg/kg至100mg/kg體重/天的活性成分的量。“穩(wěn)定的核酸分子”是指與未穩(wěn)定的核酸分子相比，在體內(nèi)更不容易降解(例如通過外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶)的核酸分子。穩(wěn)定可由長度和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或寡核苷酸主鏈的磷酸部分的糖中所含化學(xué)取代決定?？赏ㄟ^控制例如可使分子穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)而達(dá)到穩(wěn)定。例如，如果核酸分子的3'端與上游區(qū)互補(bǔ)，該部分就可以向回折疊并形成可使分子穩(wěn)定的“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)。術(shù)語“結(jié)合親和力”和“結(jié)合活性”是指配體分子與靶標(biāo)結(jié)合與否的趨勢(shì)。所述相互作用的能量學(xué)在“結(jié)合活性”和“結(jié)合親和力”中是重要的，因?yàn)樗鼈兿薅讼嗷プ饔冒閭H的必要濃度、這些伴侶能締合的速率、以及溶液中結(jié)合分子和游離分子的相對(duì)濃度。能量學(xué)可尤其通過測(cè)定解離常數(shù)Kd表征。本文所用的術(shù)語“治療”是指對(duì)哺乳動(dòng)物疾病的任何治療，包括(a)針對(duì)疾病的保護(hù)作用，也就是說，使臨床癥狀不發(fā)展；(b)抑制疾病，也就是說，終止、改善、減少或抑制臨床癥狀的發(fā)展；和/或(c)減輕疾病，也就是說，使臨床癥狀消退。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解在人用藥物中，并非總能區(qū)分“預(yù)防”和“抑制”，因?yàn)橹钡绞录l(fā)生良久之后，最終誘導(dǎo)的事件也可能是未知的、潛伏的，或患者不可查明。因此，本文所用的術(shù)語“預(yù)防”旨在作為 “治療”的要素，包括“預(yù)防”和“抑制”，如本文所定義。本文所用的術(shù)語“保護(hù)”是指包括 “預(yù)防”。術(shù)語“有效量”是指足以對(duì)待治療病癥或疾病狀態(tài)提供治療的劑量。這會(huì)因患者、 疾病和待進(jìn)行的治療而異。本文所用的術(shù)語GPVI核酸配體“變體”包括能行使與GPVI核酸配體基本相同功能并包含基本相同結(jié)構(gòu)的變體。B.糖蛋白 VI糖蛋白VI(GPVI)在血小板細(xì)胞表面上特異性表達(dá)。大量研究表明，膠原介導(dǎo)的 GPVI的激活在血小板粘附和聚集中起到關(guān)鍵作用。因此，GPVI是令人日益關(guān)注的用于治療血小板和膠原介導(dǎo)的疾病的治療靶標(biāo)。因?yàn)樯碇寡c病理血栓形成間的邊界非常窄，所以對(duì)于膠原介導(dǎo)的GPVI激活
13而言能夠提供對(duì)血小板活性的良好控制是必要的。因此，本文也提供能夠調(diào)節(jié)或調(diào)整所公開的GPVI配體的活性的調(diào)節(jié)劑成分。GPVI是長度為339個(gè)氨基酸殘基的糖蛋白(GenBank檢索號(hào)Q9HCN6 ；在本文中公開為SEQ ID NO :1)。氨基酸殘基1-20代表信號(hào)序列，其被切割而產(chǎn)生具有319個(gè)氨基酸的成熟蛋白。GPVI具有2個(gè)胞外免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域、粘蛋白樣核心、短肽接頭序列、跨膜結(jié)構(gòu)域和與Fyn和Lyn Src家族激酶結(jié)合的短胞質(zhì)尾。也可將GPVI與FcR γ -鏈組成型地復(fù)合，允許裝配和激活Syk并啟動(dòng)與免疫受體所用的途徑具有許多相似性的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活。在人類染色體19上的白細(xì)胞受體簇(LRC)中發(fā)現(xiàn)編碼GPVI的基因。沒有GPVI 或FcR Y-鏈的小鼠具有明顯受損的針對(duì)膠原的血小板響應(yīng)并降低血栓形成。另外，新的單克隆抗人GPVI抗體的Fab片段0Μ4在大鼠血栓形成模型中體內(nèi)抑制血栓形成，在用GP Ilb/IIIa抗體時(shí)可見出血時(shí)間沒有延長。已經(jīng)知道GPVI胞外結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO 2)與膠原I-IV型特異性結(jié)合(Jung等， Platelets, 2008,19 :32-42)。此外，已知膠原I-IV型支持血小板激活、聚集和粘附，而非纖維狀膠原VI、VII和VIII型則僅導(dǎo)致微弱粘附，卻不導(dǎo)致血小板聚集。因此，進(jìn)行研究以鑒定與GPVI胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的GPVI配體，以產(chǎn)生可用于治療血小板介導(dǎo)的病癥或疾病的藥物制劑。C.針對(duì)GPVI的核酸配體的開發(fā)使用SELEX方法，鑒定與GPVI蛋白特異性結(jié)合的核酸配體。再對(duì)最初通過SELEX 獲得的配體進(jìn)行充分表征，以了解GPVI配體的特性。這樣的表征包括測(cè)序、測(cè)定保守序列的序列比對(duì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)、以及鑒定對(duì)特異性結(jié)合和抑制GPVI所需功能最重要的配體區(qū)的截短和突變分析。在鑒定最佳配體序列和二級(jí)結(jié)構(gòu)之后，進(jìn)行修飾以優(yōu)化配體，用于藥物用途。這些修飾的實(shí)例包括PEG化、在核酸配體內(nèi)使用間隔基以及對(duì)核酸配體的糖和磷酸部分的所選修飾。進(jìn)行結(jié)合測(cè)定，以監(jiān)測(cè)所用不同修飾所導(dǎo)致的配體功能。SELEX是指通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化。該方法允許與靶分子高度特異性結(jié)合的核酸分子的體外進(jìn)化。該SELEX方法描述于例如美國專利號(hào)7，087，735,5, 475，096和 5，270，163 (亦見 WO 91/19813)。SELEX方法包括從候選寡核苷酸混合物中選擇并且使用同樣的通用選擇方案，逐步重復(fù)結(jié)合、區(qū)分和擴(kuò)增，從而真正達(dá)到任何所需的結(jié)合親和力和選擇性的標(biāo)準(zhǔn)。從核酸混合物例如包含隨機(jī)化序列區(qū)段的混合物開始，SELEX方法包括以下步驟在利于結(jié)合的條件下使混合物與靶標(biāo)接觸，將已與靶分子特異性結(jié)合的那些核酸與未結(jié)合核酸區(qū)分開，使核酸靶標(biāo)復(fù)合物解離，將從核酸靶標(biāo)復(fù)合物中解離出的核酸擴(kuò)增以得到配體富集的核酸混合物，再通過所需要的多輪循環(huán)重復(fù)結(jié)合、區(qū)分、解離和擴(kuò)增的步驟以便得到對(duì)靶分子具有高特異性、高親和力的配體。已經(jīng)對(duì)基本SELEX方法進(jìn)行改良，以達(dá)到各種特定目的。例如，美國專利號(hào) 5，707，796描述了使用SELEX以及凝膠電泳，以選擇具有特定結(jié)構(gòu)特征的核酸分子，例如彎曲DNA。美國專利號(hào)5，763，177描述了基于SELEX的方法，用于選擇含有光反應(yīng)性基團(tuán)并能與靶分子結(jié)合和/或與之光交聯(lián)和/或?qū)⑵涔饧せ畹呐潴w。美國專利號(hào)5，580，737描述了鑒定能區(qū)分密切相關(guān)分子的高度特異性配體的方法，稱為反向SELEX(Coimter-SELEX)。 美國專利號(hào)5，567，588和5，861，254描述了基于SELEX的方法，所述方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)靶分子具有高親和力和低親和力的寡核苷酸的高效區(qū)分。美國專利號(hào)5，496，938描述了在進(jìn)行 SELEX方法之后獲得改善的配體的方法。美國專利號(hào)5，705，337描述了使配體與其靶標(biāo)共價(jià)交聯(lián)的方法。美國專利號(hào)5，648，214證明了在溶液中鑒定針對(duì)小肽的核酸配體的可行性。美國專利號(hào)5，780，228舉例說明了使用配體親和洗脫而產(chǎn)生靶向靶分子上的特定位點(diǎn)的配體的能力，其涉及結(jié)合某些凝集素的高親和力配體的產(chǎn)生。制備針對(duì)某些組織(其包括多類細(xì)胞類型)的核酸配體的方法描述于美國專利號(hào)6，127，119。針對(duì)小牛腸磷酸酶的某些經(jīng)修飾的高親和力配體的制備描述于美國專利號(hào)6，673，553。美國專利號(hào)6，716，580描述了鑒定核酸配體的自動(dòng)化方法，其包括使用機(jī)器人操作器。按照其最基本形式，SELEX方法可定義為以下一系列步驟1)制備不同序列的候選核酸混合物。候選混合物通常包含固定序列區(qū)(即候選混合物的每個(gè)成員在相同位置中含有相同序列)和隨機(jī)序列區(qū)。選擇固定序列區(qū)是為了 (a) 有助于下述擴(kuò)增步驟，(b)模擬已知與靶標(biāo)結(jié)合的序列，或(C)在候選混合物中提高核酸的給定結(jié)構(gòu)排列的濃度。隨機(jī)序列可以是完全隨機(jī)(即在任何位置找到堿基的概率是1/4)或僅部分隨機(jī)(例如在任何位置找到堿基的概率可選擇在介于0至100%之間的任何水平)。2)在利于靶標(biāo)與候選混合物成員結(jié)合的條件下，使候選混合物與所選靶標(biāo)接觸。 在這些情況下，靶標(biāo)與候選混合物核酸間的相互作用可視為在靶標(biāo)與對(duì)靶標(biāo)具有最強(qiáng)親和力的那些核酸之間形成核酸-靶標(biāo)復(fù)合物。3)將對(duì)靶標(biāo)具有最高親和力的核酸與對(duì)靶標(biāo)具有較低親和力的那些核酸區(qū)分開。 因?yàn)閮H有對(duì)應(yīng)于最高親和力核酸的極少量序列(且可能僅一分子核酸)存在于候選混合物中，所以通常需要設(shè)定區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)，使得在區(qū)分期間在候選混合物中保留顯著量的核酸(大約 5-50% )。4)再對(duì)區(qū)分期間所選的對(duì)靶標(biāo)具有相對(duì)高親和力的那些核酸進(jìn)行擴(kuò)增，以產(chǎn)生新的候選混合物，其中富集了對(duì)靶標(biāo)具有相對(duì)高親和力的核酸。5)通過重復(fù)以上區(qū)分和擴(kuò)增步驟，新形成的候選混合物含有越來越少的弱結(jié)合序列，核酸對(duì)靶標(biāo)的親和力的平均程度通常將會(huì)上升。直到最后，SELEX方法將會(huì)從原始候選混合物中得到含有代表那些核酸序列的一個(gè)或少量獨(dú)特核酸(其折疊成使能與靶分子具有最高親和力相互作用的特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu))的候選混合物。SELEX可用于產(chǎn)生二價(jià)結(jié)合，其具有對(duì)蛋白(包括受體)的兩個(gè)或更多表位具有親和力的兩個(gè)或更多結(jié)合結(jié)構(gòu)域。具體地講，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可用于選擇對(duì)GPVI 受體的兩個(gè)或更多區(qū)具有親和力的核酸配體。例如，在某些實(shí)施方案中，配體可與C2區(qū)的至少兩個(gè)部分結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，配體通過破壞二聚體構(gòu)象或使其穩(wěn)定而影響GPVI 受體的二聚化。在這些實(shí)施方案中，可將調(diào)節(jié)劑設(shè)計(jì)為與核酸配體所能結(jié)合的僅一個(gè)表位結(jié)合、與不止一個(gè)表位結(jié)合或與所有表位都結(jié)合。調(diào)節(jié)劑可以例如干擾與僅一個(gè)表位(例如受體的C2-1或C2-2區(qū))的結(jié)合?？墒褂美缑绹鴮＠?hào)7，087，735所述的SELEX方法，通過針對(duì)代表分子的胞外結(jié)構(gòu)域的短肽進(jìn)行SELEX，而產(chǎn)生對(duì)GPVI具有特異性的核酸配體。備選地，使用例如美國專利號(hào)6，730，482所述的SELEX方法，可通過在完整血小板上、在富集所述蛋白的血小板膜部分上、在純化的GPVI上或在特異性過量表達(dá)GPVI受體的細(xì)胞系上進(jìn)行SELEX，分離對(duì)GPVI具有特異性的核酸配體。另外，可使用競(jìng)爭(zhēng)親和洗脫方案，例如美國專利號(hào)5，780，2 所描述的那些，將 SELEX方法用于分離特異性GPVI核酸配體。例如，為了分離對(duì)GPVI具有特異性的核酸配體，可通過加入足量的GPVI活化劑或結(jié)合劑(例如膠原、convulxin或CRP或相關(guān)化合物)， 而進(jìn)行與該蛋白結(jié)合的配體的洗脫。GPVI受體可以是用于SELEX方法的重組表達(dá)的和純化的蛋白。在某些實(shí)施方案中，GPVI核酸配體在生理?xiàng)l件下與GPVI受體結(jié)合。生理?xiàng)l件通常涉及溶液的鹽和pH水平。 在體外，生理?xiàng)l件通常可在包含150mM NaCl、2mM CaCl2,20mM HEPES，pH約7. 4的緩沖液中再現(xiàn)。在某些實(shí)施方案中，如上所述地使用天然的、通常是未激活的血小板，以篩選核酸配體群體并提供富含有針對(duì)血小板上存在的蛋白質(zhì)的配體的集群體。再針對(duì)過量表達(dá)所需 GPVI受體的穩(wěn)定細(xì)胞系，或已經(jīng)用該蛋白瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，來使用富集群體。二次篩選可如下完成通過使用改良SELEX方法，對(duì)于來自這些細(xì)胞的分離的受體或?qū)τ谕暾?xì)胞，通過配體競(jìng)爭(zhēng)研究或通過鑒定對(duì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的作用。在某些實(shí)施方案中，可使用固定化蛋白來鑒定針對(duì)特異性GPVI靶標(biāo)的核酸配體。 在某些這樣的實(shí)施方案中，可將純化蛋白通過化學(xué)接頭與固體基質(zhì)連接。在其它實(shí)施方案中，可使用去垢劑例如陰離子型去垢劑(例如膽酸鹽)來提取過量表達(dá)特定蛋白的細(xì)胞的膜，以分離與固定化人工膜偶聯(lián)的蛋白和混合物的某部分。通常，認(rèn)為可通過除去去垢劑而完成重新組織，在其間脂質(zhì)和蛋白重新組織并與通常在支持基質(zhì)(例如珠)上的固定化人工膜的烴鏈形成層。可通過篩選核酸配體抑制特定激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板功能和/或由GPVI誘發(fā)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的能力，鑒定由這些SELEX方法所分離的對(duì)GPVI具有特異性的核酸配體 (其也具有所需的功能活性)。因?yàn)樗韬怂崤潴w不僅是結(jié)合伴侶，而且是受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑，所以可以通過評(píng)價(jià)配體對(duì)血小板活性的作用而鑒定具有所需功能的配體。這可包括表征配體對(duì)已知由GPVI調(diào)節(jié)的不同信號(hào)途徑的作用。例如，GPVI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可導(dǎo)致GPVI 蛋白簇集，并導(dǎo)致激酶激活而開始激活磷脂酶C γ 2的事件的局部信號(hào)鏈，釋放使得Ca2+水平升高和蛋白激酶C激活的第二信使1，4，5_肌醇三磷酸和二酰甘油?？墒褂帽绢I(lǐng)域普通技術(shù)人員眾所周知的方法測(cè)定任何這樣的第二信使系統(tǒng)或信號(hào)。另外，可在這些系統(tǒng)中測(cè)定在GPVI核酸配體存在或不存在時(shí)的GPVI的膠原結(jié)合。也可在血小板功能測(cè)定(例如在富含血小板的血漿和洗滌血小板制劑中進(jìn)行的透光聚集度測(cè)定(Light Transmittance Aggregometry)或在全血中進(jìn)行的阻抗聚集度測(cè)定(Impedance Aggregometry))中篩選配體對(duì)血小板聚集的抑制。另外，也可在靜態(tài)條件或在流動(dòng)的全血中篩選配體對(duì)血小板與膠原包被的表面的相互作用的抑制。GPVI的給定核酸配體的特異性可進(jìn)一步通過配體阻斷由給定受體的已知激動(dòng)劑所觸發(fā)的胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件的能力區(qū)別。例如，GPVI核酸配體抑制劑可望阻斷由例如蛇C型凝集素convulxin、膠原或膠原相關(guān)肽(CRP)所觸發(fā)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。GPVI的給定核酸配體的特異性還進(jìn)一步通過在聚集由激活并非GPVI的受體的激動(dòng)劑所觸發(fā)時(shí)不存在對(duì)血小板聚集的作用來區(qū)別。任何上述方法的應(yīng)用，單獨(dú)或聯(lián)用，都將得到多種對(duì)GPVI具有特異性的核酸配體。一旦鑒定了具有所需抑制特性的核酸配體之后，可按照下文所述鑒定該配體的調(diào)節(jié)劑。D. GPVI的核酸配體
本文所公開的GPVI配體優(yōu)選是核酸配體，例如配體。使用在下文和實(shí)施例1中更詳細(xì)描述的SELEX方法，篩選與GPVI胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)(氨基酸殘基Gln21-Lys267 ；SEQ ID NO 2)特異性結(jié)合的GPVI配體，然后將其修飾以增加穩(wěn)定性、對(duì)GPVI的親和力和/或調(diào)節(jié) GPVI活性的能力。本發(fā)明的GPVI核酸配體由分離的核酸序列組成，所述序列可以是DNA或RNA，并且其可以用修飾的核糖核酸或脫氧核糖核酸合成。如本文所述，如果使用RNA的堿基結(jié)構(gòu)， 所述結(jié)構(gòu)在堿基序列中將包含尿苷(U)來替代胸苷(T)。在本文所述的某些實(shí)施方案中， 核酸序列被寫為RNA序列。同樣，在本文所述的某些實(shí)施方案中，其中核酸配體最初被鑒定為DNA分子，核酸序列被寫為DNA序列?？梢岳斫猓鳛镈NA序列以文本形式呈現(xiàn)的核苷酸序列固有地提供相應(yīng)RNA序列的描述，其中DNA序列內(nèi)的胸腺嘧啶⑴被尿苷⑶替換，以得到相應(yīng)的核苷酸RNA序列。同樣，可以理解，作為RNA序列以文本形式呈現(xiàn)的序列固有地提供相應(yīng)DNA序列的描述，其中RNA序列內(nèi)的尿苷⑶被胸腺嘧啶⑴替換，以得到相應(yīng)的 DNA序列。對(duì)通過SELEX方法獲取的若干GPVI核酸配體進(jìn)行測(cè)序并對(duì)其序列進(jìn)行比對(duì)。圖 4所示的序列比對(duì)導(dǎo)致對(duì)通過篩選過程而富集的6個(gè)獨(dú)特序列的鑒定。稱為“A”至“F”的 6個(gè)序列的比對(duì)表明UAA序列的存在。此外，該完全保守序列包含在以下序列之中(G/A) UAA。通過各側(cè)與GC相接的(G/A) UAA序列產(chǎn)生保守GC (G/A) UAAGC序列。然后對(duì)獨(dú)特的GPVI配體進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。二級(jí)結(jié)構(gòu)有助于配體的功能特性。正如技術(shù)人員所充分理解的，可根據(jù)莖和環(huán)結(jié)構(gòu)描述二級(jí)結(jié)構(gòu)，因?yàn)樗鼈冊(cè)诜肿又写嬖谟?’-3’方向上。根據(jù)以下實(shí)施例2所示的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，GPVI E⑶配體具有包含3莖和 4環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。5’ -3’構(gòu)型包括第1莖(莖1或Si)、第1環(huán)(環(huán)1或Li)、與第2和第3 環(huán)(環(huán)3或L3)相連的第2莖(莖2或S2)、第3環(huán)、第3莖(莖3或S3)和第4環(huán)(環(huán)4 或L4)(參見圖8A-8C)。在某些實(shí)施方案中，第2莖與第1、第2和第3環(huán)連接，而第3莖與第3和第4環(huán)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，第3莖在5’-3’方向上鄰近第1莖。序列GC(G/ A) UAAGC構(gòu)成莖3 (GC堿基對(duì))和環(huán)4 ((G/A) UAA)。序列GAC構(gòu)成環(huán)1。由SELEX所鑒定的GPVI配體的突變分析顯示，UA、UU或UG的環(huán)3序列支持配體與 GPVI的高親和力結(jié)合。因此，在某些實(shí)施方案中，GPVI核酸配體的環(huán)3包含序列5’-YD-3’， 其中Y代表嘧啶，D代表U、G或A。在某些實(shí)施方案中，使用技術(shù)人員已知的方法，可用間隔基取代GPVI核酸配體的環(huán)2。間隔基可以是提供類似于環(huán)2結(jié)構(gòu)的非核苷酸間隔基，使得當(dāng)環(huán)2被間隔基取代時(shí)， GPVI配體維持其結(jié)構(gòu)和功能。通過將(9-0-二甲氧基三苯甲基-三甘醇，1-[(2_氰基乙基)-(N，N-二異丙基)]-亞磷酰胺(參見圖13A-13B)摻入到GPVI核酸配體中而達(dá)到用六甘醇間隔基對(duì)環(huán)2進(jìn)行取代，結(jié)果對(duì)GPVI的親和力無損失。因此，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會(huì)理解，可以用各種市售的非核苷酸間隔基取代環(huán)2。所述間隔基的實(shí)例包括但不限于通過將以下化合物摻入到GPVI核酸配體中而得到的那些5’ -0-二甲氧基三苯甲基-1’ 2’ 二脫氧核糖-3’ - [ (2-氰基乙基)-(N, N- 二異丙基)]-亞磷酰胺；18-0- 二甲氧基三苯甲基六甘醇，I"[ (2-氰基乙基)-(N, N- 二異丙基)]-亞磷酰胺；和12- (4，4，- 二甲氧基三苯甲氧基)十二烷基-1- [ (2-氰基乙基)-(N, N- 二異丙基)]-亞磷酰胺。GPVI配體在調(diào)節(jié)GPVI功能或治療血小板介導(dǎo)的疾病中的功效主要取決于配體以足夠的親和力與GPVI蛋白結(jié)合的能力。因此，在通過SELEX方法得到GPVI配體之后，對(duì)每種配體測(cè)序，然后可表征其對(duì)靶分子的結(jié)合。本文的配體與靶標(biāo)(GPVI)的結(jié)合親和力可用 Kd來定義。該解離常數(shù)值可通過眾所周知的方法例如實(shí)施例1所述的放射性配體結(jié)合方法來直接測(cè)定。然而，已經(jīng)觀察到對(duì)于某些小寡核苷酸而言，直接測(cè)定Kd有時(shí)很困難，并且可導(dǎo)致錯(cuò)誤的高結(jié)果。在這樣的情況下，對(duì)于已知與靶標(biāo)或候選物結(jié)合的物質(zhì)而言，可進(jìn)行靶分子或其它候選物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合測(cè)定。在理想條件下發(fā)生50%抑制的濃度值(Ki)就等于 Kdo然而，決不能是Ki小于Kd。因此，備選地，對(duì)Ki的測(cè)定設(shè)定了 Kd值的最大值。在技術(shù)難題阻礙了對(duì)Kd進(jìn)行精確測(cè)定的情況下，可合宜地替換為對(duì)Ki的測(cè)定，以提供Kd的上限。Ki 值也可用于證實(shí)本發(fā)明的配體與靶標(biāo)結(jié)合。在表征GPVI配體結(jié)合特性時(shí)，可用已知的GPVI 結(jié)合分子(例如膠原、CRP(膠原相關(guān)肽)或C0nvuIxin(Cvx))的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合或功能測(cè)定來分析特異性。在某些實(shí)施方案中，配體與GPVI結(jié)合的Kd范圍可為約InM至約ΙΟΟηΜ，約IOnM至約50nM或約20nM至約0. InM。在其它實(shí)施方案中，配體與GPVI結(jié)合的Kd比配體與環(huán)境中的無關(guān)蛋白或其它伴隨材料結(jié)合的Kd小至少2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。無關(guān)蛋白也可以是具有與GPVI中存在的模體相關(guān)的模體的蛋白，例如另一 Ig超家族成員或包含膠原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的另一種蛋白或另一種血小板激活或粘附受體。正如下文將要詳述的那樣，可使用各種各樣的工程方法，對(duì)經(jīng)SELEX方法而獲取并鑒定的配體的結(jié)合活性進(jìn)行進(jìn)一步修飾或增強(qiáng)。在某些實(shí)施方案中，配體與GPVI的胞外結(jié)構(gòu)域相互作用。配體可干擾GPVI受體與膠原結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，配體可通過GPVI受體而抑制胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括降低肌醇三磷酸的產(chǎn)生或降低胞內(nèi)鈣水平的波動(dòng)。配體也可穩(wěn)定或破壞受體構(gòu)象，例如二聚體構(gòu)象，使得受體與膠原或FcR γ相互作用的能力降低。配體可通過膠原或其它GPVI激動(dòng)劑而影響血小板激活。配體也可影響血小板對(duì)膠原或膠原相關(guān)肽的粘附。配體可影響由膠原或其它GPVI激動(dòng)劑誘導(dǎo)的血小板聚集。本文所述的核酸配體可起到活性可逆試劑的作用。它們是這樣的試劑或藥學(xué)活性分子其在給予患者之后可通過給予第二種試劑而受到直接控制。正如下文詳述的那樣，第二種試劑，在本文中稱為調(diào)節(jié)劑，可關(guān)閉或微調(diào)配體的藥理活性。結(jié)果，可通過并非例如藥物清除的方式而逆轉(zhuǎn)配體的藥理活性。E.調(diào)節(jié)劑在某些實(shí)施方案中，GPVI的核酸配體是可逆的。一方面，本發(fā)明通過將GPVI配體的調(diào)節(jié)劑給予已被給予核酸配體的宿主而提供調(diào)節(jié)GPVI的核酸配體的活性的方法。本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑包括可以所需方式與核酸配體結(jié)合并改變?cè)撆潴w與其靶分子間相互作用(例如通過改變核酸配體的結(jié)構(gòu))的任何藥學(xué)上可接受的試劑，或降解、代謝、切割或以其它方式化學(xué)改變核酸配體以改變其生物學(xué)作用的任何藥學(xué)上可接受的試劑。本發(fā)明調(diào)節(jié)劑的實(shí)例包括與至少部分的核酸配體序列互補(bǔ)的寡核苷酸或其類似物(包括核酶或DNA酶)。其它實(shí)例包括肽核酸(PNA)、嗎啉代核酸(MNA)或鎖定核酸(LNA)；核酸結(jié)合蛋白或肽；寡糖；小分子；或基于核酸結(jié)合聚合物、脂質(zhì)、納米?；蛭⑶蝮w的調(diào)節(jié)劑。調(diào)節(jié)劑可經(jīng)設(shè)計(jì)，使其以高度特異性和所需親和力程度與特定核酸配體結(jié)合。調(diào)節(jié)劑也可經(jīng)設(shè)計(jì)，使得一旦結(jié)合后，配體結(jié)構(gòu)被改變?yōu)楦呋蚋突钚孕问?。例如，調(diào)節(jié)劑可經(jīng)設(shè)計(jì)，使得一旦與靶核酸配體結(jié)合后，該配體的二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而配體不再與其靶分子結(jié)合或以較低親和力與其靶分子結(jié)合。備選地，調(diào)節(jié)劑可經(jīng)設(shè)計(jì)，使得一旦結(jié)合后，配體的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以增強(qiáng)配體與其靶分子的親和力。也就是說，調(diào)節(jié)劑可經(jīng)設(shè)計(jì)，使得一旦結(jié)合后，結(jié)構(gòu)模體被修飾，使配體親和力增加。在另一個(gè)實(shí)施方案中，配體/調(diào)節(jié)劑對(duì)經(jīng)設(shè)計(jì)，使調(diào)節(jié)劑與不能與目標(biāo)靶標(biāo)結(jié)合的核酸配體分子的結(jié)合可導(dǎo)致在配體內(nèi)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)模體，從而允許配體與其靶分子結(jié)合。調(diào)節(jié)劑也可經(jīng)設(shè)計(jì)，使其以足夠親和力與特定核酸配體或核酸配體組非特異性結(jié)合而形成復(fù)合物。這樣的調(diào)節(jié)劑通?？赏ㄟ^電荷-電荷相互作用與核酸締合。這樣的調(diào)節(jié)劑也可同時(shí)與不止一個(gè)核酸配體結(jié)合。調(diào)節(jié)劑可經(jīng)設(shè)計(jì)，使得一旦與一種或多種核酸配體結(jié)合后，核酸配體的結(jié)構(gòu)并未與其活性形式有顯著改變，但是，調(diào)節(jié)劑掩蔽或在空間上阻止了核酸配體與其靶分子的締合。核苷酸調(diào)節(jié)劑可以是允許與配體分子有效結(jié)合的任何長度。例如，寡核苷酸調(diào)節(jié)的長度范圍可為約10個(gè)核苷酸(nt)至約30nt、約IOnt至約20nt、或約15nt。核苷酸調(diào)節(jié)劑的長度可以是 8nt、9nt、10nt、lint、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、20nt、 21nt>22nt>23nt>24nt>25n25>26nt>27nt>28nt>29nt 或 30nt。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員也可設(shè)想長度大于30nt的核苷酸調(diào)節(jié)劑。本文所述的核酸配體具有活性三級(jí)結(jié)構(gòu)，其可受合適的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)的形成的影響。因此，盡管互補(bǔ)的本發(fā)明寡核苷酸調(diào)節(jié)劑與核酸配體間雙鏈體的形成機(jī)制類似于兩個(gè)短的線狀寡核糖核苷酸間的雙鏈體的形成，但是分子內(nèi)配體結(jié)構(gòu)可同時(shí)影響到設(shè)計(jì)這樣的相互作用的規(guī)則和所述產(chǎn)物形成的動(dòng)力學(xué)。核酸配體與寡核苷酸調(diào)節(jié)劑間最初堿基對(duì)形成的成核率在最終穩(wěn)定雙鏈體形成中起到重要作用，并且通過將寡核苷酸調(diào)節(jié)劑靶向到核酸配體中存在的單鏈環(huán)和/或單鏈 3'或5'尾極大地提高該步驟的速率。對(duì)于分子間雙鏈體最佳形成的發(fā)生，相對(duì)于靶向核酸配體內(nèi)現(xiàn)有的分子內(nèi)雙鏈體的形成，自由能理想地有利于分子間雙鏈體的形成。本發(fā)明在本文所述的調(diào)節(jié)劑通常是包含與至少部分的靶向核酸配體序列互補(bǔ)的序列的寡核苷酸。例如，調(diào)節(jié)劑寡核苷酸可包含與靶向配體的約6nt至25nt、8nt至20nt 或IOnt至15nt互補(bǔ)的序列。使用本文所述的和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的技術(shù)，考慮到靶向配體和所尋求的效果，可以容易地優(yōu)化調(diào)節(jié)劑寡核苷酸的長度?？梢杂脭y帶D或L立體化學(xué)的核苷酸或其混合物制備寡核苷酸。天然存在的核苷呈D構(gòu)型。盡管本發(fā)明的寡核苷酸調(diào)節(jié)劑包含與至少部分的核酸配體互補(bǔ)的序列，但絕對(duì)互補(bǔ)性并非必需的?！芭c至少部分的核酸配體互補(bǔ)的”序列在本文中是指具有足夠互補(bǔ)性以能與核酸配體雜交的序列。雜交能力可取決于核酸的互補(bǔ)性程度和長度。通常，雜交的寡核苷酸越大，其可含有的與靶配體錯(cuò)配的堿基就約多并且仍能形成穩(wěn)定的雙鏈體(或三鏈體，視情況而定)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過使用測(cè)定雜交復(fù)合物熔點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)程序來確定錯(cuò)配的可容忍程度。本發(fā)明的寡核苷酸可以是單鏈DNA或RNA或嵌合混合物或其衍生物或修飾形式。調(diào)節(jié)劑在核酸主鏈和單個(gè)核酸結(jié)構(gòu)中都可包含修飾。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是與配體中的至少一個(gè)環(huán)區(qū)互補(bǔ)的核酸。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是至少具有在生理?xiàng)l件下與二維結(jié)構(gòu)中的第4環(huán)雜交的序列的寡核苷酸，并且尤其是包含序列3’ -AUU-5’的寡核苷酸。在其它實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是在生理?xiàng)l件下與配體二級(jí)結(jié)構(gòu)中的第1環(huán)雜交的寡核苷酸，并且尤其是至少包含序列3’-CUG-5’的寡核苷酸。根據(jù)調(diào)節(jié)劑的所需功能，可設(shè)計(jì)調(diào)節(jié)劑以破壞或穩(wěn)定核酸配體的二級(jí)和/或三級(jí)結(jié)構(gòu)。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑經(jīng)設(shè)計(jì)與配體上的“自殺位置”結(jié)合并因此破壞配體序列。自殺位置是對(duì)酶促切割敏感的配體的單鏈部分。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，一旦調(diào)節(jié)劑與配體結(jié)合后，自殺位置就變?yōu)閱捂湶⑶也环€(wěn)定，并且可增強(qiáng)由循環(huán)例如血液中的酶或肝臟內(nèi)切核酸酶對(duì)配體的切割。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑與配體結(jié)合，然后配體就不再與其靶標(biāo)相互作用。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑包含選自SEQ ID NO :74-88的核酸序列。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑序列包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。例如，2’-0_甲基和2’-氟代修飾，其可包含2’-0-甲基胞嘧啶、2’-0-甲基尿苷、2’-0-甲基腺苷、2’-0-甲基鳥苷、2’氟胞苷或2’氟尿苷?？墒褂貌煌呗砸詼y(cè)定核酸配體內(nèi)寡核苷酸調(diào)節(jié)劑所結(jié)合的最佳位點(diǎn)?？墒褂靡粋€(gè)經(jīng)驗(yàn)性的策略，其中互補(bǔ)寡核苷酸在核酸配體周圍“步查(walk)”。依照該方法，可使用長度約15個(gè)核苷酸的寡核苷酸(例如2' -0-甲基或2’ -氟寡核苷酸)，其錯(cuò)開配體上的約5個(gè)核苷酸(例如與配體的1-15、6-20、11-25等互補(bǔ)的寡核苷酸)。經(jīng)驗(yàn)性的策略特別有效，因?yàn)楹怂崤潴w三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)雜交效率的影響可能難以預(yù)測(cè)。在以下實(shí)施例中描述的測(cè)定可用于評(píng)價(jià)不同寡核苷酸與特異性核酸配體雜交的能力，尤其強(qiáng)調(diào)要達(dá)到與核酸配體完全結(jié)合，需要寡核苷酸摩爾過量。也可通過進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)力學(xué)研究，使用例如BIAC0RE測(cè)定，來確定不同寡核苷酸調(diào)節(jié)劑提高核酸配體與其靶分子的解離速率或配體與其靶分子的締合速率的能力?？蛇x擇寡核苷酸調(diào)節(jié)劑，使得需要5-50 倍摩爾過量的寡核苷酸或更少，以便以所需方式修飾配體與其靶分子間的相互作用。備選地，靶向核酸配體可經(jīng)修飾，使其包含單鏈尾(3'或5')，以促進(jìn)與寡核苷酸調(diào)節(jié)劑的締合。合適的尾可包含1-20個(gè)核苷酸、1-10個(gè)核苷酸、1-5個(gè)核苷酸或3-5個(gè)核苷酸。尾也可經(jīng)修飾(例如2’ -0-甲基和2’ -氟代修飾，其可包含2’ -0-甲基胞嘧啶、 2’ -0-甲基尿苷、2’ -0-甲基腺苷、2’ -0-甲基鳥苷、2’氟胞苷或2’氟尿苷)?？稍诮Y(jié)合和生物測(cè)定(例如以下實(shí)施例所述)中測(cè)試加尾配體，以證實(shí)單鏈尾的加入未破壞核酸配體的活性結(jié)構(gòu)?？稍O(shè)計(jì)出可與尾序列形成例如1、2、3、4或5堿基對(duì)的一系列寡核苷酸(例如2' -0-甲基寡核苷酸)并測(cè)試它們單獨(dú)與加尾配體締合的能力，以及它們提高配體與其靶分子的解離速率或配體與其靶分子的締合速率的能力?？墒褂缅e(cuò)義序列(scrambled sequence)對(duì)照以證實(shí)作用是因?yàn)殡p鏈體形成而不是非特異性作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是核酶或DNA酶。酶核酸通過首先與靶RNA或DNA 結(jié)合而起作用。這樣的結(jié)合是通過酶核酸的靶結(jié)合部分而發(fā)生的，所述部分與可起到切割靶RNA的作用的分子的酶部分緊密接近。因此，酶核酸通過互補(bǔ)堿基配對(duì)先識(shí)別再結(jié)合靶 RNA或DNA，而且一旦結(jié)合正確位點(diǎn)后，起到酶促作用，以切割靶RNA，因而允許RNA配體失活。有至少5類核酶，其各自顯示不同類型的特異性。例如，I組內(nèi)含子的大小是約300至 > 1000個(gè)核苷酸并且在緊接切割位點(diǎn)的5'的靶序列中需要U并且在切割位點(diǎn)的5'側(cè)與 4-6個(gè)核苷酸結(jié)合。另一類是RNaseP RNA(Ml RNA)，其大小為約四0_400個(gè)核苷酸。第3 類是錘頭核酶，其大小為約30-40個(gè)核苷酸。它們?cè)诰o接切割位點(diǎn)的5'需要靶序列UH(其中H不是G)并且在切割位點(diǎn)兩側(cè)與不同數(shù)量的核苷酸結(jié)合。第4類是發(fā)夾核酶，其大小為約50個(gè)核苷酸。它們?cè)诰o接切割位點(diǎn)的3'需要靶序列GUC并在切割位點(diǎn)的5'側(cè)與4個(gè)核苷酸結(jié)合并且在切割位點(diǎn)的3'-側(cè)與不同數(shù)量結(jié)合。第5組是丁型肝炎病毒(HDV)核酶，其大小為約60個(gè)核苷酸。DNA酶是單鏈的并且切割RNA和DNA 二者。已經(jīng)提出了 DNA 酶的一般模型，其被稱為“10-23”模型。遵循“10-23”模型的DNA酶具有15個(gè)脫氧核糖核苷酸的催化結(jié)構(gòu)域，其側(cè)翼連接各自具有7-9個(gè)脫氧核糖核苷酸的兩個(gè)底物識(shí)別結(jié)構(gòu)域。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑本身是核酸配體。在該實(shí)施方案中，產(chǎn)生與所需治療靶標(biāo)結(jié)合的第1配體。在第2步驟中，使用本文所述的SELEX方法或另一方法，產(chǎn)生與第1 配體結(jié)合的第2配體，并且其調(diào)節(jié)治療性配體與靶標(biāo)間的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，第 2配體使第1配體的作用失效。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是基于PNA、MNA、LNA或PCO的調(diào)節(jié)劑。本發(fā)明寡核苷酸調(diào)節(jié)劑的核酸堿基(NuclecAase)可通過核酸堿基間鍵而連接，所述鍵例如肽鍵(例如在肽核酸(PNA)的情況下；Nielsen等(1991) Science 254，1497和美國專利號(hào) 5，539，082)和嗎啉代鍵(Qin 等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 10,11(2000)； Summerton, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7,187(1997) ；Summerton 等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7,63(1997) ；Taylor 等，J Biol Chem. 271,17445 (1996)； Partridge 等，Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 6，169 (1996))，或通過任何其他天然的或經(jīng)修飾的鍵。寡核苷酸堿基(oligonucleobase)還可以是鎖定核酸(LNA)。Nielsen等，J Biomol Struct Dyn 17,175(1999) ；Petersen 等，J Mol Recognit 13,44(2000) ；Nielsen 等，Bioconjug Chem 11,228(2000) PNA是類似于寡核苷酸、但組成不同的化合物。在PNA中，寡核苷酸的脫氧核糖主鏈被肽主鏈取代。肽主鏈的各亞基與天然存在的或非天然存在的核酸堿基連接。PNA通常具有由N-(2-氨基乙基)甘氨酸單位組成的非手性聚酰胺主鏈。嘌呤堿基或嘧啶堿基通過亞甲基羰基接頭(1-3)與各單位連接，以靶向互補(bǔ)核酸。PNA按照Watson-Crick堿基配對(duì)原則以平行或反向平行方向與互補(bǔ)RNA或DNA結(jié)合。與天然同型雙鏈體相比，PNA寡聚體不帶電荷的特性增強(qiáng)了雜合PNA/DNA(RNA)雙鏈體的穩(wěn)定性。嗎啉代核酸如此命名，是因?yàn)樗鼈儚膯徇鷣喕b配而來，其各自含有與6元嗎啉環(huán)連接的4種遺傳堿基(腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和胸腺嘧啶)中的一個(gè)。這4種亞基類型的18-25個(gè)亞基通過非離子型磷酸二酰胺(phosphorodiamidate)的亞基間鍵以特定順序相連，得到嗎啉代寡聚物。LNA是一類DNA類似物，其具有可使其成為本發(fā)明調(diào)節(jié)劑的首要候選者的某些特性。LNA單體是結(jié)構(gòu)類似于RNA單體的雙環(huán)化合物。LNA與DNA和RNA共享大部分化學(xué)性能， 它是水溶性的，可以經(jīng)凝膠電泳分離、乙醇沉淀等(Tetrahedron，54，3607-3630 (1998))。然而，將LNA單體引入DNA或RNA寡聚物中，導(dǎo)致具有互補(bǔ)DNA或RNA的雙鏈體具有高的熱穩(wěn)定性，同時(shí)又服從Watson-Crick堿基配對(duì)原則。假環(huán)狀寡核苷酸堿基(PCO)也可用作本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑(參見美國專利號(hào) 6，383，752)。PCO含有通過其3' -3'或5' -5'端連接的2個(gè)寡核苷酸區(qū)段。PCO的區(qū)段之一(“功能性區(qū)段”)具有某些功能性(例如與靶RNA互補(bǔ))。另一區(qū)段(“保護(hù)性區(qū)段”)與功能性區(qū)段的3'-或5'-末端互補(bǔ)(取決于通過其與功能性區(qū)段連接的末端)。
21由于功能性區(qū)段與保護(hù)性區(qū)段間的互補(bǔ)性，在靶核酸(例如RNA)不存在時(shí)，PCO構(gòu)成分子內(nèi)假環(huán)狀結(jié)構(gòu)。PCO比常規(guī)寡核苷酸更穩(wěn)定，因?yàn)榇嬖?' -3'或5' -5'鍵并形成分子內(nèi)假環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在小鼠中進(jìn)行的藥物動(dòng)力學(xué)、組織分布和穩(wěn)定性研究表明，PCO與PS-寡核苷酸相比一般具有更高的體內(nèi)穩(wěn)定性，以及類似的藥物動(dòng)力學(xué)和組織分布特征，但從所選組織中快速消除。當(dāng)熒光團(tuán)和猝滅劑分子與本發(fā)明的PCO適當(dāng)連接時(shí)，如果所述分子呈線狀構(gòu)型則會(huì)發(fā)熒光，但呈環(huán)狀構(gòu)象時(shí)熒光就會(huì)被猝滅。該特性可用于篩選PCO作為潛在調(diào)節(jié)劑。在另一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是基于肽的調(diào)節(jié)劑。基于肽的核酸配體調(diào)節(jié)劑代表了寡核苷酸或其類似物的調(diào)節(jié)劑的一類備選分子。如果靶核酸配體的足夠活性的寡核苷酸調(diào)節(jié)劑因缺乏足夠的單鏈區(qū)而不能促進(jìn)靶標(biāo)與寡核苷酸調(diào)節(jié)劑間成核，因而無法分離，那么這類調(diào)節(jié)劑就特別有用。另外，與寡核苷酸調(diào)節(jié)劑相比，肽調(diào)節(jié)劑提供不同的生物利用度和藥物動(dòng)力學(xué)。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是魚精蛋白(Oney等，2009， Nat. Med. 15 :1224-12 )。魚精蛋白是水溶性的，受熱不凝結(jié)，并且含有精氨酸、丙氨酸和絲氨酸(大部分還含脯氨酸和纈氨酸而且許多含甘氨酸和異亮氨酸)。調(diào)節(jié)劑也包括魚精蛋白變體(參見例如Wakefield等，J. Surg. Res. 63 :280(1996))和魚精蛋白的修飾形式，包括美國公開號(hào)20040121443中描述的那些。其它調(diào)節(jié)劑包括魚精蛋白片段，例如美國專利號(hào)6，624，141和美國公開號(hào)20050101532中描述的那些。調(diào)節(jié)劑通常也包括調(diào)節(jié)肝素活性的肽、其它糖胺聚糖或蛋白聚糖(參見例如美國專利號(hào)5，919，761)。在一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是含有陽離子-NH基團(tuán)并能穩(wěn)定電荷-電荷相互作用的肽，例如聚-L-賴氨酸和聚-L-鳥氨酸。可使用若干策略以分離能結(jié)合并因此調(diào)節(jié)靶核酸配體活性的肽。例如，已經(jīng)描述了固定在珠上的編碼肽組合文庫，并已證明其中含有能結(jié)合病毒RNA序列并破壞病毒RNA 與病毒調(diào)節(jié)蛋白間相互作用的肽，所述病毒調(diào)節(jié)蛋白與所述RNA特異性結(jié)合(Hwang等， Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1999,96 :12997) 使用這樣的文庫，核酸配體調(diào)節(jié)劑可如下分離通過給靶核酸配體掛上標(biāo)記并在有利于文庫的某些成員與核酸結(jié)合的條件下將帶標(biāo)記的靶標(biāo)與固定在珠上的肽文庫一起溫育。核酸配體與給定珠上的特異性肽結(jié)合，使該珠通過核酸配體上的標(biāo)記而“著色”，因此使能夠通過簡(jiǎn)單的珠分離而鑒定出能與靶標(biāo)結(jié)合的肽。使用描述用于鑒定核酸配體調(diào)節(jié)劑的多種結(jié)合測(cè)定，可以證實(shí)經(jīng)這類篩選方法所分離出的肽與靶核酸配體之間的直接相互作用并對(duì)其進(jìn)行定量測(cè)定?？赏ㄟ^合適的生物測(cè)定， 證實(shí)所述肽調(diào)節(jié)靶核酸配體活性的能力。在一個(gè)另外的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是基于寡糖的調(diào)節(jié)劑。寡糖可與核酸相互作用。 例如，氨基糖苷類抗生素是鏈霉菌(Streptomyces)的產(chǎn)物并與多種RNA分子(例如各種核酶、核糖體的RNA組分以及HIV-I的TAR和RRE序列)特異性相互作用。因此寡糖可與核酸結(jié)合并可用于調(diào)節(jié)核酸配體活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是基于小分子的調(diào)節(jié)劑。插入配體與靶標(biāo)之間或者以其它方式破壞或改變配體與靶標(biāo)之間結(jié)合的小分子也可用作治療調(diào)節(jié)劑。通過在有或無小分子時(shí)在測(cè)定配體與靶標(biāo)之間結(jié)合改變的測(cè)定中篩選候選者，或者通過使用測(cè)定在有或無小分子時(shí)配體對(duì)靶標(biāo)的生物學(xué)作用的差異的體內(nèi)或體外測(cè)定，就可以鑒定這樣的小分子。一旦鑒定了表現(xiàn)出所需作用的小分子后，組合方法等技術(shù)就可用于優(yōu)化用于所需調(diào)節(jié)作用的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在再一個(gè)示例性的實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是核酸結(jié)合聚合物、脂質(zhì)、納米?；蛭⑶蝮w。在再一些非限制性實(shí)例中，調(diào)節(jié)劑可選自1，2-二油酰-Sn-甘油-3-乙基磷酸膽堿 (EDOPC) ；二月桂酰乙基磷脂酰膽堿(EDLPC) ；EDLPC/ED0PC ；吡啶鐺表面活性劑；二油酰磷脂酰-乙醇胺(DOPE) ； (士)-N- (3-氨基丙基)-N，N- 二甲基-2，3- 二(十二烷氧基)丙基溴化銨(GAP-DLRIE)加中性輔脂二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE) (GAP-DLRIE/D0PE) ； (士)_N， N-二甲基-N-[2-(精胺甲酰胺基)乙基]-2，3-二(二油酰氧基-1-propaniminium petahydrochloride (DOSPA) ；二月桂酰乙基磷脂酰膽堿(EDLPC)；乙基二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿(EDMPC) ； (士)-N，N，N-三甲基-2，3-二(ζ-十八-9-烯-酰氧基(oyloxy))-I-丙基氯化銨(DOTAP) ； (士)-N-2-(2-羥乙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十四烷氧基)丙基溴化銨(DMRIE) ； (士)-N，N，N-三甲基-2，3-二(ζ-十八-9-烯氧基)-1-丙基氯化銨(DOTMA)； 5-羧基精胺基甘氨酸雙十八烷基-酰胺(D0GQ ；二棕櫚?；字Ｒ掖及?-羧基精胺基酰胺(DPPEQ ；1，3 二油酰氧基-2-(6-羧基精胺基)-丙基-酰胺基(DOSPER)；四甲基四棕櫚?；?TMTPQ ；(四甲基四油酰基精胺(TMTOQ ；四甲基四月桂基精胺(TMTLS)； 四甲基四肉豆蔻基精胺(TMTMQ ；四甲基二油基精胺(TMD0Q ；二植烷?；字?乙醇胺 (DPhPE)；和(士)-N-(3-氨基丙基)-N，N-二甲基-2，3-二(十二烷氧基)丙基溴化銨 (GAP-DLRIE)。在其它實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑選自脫乙酰殼多糖；脫乙酰殼多糖衍生物；1，5_ 二甲基-1，5-二氮雜十一亞甲基聚甲溴化物；聚氧乙烯/聚氧丙烯嵌段共聚物；聚-L-賴氨酸； 聚酰胺基胺(PAMAM)；含β-環(huán)糊精的聚陽離子(CDP)；含β-環(huán)糊精的聚陽離子(含咪唑的變體)(CDP-Im)；聚氨基磷酸酯聚合物(8kDa，30kDa) (PPA-DPA 8k，PPA-DPA 30k)；聚凝胺(polybrene)；精胺；PEG-嵌段-PLL-樹狀聚合物；聚乙烯亞胺(PEI)；甘露糖-PEI ；轉(zhuǎn)鐵蛋白-PEI ；線狀(Iinera)-PEI(IPEI)；明膠；甲基丙烯酸/甲基丙烯酰胺；聚(β -氨基酯)；聚電解質(zhì)復(fù)合物(PEC)；聚(乙烯胺)(PVA)；膠原；聚丙烯亞胺(PPI)；聚丙烯胺；聚乙烯吡啶；氨基縮醛化聚(乙烯醇)；丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物；Newkome樹狀聚合物；聚亞苯基；二甲基雙十八烷基溴化銨(DAB)；十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)；白蛋白；經(jīng)酸處理的明膠；聚賴氨酸；聚鳥氨酸；聚精氨酸；DEAE-纖維素；DEAE-葡聚糖；和聚(N，N- 二甲氨基乙基甲基丙烯酸)；和聚丙胺(POPAM)。在一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑選自脫乙酰殼多糖和脫乙酰殼多糖衍生物。脫乙酰殼多糖衍生物包括水溶性脫乙酰殼多糖納米粒(例如以下文獻(xiàn)所述美國專利號(hào)6，475，995 ； 美國專禾Ij 申請(qǐng)?zhí)?2006/0013885 ；Limpeanchob 等(2006) Efficacy and Toxicity of Amphotericin B-Chitosan Nanoparticles ；Nareusan University Journal 14(2) 27-34)。給定脫乙酰殼多糖聚合物(本質(zhì)上是由重復(fù)葡糖胺單體組成的非常大的聚胺聚合物)的聚陽離子特性，脫乙酰殼多糖可用于在注入宿主之后在體內(nèi)將配體聚集和/或包入聚電解質(zhì)復(fù)合物中。這部分是基于脫乙酰殼多糖上存在的伯胺與配體的磷酸二酯主鏈的相互作用。在某些實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖聚合物上的伯胺可被充分修飾，以改變水溶性和電荷狀態(tài)。脫乙酰殼多糖衍生物包括三甲基脫乙酰殼多糖氯化物(TMC)，其可在不同季銨化程度下合成；一羧基甲基化脫乙酰殼多糖(MCC)，其是聚兩性電解質(zhì)聚合物；戊二醛交聯(lián)的衍生物(CSGA)；硫醇化脫乙酰殼多糖(Lee等(2007)Pharm. Res. 24:157-67) ；二醇脫乙酰殼多糖(GC)，一種與乙二醇綴合的脫乙酰殼多糖衍生物(Lee等J Pharm.)； [N-(2-羧基芐基)脫乙酰殼多糖(CBCS) (Lin 等(2007)Carbohydr Res. 342(1) :87-95)； β-環(huán)糊精-脫乙酰殼多糖聚合物(Venter，等(2006) Int J Pharm. 313(1-2) :36-42)； 0-羧基甲基脫乙酰殼多糖；N，0-羧基甲基脫乙酰殼多糖；或通過將黃原酸酯基引到其主鏈上而進(jìn)行化學(xué)修飾的脫乙酰殼多糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生空的脫乙酰殼多糖納米粒并用作調(diào)節(jié)劑?？墒褂梅肿恿糠秶鸀?0，OOODa至> 1，000, OOODa的脫乙酰殼多糖或脫乙酰殼多糖衍生物。在某些實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖是500，OOODa或更小。在某些實(shí)施方案中，脫乙酰殼多糖是100，OOODa 或更小。在某些實(shí)施方案中，所述化合物介于10，000和100，OOODa之間、介于10，000和 90，000之間、介于10，000和80，000之間、介于20，000和70，0000之間、介于30，000和 70，000 之間、約 30，000、約 40，000、約 50，000 或約 60，OOODa0在某些實(shí)施方案中，使用含有不同程度脫乙?；返拿撘阴ざ嗵蔷酆衔铩Ｔ谶@些實(shí)施方案中，不同脫乙酰化程度改變了聚合物的電荷狀態(tài)并因此改變聚合物的結(jié)合性能。一旦脫乙酰殼多糖納米粒與宿主中的配體接觸之后，配體可與納米粒表面結(jié)合并被捕獲在其上，或進(jìn)入納米粒并因離子相互作用而被包入。在另一個(gè)實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是聚磷酸聚合物微球體。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是這樣的微球體的衍生物，例如聚(L-丙交酯-共-亞磷酸乙酯)或P(LAEG-EOP)等，如美國專利號(hào)6，548, 302所述?？芍苽溥@樣的聚合物，使其含有各種各樣的官能團(tuán)作為聚合物主鏈的組成部分。在一個(gè)實(shí)例中，聚合物可含有在生理PH下帶正電荷的季胺，使得它們?cè)谂c一個(gè)或多個(gè)核酸接觸后可與之復(fù)合或?qū)⑵浒搿Ｔ谀承?shí)施方案中，聚合物不含正電荷。本發(fā)明也提供鑒定核酸GPVI配體調(diào)節(jié)劑的方法。通?？赏ㄟ^結(jié)合測(cè)定、分子建?；蛘邷y(cè)定生物學(xué)功能改變的體內(nèi)或體外測(cè)定來鑒定調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過凝膠遷移測(cè)定(gel shift assay)來測(cè)定調(diào)節(jié)劑與核酸的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過 BIAC0RE測(cè)定來測(cè)定調(diào)節(jié)劑與核酸配體的結(jié)合。標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合測(cè)定可用于鑒定和選擇本發(fā)明的調(diào)節(jié)劑。非限制性實(shí)例是凝膠遷移測(cè)定和BIAC0RE測(cè)定。也就是說，可在試驗(yàn)條件或典型生理?xiàng)l件下使試驗(yàn)調(diào)節(jié)劑與待靶向的核酸配體接觸，并確定試驗(yàn)調(diào)節(jié)劑是否真的與配體結(jié)合。再在合適生物測(cè)定(其因配體及其靶分子的不同而異，例如凝結(jié)試驗(yàn))中分析被發(fā)現(xiàn)與核酸配體結(jié)合的試驗(yàn)調(diào)節(jié)劑，以確定試驗(yàn)調(diào)節(jié)劑是否能影響配體對(duì)其靶分子所引起的生物學(xué)作用。凝膠遷移測(cè)定是眾所周知的用于評(píng)價(jià)結(jié)合能力的技術(shù)。例如，先將含有試驗(yàn)序列的DNA片段與試驗(yàn)蛋白或含有推定結(jié)合蛋白的混合物一起溫育，再通過凝膠電泳在凝膠上分離。如果DNA片段與蛋白結(jié)合，它的尺寸就會(huì)比較大，因此其遷移就比游離片段更遲緩。 例如，電泳凝膠遷移率遷移測(cè)定的一個(gè)方法可以是(a)在合適條件下在混合物中使核酸結(jié)合蛋白與包含分子探針的非放射性或放射性標(biāo)記的核酸分子接觸，以促進(jìn)正形成復(fù)合物中的蛋白與核酸間的特異性結(jié)合相互作用，其中所述探針選自dSDNA、SSDNA和RNA;(b)將混合物電泳；和(c)通過檢測(cè)復(fù)合物中的非放射性或放射性標(biāo)記而檢測(cè)與膜結(jié)合的復(fù)合物。BIAC0RE技術(shù)測(cè)量傳感器芯片表面上的結(jié)合事件，使得與表面連接的相互作用物確定分析特異性。測(cè)試相互作用的特異性包括簡(jiǎn)單分析不同分子是否可與固定化的相互作用物結(jié)合。結(jié)合使表面等離子共振(surface ρlasmon resonance, SPR)信號(hào)立即發(fā)生變化，使得相互作用是否發(fā)生直接顯而易見。基于SPR的生物傳感器通過測(cè)定接近表面的生物分子的質(zhì)量濃度而監(jiān)測(cè)相互作用。通過連接相互作用伴侶之一使表面具特異性。含有其它伴侶的樣品流過表面當(dāng)來自樣品的分子與連接在表面上的相互作用物結(jié)合時(shí)，局部濃度變化并測(cè)得sra響應(yīng)。該響應(yīng)與同表面結(jié)合的分子質(zhì)量直接成比例。當(dāng)光在某些條件下在不同折射率的兩種介質(zhì)的界面上從傳導(dǎo)膜反射時(shí)，產(chǎn)生SPR。 在BIAC0RE技術(shù)中，介質(zhì)是樣品和傳感器芯片的玻璃，而傳導(dǎo)膜是芯片表面上的金薄層。 SI^R在特定反射角引起反射光強(qiáng)度降低。該角度隨接近反射光相對(duì)側(cè)表面的折射率不同而變化。當(dāng)樣品中的分子與傳感器表面結(jié)合時(shí)，表面處的濃度改變和因此折射率改變，并檢測(cè) SPR響應(yīng)。將響應(yīng)針對(duì)相互作用過程期間的時(shí)間來作圖，提供對(duì)相互作用過程的定量度量。 BIAC0RE技術(shù)測(cè)定最小反射光強(qiáng)度的角度。光不被樣品吸收而是光能通過金膜中的SI^R而耗散。sra響應(yīng)值用共振單位(RU)來表示。1 RU代表強(qiáng)度最小角度的0.0001°的變化，對(duì)于大部分蛋白質(zhì)，這大致等于在傳感器表面上的約lpg/rnm2的濃度改變。RU與表面濃度間的準(zhǔn)確轉(zhuǎn)換因子取決于傳感器表面性能和造成濃度改變的分子的特性。有許多其它測(cè)定可測(cè)定寡核苷酸或其類似物、肽、多肽、寡糖或小分子是否能與配體結(jié)合，其結(jié)合方式使得改變與靶標(biāo)的相互作用。例如，電泳遷移率遷移測(cè)定(EMSA)JfS 量熱術(shù)、閃爍親近測(cè)定、使用分析用超速離心的沉降平衡測(cè)定(參見例如靈cores. Utah, edu/interaction)、熒光偏振測(cè)定、熒光各向異性測(cè)定、熒光強(qiáng)度測(cè)定、熒光共振能量轉(zhuǎn)移 (FRET)測(cè)定、硝基纖維素濾膜結(jié)合測(cè)定、ELISA、ELONA(參見例如美國專利號(hào)5，789，163)、 RIA或平衡透析測(cè)定都可用于評(píng)價(jià)試劑與核酸配體結(jié)合的能力?？梢赃M(jìn)行直接測(cè)定，其中直接測(cè)定試劑與核酸配體間的相互作用；或者可以進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定或置換測(cè)定，其中測(cè)定試劑將配體從其靶標(biāo)置換的能力(例如參見Green，Bell和Janjic，Biotechniques 30(5)， 2001，第1094頁和美國專利號(hào)6，306，598)。一旦鑒定候選調(diào)節(jié)劑后，就可在生物測(cè)定中證實(shí)其調(diào)節(jié)核酸配體對(duì)其靶標(biāo)的活性的能力。備選地，如果試劑被鑒定為可調(diào)節(jié)配體與其靶標(biāo)的相互作用，那么這樣的結(jié)合測(cè)定可用于證實(shí)該試劑與配體直接相互作用并可測(cè)定所述相互作用的親和力。在另一個(gè)實(shí)施方案中，質(zhì)譜可用于鑒定與核酸配體結(jié)合的調(diào)節(jié)劑、調(diào)節(jié)劑與核酸配體間相互作用位點(diǎn)和試劑對(duì)配體的相對(duì)結(jié)合親和力(參見例如美國專利號(hào)6，329，146)。 這樣的質(zhì)譜方法也可用于篩選化學(xué)混合物或文庫，尤其是組合文庫，用于篩選出與所選靶配體結(jié)合的各個(gè)化合物，其可用作配體調(diào)節(jié)劑。此外，質(zhì)譜技術(shù)可用于針對(duì)例如化合物的組合文庫同時(shí)篩選多個(gè)靶核酸配體。此外，質(zhì)譜技術(shù)可用于鑒定多個(gè)分子物類(尤其是“小” 分子)與靶配體上分子相互作用位點(diǎn)間的相互作用。評(píng)價(jià)調(diào)節(jié)劑在改變核酸配體與靶標(biāo)間相互作用中的有效性的體內(nèi)或體外測(cè)定對(duì)于待治療的疾病是特異性的。有許多標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定用于生物學(xué)特性，所述測(cè)定是眾所周知的并可使用。生物學(xué)測(cè)定的實(shí)例在本申請(qǐng)中所引用的專利中提供，其描述了某些核酸配體用于特定應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是小分子。例如，在某些實(shí)施方案中，核酸配體與生物素分子連接。在這樣的情況下，給予鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白，以結(jié)合和逆轉(zhuǎn)配體的作用(參見 Savi 等.J Thrombosis and Haemostasis，6 :1697-1706)。抗生物素蛋白是鳥類、 爬行類和兩棲類輸卵管中產(chǎn)生的四聚體蛋白，其沉積在它們的卵白中。鏈霉抗生物素是從細(xì)菌阿維丁鏈霉菌(Sti^ptomyces avidinii)中純化的四聚體蛋白。該四聚體蛋白含有4 個(gè)相同的亞基(同型四聚體)，其各自可以高度親和力和特異性與生物素(維生素B7、維生素H)結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是陽離子型分子。在某些實(shí)施方案中，配體形成鳥嘌呤四聯(lián)體(quartet) (G_四聯(lián)體或G-四鏈結(jié)構(gòu)(quadruplex))結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)為陽離子型分子所結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，所述分子是金屬螯合分子。在某些實(shí)施方案中，調(diào)節(jié)劑是卟啉。在某些實(shí)施方案中，化合物是TMPyP4。參見Joachimi等.JACS 2007，129，3036-3037 和 iToro 等· Analytical Biochemistry 2008，8 月 1 日，379 ⑴ 8-15。在一個(gè)實(shí)施方案中，在小于10. O微摩爾濃度(uM)、1. O微摩爾濃度(uM)、優(yōu)選小于0. IuM和更優(yōu)選小于0. OluM的調(diào)節(jié)劑濃度下，調(diào)節(jié)劑在溶液中具有與核酸配體充分結(jié)合的能力?！俺浞帧笔侵冈诎袠?biāo)存在下通過調(diào)節(jié)而觀察到靶生物活性至少降低50%，并且降低 50%在本文中稱為IC5tl值。F.優(yōu)化配體和調(diào)節(jié)劑為了使配體適合用作治療藥，優(yōu)選配體合成便宜，在宿主中使用安全并且在體內(nèi)穩(wěn)定。野生型RNA和DNA寡核苷酸在體內(nèi)通常都不穩(wěn)定，因?yàn)樗鼈儗?duì)核酸酶的降解敏感。通過在2'-位摻入修飾基團(tuán)可極大地提高對(duì)核酸酶降解的抗性。可將2’ -氟代或氨基基團(tuán)摻入到寡核苷酸池中，隨后從中選擇配體。在本說明書中，在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中使用2’-氟嘧啶以產(chǎn)生最初的寡核苷酸池，用于配體選擇(參見實(shí)施例1)。然而，選自在各嘌呤位置上含有2’ -羥基糖的這類文庫的所得配體，雖然因此在體內(nèi)比類似RNA或DNA配體更穩(wěn)定，但是需要另外優(yōu)化。因此，隨后經(jīng)各種方式對(duì)用本文所述方法鑒定的配體進(jìn)行修飾，以獲取功能和穩(wěn)定性增強(qiáng)且用于大規(guī)模制備工藝的可行性增加的配體。在最初鑒定配體(通過例如SELEX)和調(diào)節(jié)劑(例如根據(jù)序列互補(bǔ)性設(shè)計(jì))之后， 可經(jīng)各種方式對(duì)配體和調(diào)節(jié)劑進(jìn)行修飾或工程改造，以改進(jìn)它們的所需結(jié)構(gòu)、功能和/或穩(wěn)定性。這些包括但不限于取代特定糖殘基，改變配體中特定區(qū)域和/或結(jié)構(gòu)的組成和大小，并且設(shè)計(jì)可被調(diào)節(jié)劑更有效調(diào)節(jié)的配體。核酸配體的設(shè)計(jì)和優(yōu)化包括評(píng)價(jià)配體的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及二級(jí)結(jié)構(gòu)與調(diào)節(jié)劑控制之間的關(guān)系。與修飾核酸的常規(guī)方法不同，設(shè)計(jì)針對(duì)GPVI蛋白的配體可包括考慮改變配體對(duì)潛在調(diào)節(jié)劑設(shè)計(jì)的影響。如果配體通過例如截短而被修飾，那么相應(yīng)調(diào)節(jié)劑應(yīng)當(dāng)設(shè)計(jì)為控制截短的配體?？赏ㄟ^本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種方法，對(duì)通過SELEX方法鑒定的配體二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。例如，可用以下軟件程序來分析各序列例如Mfold(mfold.bioinfo.rpi. edu ；另見 Zuker，2003，Nucleic Acids Res. 31 :3406-3415 和 Mathews 等，1999，J. Mol. Biol. 288 :911-940)。隨后，可使用不同所選序列的比較序列分析，根據(jù)保守共有二級(jí)結(jié)構(gòu)元件比對(duì)序列，以達(dá)到預(yù)測(cè)GPVI配體的二級(jí)共有結(jié)構(gòu)(參見實(shí)施例2)。例如上述分析允許設(shè)計(jì)并測(cè)試通過SELEX獲得的序列變體，以產(chǎn)生功能和穩(wěn)定性增強(qiáng)的配體?？赏ㄟ^改變配體總長度以及莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的長度，修飾本發(fā)明的GPVI核酸配體。例如，可產(chǎn)生配體截短，其中在SELEX方法中所選的配體的5’和/或3’端的部分缺失。為了測(cè)定配體所能耐受的截短程度，所用的一個(gè)方法可以是加熱退火與配體5’或3’端區(qū)域互補(bǔ)的寡核苷酸(例如DNA寡核苷酸)，然后比較有或無退火寡核苷酸的配體的結(jié)合。如果有或無退火寡核苷酸的配體之間未觀察到顯著的結(jié)合差異，那么這表明配體的退火部分并非配體與靶蛋白結(jié)合所必需的?？墒褂门c不同長度的配體5’或3’端退火的寡核苷酸來進(jìn)行該方法，以測(cè)定提供完整功能性配體的5’和3’邊界。在另一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)包括降低配體大小。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與配體大小相關(guān)地改變調(diào)節(jié)劑的大小。在又一個(gè)實(shí)施方案中，將鳥嘌呤串減少至小于4個(gè)鳥嘌呤，或小于3個(gè)鳥嘌呤，或小于2個(gè)鳥嘌呤或無鳥嘌呤。然而，這些改變的聯(lián)合效果必需滿足產(chǎn)生配體的挑戰(zhàn)，所述配體提供足夠的活性但又容易被調(diào)節(jié)劑所中和。對(duì)于調(diào)節(jié)劑的靶向，也可修飾改進(jìn)的配體，使其包含單鏈尾(3'或5')，以促進(jìn)與寡核苷酸調(diào)節(jié)劑的締合。合適的尾可包含Int至20nt，優(yōu)選Int至IOntUnt至5nt或 3nt至5nt。容易理解，這樣的尾可包含經(jīng)修飾的核苷酸，如下文將會(huì)更詳細(xì)描述的那樣。可在結(jié)合和生物測(cè)定(例如下文所述)中測(cè)試加尾配體，以證實(shí)單鏈尾的加入未破壞配體的活性結(jié)構(gòu)?？稍O(shè)計(jì)出可與尾序列形成例如1、3或5堿基對(duì)的一系列寡核苷酸 (例如2' -0-甲基寡核苷酸)，并測(cè)試它們單獨(dú)與加尾配體締合的能力，以及它們提高配體與其靶分子的解離速率或締合速率的能力。可使用錯(cuò)義序列對(duì)照以證實(shí)作用是因?yàn)殡p鏈體形成而不是非特異性作用。對(duì)共有結(jié)構(gòu)的測(cè)定也有助于配體的工程改造，以鑒定可增強(qiáng)或降低配體結(jié)構(gòu)和功能的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。例如，可更有效地鑒定和測(cè)試特定莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的核苷酸添加、缺失和取代(參見實(shí)施例3)。對(duì)共有二級(jí)結(jié)構(gòu)的知識(shí)也使我們能夠避免可能對(duì)配體結(jié)構(gòu)和功能不利的修飾。例如，某些修飾在共有二級(jí)結(jié)構(gòu)內(nèi)可能是保守的，例如莖或環(huán)區(qū)內(nèi)的2’ -氟代。在這些情況下，從配體的莖或環(huán)中除去2'-氟代可導(dǎo)致活性喪失。在某些實(shí)施方案中，配體是選自表1-7的核酸分子，包括其截短的和基本同源的序列。如本文所用，就同源區(qū)而言，“基本同源的”序列是通過Watson-Crick堿基配對(duì)在特定分子內(nèi)形成相同二級(jí)結(jié)構(gòu)的序列。在某些實(shí)施方案中，如果序列與指定配體共享至少80 %、 85%或更高序列同一性，例如 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或 99% 序列同一性時(shí)，則序列是“基本同源的”。就指定長度(例如50個(gè)或更少核苷酸)的核酸配體而言，在允許Watson-Crick結(jié)合而形成相同二級(jí)結(jié)構(gòu)的任何區(qū)域內(nèi)可找到同源序列，無論該指定區(qū)域內(nèi)序列同一性如何。配體也可經(jīng)設(shè)計(jì)而具有自殺位置，其允許配對(duì)的調(diào)節(jié)劑更有效的調(diào)節(jié)。一旦調(diào)節(jié)劑與配體結(jié)合，自殺位置就變?yōu)閱捂湶⑶也环€(wěn)定，因此利于由天然存在于血液中的酶(例如血液或肝臟的內(nèi)切核酸酶)對(duì)配體的切割。這提供了從循環(huán)中有效且基本上是立即消除活性配體的方式?；瘜W(xué)修飾在核酸的治療用途中遇到的一個(gè)問題是，呈其磷酸二酯形式的寡核苷酸在表現(xiàn)所需作用之前，在體液中可被胞內(nèi)和胞外酶(例如內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶)快速降解。核酸配體的某些化學(xué)修飾可提高核酸配體的體內(nèi)穩(wěn)定性或者增強(qiáng)或介導(dǎo)核酸配體的遞送。另夕卜，某些化學(xué)修飾可通過穩(wěn)定或促進(jìn)核酸配體內(nèi)所需結(jié)構(gòu)元件的形成或者提供與靶分子的另外的分子相互作用而增強(qiáng)核酸配體對(duì)其靶標(biāo)的親和力。配體的修飾可包括但不限于提供化學(xué)基團(tuán)的修飾，其向核酸配體堿基或向作為整體的配體摻入額外電荷、極化率、疏水性、氫鍵、靜電相互作用和官能度。這樣的修飾包括但不限于2'-位的糖修飾、5-位的嘧啶修飾、8-位的嘌呤修飾、在環(huán)外胺上的修飾、4-硫代尿苷的取代、5-溴尿嘧啶或5-碘尿嘧啶的取代、主鏈修飾、硫代磷酸酯或烷基磷酸酯修飾、甲基化、不常見的堿基配對(duì)組合(例如異堿基(isobase)異胞苷(isocytidine)和異胍 (isoguanidine))等。修飾也可包括3'修飾和5'修飾，例如加帽。SELEX方法包括鑒定含有修飾核苷酸的高親和力核酸配體，修飾核苷酸賦予配體改進(jìn)的特性，例如改進(jìn)的體內(nèi)穩(wěn)定性或改進(jìn)的遞送特性。這類修飾的實(shí)例包括在核糖和/ 或磷酸和/或堿基位置上的化學(xué)取代。經(jīng)SELEX鑒定的含有經(jīng)修飾核苷酸的核酸配體描述于美國專利號(hào)5，660，985，其描述了含有在嘧啶的5-位和2'-位上進(jìn)行化學(xué)修飾的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美國專利號(hào)5，580，737描述了含有經(jīng)2'-氨基O' -NH2), 2'-氟代議-F)和/或2' -0-甲基議-OMe)修飾的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的特異性核酸配體。 美國專利號(hào)5，756，703描述了含有不同2'-修飾嘧啶的寡核苷酸。SELEX方法包括將所選寡核苷酸與其它所選寡核苷酸和非寡核苷酸功能性單元組合起來，如美國專利號(hào)5，637，459和5，683，867所述。美國專利號(hào)5，637，459描述了含有經(jīng) 2'-氨基O' -NH2),2'-氟代O' -F)和/或2' -0-甲基O' -OMe)修飾的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的高度特異性核酸配體。SELEX方法還包括將所選核酸配體與親脂性或非免疫原性的高分子量化合物組合在診斷用或治療用復(fù)合物中，如美國專利號(hào)6，011，020所述。如果核酸配體經(jīng)SELEX方法得到，那么修飾可以是SELEX前或后的修飾。SELEX前修飾可得到對(duì)其靶標(biāo)具有特異性且具有改進(jìn)的體內(nèi)穩(wěn)定性的配體。對(duì)2'-羥基(2’-0H) 核酸配體進(jìn)行的SELEX后修飾可導(dǎo)致改進(jìn)的體內(nèi)穩(wěn)定性，而不有害地影響核酸配體的結(jié)合能力。在一個(gè)實(shí)施方案中，配體的修飾包括在分子的3'端的3' -3'反向磷酸二酯鍵，以及某些或所有核苷酸的2'氟代O' _F)、2'氨基O' -NH2)、2’脫氧和/或2' 0甲基 (2' -OMe)修飾。本文所述的配體首先通過SELEX使用轉(zhuǎn)錄物文庫而產(chǎn)生，所述文庫中C殘基和U 殘基是2’ -氟取代的，而A殘基和G殘基是2’ -OH取代的。盡管這樣的修飾產(chǎn)生適于篩選的配體分子，但是高2’羥基含量卻使它們并不適于作為藥物開發(fā)候選者，這是因?yàn)橐韵率聦?shí)這些位置對(duì)體內(nèi)核酸酶降解非常敏感，限制了胃腸外給予之后所能達(dá)到的最大濃度以及它們的循環(huán)半衰期。因此，一旦例如通過SELEX方法鑒定了功能性序列后，就可通過評(píng)價(jià)取代對(duì)配體結(jié)構(gòu)、功能和穩(wěn)定性的影響來測(cè)試單個(gè)殘基對(duì)這些取代的耐受性。在某些實(shí)施方案中，組成配體的核酸包含經(jīng)修飾的糖和/或經(jīng)修飾的堿基。在某些實(shí)施方案中，修飾包括穩(wěn)定化修飾，例如2’ -穩(wěn)定化修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，2’ -穩(wěn)定化修飾可包括在糖環(huán)上的2’ -氟代、2’脫氧或2’ -0-甲基修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)包括降低配體或調(diào)節(jié)劑或這兩者的2'-羥基含量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)包括降低配體或調(diào)節(jié)劑或這兩者的2’ -氟含量。在另一個(gè)實(shí)施方案中，設(shè)計(jì)包括提高配體或調(diào)節(jié)劑或這兩者的2’ -0-甲基含量。寡核苷酸可包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的堿基部分，其選自包括但不限于以下的堿基部分5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、4-乙?；奏?、5_(羧基羥甲基)尿嘧啶、5-羧基甲氨基甲基硫代尿苷、5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、β-D-半乳糖基辮苷、肌苷、Ν6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基鳥嘌呤、1-甲基肌苷、2， 2- 二甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2 α-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基辮苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-Ν&異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶氧乙酸、懷丁苷(wybutoxosine)、假尿嘧啶、辮苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲基酯、尿嘧啶氧乙酸(v)、5-甲基硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N羧基丙基)和2，6_ 二氨基嘌呤。本文所述的配體和調(diào)節(jié)劑的寡核苷酸可包含經(jīng)修飾的糖基，例如，一個(gè)或多個(gè)羥基被鹵素、脂族基團(tuán)置換或官能化為醚或胺。在一個(gè)實(shí)施方案中，呋喃糖殘基的2'-位被 0-甲基、0-烷基、0-烯丙基、S-烷基、S-烯丙基或鹵基中的任何一個(gè)取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸配體或調(diào)節(jié)劑可包含至少一個(gè)選自包括但不限于以下的經(jīng)修飾的糖部分阿拉伯糖、2-氟代阿拉伯糖、木酮糖、己糖、2'-氟代核糖、2' -0-甲基核糖、2' -0-甲氧基乙基核糖、2' -0-丙基核糖、2' -0-甲巰基乙基核糖、2' -0-二乙氨基氧乙基核糖、 2' -0-(3-氨基丙基)核糖、2' -0-( 二甲氨基丙基)核糖、2' -0-(甲基乙酰氨基)核糖和2' -0-( 二甲氨基乙氧基乙基)核糖。配體或調(diào)節(jié)劑可包含至少一個(gè)選自包括但不限于以下的經(jīng)修飾的磷酸主鏈硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、膦酸甲酯、烷基磷酸三酯和甲縮醛(formacetal)或其類似物。還可通過用更穩(wěn)定的環(huán)結(jié)構(gòu)取代一個(gè)或多個(gè)核酸環(huán)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步穩(wěn)定包含莖和環(huán)結(jié)構(gòu)的配體分子，用于治療用途。例如，對(duì)于本文所述的GPVI配體，發(fā)現(xiàn)用六甘醇間隔基取代環(huán)2，導(dǎo)致具有類似親和力的GPVI配體和具有核苷酸基環(huán)的抗GPVI配體。圖13A顯示在合成中使用的用于六甘醇接頭的起始亞磷酰胺。圖13B顯示當(dāng)摻入到核酸配體的兩個(gè)核苷酸之間時(shí)的六甘醇間隔基。在藥物組合物中可提供配體，其形式例如改進(jìn)溶解度或生物利用度的鹽形式。本發(fā)明的任何寡核苷酸都可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法來合成，例如通過使用自動(dòng)化DNA合成儀(例如可購自例如Biosearch，Applied Biosystems)。配體和修飾劑(modifier)在本文中用技術(shù)人員容易理解并記錄如下的縮略語來描述“rA”是2' OH A或腺苷；“A”是2’-脫氧A或2’-脫氧腺苷；“mA”是2' -0-甲基A或2’-甲氧基-2’-脫氧腺嘌呤；“rG”是2' -OH G或鳥苷；“G”是2’ -脫氧G或 2’ -脫氧鳥苷；“mG”是2' -0-甲基G或2’-甲氧基-2’脫氧鳥苷；“fC”是2'-氟C或 2’-氟_2’脫氧胞苷；“mC”是2' -0-甲基C或甲氧基-2’-脫氧胞苷；“fU”是2'-氟 U或2’-氟-尿苷；“mU”是2' -0-甲基U或2’-甲氧基-尿苷；“iT”是反向2' H T, (C6L)是己基氨基接頭；(6GLY)是六甘醇間隔基；(PEG40KGL2-N0F)是大約40kDa的支化 PEG(SUNBRIGHT 產(chǎn)品號(hào)GL2-400GS2)，(6FAM)是6-羧基熒光素；(s)是兩個(gè)核苷酸間的硫代磷酸酯鍵。與載體偶聯(lián)GPVI配體也可包含改進(jìn)生物利用度或穩(wěn)定性的修飾。這樣的修飾可包括與可包含但不限于親水性部分或疏水性部分的載體分子綴合。一個(gè)實(shí)例是與核酸序列綴合的聚乙二醇分子。與例如下文所述的聚合物綴合，可限制血漿區(qū)室的分布并增加循環(huán)半衰期。糖修飾，如上所述，可確保穩(wěn)定性，但它們卻不能保證核酸配體為治療活性的足夠藥物動(dòng)力學(xué)。在健康個(gè)體中，配體在IV注射的數(shù)分鐘內(nèi)就被從血漿中清除掉，可能是通過腎排泄。通過將配體與較大的大分子例如聚乙二醇(PEG)綴合，實(shí)現(xiàn)在注射后將完整配體保留在血液中達(dá)數(shù)小時(shí)至數(shù)日。通過將配體包埋在脂質(zhì)體中，也可降低配體的血漿清除率。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，可將GPVI核酸配體或GPVI配體調(diào)節(jié)劑與非免疫原性的高分子量化合物例如聚乙二醇(PEG)或其它水溶性藥學(xué)上可接受的聚合物共價(jià)結(jié)合或以其它方式連接，所述聚合物包括但不限于聚氨基胺(PAMAM)；多糖例如葡聚糖；或聚噁唑啉 (ΡΟΖ)。GPVI核酸配體或GPVI配體調(diào)節(jié)劑可通過共價(jià)鍵與高分子量化合物締合。當(dāng)使用共價(jià)連接時(shí)，高分子量化合物可共價(jià)連接在配體或調(diào)節(jié)劑的多種位置上。在某些實(shí)施方案中， 配體或調(diào)節(jié)劑可包入脂質(zhì)體內(nèi)部，用于給予有需要的宿主。在一個(gè)實(shí)施方案中，將配體或調(diào)節(jié)劑與聚乙二醇(PEG)連接?？蓪⒕垡叶?PEG) 與生物活性化合物綴合，作為“惰性”載體以潛在地(1)延長化合物在循環(huán)中的半衰期，(2) 改變化合物的分布概況和/或C3)偽裝化合物，從而降低其免疫原性潛力并保護(hù)其免遭酶促降解?？蓪⑴潴w或調(diào)節(jié)劑通過共價(jià)鍵與PEG分子連接。例如，可通過馬來酰亞胺或乙烯基砜官能團(tuán)將寡核苷酸配體或調(diào)節(jié)劑與5'-巰基連接。通常，活化PEG和其它活化的水溶性聚合物用適于與治療藥上的所需位點(diǎn)偶聯(lián)的合適活化基團(tuán)來活化。將這些聚合物與活性劑綴合的代表性聚合物試劑和方法是本領(lǐng)域已知的，并進(jìn)一步描述于例如 Zalipsky，S.等，“Use of Functionalized Poly (Ethylene Glycols) for Modification of Polypeptides “載于 Polyethylene Glycol Chemistry Biotechnical and Biomedical Applications, J.M.Harris, Plenus Press, New York(1992)；和 Zalipsky，Advanced Drug Reviews, 1995,16 :157_182。這樣的試劑也有市
佳口。例如，在一個(gè)用于制備酰胺連接的綴合物的方法中，使帶有活化酯(例如NHS酯， 例如mPEG-琥珀酰亞胺基-α -甲基丁酸酯)的水溶性聚合物與活性劑的胺基反應(yīng)，由此得到活性劑與水溶性聚合物之間的酰胺鍵。能與活性氨基反應(yīng)的另外的官能團(tuán)包括例如 N-羥基琥珀酰亞胺基酯、對(duì)硝基苯基碳酸酯、琥珀酰亞胺基碳酸酯、醛、縮醛、N-酮-哌啶酮、馬來酰亞胺、羰基咪唑、氮雜內(nèi)酯類、環(huán)狀酰亞胺硫酮、異氰酸酯、異硫氰酸酯、三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chloride)和鹵素甲酸酯等。在一個(gè)實(shí)施方案中，可將多個(gè)GPVI配體或GPVI配體調(diào)節(jié)劑與一個(gè)PEG分子締合。 配體和調(diào)節(jié)劑可以是相同或不同的序列和修飾。在還一個(gè)實(shí)施方案中，可將多個(gè)PEG分子彼此連接。在該實(shí)施方案中，可將針對(duì)相同GPVI蛋白靶序列或不同GPVI蛋白序列靶標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)GPVI配體或GPVI配體調(diào)節(jié)劑與每個(gè)PEG分子締合。在將對(duì)相同靶標(biāo)具有特異性的多個(gè)配體或調(diào)節(jié)劑與PEG連接的實(shí)施方案中，有可能使相同靶標(biāo)彼此緊密接近，以產(chǎn)生相同靶標(biāo)之間的特異性相互作用。在將對(duì)不同靶標(biāo)具有特異性的多個(gè)配體或調(diào)節(jié)劑與PEG 連接時(shí)，有可能使不同靶標(biāo)彼此緊密接近，以產(chǎn)生靶標(biāo)間的特異性相互作用。盡管用于親水性部分(例如PEG分子)綴合的各種接頭和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，但是以下仍提供了若干實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施方案中，氨基接頭，例如圖14所示的C6己基氨基接頭，即6-(三氟乙酰氨基)己醇O-氰基乙基-N，N-二異丙基)亞磷酰胺，可用于將己基氨基接頭添加到合成寡核苷酸的5’端。以下描述了可用于將接頭添加到合成寡核苷酸上的其它接頭亞磷酰胺以下結(jié)構(gòu)的TFA-氨基C4CED亞磷酰胺(可得自ChemGenes，目錄號(hào)CLP-1453)
權(quán)利要求
1.一種包含第1分離的核酸序列的GPVI配體，其中所述GPVI配體與糖蛋白VI (GPVI) 結(jié)合，且所述GPVI配體包含二級(jí)結(jié)構(gòu)，所述二級(jí)結(jié)構(gòu)在5’ -3’方向上包含第1莖、第1環(huán)、 第2莖、第2環(huán)、第3環(huán)、第3莖和第4環(huán)；并且其中所述第4環(huán)包含UAA0
2.權(quán)利要求1的GPVI配體，其中所述第2環(huán)被間隔基取代。
3.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GPVI配體，其中所述第1核酸包含至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GPVI配體，所述配體與載體綴合。
5.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GPVI配體，其中所述載體是親水性部分。
6.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GPVI配體，其中所述親水性部分是聚乙二醇(PEG)分子。
7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GPVI配體，所述配體包含經(jīng)修飾的磷酸主鏈。
8.權(quán)利要求1的GPVI配體，所述配體包含SEQID NO :69，其中間隔基摻入到SEQ ID NO 69的11位的2’ 0-甲基G與12位的2’ 0-甲基C之間。
9.權(quán)利要求8的GPVI配體，所述配體包含經(jīng)修飾的磷酸主鏈。
10.權(quán)利要求8或9的GPVI配體，所述配體還包含聚乙二醇部分。
11.權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)的GPVI配體，其中所述GPVI配體選自RB569、RB570和 RB571。
12.包含前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的GPVI配體的藥物組合物。
13.—種與GPVI配體特異性結(jié)合的調(diào)節(jié)劑， 其中所述調(diào)節(jié)劑包含第2核酸序列；和其中所述GPVI配體與糖蛋白VI (GPVI)結(jié)合；和其中所述GPVI配體包含包含二級(jí)結(jié)構(gòu)的第1核酸序列，所述二級(jí)結(jié)構(gòu)在5’ -3’方向上包含第1莖、第1環(huán)、第2莖、第2環(huán)、第3環(huán)、第3莖和第4環(huán)；并且其中所述第4環(huán)包含 UAA。
14.權(quán)利要求13的調(diào)節(jié)劑，其中所述第2核酸序列由約IOnt至約50nt組成。
15.包含權(quán)利要求13或14的調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。
16.包含SEQID NO 84的調(diào)節(jié)劑。
17.權(quán)利要求16的調(diào)節(jié)劑，其中所述調(diào)節(jié)劑是RB515。
18.包含權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)的調(diào)節(jié)劑的藥物組合物。
19.治療有效量的GPVI配體在治療血小板介導(dǎo)的病癥中的用途，所述用途包括給予有需要的宿主治療有效量的GPVI配體。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述血小板介導(dǎo)的病癥選自血管病癥、腦血管疾病、血小板介導(dǎo)的炎性病癥、糖尿病相關(guān)疾病或癌癥。
21.權(quán)利要求20的用途，其中所述血管病癥選自急性冠狀動(dòng)脈綜合征、血栓形成、血栓栓塞、外周血管病和短暫性缺血發(fā)作。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述腦血管疾病選自短暫性缺血發(fā)作、缺血性發(fā)作和栓O
23.權(quán)利要求20的用途，其中所述血小板介導(dǎo)的炎性病癥選自關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、銀屑病性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、強(qiáng)直性脊柱炎和硬皮病。
24.權(quán)利要求20的用途，其中所述糖尿病相關(guān)疾病選自糖尿病性視網(wǎng)膜病、糖尿病性血管病、動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性發(fā)作、外周血管病、急性腎損傷和慢性腎衰竭。
25.權(quán)利要求20的用途，其中所述癌癥選自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、腦癌、骨癌禾口肝癌。
26.GPVI配體在調(diào)節(jié)有需要的宿主中的血小板功能的用途，所述用途包括將有效量的所述GPVI配體給予所述宿主。
27.權(quán)利要求沈的用途，其中所述宿主正在接受心臟介入。
28.權(quán)利要求19-27中任一項(xiàng)的用途，所述用途還包括將調(diào)節(jié)劑給予所述宿主，其中所述調(diào)節(jié)劑與所述GPVI配體特異性結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明一般而言涉及調(diào)節(jié)血小板生物學(xué)的藥理學(xué)系統(tǒng)，所述系統(tǒng)基于可與血小板糖蛋白GPVI結(jié)合并調(diào)整其活性以調(diào)節(jié)血小板功能的核酸配體。使用調(diào)節(jié)劑，這些核酸配體也是活性可逆的，所述調(diào)節(jié)劑抑制所述核酸配體的活性以中和該藥理作用并因此恢復(fù)GPVI功能，包括膠原結(jié)合、血小板粘附、膠原誘導(dǎo)的血小板激活和膠原誘導(dǎo)的血小板聚集。本發(fā)明還涉及包含所述核酸配體的組合物、包含所述配體和調(diào)節(jié)劑的組合物，產(chǎn)生所述核酸配體及其調(diào)節(jié)劑的方法，并涉及在藥物治療和診斷過程中使用這些試劑和組合物的方法。
文檔編號(hào)A61P9/10GK102459599SQ201080035295
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者C·P·魯斯科尼, D·布魯克斯, J·M·萊澤, S·L·澤倫科夫斯克 申請(qǐng)人:雷加多生物科學(xué)公司