專利名稱：殺腫瘤的、殺菌的、或殺病毒的巨噬細(xì)胞的激活的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及巨噬細(xì)胞的激活和治療癌癥、細(xì)菌病原體和病毒病原體的方法。尤其，在活體內(nèi)或活體外，將維生素D結(jié)合蛋白(Ge蛋白質(zhì))轉(zhuǎn)化為Gc-巨噬細(xì)胞激活因子 (GcMAF)。GcMAF激活巨噬細(xì)胞，然后激活的巨噬細(xì)胞把癌癥細(xì)胞、細(xì)菌病原體和/或病毒病原體作為靶標(biāo)。兩者擇一地，在活體內(nèi)或活體外，巨噬細(xì)胞通過與GcMAF接觸而被激活?？蛇x擇地，通過將病人血液與一種固定在惰性介質(zhì)上的α -N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體接觸使α -N-乙酰半乳糖胺酶(nagalase)失活。
背景技術(shù)：
對(duì)傳統(tǒng)的治療模式有抵抗力的轉(zhuǎn)移的不受控生長(zhǎng)，是癌癥死亡的一個(gè)主要原因。 轉(zhuǎn)移起因于先前存在于原發(fā)性腫瘤中的特異性惡性腫瘤細(xì)胞的非隨機(jī)擴(kuò)散。這些轉(zhuǎn)移在起源上可以是克隆的，且不同轉(zhuǎn)移能來源于不同祖細(xì)胞。此外，與良性非轉(zhuǎn)移性細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)移性細(xì)胞表現(xiàn)出自發(fā)突變速率增加。該數(shù)據(jù)為多發(fā)性轉(zhuǎn)移對(duì)同種治療模式顯示出不同敏感性的臨床觀察提供了解釋。這些發(fā)現(xiàn)暗示播散性轉(zhuǎn)移的成功治療必須設(shè)法克服腫瘤異質(zhì)性的問題和抵抗力的發(fā)展。適當(dāng)?shù)丶せ畹木奘杉?xì)胞能夠達(dá)到這些苛刻的標(biāo)準(zhǔn)。巨噬細(xì)胞激活后，通過與包含免疫調(diào)制劑的磷脂囊泡(脂質(zhì)體)相互作用而變得具有殺腫瘤的性能。殺腫瘤的巨噬細(xì)胞可在活體內(nèi)和活體外識(shí)別并破壞腫瘤細(xì)胞，而讓非腫瘤細(xì)胞免受傷害。盡管巨噬細(xì)胞辨別致腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的確切機(jī)制是未知的，但是它不依賴于腫瘤細(xì)胞的特性，如免疫原性、轉(zhuǎn)移潛能和對(duì)細(xì)胞毒素藥物的敏感性。而且，巨噬細(xì)胞破壞腫瘤細(xì)胞顯然與腫瘤細(xì)胞抵抗力的發(fā)展不相關(guān)。此外，激活的巨噬細(xì)胞對(duì)形成涉及細(xì)菌和病毒入侵的免疫反應(yīng)是必不可少的。由于在三種反應(yīng)(殺腫瘤，殺細(xì)菌，殺病毒)中激活的機(jī)制是相同的，因此巨噬細(xì)胞的激活在橫跨抗腫瘤、細(xì)菌和病毒挑戰(zhàn)的宿主免疫反應(yīng)中進(jìn)行應(yīng)用。維生素D結(jié)合蛋白，也稱為DBP或Gc蛋白質(zhì)，是動(dòng)物內(nèi)一種進(jìn)化中保守的糖蛋白 (Cooke 和 Haddad, Endocrine Rev. 10 :2941989)。動(dòng)物 DBP 與人 DBP 在血清學(xué)上交叉反應(yīng) (Ogata 等等，Comp. Bioch. Physiol. 90B :193，1988)。在一些物種中，動(dòng)物 DBP 是一種遺傳上多態(tài)的血漿蛋白質(zhì)，其相對(duì)分子質(zhì)量約52，000。在動(dòng)物中，它通常構(gòu)成約0.5%的血漿蛋白質(zhì)。血漿濃度通常為約260 μ g/ml。人DBP (又稱為“組特異性成分”(group specific component)或“Ge蛋白質(zhì)”)的多態(tài)性可以通過凝膠電泳分析確認(rèn)，該分析揭示兩種主要的表型Gcl 和 Gc2 (Hirschfeld 等等，Nature 185 :931，1960)。Gcl 和 Gc2 基因的全部核苷酸編碼序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列已被報(bào)道(Cooke等等，J. Clin. Invest. 76 :2420,1985 ；Yang等等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 :7994,1985)。Gcl 被進(jìn)一步分成 Gclf 和 Gcls 亞型，兩種亞型電泳遷移形成兩條條帶，“快”和“慢” (Svasti等等，Biochem. 18 1611，1979)。巨噬細(xì)胞的激活由隨之增強(qiáng)的吞噬活性表征，其是在宿主抵抗癌癥以及細(xì)菌和病毒病原體的免疫防御機(jī)制的第一個(gè)主要步驟。巨噬細(xì)胞激活需要B和T淋巴細(xì)胞作用，其逐步改變DBP/Gc蛋白質(zhì)，以得到GcMAF。圖1中的反應(yīng)“a”顯示Gc蛋白質(zhì)如何與B-細(xì)胞表達(dá)的β -半乳糖苷酶反應(yīng)以形成一種Gc蛋白質(zhì)中間產(chǎn)物，該產(chǎn)物然后與T-細(xì)胞表達(dá)的唾液酸酶反應(yīng)形成GcMAF。Nagalaseh-N-乙酰半乳糖胺酶)阻斷圖1中反應(yīng)(b)所示的Gc蛋白質(zhì)到 Gc-MAF的轉(zhuǎn)化。Nagalase與Gc蛋白質(zhì)反應(yīng)生成一種去糖基的Gc蛋白質(zhì)產(chǎn)物，該產(chǎn)物阻止GcMAF的形成和隨之發(fā)生的巨噬細(xì)胞的激活。Nagalase由多種癌細(xì)胞和一些細(xì)菌和病毒病原體產(chǎn)生，且是一種癌癥細(xì)胞和其它病原體借以逃避宿主免疫系統(tǒng)的機(jī)制。血液中 Nagalase測(cè)量被用作一種診斷工具，比如，例如在癌癥診斷和治療期間診斷癌癥和監(jiān)測(cè)腫瘤負(fù)荷。GcMAF應(yīng)當(dāng)與T-細(xì)胞淋巴因子巨噬細(xì)胞激活因子(也稱為Y -干擾素)進(jìn)行區(qū)分，T細(xì)胞淋巴因子巨噬細(xì)胞激活因子由產(chǎn)淋巴因子T細(xì)胞少量產(chǎn)生，或在藥品級(jí)水平由基因工程獲得。Yamamoto 在 US 5，177，001 ；5，177，002 ；5，326，749 和 6，410，269 中公開了由 Gc 蛋白質(zhì)生成GcMAF的方法以及生成CdMAF的Gc蛋白質(zhì)的較小結(jié)構(gòu)域。由Yamamoto制備的巨噬細(xì)胞激活因子(MAF)產(chǎn)物然后被注射到病人中治療癌癥和其它病原性疾病。本發(fā)明提供一種新的處理方法，即通過在活體內(nèi)或活體外處理激活病人自身巨噬細(xì)胞，其中巨噬細(xì)胞與MAF接觸或Gc蛋白質(zhì)與產(chǎn)GcMAF的酶接觸。病人血液富含白細(xì)胞的部分與MAF和/ 或酶接觸，該酶被固定化在一種惰性載體/介質(zhì)上，比如，單采血成分(apheretic)裝置或微流控裝置內(nèi)的聚合物微珠或薄膜。此外，通過將一種α-N-乙酰半乳糖胺酶配體固定到一種固體載體上并使血液與固定化α-N-乙酰半乳糖胺酶配體接觸，可從病人血液中去除 α -N-乙酰半乳糖胺酶。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明制備和使用的GcMAF是在活體內(nèi)和/或活體外由DBP/Gc蛋白質(zhì)在治療中產(chǎn)生，DBP/Gc蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物血液的血漿中循環(huán)。此外，根據(jù)本發(fā)明α-N-乙酰半乳糖胺酶可從病人血液中去除，從而降低α "N-乙酰半乳糖胺酶在體內(nèi)GcMAF生產(chǎn)上的抑制效應(yīng)。此處我們?cè)斒鲈诨铙w內(nèi)和活體外依靠裝置采用不同的處理全血和血漿的策略激活巨噬細(xì)胞的方法，所述的不同的處理全血和血漿的策略都是基于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)的單采血液成分(apheretic)和/或微流控原則。關(guān)于這一點(diǎn)本發(fā)明包括一種體外處理方法，其中病人的血液和/或血漿在體外進(jìn)行處理，并返回病人的血管系統(tǒng)。兩者擇一地，一種微流控裝置可被植入身體中以處理巨噬細(xì)胞和/或血漿。策略#1 實(shí)施標(biāo)準(zhǔn)白細(xì)胞除去法從哺乳動(dòng)物中去除500cc富含白細(xì)胞的血漿。然后使富含白細(xì)胞的血漿通過一個(gè)包含固定化GcMAF或α -N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體或兩者的表面。作為直接接觸固定化GcMAF的一種副作用，巨噬細(xì)胞將被激活。利用α-N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體將α-N-乙酰半乳糖胺酶從血漿中去除，α-N-乙酰半乳糖胺酶對(duì)巨噬細(xì)胞激活的任意更長(zhǎng)期的抑制效應(yīng)將得到減輕。如此處理過的富含白細(xì)胞的血漿被重新輸回到哺乳動(dòng)物以治療細(xì)菌感染、病毒感染(比如丙型肝炎)或惡性腫瘤。策略#2 哺乳動(dòng)物的血液通過一個(gè)單采血液成分過濾器(apheretic filter)，所述的單采血液成分過濾器包含一個(gè)流化床，該流化床由(a)與α-N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體結(jié)合的微珠，(b)與半乳糖苷酶結(jié)合的微珠，(c)與唾液酸酶或α-甘露糖苷酶結(jié)合的微珠，或(a)、(b)和(c)的組合組成。當(dāng)與半乳糖苷酶和唾液酸酶結(jié)合的微珠將用于使哺乳動(dòng)物自身的Gc蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為GcMAF以用于巨噬細(xì)胞的激活時(shí)，免疫抑制的 α-N-乙酰半乳糖胺酶將被結(jié)合在過濾器中以降低其系統(tǒng)效應(yīng)。然后如此處理過的血液被重新輸回到哺乳動(dòng)物(病人)以治療細(xì)菌感染、病毒感染(比如丙型肝炎)或惡性腫瘤。策略#3 在一個(gè)微流控裝置中有一個(gè)表面，該表面含有固定化GcMAF，該表面通常被呈現(xiàn)給白細(xì)胞，因此巨噬細(xì)胞被激活。兩者擇一地，使血漿通過含固定化半乳糖苷酶和固定化唾液酸酶的表面，以將病人自身的血漿Gc蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為GcMAF。此外，相同表面還可以呈現(xiàn)α -N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體，以減少其系統(tǒng)抑制劑的效應(yīng)。


圖1顯示(a)Gc蛋白質(zhì)與B-細(xì)胞和T-細(xì)胞產(chǎn)生的酶反應(yīng)，得到巨噬細(xì)胞激活因子(MAF)，(b)Gc蛋白質(zhì)在α-N-乙酰半乳糖胺酶作用下的去糖基化反應(yīng)，和(c)Gc蛋白質(zhì)與固定化酶的反應(yīng)。圖2是一種流程圖，描述借助一種微流控設(shè)備對(duì)哺乳動(dòng)物血液進(jìn)行的各種處理。
具體實(shí)施例方式
權(quán)利要求
1.一種通過體外系統(tǒng)的使用激活巨噬細(xì)胞在哺乳動(dòng)物內(nèi)誘導(dǎo)殺腫瘤、殺細(xì)菌或殺病毒反應(yīng)的方法，該方法包括使哺乳動(dòng)物血液的白細(xì)胞部分與(a)GcMAF或(b) —種或多種酶接觸，所述的酶由Gc蛋白質(zhì)前體生成內(nèi)源性GcMAF。
2.一種通過體外系統(tǒng)的使用激活巨噬細(xì)胞在哺乳動(dòng)物內(nèi)誘導(dǎo)殺腫瘤、殺細(xì)菌或殺病毒反應(yīng)的方法，該方法包括通過在體外系統(tǒng)中引入一種固定在一種惰性介質(zhì)上的α -N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體來降低哺乳動(dòng)物血漿的α "N-乙酰半乳糖胺酶水平。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中GcMAF固定在一種惰性介質(zhì)上且巨噬細(xì)胞被暴露給固定化GcMAF，借以激活巨噬細(xì)胞。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中一種或多種酶為β-半乳糖苷酶、唾液酸酶、α-甘露糖苷酶或它們的一種組合，且所述酶被固定在一種惰性介質(zhì)上。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的惰性介質(zhì)是一種中空纖維，一種大孔微珠，一種纖維素基纖維，一種合成纖維，一種硅基顆粒，一種合成薄膜，一個(gè)覆有一種生理中性物質(zhì)的表面，一種多聚不飽和磷脂酰膽堿，或一個(gè)聚合物表面。
6.如權(quán)利要求2所述的方法，其中一種合適的結(jié)合配體為一種能與目標(biāo)物特異性地自然結(jié)合的結(jié)合配偶體的一個(gè)片段，一種單克隆抗體，一種多克隆抗體，一種設(shè)計(jì)者合成縮氨酸，一種重組產(chǎn)生的單克隆抗體或一種重組產(chǎn)生的多克隆抗體。
7.—種通過微流控系統(tǒng)的使用激活巨噬細(xì)胞在哺乳動(dòng)物內(nèi)誘導(dǎo)殺腫瘤、殺細(xì)菌或殺病毒反應(yīng)的方法，該方法包括在哺乳動(dòng)物內(nèi)植入一個(gè)微流控裝置，所述的微流控裝置允許白細(xì)胞部分接觸到GcMAF或者一種或多種酶，所述的酶能由Gc蛋白質(zhì)前體生成內(nèi)源性GcMAF。
8.—種通過微流控系統(tǒng)的使用激活巨噬細(xì)胞在哺乳動(dòng)物內(nèi)誘導(dǎo)殺腫瘤、殺細(xì)菌或殺病毒反應(yīng)的方法，該方法包括在哺乳動(dòng)物內(nèi)植入一個(gè)微流控裝置，所述的微流控裝置通過引入一種固定在一種惰性介質(zhì)上的α-N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體來降低哺乳動(dòng)物血漿的 α -N-乙酰半乳糖胺酶水平。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中一種合適的結(jié)合配體為一種能與目標(biāo)物特異性地自然結(jié)合的結(jié)合配偶體的一個(gè)片段，一種單克隆抗體，一種多克隆抗體，一種設(shè)計(jì)者合成縮氨酸，一種重組產(chǎn)生的單克隆抗體或一種重組產(chǎn)生的多克隆抗體。
10.如權(quán)利要求7所述的方法，其中GcMAF被固定在一種惰性介質(zhì)上，且巨噬細(xì)胞被暴露給固定化GcMAF。
11.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的一種或多種酶為β-半乳糖苷酶、唾液酸酶、 α -甘露糖苷酶或它們的一種組合，且所述酶被固定在一種惰性介質(zhì)上。
12.如權(quán)利要求7所述的方法，其中惰性介質(zhì)可以是一種中空纖維，一種大孔微珠，一種纖維素基纖維，一種合成纖維，一種硅基顆粒，一種合成薄膜，一個(gè)覆有一種生理中性物質(zhì)的表面，一種多聚不飽和磷脂酰膽堿，或一個(gè)聚合物表面。
13.如權(quán)利要求7所述的方法，其中微流控裝置被植入哺乳動(dòng)物的血管系統(tǒng)。
14.如權(quán)利要求7所述的方法，其中微流控裝置連接到一個(gè)耐用泵、一個(gè)耐用血漿分離器、一個(gè)耐用電源，并通過標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)管與血管系統(tǒng)連接，如此以致哺乳動(dòng)物能充分地走動(dòng)且不受支撐系統(tǒng)的限制。
15.一種用于處理病人血漿的體外裝置，該裝置包含一種固定在一種惰性材料上的 α -N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體，因此在病人血液中循環(huán)的α -N-乙酰半乳糖胺酶能與α -N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體結(jié)合。
16.一種用于處理病人血液的體外裝置，該裝置包含固定在一種惰性材料上的巨噬細(xì)胞激活因子(MAF)，因此在病人血液中循環(huán)的巨噬細(xì)胞被MAF激活。
17.一種用于處理病人血漿的體外裝置，該裝置包含固定在一種惰性材料上的酶，因此在病人血漿中循環(huán)的Gc蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)化為GcMAF。
18.如權(quán)利要求16所述的體外裝置，其中固定在惰性材料上的酶包括(a)—種半乳糖苷酶和(b) —種唾液酸酶，一種α -甘露糖苷酶或唾液酸酶和α-甘露糖苷酶兩者。
全文摘要
本發(fā)明公開了巨噬細(xì)胞的激活以及治療癌癥、細(xì)菌病原體和病毒病原體的方法。尤其，在活體內(nèi)或活體外，維生素D結(jié)合蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)化為維生素D結(jié)合蛋白質(zhì)-巨噬細(xì)胞激活因子(GcMAF)。GcMAF激活巨噬細(xì)胞，然后巨噬細(xì)胞能以癌癥細(xì)胞、細(xì)菌病原體和/或病毒病原體為靶標(biāo)。兩者擇一地，巨噬細(xì)胞通過在活體內(nèi)或活體外接觸GcMAF而被激活。視情況需要，在接受本發(fā)明的巨噬細(xì)胞激活處理的病人中，可以通過將病人的血液與一種固定在一種惰性介質(zhì)上的α-N-乙酰半乳糖胺酶結(jié)合配體接觸使α-N-乙酰半乳糖胺酶失活。
文檔編號(hào)A61K47/48GK102596223SQ201080037404
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月22日
發(fā)明者查爾斯·肯尼薩維奇, 羅伯特·希爾維茲 申請(qǐng)人:查爾斯·肯尼薩維奇, 羅伯特·希爾維茲