專利名稱：：重組rsv抗原的制作方法重組RSV抗原相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求2010年5月13日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/334，568和2009年6月M日提交的61/219，964的較早申請(qǐng)日的權(quán)利，所述申請(qǐng)的公開內(nèi)容通過(guò)引用并入本文。依照37C.F.R.§1.71(E)的版權(quán)通告本專利文件的部分公開內(nèi)容含有受到版權(quán)保護(hù)的材料。版權(quán)所有者不反對(duì)專利文件或?qū)＠_中使用的提交到IntentandTrademarkOffice的專利文件或記錄中出現(xiàn)的任何復(fù)制件，但除此之外保留所有版權(quán)利。背景本公開涉及免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地說(shuō)，本公開涉及用于引發(fā)對(duì)呼吸道合胞病毒(RSV)的特異免疫反應(yīng)的組合物和方法。人呼吸道合胞病毒(RSV)是全球6個(gè)月以下嬰兒和妊娠期短于或等于35周的早產(chǎn)兒中下呼吸道感染(LRI)的最常見(jiàn)病因。RSV疾病的譜系包括多種呼吸道癥狀，從鼻炎和中耳炎到肺炎及毛細(xì)支氣管炎，后兩種疾病引起相當(dāng)高的發(fā)病率和死亡率。人類是唯一已知的RSV貯主。被污染的鼻分泌物中的病毒通過(guò)大的呼吸道飛沫進(jìn)行傳播，因此傳播需要與被感染個(gè)體或被污染表面的緊密接觸。RSV可以在玩具或其它物品上存活幾個(gè)小時(shí)，這就解釋了特別是在兒科病房中醫(yī)院源性RSV感染的高發(fā)生率。每年全球RSV感染和死亡的數(shù)字據(jù)估計(jì)分別是Mmillion和160，000。僅在美國(guó)，估計(jì)RSV即造成每年18，000到75，000例住院和90到1900例死亡。在溫帶氣候，大量記錄表明RSV是造成每年冬天急性LRI流行病，包括毛細(xì)支氣管炎和肺炎的原因。在美國(guó)，幾乎所有兒童到兩歲時(shí)均感染過(guò)RSV。RSV相關(guān)LRI在除此以外健康的兒童中的發(fā)生率據(jù)計(jì)算是兩歲前每1000個(gè)兒童年齡有37例(小于6個(gè)月的嬰兒中是每1000個(gè)兒童年齡有45例)，住院風(fēng)險(xiǎn)是每1000個(gè)兒童年齡有6個(gè)(每1000個(gè)6個(gè)月以下兒童年齡)。在患有心肺疾病和早產(chǎn)的兒童中發(fā)生率更高，這些兒童構(gòu)成了美國(guó)RSV相關(guān)入院的幾乎一半。經(jīng)歷過(guò)RSV引起的更嚴(yán)重LRI的兒童以后發(fā)生兒童期哮喘的幾率增加。這些研究展示了在工業(yè)化國(guó)家，由于對(duì)患有嚴(yán)重LRI及其后遺癥的患者的護(hù)理成本極高，對(duì)RSV疫苗及其使用的廣泛需求。RSV還逐漸被認(rèn)為是造成老年人中流感樣疾病的重要原因。已嘗試了各種方法希望產(chǎn)生安全有效的RSV疫苗，能夠在健康和有風(fēng)險(xiǎn)的群體中引發(fā)持久和保護(hù)性的免疫反應(yīng)。但是目前為止，評(píng)估過(guò)的候選物中沒(méi)有一個(gè)被證明作為預(yù)防RSV感染和/或減少或預(yù)防RSV疾病，包括下呼吸道感染(LRIs)的疫苗是安全有效的。發(fā)明概述本公開涉及重組呼吸道合胞病毒(RSV)抗原。更具體地說(shuō)，本公開涉及包含重組F蛋白的抗原，其中所述F蛋白經(jīng)過(guò)修飾以便穩(wěn)定三聚體融合前構(gòu)象。公開的重組抗原表現(xiàn)出極佳的免疫原性，尤其適合作為抗RSV感染和/或疾病的免疫原性組合物(例如疫苗)的成分。還公開了編碼所述重組抗原的核酸、含有抗原的免疫原性組合物，以及制備和使用抗原的方法。附圖簡(jiǎn)述圖IA是突出RSVF蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的示意圖。圖IB是示范性RSVPrefusionF(PreF)抗原的示意圖。圖2的線狀圖顯示了PreF的非對(duì)稱場(chǎng)流分離(asymmetricalfieldflowfractionation)(AFF-MALS)分析的代表性結(jié)果。圖3的條形圖顯示了I^reF抗原對(duì)人血清的中和抑制。圖4A和B的條形圖顯示了小鼠應(yīng)答I^reF抗原引發(fā)的血清IgG效價(jià)。圖5A和B的條形圖顯示了I^reF抗原引發(fā)的RSV特異中和抗體的效價(jià)。圖6A和B顯示了RSVPreF抗原給小鼠提供的抗攻擊保護(hù)作用。圖7評(píng)估了免疫和攻擊后的BAL白細(xì)胞。圖8的條形圖展示了用和水包油乳劑(AS03)稀釋液一起成劑的I^reF免疫后，弓丨發(fā)的血清IgG。圖9的條形圖展示了用和水包油乳劑(AS03)稀釋液一起成劑的I^reF免疫后，中和抗體的效價(jià)。圖10的條形圖展示了用和水包油乳劑(AS03)稀釋液一起成劑的I^reF免疫后，抗攻擊的保護(hù)作用。發(fā)明詳述Mit在RSV感染的發(fā)病機(jī)制中，宿主免疫反應(yīng)似乎參與其中，這一事實(shí)使得開發(fā)預(yù)防RSV感染的疫苗復(fù)雜化。1960年代的研究顯示接種過(guò)福爾馬林滅活的RSV疫苗的兒童在以后接觸到病毒時(shí)比未接種的對(duì)照個(gè)體病情更嚴(yán)重。這些早期試驗(yàn)導(dǎo)致80%接種兒童入院和兩例死亡。在動(dòng)物模型中也發(fā)生疾病嚴(yán)重程度增加的現(xiàn)象，被認(rèn)為是由于血清中和抗體水平不夠、缺乏局部免疫，以及肺嗜酸粒細(xì)胞增多癥(pulmonaryeosinophilia)過(guò)度誘發(fā)2型輔助T細(xì)胞樣(TM)免疫反應(yīng)和IL-4和IL-5細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加。相反，抗RSV感染的成功疫苗誘發(fā)的是Thl型免疫反應(yīng)，其特點(diǎn)在于產(chǎn)生IL-2和Y-干擾素(IFN)。本公開涉及重組呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，所述重組抗原解決了以前疫苗中使用的RSV抗原遇到的問(wèn)題，改善了抗原的免疫學(xué)和制備性能。本文公開的重組RSV抗原涉及包含可溶性F蛋白多肽的Fusion(F)蛋白類似物，其中所述F蛋白多肽經(jīng)過(guò)改造以便穩(wěn)定G蛋白的融合前構(gòu)象，即在與宿主細(xì)胞膜融合前，成熟組織的F蛋白的構(gòu)象。為了清楚簡(jiǎn)潔起見(jiàn)，這些F蛋白類似物被命名為“I^reF”或“PreF抗原”。本文公開的抗原是根據(jù)這樣一個(gè)意外發(fā)現(xiàn)而預(yù)測(cè)的，即經(jīng)過(guò)引入異源三聚化結(jié)構(gòu)域而被改造的可溶性F蛋白類似物表現(xiàn)出改進(jìn)的免疫學(xué)特性，并且體內(nèi)給予受試對(duì)象時(shí)是安全并有極高保護(hù)性的。參照本領(lǐng)域廣泛接受的術(shù)語(yǔ)和命名，文中提供了RSVF蛋白的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，并在圖IA中進(jìn)行了圖示。圖IB提供了示范性抗原的示意圖。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，根據(jù)本文提供的教導(dǎo)，可以將任何RSVF蛋白通過(guò)修飾來(lái)穩(wěn)定其融合前構(gòu)象。因此，為了促進(jìn)對(duì)指導(dǎo)I^reF抗原產(chǎn)生原理的理解，根據(jù)示范性F蛋白來(lái)說(shuō)明各個(gè)結(jié)構(gòu)成分，SEQIDNOs1和2分別給出了示范性F蛋白的多核苷酸和氨基酸序列。類似地，適用的情況下，參考示范性G蛋白來(lái)描述G蛋白抗原，SEQIDNOs:3和4分別提供了示范性G蛋白的多核苷酸和氨基酸序列。參考F蛋白多肽的一級(jí)氨基酸序列(圖1A)，使用以下名詞描述抗原的結(jié)構(gòu)特征。名詞FO是指全長(zhǎng)翻譯出來(lái)的F蛋白前體。FO多肽可以劃分為被中間的稱為ρ印27的肽分隔開的F2結(jié)構(gòu)域和Fl結(jié)構(gòu)域。在成熟過(guò)程中，F(xiàn)O多肽在位于F2和Fl之間并側(cè)接pep27的兩個(gè)弗林蛋白酶位點(diǎn)發(fā)生蛋白水解切割。為了以下討論，F(xiàn)2結(jié)構(gòu)域包括F蛋白中氨基酸1-109的至少一部分和甚至全部，F(xiàn)l結(jié)構(gòu)域的可溶性部分包括氨基酸137-526的至少一部分和甚至全部。正如以上指出的，這些氨基酸位點(diǎn)(和文中之后指定的所有氨基酸位點(diǎn))是參考SEQIDNO2所示的示范性F蛋白前體多肽(FO)給出的。融合前F(或“PreF”)抗原是可溶性的(即不是膜結(jié)合的)F蛋白類似物，其包含至少一個(gè)能夠穩(wěn)定F蛋白融合前構(gòu)象的修飾，這樣RSV抗原可以保持F蛋白融合前構(gòu)象的至少一個(gè)免疫優(yōu)勢(shì)表位?？扇苄訤蛋白多肽包含RSVF蛋白的F2結(jié)構(gòu)域和Fl結(jié)構(gòu)域(但不包含RSVF蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域)。在示范性實(shí)施方案中，F(xiàn)2結(jié)構(gòu)域包括F蛋白的氨基酸26-105,Fl結(jié)構(gòu)域包括氨基酸137-516。但也可以使用較小的部分，只要能夠維持穩(wěn)定I^reF抗原的三維構(gòu)象。類似地，也可以用包含其他結(jié)構(gòu)成分的多肽(例如，融合多肽)來(lái)代替示范性F2和Fl結(jié)構(gòu)域，只要所述其他成分不會(huì)破壞三維構(gòu)象，或者以其他方式對(duì)抗原的穩(wěn)定性、生產(chǎn)或加工有負(fù)面影響、或者降低免疫原性。F2和Fl結(jié)構(gòu)域處于N-端到C-端的方向，這種設(shè)計(jì)是為了使F蛋白類似物折疊和組裝成熟融合前構(gòu)象。為了增加產(chǎn)量，F(xiàn)2結(jié)構(gòu)域前面可以添加分泌信號(hào)肽，比如天然F蛋白信號(hào)肽或者能夠增強(qiáng)在表達(dá)重組抗原的宿主細(xì)胞中生產(chǎn)和分泌的異源信號(hào)肽。I^reF抗原通過(guò)引入一或多個(gè)修飾得以(三聚體融合前構(gòu)象)穩(wěn)定，比如添加、缺失或替代一或多個(gè)氨基酸。一個(gè)這類穩(wěn)定修飾是添加包含異源穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在示范性實(shí)施方案中，所述異源穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域是蛋白多聚化結(jié)構(gòu)域。所述蛋白多聚化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)特別合適的例子是卷曲螺旋(coiled-coil)結(jié)構(gòu)域，比如促進(jìn)含有這類結(jié)構(gòu)域的多個(gè)多肽三聚化的異亮氨酸拉鎖結(jié)構(gòu)域。示范性異亮氨酸拉鎖結(jié)構(gòu)域如SEQIDN0:11所示。一般來(lái)說(shuō)，異源穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域位于Fl結(jié)構(gòu)域的C端。任選地，多聚化結(jié)構(gòu)域經(jīng)由短的氨基酸連接序列，比如序列GG與Fl結(jié)構(gòu)域連在一起。連接肽還可以說(shuō)較長(zhǎng)的連接分子(例如，包含序列GG的連接肽，比如氨基酸序列GGSGGSGGS；SEQIDNO:14)。本領(lǐng)域已知的許多構(gòu)象上是中性的連接肽可以用于這種情況，而不破壞I^reF抗原的構(gòu)象。另一種穩(wěn)定修飾是去除位于天然FO蛋白中F2和Fl結(jié)構(gòu)域之間的弗林蛋白酶的識(shí)別和切割位點(diǎn)。通過(guò)缺失或者取代弗林酶識(shí)別位點(diǎn)中的一或多個(gè)氨基酸，可以消除位于位點(diǎn)105-109和位點(diǎn)133-136的弗林酶識(shí)別位點(diǎn)中的一個(gè)或兩者，這樣蛋白酶不能將PreF多肽切割成它的組成結(jié)構(gòu)域。任選地，還可以將之間的ρ印27肽除去或者用例如連接肽替代。此外或者任選地，可以除去或取代靠近融合肽的非弗林酶切割位點(diǎn)(例如，位點(diǎn)112-113處的金屬蛋白酶位點(diǎn))。穩(wěn)定突變的另一個(gè)例子是在F蛋白的疏水結(jié)構(gòu)域中添加或取代親水氨基酸。通常，在疏水區(qū)域內(nèi)添加帶電荷的氨基酸(比如賴氨酸)或者用它取代中性殘基(比如亮氨酸)。例如，在F蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的HRB卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域內(nèi)添加親水氨基酸或者用親水氨基酸取代疏水或中性氨基酸。作為一個(gè)例子，可以用帶電荷的氨基酸殘基，比如賴氨酸取代F蛋白中位點(diǎn)512的亮氨酸。替代地或者此外地，可以在F蛋白的HRA結(jié)構(gòu)域內(nèi)添加親水氨8基酸，或者用親水氨基酸取代疏水或中性氨基酸。例如，可以在I^reF抗原位點(diǎn)105-106(例如對(duì)應(yīng)參照序列SEQIDNO2中的殘基105的氨基酸后面的，比如氨基酸105和106之間的位點(diǎn))或者附近加入一或多個(gè)帶電荷的氨基酸，比如賴氨酸。任選地，HRA和HRB結(jié)構(gòu)域中都可以添加或取代親水氨基酸。替代地，可以缺失一或多個(gè)疏水殘基，只要I^reF抗原整體構(gòu)象不被損害。此外或者替代地，可以進(jìn)行能夠改變I^reF抗原糖基化狀態(tài)的一或多個(gè)修飾。例如，可以將天然RSVF蛋白中存在的糖基化位點(diǎn)的一或多個(gè)氨基酸(例如在相對(duì)SEQIDNO2的氨基酸殘基500處或者附近)缺失或取代(或者可以添加氨基酸使得糖基化位點(diǎn)被破壞)，從而增加或減少I^reF抗原的糖基化情況。例如，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2中位點(diǎn)500-502的氨基酸可以選自NGS、NKS、NGT和NKT。因此，在某些實(shí)施方案中，PreF抗原含有的可溶性F蛋白多肽包含RSVF蛋白多肽的F2結(jié)構(gòu)域(例如，對(duì)應(yīng)SEQIDNO:2中的氨基酸沈_105of)和Fl結(jié)構(gòu)域(例如，對(duì)應(yīng)SEQIDNO2中的氨基酸137-516)，其中引入了至少一個(gè)使糖基化改變的修飾。RSVI^reF抗原通常在F2結(jié)構(gòu)域和Fl結(jié)構(gòu)域之間包含完整的融合肽。任選地，PreF抗原包含信號(hào)肽。正如以上公開的，這些F蛋白多肽可以包含至少一個(gè)選自以下的修飾(i)添加包含異源三聚化結(jié)構(gòu)域(比如異亮氨酸拉鎖結(jié)構(gòu)域)的氨基酸序列；(ii)缺失至少一個(gè)弗林酶切割位點(diǎn)；(iii)缺失至少一個(gè)非弗林酶切割位點(diǎn)；(iv)缺失pep27結(jié)構(gòu)域中的一或多個(gè)氨基酸；和(ν)在F蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的疏水結(jié)構(gòu)域中取代或添加至少一個(gè)親水氨基酸。正如以上公開的，這類糖基化修飾過(guò)的RSVI^reF抗原可以組裝成多聚體，例如三聚體。在示范性實(shí)施方案中，糖基化修飾過(guò)的I^reF抗原選自a)包含SEQIDNO:22或由其構(gòu)成的多肽；b)SEQIDN0:21或者與SEQIDNO:21在嚴(yán)緊條件下幾乎全長(zhǎng)雜交的多核苷酸序列所編碼的多肽；c)與SEQIDNO22有至少95%序列同一性的多肽。任何和/或所有穩(wěn)定修飾可以單獨(dú)使用或者與本文公開的任何其他穩(wěn)定修飾組合使用來(lái)產(chǎn)生I^reF抗原。在示范性實(shí)施方案中，PreF蛋白含有的多肽包含F(xiàn)2結(jié)構(gòu)域和Fl結(jié)構(gòu)域，并且在F2結(jié)構(gòu)域和Fl結(jié)構(gòu)域之間沒(méi)有居中的弗林酶切割位點(diǎn)，還有位于Fl結(jié)構(gòu)域C端的異源穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域(例如三聚化結(jié)構(gòu)域)。某些實(shí)施方案中，PreF抗原在疏水HRA和/或HRB結(jié)構(gòu)域中還包含一或多個(gè)親水殘基的添加和/或取代。任選地，PreF抗原含有至少一個(gè)非弗林酶切割位點(diǎn)，比如金屬蛋白酶位點(diǎn)的修飾。I^reF抗原任選包含其他多肽成分，包括RSVG蛋白的至少免疫原性部分。即在某些實(shí)施方案中，I^reF抗原是既包含F(xiàn)蛋白也包含G蛋白成分的嵌合蛋白。F蛋白成分可以是任何以上描述的I^reF抗原，選中的G蛋白成分是RSVG蛋白的有免疫原活性的部分(最多和/或包含全長(zhǎng)G蛋白)。在示范性實(shí)施方案中，G蛋白多肽包含G蛋白的氨基酸149-229(其中氨基酸位點(diǎn)參照SEQIDNO:4所代表的G蛋白序列指定)。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可以使用更小的G蛋白部分或片段，只要選中的部分保留了較大G蛋白片段的優(yōu)勢(shì)免疫特征。特別是選中的片段保留位于大約氨基酸位點(diǎn)184-198(例如氨基酸180-200)之間的免疫優(yōu)勢(shì)表位，并且長(zhǎng)度足夠折疊和組裝成展示免疫優(yōu)勢(shì)表位的穩(wěn)定構(gòu)象。也可以使用更長(zhǎng)的片段，例如從大約氨基酸1到大約氨基酸229，甚至全長(zhǎng)的G蛋白。只要在宿主細(xì)胞內(nèi)重組產(chǎn)生時(shí)，選擇的片段在嵌合蛋白中折疊成穩(wěn)定構(gòu)象，并且不干擾到蛋白的產(chǎn)生、力口工或穩(wěn)定性。任選地，G蛋白成分經(jīng)由短的氨基酸連接序列，例如序列GG與F蛋白成分連接。連接肽還可以是較長(zhǎng)的連接分子(比如氨基酸序列GGSGGSGGS:SEQIDNO:14)。本領(lǐng)域已知的許多構(gòu)象上是中性的連接肽可以用于這種情況，而不破壞I^reF抗原的構(gòu)象。任選地，G蛋白成分可以包含一或多個(gè)氨基酸取代，所述取代能夠減輕或防止RSV疾病動(dòng)物模型中出現(xiàn)加重的病毒疾病。這就是說(shuō)，G蛋白可以包含氨基酸取代，當(dāng)包含I^reF-G嵌合抗原的免疫原性組合物被給予選自公認(rèn)動(dòng)物模型(例如RSV的小鼠模型)的受試對(duì)象時(shí)，與接受含有未修飾G蛋白的疫苗的對(duì)照動(dòng)物相比，受試對(duì)象表現(xiàn)出的疫苗加重的病毒疾病(例如嗜酸粒細(xì)胞增多、嗜中性粒細(xì)胞增多)的癥狀減輕或者沒(méi)有癥狀。當(dāng)免疫原性組合物在沒(méi)有佐劑的情況下給予時(shí)，這種疫苗加重的病毒疾病的減輕和/或防止可能很明顯(但在抗原例如與強(qiáng)Thl誘發(fā)佐劑一起給予時(shí)，可能不明顯)。此外，給予人受試對(duì)象時(shí)，氨基酸取代可以減輕或防止疫苗加重的病毒疾病。合適的氨基酸取代的例子是用丙氨酸代替位點(diǎn)191的天冬酰胺(氨基酸191的Asn—Ala:N191A)。任選地，任何以上描述的I^reF抗原可以包含協(xié)助純化的其他序列。一個(gè)例子是多聚組氨酸標(biāo)簽。如果需要，可以從終產(chǎn)物中去除這種標(biāo)簽。被表達(dá)時(shí)，PreF抗原進(jìn)行分子內(nèi)折疊并組裝成包含多肽多聚體的成熟蛋白。有益的是PreF抗原多肽組裝成三聚體，所述三聚體效仿成熟加工后的RSVF蛋白的融合前構(gòu)象。本文公開的任何I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)適合用于免疫原性組合物中，以便引發(fā)抗RSV的保護(hù)性免疫反應(yīng)。這種免疫原性組合物一般包含藥物可接受載體和/或賦形劑，比如緩沖液。為了增強(qiáng)給藥后產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，免疫原性組合物一般還包含佐劑。對(duì)用于引發(fā)抗RSV保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫原性組合物(例如疫苗)的情況，組合物包含主要引發(fā)Thl型免疫反應(yīng)的佐劑(Thl型佐劑)是有利的。一般來(lái)說(shuō)，佐劑要選擇適合給予組合物所給予的目標(biāo)群體。因此，根據(jù)應(yīng)用，選擇適合給予例如新生兒或老年人的佐劑。本文描述的免疫原性組合物適合作為疫苗用于減少或預(yù)防RSV感染，而不會(huì)在給藥或接觸RSV后誘發(fā)病理反應(yīng)(比如疫苗加重的病毒疾病)。某些實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含I^reF抗原(比如SEQIDNO6所示的示范性實(shí)施方案)和包含G蛋白成分的第二多肽。G蛋白成分通常至少包含G蛋白的氨基酸149-2四。雖然可以使用更小的G蛋白部分，所述片段應(yīng)當(dāng)最少包含氨基酸184-198的免疫優(yōu)勢(shì)表位。替代地，G蛋白可以包含更大的G蛋白部分，比如氨基酸1觀-2四或130-230，任選是更大的蛋白(比如全長(zhǎng)G蛋白或嵌合多肽)的元件。在其他實(shí)施方案中，免疫原性組合物包含的I^reF抗原是嵌合蛋白，也包含G蛋白成分(比如SEQIDNOs8和10所展現(xiàn)的示范性實(shí)施方案)。這種嵌合I^reF(或I^reF-G)抗原的G蛋白成分一般至少包含G蛋白的氨基酸149-229。正如以上指出的，也可以使用更小或更大的片段(比如氨基酸1四_2四或130-230)，只要保留免疫優(yōu)勢(shì)表位，并且I^reF-G抗原的構(gòu)象不受不利影響。任選地，免疫原性組合物還包含除RSV以外的病原生物體的至少一個(gè)其他抗原。例如，所述病原生物體是除RSV以外的病毒，比如副流感病毒(PIV)、麻疹、乙肝、脊髓灰質(zhì)炎或流感病毒。替代地，病原生物體可以是細(xì)菌，比如白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感嗜血桿菌和肺炎球菌。編碼任何I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)的重組核酸也是本公開的特點(diǎn)。某些實(shí)施方案中，編碼I^reF抗原的核酸的多核苷酸序列經(jīng)過(guò)優(yōu)化以便在選定的宿主(比如CHO細(xì)胞，其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞)中進(jìn)行表達(dá)。相應(yīng)地，載體，包括表達(dá)載體(包括原核和真核表達(dá)載體)也是本公開的特點(diǎn)。類似地，包含這些核酸和載體的宿主細(xì)胞是本公開的特點(diǎn)。所述核酸還可以用于免疫原性組合物給予受試對(duì)象引發(fā)針對(duì)RSV的免疫反應(yīng)。PreF抗原適合用于防止和/或治療RSV感染。因此，本公開的另一個(gè)方面涉及引發(fā)抗RSV的免疫反應(yīng)的方法。所述方法涉及將免疫有效量的含有I^reF抗原的組合物給予受試對(duì)象(比如人或動(dòng)物受試對(duì)象)。給予免疫有效量的組合物能夠引發(fā)對(duì)I^reF抗原是呈遞的表位特異的免疫反應(yīng)。所述免疫反應(yīng)可以包括B細(xì)胞反應(yīng)(例如產(chǎn)生中和抗體)和/或T細(xì)胞反應(yīng)(例如產(chǎn)生細(xì)胞因子)。優(yōu)選地，由I^reF抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)包含對(duì)RSVF蛋白融合前構(gòu)象上呈遞的至少一個(gè)構(gòu)象表位特異的元素?？梢詫^reF抗原和組合物給予受試對(duì)象，而不加重他們與RSV接觸后的病毒疾病。有利地，本文公開的I^reF抗原和恰當(dāng)配制的免疫原性組合物引發(fā)Thl型免疫反應(yīng)，所述免疫反應(yīng)能夠減少或防止RSV感染，和/或減少或防止感染RSV后的病理反應(yīng)。免疫原性組合物可以經(jīng)由多種途徑給藥，包括諸如鼻內(nèi)這樣將I^reF抗原與上呼吸道黏膜直接接觸的途徑。替代地，可以采用更傳統(tǒng)的給藥途徑，比如肌內(nèi)給藥途徑。因此，還考慮了任何公開的RSV抗原(或核酸)在制備治療RSV感染(例如，預(yù)防性治療或防止RSV感染)的藥物中的用途。相應(yīng)地，本公開提供了公開的重組RSV抗原或免疫原性組合物用于醫(yī)藥，以及它們預(yù)防或治療RSV相關(guān)疾病的用途。以下描述和實(shí)施例中呈現(xiàn)了關(guān)于抗原以及它們的使用方法的其他細(xì)節(jié)。名詞為了協(xié)助對(duì)本公開各種實(shí)施方案的審核，特提供以下名詞解釋。根據(jù)本公開的語(yǔ)境可以給出其他名詞和解釋。除非另有說(shuō)明，本文使用的所有科技名詞與本公開所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的意義相同。分子生物學(xué)常見(jiàn)名詞的定義可以在BenjaminLewin,GenesV,OxfordUniversityPress出版，1994(ISBN0-19-854287-9)；Kendrewetal.(eds.)，TheEncyclopediaofMolecularBiology,BlackwellScienceLtd.出版，1994(ISBN0-632-02182-9)；以^RobertA.Meyers(ed.),MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference,VCHPublishers,Inc.出版，1995(ISBN1-56081-569-8)中找到。除非上下文明確另有說(shuō)明，單數(shù)名詞“一個(gè)”(“a”、“an”和“the”)包括復(fù)數(shù)指示物。類似地，單詞“或”意味著包含“和”，除非上下文明確另有說(shuō)明。名詞“復(fù)數(shù)”是指兩個(gè)或以上。還應(yīng)當(dāng)明白，文中給出的核酸或多肽的所有堿基大小或氨基酸大小，以及所有分子量或分子質(zhì)量數(shù)值都是近似值，僅用于描述目的。此外，就物質(zhì)(比如抗原)濃度或水平給出的數(shù)值限制是近似的。因此，濃度被指明是至少(例如)200pg的情況中，是指濃度應(yīng)理解為至少接近(或者“大約”或“”)200pg。雖然與本文描述的方法和材料類似或等同的那些方法和材料可以用于實(shí)踐或測(cè)試本公開，以下描述了合適的方法和材料。名詞“包含”意味著“包括”。因此，除非上下文另有要求，單詞“包含”(“comprises”及其變形，比如“comprise”和“comprising”)理解為表示含有所陳述的化合物或組合物(例如核酸、多肽、抗原)或者步驟，或者一組化合物或步驟；但不排除含有其他化合物、組合物、步驟或一組化合物、組合物或步驟?？s寫“e.g.”來(lái)自拉丁文exempligratia，用于本文表示非限制性的例子。因此，縮寫“e.g.”是名詞“forexample(例如)”的同義詞。人呼吸道合胞病毒(RSV)是副粘病毒科、肺炎病毒亞科、肺病毒屬的病原性病毒。RSV的基因組是編碼11個(gè)蛋白的負(fù)鏈RNA分子。RNA基因組與病毒N蛋白緊密關(guān)聯(lián)形成包裹在病毒包膜內(nèi)的核衣殼。根據(jù)G糖蛋白的抗原性的不同，已有A和B兩組人RSV株被描述。迄今已分離到大量RSV株。GenBank和/或EMBL登錄號(hào)所代表的示范性病毒株可以在W02008114149中找到，為了公開I^reF抗原(包括嵌合I^reF-G抗原)中適合使用的和適合與I^reF抗原組合的RSVF和G蛋白的核酸和多肽序列，通過(guò)引用將該文獻(xiàn)并入本文。還可能分離到其他RSV株，也涵蓋在RSV屬內(nèi)。類似地，RSV的屬涵蓋由遺傳漂變天然發(fā)生(例如以前或者之后鑒定的株)的變體或者人工合成和/或重組產(chǎn)生的變體。名詞“F蛋白”或“Fusion蛋白”或“F蛋白多肽”或“Fusion蛋白多肽”是指具有RSVFusion蛋白多肽的全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。類似地，名詞“G蛋白”或“G蛋白多肽”是指具有RSVAttachment蛋白多肽的全部或部分氨基酸序列的多肽或蛋白質(zhì)。已有許多RSVFusion和Attachment蛋白被描述，是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。W02008114149給出了示范性的F和G蛋白變體(例如，天然變體)，至本公開提交日仍是公開的。當(dāng)“變體”是指核酸或多肽(例如RSVF或G蛋白核酸或多肽，或者核酸或多肽)時(shí)，它是與參照核酸或多肽不同的核酸或多肽。通常，變體和參照核酸或多肽之間的差別與參照物相比，是構(gòu)成比例上很少的差別。多肽或蛋白的“結(jié)構(gòu)域”是多肽或蛋白內(nèi)結(jié)構(gòu)明確的元件。例如，“三聚化結(jié)構(gòu)域”是多肽內(nèi)促進(jìn)多肽組裝成三聚體的氨基酸序列。例如，三聚化結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)關(guān)聯(lián)其他三聚化結(jié)構(gòu)域(氨基酸序列相同或不同的其他多肽)促進(jìn)三聚體的組裝。該名詞還指編碼這類肽或多肽的多核苷酸。名詞“天然”和“天然存在”是指其存在狀態(tài)和在自然界中是一樣的元件，比如蛋白、多肽或核酸。即，元件未被人工改造過(guò)。應(yīng)當(dāng)理解，在本公開的語(yǔ)境中，有許多從例如不同RSV的天然存在株或分離物中獲得的RSV蛋白或多肽的天然/天然存在變體。名詞“多肽”是指一種聚合物，其中的單體是通過(guò)酰胺鍵連接起來(lái)的氨基酸殘基。名詞“多肽”或“蛋白”用于本文意圖涵蓋任何氨基酸序列，并且包括修飾過(guò)的序列，比如糖蛋白。名詞“多肽”特別要包含天然存在的蛋白，以及那些重組或合成產(chǎn)生的蛋白。提到多肽時(shí)的名詞“片段”是指多肽的一部分(即亞序列)。名詞“免疫原性片段”是指保留了全長(zhǎng)參照蛋白或多肽的至少一個(gè)優(yōu)勢(shì)免疫原性表位的所有多肽片段。多肽內(nèi)的方向通常按照N端到C端來(lái)敘述，所述N端到C端的方向是由各個(gè)氨基酸的氨基和羧基部分的方向確定的。多肽的翻譯是從N或氨基端向C或羧基端?！靶盘?hào)肽”是這樣的短氨基酸序列(例如大約18-25個(gè)氨基酸長(zhǎng))，這類序列能夠?qū)⑿潞铣傻姆置诘鞍谆蚰さ鞍滓龑?dǎo)到或者引導(dǎo)著跨過(guò)例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。信號(hào)肽常常但并不永遠(yuǎn)位于多肽的N端，經(jīng)常在蛋白跨膜后被信號(hào)肽酶切割下來(lái)。信號(hào)序列一般含有三個(gè)常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)特征N-端極性堿性區(qū)(η區(qū))、疏水中心和親水c區(qū))。名詞“多核苷酸”和“核酸序列”是指至少10個(gè)堿基長(zhǎng)的聚合物形式的核苷酸。核苷酸可以是核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸或者任何一種核苷酸的修飾形式。該名詞包括單鏈和雙鏈形式的DNA?！胺蛛x的多核苷酸”意味著所述多核苷酸和它所來(lái)源的生物體中天然存在的基因組中直接相接(一個(gè)在5’端，一個(gè)在3’端)的兩個(gè)編碼序列不再直接相接。在一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸編碼多肽。核酸的5'和3'方向參考各個(gè)核苷酸單元的連接而定義，并且按照脫氧核糖(或核糖)糖環(huán)的碳位置指定。多核苷酸序列的信息(編碼)內(nèi)容從5'向3'方向閱讀。“重組”核酸是這樣的核酸，它含有不是天然存在的序列或者含有將兩個(gè)本來(lái)分開的序列區(qū)段通過(guò)人工組合而制成的序列。這種人工組合可以通過(guò)化學(xué)合成，或者更常見(jiàn)的，通過(guò)對(duì)核酸分離區(qū)段借助例如基因工程技術(shù)進(jìn)行人工操作而實(shí)現(xiàn)?！爸亟M”蛋白是由被導(dǎo)入諸如細(xì)菌或真核細(xì)胞的宿主細(xì)胞的異源(例如重組)核酸所編碼的蛋白。核酸可以被導(dǎo)入表達(dá)載體，所述載體含有能夠表達(dá)被導(dǎo)入的核酸所編碼的蛋白的信號(hào)；或者核酸可以整合到宿主細(xì)胞染色體中。名詞“異源”就核酸、多肽或另一種細(xì)胞成分而言，表明該成分出現(xiàn)在自然界中通常找不到它的地方和/或它起源于不同的來(lái)源或物種。名詞“純化”(例如就病原體或者含有病原體的組合物而言)是指從組合物中除去那些不希望有的成分的過(guò)程。純化是一個(gè)相對(duì)名詞，不要求不需要的成分全部都被從組合物中除去。在疫苗生產(chǎn)的語(yǔ)境中，純化包括諸如離心、透析、離子交換層析和大小排阻層析、親和純化或沉淀的過(guò)程。因此，名詞“純化的”不要求絕對(duì)純；而是作為一個(gè)相對(duì)名詞。因此，例如，純化的核酸制品是指，指定蛋白比在其核酸的產(chǎn)生環(huán)境(例如在細(xì)胞內(nèi)或者在生化反應(yīng)室內(nèi))中更富集的核酸制品?；炯兊暮怂峄虻鞍字破房梢员患兓伤韬怂岽碇破分锌偤怂岷康闹辽?0%。在某些實(shí)施方案中，基本純的核酸代表制品中總核酸或蛋白含量的至少60%、至少70%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%或以上。“分離的”生物成分(比如核酸分子、蛋白或細(xì)胞器)已被與該成分天然存在的生物體的細(xì)胞內(nèi)的其他生物成分(比如其他染色體和染色體外DNA和RNA、蛋白和細(xì)胞器)分開或者純化出來(lái)。被“分離的”核酸和蛋白包括通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化得到的核酸和蛋白。該名詞還包括通過(guò)在宿主細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)而制備的核酸和蛋白以及化學(xué)合成的核酸和蛋白?！翱乖笔强梢栽趧?dòng)物內(nèi)刺激抗體產(chǎn)生和/或T細(xì)胞反應(yīng)的化合物、組合物或物質(zhì)，包括通過(guò)注射、吸收或其他方式引入動(dòng)物的組合物。名詞“抗原”包括所有相關(guān)的抗原表位。名詞“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上B和/或T細(xì)胞對(duì)其反應(yīng)的位點(diǎn)。“優(yōu)勢(shì)抗原表位”或“優(yōu)勢(shì)表位”是那些對(duì)它們產(chǎn)生功能重要的宿主免疫反應(yīng)(例如，抗體反應(yīng)或T細(xì)胞反應(yīng))的表位。因此，就抗病原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)而言，優(yōu)勢(shì)抗原表位是這樣的抗原部分，當(dāng)它們被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別時(shí)導(dǎo)致對(duì)抗病原體引起的疾病的保護(hù)作用。名詞“T細(xì)胞表位”是指當(dāng)結(jié)合合適的MHC分子時(shí)被T細(xì)胞(經(jīng)由T細(xì)胞受體)特異結(jié)合的表位?！癇細(xì)胞表位”是被抗體(或B細(xì)胞受體分子)特異結(jié)合的表位。“佐劑”是以非特異性方式增強(qiáng)免疫反應(yīng)的產(chǎn)生的試劑。常見(jiàn)佐劑包括抗原吸附在上面的礦物質(zhì)(明礬、氧化鋁、磷酸鋁)懸浮液；乳劑，包括油包水和水包油(及其變形，包括復(fù)乳劑和可逆乳劑)、脂糖、脂多糖、免疫刺激性核酸(比如CpG寡核苷酸)、脂質(zhì)體、Toll樣受體激動(dòng)劑(特別是TLR2、TLR4、TLR7/8和TLR9激動(dòng)劑)和這些成分的各種組合?！懊庖咴越M合物”是適合(在例如試驗(yàn)情景中)給予人或動(dòng)物受試對(duì)象的物質(zhì)組合物，其能夠引發(fā)例如抗病原體，比如RSV的特異性免疫反應(yīng)。這樣，免疫原性組合物包含一或多種抗原(例如多肽抗原)或抗原表位。免疫原性組合物還可以包含一或多種其他能夠引發(fā)或增強(qiáng)免疫反應(yīng)的成分，比如賦形劑、載體和/或佐劑。某些情況中，受試對(duì)象被給予免疫原性組合物以便引發(fā)免疫反應(yīng)保護(hù)其抵抗病原體引起的癥狀或狀況。某些情況中，在受試對(duì)象接觸到病原體(例如RSV)后，通過(guò)抑制病原體的復(fù)制來(lái)防止(或者減少或改善)病原體所導(dǎo)致的癥狀或疾病。在本公開的語(yǔ)境中，名詞免疫原性組合物理解為涵蓋這樣的組合物，所述組合物是為了引發(fā)抗RSV的保護(hù)性或緩解性免疫反應(yīng)的目的被給予受試對(duì)象或受試對(duì)象群體(即疫苗組合物或疫苗)?！懊庖叻磻?yīng)”是免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，比如B細(xì)胞、T細(xì)胞或單核細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)。免疫反應(yīng)可以是導(dǎo)致產(chǎn)生特異抗體(比如抗原特異性中和抗體)的B細(xì)胞反應(yīng)。免疫反應(yīng)也可以是T細(xì)胞反應(yīng)，比如CD4+反應(yīng)或CD8+反應(yīng)。某些情況中，反應(yīng)對(duì)特定抗原是特異的(即，“抗原特異性反應(yīng)”)。如果所述抗原來(lái)源于病原體，抗原特異性反應(yīng)是“病原體特異性反應(yīng)”?！氨Ｗo(hù)性免疫反應(yīng)”是抑制病原體的有害功能或活性、減少病原體感染或者減輕病原體感染所造成的癥狀(包括死亡)的免疫反應(yīng)。保護(hù)性免疫反應(yīng)可以通過(guò)噬斑減少試驗(yàn)或者ELISA中和分析法中病毒復(fù)制或噬斑形成受到的抑制來(lái)測(cè)量，或者通過(guò)體內(nèi)測(cè)量對(duì)病原體攻擊的抗性?！癟hl”型免疫反應(yīng)特征在于存在產(chǎn)生IL-2和IFN-γ的⑶4+輔助T細(xì)胞，因此特征也在于IL-2和IFN-γ的分泌或存在。相反，“Th2”型免疫反應(yīng)特征在于產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-13的占優(yōu)勢(shì)的⑶4+輔助細(xì)胞。“免疫有效量”是組合物(一般是免疫原性組合物)的量，該量用于在受試對(duì)象中引發(fā)對(duì)組合物或組合物中的抗原的免疫反應(yīng)。通常，希望的結(jié)果是產(chǎn)生能夠保護(hù)或者協(xié)助受試對(duì)象抵抗病原體的抗原(例如病原體)_特異性免疫反應(yīng)。但是，為了獲得抵抗病原體的保護(hù)性免疫反應(yīng)可能需要多次給予免疫原性組合物。因此，在本公開的語(yǔ)境中，名詞免疫有效量涵蓋與先前給藥或者之后給藥組合達(dá)到保護(hù)性免疫反應(yīng)的部分劑量。形容詞“藥物可接受的”表明指示物適合給予受試對(duì)象(例如人或動(dòng)物受試對(duì)象)。Remington,sPharmaceuticalSciences,byΕ.W.Martin,MackPublishingCo.,Easton,PA,15thEdition(1975)描述了適用于治療性和/或預(yù)防性組合物(包括免疫原性組合物)的藥物遞送的組合物和制劑(包括稀釋劑)。在提及反應(yīng)，比如免疫反應(yīng)時(shí)，名詞“調(diào)整”意味著改動(dòng)或改變反應(yīng)的開始、反應(yīng)量、持續(xù)時(shí)間或特點(diǎn)。能夠調(diào)整免疫反應(yīng)的試劑在給藥后，能夠改變免疫反應(yīng)的開始、反應(yīng)量、持續(xù)時(shí)間或特點(diǎn)中的至少一項(xiàng)，或者與參照試劑相比，能夠改變免疫反應(yīng)的開始、反應(yīng)量、持續(xù)時(shí)間或特點(diǎn)中的至少一項(xiàng)。名詞“減輕”是一個(gè)相對(duì)名詞，如果在給予試劑后，反應(yīng)或者狀況從量上縮小了；或者與參照試劑相比，給予試劑后，反應(yīng)或狀況從量上縮小了，則所述試劑能夠減輕反應(yīng)或狀況。類似地，只要反應(yīng)或狀況的至少一個(gè)特征被消除了，名詞“防止”不一定要求試劑徹底消除了反應(yīng)或狀況。因此減輕或防止感染或反應(yīng)(比如病理反應(yīng)，例如疫苗增強(qiáng)的病毒疾病)的免疫原性組合物可以，但不一定徹底消除了這類感染或反應(yīng)，只要感染或反應(yīng)比沒(méi)有所述試劑情況下的感染或反應(yīng)或者與參照試劑相比，測(cè)量到縮小了例如至少大約50%，比如至少大約70%或大約80%或甚至大約90%(即達(dá)到原來(lái)的10%或更少)。“受試對(duì)象”是活的多細(xì)胞脊椎動(dòng)物生物體。在本公開的語(yǔ)境中，受試對(duì)象可以是試驗(yàn)對(duì)象，比如非人動(dòng)物，例如小鼠、棉田鼠或非人的靈長(zhǎng)動(dòng)物。替代地，受試對(duì)象可以是人受試對(duì)象。PreF抗原自然界中，RSVF蛋白表達(dá)為被稱為FO的長(zhǎng)574個(gè)氨基酸的單一多肽前體。在體內(nèi)，F(xiàn)O在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中寡聚化，被弗林蛋白酶在兩個(gè)保守弗林酶共有序列(弗林酶切割位點(diǎn))RARR109(SEQIDNO15)和RKRR136(SEQIDNO16)處經(jīng)蛋白水解加工形成由兩個(gè)二硫鍵連接的片段構(gòu)成的寡聚物。兩個(gè)片段中的較小片段被稱為F2，其起源于FO前體的N端部分。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠認(rèn)識(shí)到縮寫F0、F1和F2在科技文獻(xiàn)中常被稱為Fd1和F2。較大的C末端Fl片段通過(guò)疏水氨基酸序列將F蛋白錨定在膜中，其中該疏水氨基酸序列鄰接M個(gè)氨基酸的細(xì)胞質(zhì)尾巴。三個(gè)F2-F1二聚體關(guān)聯(lián)形成成熟的F蛋白，F(xiàn)蛋白處于次穩(wěn)定的融合發(fā)生前(“融合前”)構(gòu)象，在接觸到靶細(xì)胞膜時(shí)被引發(fā)進(jìn)行構(gòu)象改變。這一構(gòu)象改變使被稱為融合肽的一段疏水序列被暴露，該融合肽與宿主細(xì)胞膜聯(lián)系促進(jìn)病毒或者感染細(xì)胞的膜與靶細(xì)胞膜的融合。Fl片段含有至少兩個(gè)七肽重復(fù)結(jié)構(gòu)域，命名為HRA和HRB，分別位于融合肽和跨膜錨定結(jié)構(gòu)域附近。在融合前構(gòu)象中，F(xiàn)2-F1二聚體形成球狀頭部和莖部結(jié)構(gòu)，其中HRA結(jié)構(gòu)域在球狀頭部中處于分節(jié)段(延伸)構(gòu)象。相反，HRB結(jié)構(gòu)域形成從頭部區(qū)域伸出的三鏈卷曲螺旋莖部。在從融合前到融合后構(gòu)象的轉(zhuǎn)換過(guò)程中，HRA結(jié)構(gòu)域瓦解并被帶到HRB結(jié)構(gòu)域附近形成反平行的6螺旋束。在融合后狀態(tài)中，融合肽和跨膜結(jié)構(gòu)域并列促進(jìn)膜融合。雖然以上提供的構(gòu)象描述是基于晶體學(xué)數(shù)據(jù)的分子模型，融合前和融合后構(gòu)象的結(jié)構(gòu)差異并不需要借助晶體學(xué)來(lái)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。例如，可以按照Calderetal.,Virology,271:122-131(2000)和Mortonetal.，Virology,311:275-288展示的，用電子顯微鏡來(lái)區(qū)分融合前和融合后(替代地稱為融合發(fā)生前或融合)構(gòu)象，為了其中的技術(shù)教導(dǎo)將所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。還可以通過(guò)如Connollyetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,10317903-17908(2006)描述的脂質(zhì)體關(guān)聯(lián)分析法來(lái)區(qū)分融合前構(gòu)象和融合(融合后)構(gòu)象，為了其中的技術(shù)教導(dǎo)將所述文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。此外，還可以利用抗體(例如單克隆抗體)區(qū)分融合前和融合構(gòu)象，所述抗體特異識(shí)別RSVF蛋白的融合前或融合形式中一個(gè)上存在，而在另一種形式上不存在的構(gòu)象表位。這種構(gòu)象表位可能是由于分子表面上優(yōu)先暴露的抗原決定簇。替代地，構(gòu)象表位可以來(lái)自線性多肽中不相鄰的氨基酸的排列。本文公開的抗原是設(shè)計(jì)用于穩(wěn)定和維持RSVF蛋白的融合前構(gòu)象，這樣在表達(dá)蛋白群中，相當(dāng)一部分處于融合發(fā)生前(融合前)構(gòu)象(例如結(jié)構(gòu)和/或熱動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測(cè)的或者通過(guò)以上公開的一或多種方法評(píng)估的)。天然(或合成)F蛋白(比如SEQIDNO:2的示范性RSVF蛋白)中被引入穩(wěn)定化修飾，這樣I^reF抗原被引入細(xì)胞或胞外環(huán)境(例如體內(nèi)，例如給予受試對(duì)象后)后，能夠保持F蛋白融合前構(gòu)象中的主要免疫原表位。首先，可以將異源穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域放置在構(gòu)建體的C末端以便替代FO多肽的膜錨定結(jié)構(gòu)域。所述穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域預(yù)計(jì)能夠補(bǔ)償HRB的不穩(wěn)定性，幫助穩(wěn)定融合前構(gòu)象。在示范性實(shí)施方案中，異源穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域是蛋白多聚化結(jié)構(gòu)域。這類蛋白多聚化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)特別優(yōu)選的例子是三聚化結(jié)構(gòu)域。示范性三聚化結(jié)構(gòu)域折疊成卷曲螺旋，后者促進(jìn)組裝成含有該卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的多個(gè)多肽的三聚體。三聚化結(jié)構(gòu)域的一個(gè)優(yōu)選例子是異亮氨酸拉鎖。示范性的異亮氨酸拉鎖結(jié)構(gòu)域是Harburyetal.Science2621401-1407(1993)所描述的基因工程化的酵母GCN4異亮氨酸變體。SEQIDNO:15代表了一個(gè)合適的異亮氨酸結(jié)構(gòu)域的序列，當(dāng)然該序列的那些保留形成卷曲螺旋穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域能力的變體同樣適合。替代的穩(wěn)定卷曲螺旋三聚化結(jié)構(gòu)域包括TRAF2(GENBANK登錄號(hào)Q12933[gi:23503103]；氨基酸四9-348)；血小板反應(yīng)蛋白1(登錄號(hào)P07996[gi:135717]；氨基酸四1_314)；Matrilin-4(登錄號(hào)095460[gi:14548117]；氨基酸594-618)；CMP(matrilin-1)(登錄號(hào)NP_002370[gi:4505111]；氨基酸463-496)；HSFl(登錄號(hào)AAX42211[gi:61362386]；氨基酸165-191)；和Cubilin(AccessionNo.NP_001072[gi:4557503]；氨基酸104-138)。預(yù)計(jì)合適的三聚化結(jié)構(gòu)域可以導(dǎo)致表達(dá)蛋白的相當(dāng)一部分組裝成三聚體。例如，含有三聚化結(jié)構(gòu)域的重組I^reF多肽至少50%組裝成三聚體(通過(guò)例如AFF-MALS估計(jì)的)。一般來(lái)說(shuō)，表達(dá)多肽的至少60%，更優(yōu)選至少70%，最希望至少75%或以上以三聚體存在。為了進(jìn)一步增強(qiáng)穩(wěn)定性，位于位點(diǎn)512(相對(duì)天然FO蛋白)的亮氨酸殘基可以取代為賴氨酸(SEQID而10所示示范性1^評(píng)抗原多肽中1^4821()。這一取代提高了卷曲螺旋疏水殘基的周期性。類似地，可以在位點(diǎn)105的氨基酸后面添加賴氨酸。其次，可以除去ρ印27。分析融合前狀態(tài)的RSVF蛋白的結(jié)構(gòu)模型顯示ρ印27在Fl和F2之間形成一個(gè)大的不受約束的環(huán)。這個(gè)環(huán)對(duì)穩(wěn)定融合前狀態(tài)沒(méi)有幫助，在天然蛋白被弗林蛋白酶切割后消除。第三，可以刪除一個(gè)或者兩個(gè)弗林酶切割基序。對(duì)于這種設(shè)計(jì)，融合肽沒(méi)有被從F2切割下來(lái)，防止了它從融合前構(gòu)象子的球狀頭部釋放和與臨近膜的接觸。融合肽和膜界面之間的相互作用預(yù)計(jì)是融合前狀態(tài)不穩(wěn)定的一個(gè)主要問(wèn)題。在融合過(guò)程中，融合肽和目標(biāo)膜之間的相互作用導(dǎo)致融合肽從球狀頭部結(jié)構(gòu)中暴露出來(lái)，提高了融合前狀態(tài)的不穩(wěn)定性和折疊成融合后構(gòu)象子。這種構(gòu)象改變使得膜融合過(guò)程得以實(shí)現(xiàn)。除去一個(gè)或者兩個(gè)弗林酶切割位點(diǎn)預(yù)計(jì)會(huì)阻礙融合肽N端部分接近膜，從而穩(wěn)定了融合前狀態(tài)。因此，在本文公開的示范性實(shí)施方案中，去除弗林酶切割基序產(chǎn)生的I^reF抗原含有完整的融合肽，該融合肽在加工和組裝過(guò)程之中或者之后不會(huì)被弗林酶切割。任選地，還可以通過(guò)例如取代一或多個(gè)氨基酸來(lái)去除至少一個(gè)非弗林酶切割位點(diǎn)。例如，試驗(yàn)證據(jù)表明在容易被某些金屬蛋白酶進(jìn)行切割的條件下，PreF抗原可以在氨基酸110-118附近被切割(例如，切割發(fā)生在I^reF抗原的氨基酸112和113之間；在SEQIDNO:2所示參照F蛋白多肽中位點(diǎn)142的亮氨酸和位點(diǎn)143的甘氨酸之間)。相應(yīng)地，該區(qū)域內(nèi)一或多個(gè)氨基酸的修飾會(huì)減少I^reF抗原的切割。例如，位點(diǎn)112的亮氨酸可以取代為不同氨基酸，比如異亮氨酸、谷氨酰胺或色氨酸(如SEQIDNO:20的示范性實(shí)施方案所示)。替代地或者另外地，位點(diǎn)113的甘氨酸可以取代為絲氨酸或丙氨酸。任選地，PreF抗原可以包含一或多個(gè)改變糖基化模式或狀態(tài)的修飾(例如通過(guò)提高或降低天然F蛋白多肽中存在的一或多個(gè)糖基化位點(diǎn)上被糖基化的分子比例)。例如，SEQIDNO2的天然F蛋白多肽預(yù)計(jì)在氨基酸位點(diǎn)27、70和500(對(duì)應(yīng)SEQIDNO6的示范性I^reF抗原的位點(diǎn)27、70和470)被糖基化。一個(gè)實(shí)施方案中，位于氨基酸位點(diǎn)500的糖基化位點(diǎn)附近被引入修飾(指定為N470)。例如，可以通過(guò)用諸如谷氨酰胺⑴)的氨基酸取代位點(diǎn)500(參照序列的，通過(guò)序列比對(duì)對(duì)應(yīng)示范性I^reF抗原的位點(diǎn)470)的天冬酰胺將糖基化位點(diǎn)除去。在糖基化位點(diǎn)引入能夠提高糖基化效率的修飾是有利的。合適修飾的例子包括在位點(diǎn)500-502的以下氨基酸序列NGS、NKS、NGT、NKT。有趣的是，已發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致該糖基化位點(diǎn)糖基化增加的修飾也會(huì)導(dǎo)致I^reF的產(chǎn)生極大地提高。因此在某些實(shí)施方案中，I^reF抗原中對(duì)應(yīng)參照I^reF序列(SEQIDNO:2)氨基酸500的位置(例如在SEQIDNO:6所示范的I^reF抗原的位點(diǎn)470)上帶有修飾的糖基化位點(diǎn)。合適的修飾包括序列NGS、NKS、NGT、NKT，它們所在的氨基酸對(duì)應(yīng)參照F蛋白多肽序列中的位點(diǎn)500-502。SEQIDNO:18提供了包含NGT修飾的示范性實(shí)施方案的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以很容易地確定對(duì)應(yīng)NGS、NKS和NKT修飾的類似修飾。這些修飾優(yōu)選與本文公開的任何穩(wěn)定突變(例如異源卷曲螺旋，比如異亮氨酸拉鎖結(jié)構(gòu)域和/或疏水區(qū)內(nèi)的修飾；和/或去除pep27；和/或去除弗林酶切割位點(diǎn)；和/或去除非弗林酶切割位點(diǎn))組合使用。例如在一個(gè)特定實(shí)施方案中，PreF抗原包含去除弗林酶切割位點(diǎn)的取代和提高糖基化的修飾。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，PreF抗原還包含位于氨位點(diǎn)500的修飾的糖基化位點(diǎn)。SEQIDNO22提供了示范性序列(該示范性實(shí)施方案包含NGT修飾和位點(diǎn)112的亮氨酸被谷氨酰胺所取代)。更一般地說(shuō)，本文公開的任何一種穩(wěn)定修飾，例如優(yōu)選在可溶性I^reF抗原的C末端添加異源穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域，比如卷曲螺旋(例如，異亮氨酸拉鎖結(jié)構(gòu)域)；殘基的修飾，比如疏水HRB結(jié)構(gòu)域中亮氨酸到賴氨酸；去除pep27；去除一個(gè)或兩個(gè)弗林酶切割基序；去除非弗林酶切割位點(diǎn)；和/或糖基化位點(diǎn)的修飾，可以與一種或多種(或者以任何希望的組合的所有)其他穩(wěn)定修飾組合使用。例如，可以單獨(dú)使用異源卷曲螺旋(或其他異源穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域)，或者與下述中的任一種組合使用疏水區(qū)內(nèi)的修飾、和/或去除pep27、和/或去除弗林酶切割位點(diǎn)、和/或去除非弗林酶切割位點(diǎn)。某些特定實(shí)施方案中，PreF抗原包含C-端卷曲螺旋(異亮氨酸拉鎖)結(jié)構(gòu)域、位于HRB疏水結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定取代，以及一或兩個(gè)弗林酶切割位點(diǎn)的去除。這樣的實(shí)施方案包含未被弗林酶切割所去掉的完整的融合肽。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，PreF抗原還包含位于氨基酸位點(diǎn)500的被修飾過(guò)的糖基化位點(diǎn)。天然F蛋白多肽可以選自RSVA或RSVB株的任何F蛋白，或者它們的變體(如上文定義的)。在某些示范性實(shí)施方案中，F(xiàn)蛋白多肽是SEQIDNO:2所代表的F蛋白。為了方便對(duì)本公開的理解，不論來(lái)自哪個(gè)病毒株，所有氨基酸殘基位點(diǎn)都是相對(duì)(即氨基酸殘基位點(diǎn)對(duì)應(yīng))示范性F蛋白的氨基酸位點(diǎn)給出的。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用現(xiàn)有的公知比對(duì)算法(比如BLAST，使用例如缺省參數(shù))，通過(guò)將所選RSV株的氨基酸序列與示范性序列進(jìn)行序列比對(duì)可以容易地確定任何其他RSVA或B株的相當(dāng)?shù)陌被嵛稽c(diǎn)。W02008114149(為了提供FSVF和G蛋白序列的其他例子，通過(guò)引用并入本文)中公開了來(lái)自不同RSV株的F蛋白多肽的許多其他例子。其他變體可以來(lái)自遺傳漂變，或者可能利用定點(diǎn)或隨機(jī)突變?nèi)斯ぶ苽?，或者通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)已有變體的重組制備。就本文公開的PreF(和I^reF-G)抗原來(lái)說(shuō)，這些額外的變體也是合適的。挑選F蛋白的F2和Fl結(jié)構(gòu)域時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到不必須包括完整的F2和/或Fl結(jié)構(gòu)域。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)選擇F2結(jié)構(gòu)域的亞序列(或片段)時(shí)，構(gòu)象方面的考慮是重要的。因此，F(xiàn)2結(jié)構(gòu)域通常含有F2結(jié)構(gòu)域中能夠促進(jìn)多肽組裝和穩(wěn)定性的那部分。在某些示范性變體中，F(xiàn)2結(jié)構(gòu)域包含氨基酸沈-105。但長(zhǎng)度(通過(guò)添加或缺失一或多個(gè)氨基酸)略有改變的變體也是可能的。通常，選擇或設(shè)計(jì)Fl結(jié)構(gòu)域的至少一個(gè)亞序列(或片段)來(lái)維持穩(wěn)定的包含F(xiàn)蛋白免疫優(yōu)勢(shì)表位的構(gòu)象。例如，通常希望選擇Fl多肽結(jié)構(gòu)域中位于氨基酸262-275(palivizumabneutralization)禾口423—436(Centocor，schlOlFMAb)的亞序列，所述亞序列包含能夠被中和抗體識(shí)別的表位。此外，希望包含例如氨基酸328-355區(qū)域內(nèi)的T細(xì)胞表位。最常見(jiàn)的，是作為Fl亞基的單一連續(xù)部分(例如跨越氨基酸沈2-436)，但表位也可以保留在合成序列中，所述合成序列包含這些免疫優(yōu)勢(shì)表位，在穩(wěn)定構(gòu)象中它們組裝成不連續(xù)的元件。因此Fl結(jié)構(gòu)域多肽包含RSVF蛋白多肽的至少大約氨基酸沈2-436。本文提供的一個(gè)非限制性實(shí)例中，F(xiàn)l結(jié)構(gòu)域包含天然F蛋白多肽的氨基酸137-516。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，實(shí)施者可以自己判斷使用其他更短的亞序列。當(dāng)選擇F2或Fl結(jié)構(gòu)域(或者如下文討論的，對(duì)某些PreF-G抗原的G蛋白成分而言)的亞序列時(shí)，除了構(gòu)象學(xué)方面的考慮，最好在包含其他免疫原性表位的基礎(chǔ)上對(duì)序列(例如變體、亞序列等)進(jìn)行選擇。例如，利用錨定基序或其他方法，比如本領(lǐng)域已知的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)或多項(xiàng)式函數(shù)判定來(lái)鑒定其他T細(xì)胞表位，參見(jiàn)例如RANKPEP(mif.dfci.harvard.edu/Tools/rankpep.html提供)；ProPredI(imtech.res.in/raghava/propredl/index.html提供)；Bimas(www-bimas.dcrt.nih.gov/molbi/hla_bind/index.html提供)；禾口SYFPEITH(syfpeithi.bmi-heidelberg.com/scripts/MHCServer.dll/home.htm提供)。例如，利用算法確定肽的“結(jié)合閾值”，挑選那些有使它們?cè)谝欢ㄓH和力有較高M(jìn)HC或抗體結(jié)合概率的分?jǐn)?shù)的肽。算法基于特定位點(diǎn)上特定氨基酸對(duì)MHC結(jié)合的影響、特定位點(diǎn)上特定氨基酸對(duì)抗體結(jié)合的影響，或者含有基序的肽中特定取代對(duì)結(jié)合的影響。就免疫原性肽來(lái)說(shuō)，“保守殘基”是肽中特定位點(diǎn)上出現(xiàn)頻率比隨機(jī)分布情況下預(yù)期的頻率明顯高的殘基。錨定殘基是提供與MHC分子的接觸點(diǎn)的保守殘基。通過(guò)這種預(yù)測(cè)方法鑒定到的T細(xì)胞表位可以通過(guò)測(cè)量它們與特異MHC蛋白的結(jié)合以及當(dāng)呈遞給MHC蛋白時(shí)它們刺激T細(xì)胞的能力來(lái)確認(rèn)。PreF抗原(包括以下討論的I^reF-G抗原)包含與表達(dá)系統(tǒng)對(duì)應(yīng)的信號(hào)肽是有利的，例如，包含哺乳動(dòng)物或病毒信號(hào)肽，比如RSVFO天然信號(hào)序列(例如SEQIDNO:2的氨基酸1-25或者SEQIDNO:6的氨基酸1-25)。一般來(lái)說(shuō)，選擇的信號(hào)肽與選中用于重組表達(dá)的細(xì)胞相容。例如，信號(hào)肽(比如桿狀病毒信號(hào)肽，或蜂素信號(hào)肽)可以經(jīng)取代用于在昆蟲細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。如果優(yōu)選植物表達(dá)系統(tǒng)，合適的植物信號(hào)肽是本領(lǐng)域已知的。許多示范性信號(hào)肽是本領(lǐng)域已知的(參見(jiàn)例如Zhang&Henzel，ProteinSci.,13:2819-2824(2004),該文獻(xiàn)描述了多種人信號(hào)肽)，并在例如SPdb信號(hào)肽數(shù)據(jù)庫(kù)中羅列，該數(shù)據(jù)庫(kù)包括古細(xì)菌、原核生物和真核生物的信號(hào)序列(http://proline,bic.nus.edu.sg/spdb/)。任選地，任何以上抗原可以包含其他序列或標(biāo)簽，比如協(xié)助純化的His標(biāo)簽。任選地，PreF抗原可以包含其他免疫原性成分。某些特別有利的實(shí)施方案中，PreF抗原包含RSVG蛋白抗原成分。示范性的含有I^reF和G成分的嵌合蛋白包含以下Vl(SEQIDNOs7和8所代表)和PreF_V2(SEQIDNOs9禾口10所代表)。在ft~eF-G抗原中，在構(gòu)建體的C末端添加G蛋白的抗原部分(例如，截?cái)嗟腉蛋白，比如氨基酸殘基149-229)。通常G蛋白成分通過(guò)柔性連接序列與F蛋白成分連在一起。例如，在示范性I^reFJl設(shè)計(jì)中，G蛋白通過(guò)-GGSGGSGGS-連接肽(SEQIDNO14)與I^reF成分連在一起。在ft~eF_V2設(shè)計(jì)中，連接肽更短。PreF_V2含有兩個(gè)甘氨酸(-GG-)作為連接分子，而沒(méi)有-GGSGGSGGS-連接肽(SEQIDN0:14)。如果有G蛋白多肽結(jié)構(gòu)域，其可以包含選自任何RSVA或RSVB株的G蛋白的全部或部分。在某些示范性實(shí)施方案中，G蛋白是SEQIDNO:4所代表的G蛋白或者與它95%相同。合適的G蛋白序列的其他例子可以在W02008114149(通過(guò)引用并入本文)中找到。選擇的G蛋白多肽成分要包含G蛋白的至少一個(gè)這樣的亞序列(或片段)，所述亞序列(或片段)保留了例如氨基酸183-197區(qū)域內(nèi)的T細(xì)胞表位，比如G蛋白的包含天然G蛋白氨基酸151-229、149-2或128-229的片段。在一個(gè)示范性實(shí)施方案中，G蛋白多肽是天然G蛋白多肽中包含天然G蛋白多肽氨基酸殘基149-229中全部或部分的片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，也可以使用更長(zhǎng)或更短的G蛋白部分，只要選中的部分不會(huì)從構(gòu)象上使得ft~eF-G抗原不穩(wěn)定，或者破壞它的表達(dá)、折疊或加工。任選地，G蛋白結(jié)構(gòu)域包含位點(diǎn)191處的氨基酸取代，該位點(diǎn)以前曾被證實(shí)參與減輕和/或防止福爾馬林滅活RSV疫苗引起的以嗜酸粒細(xì)胞增多為特征的病情加重。對(duì)天然和取代(N191A)G蛋白的特性的詳盡描述可以在例如美國(guó)專利公開2005/0042230中找到，該文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。例如，對(duì)于挑選對(duì)應(yīng)天然存在病毒株的序列，一或多個(gè)結(jié)構(gòu)域可以在序列上對(duì)應(yīng)RSVA或B株，比如常見(jiàn)的命名為A2或Long的實(shí)驗(yàn)室分離物，或者任何其他天然存在株或分離物(如以上提到的W02008114149中公開的)。除了這些天然發(fā)生的和分離的變體，PreF(包括ft~eF-G)抗原中還可以采用與上述序列有相似度的基因工程變體。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，PreF抗原多肽(和如下文描述的多核苷酸序列)之間的相似度，和對(duì)于多肽一樣(和一般來(lái)說(shuō)的核苷酸序列)，可以表達(dá)為序列間的相似度，另外也可稱為序列同一性。序列同一性常常以百分比同一性(或相似度)來(lái)衡量，百分比越高，兩個(gè)序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)越相似。一般，兩個(gè)氨基酸(或多核苷酸)序列的一級(jí)結(jié)構(gòu)越相似，由折疊和組裝產(chǎn)生的更高結(jié)構(gòu)越相似。I^reF多肽(和多核苷酸)序列的變體通常含有一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)氨基酸缺失、添加或取代，但它們?nèi)杂懈甙俜直鹊南嗤被?以及一般來(lái)說(shuō)多核苷酸)。更重要的是，變體保持了本文公開的參照序列的結(jié)構(gòu)上的因此也就是構(gòu)象上的特性。確定序列同一性的方法是本領(lǐng)域公知的，可以應(yīng)用于抗原多肽以及編碼它們的核酸(例如如下文描述的方法)。各種程序和序列比對(duì)算法在SmithandWaterman,Adv.App1.Math.2:482,1981；NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443,1970；HigginsandSharp,Gene73:237,1988；HigginsandSharp,CABIOS5:151,1989；Corpetetal.,核酸Research16:10881,1988禾口PearsonandLipman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA852444，1988中有描述。Altschuletal.,NatureGenet.6:119，1994提供了對(duì)序列比對(duì)方法和同源性計(jì)算的詳細(xì)考慮。NCBIBasicLocalAlignmentSearchTool(BLAST)(Altschuletal.，J.Mol.Biol.215:403,1990)可以從多個(gè)來(lái)源得到，包括NationalCenterforBiotechnologyInformation(NCBI,Bethesda,MD)和互聯(lián)網(wǎng)，可以與序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx聯(lián)合使用。NCBI網(wǎng)站提供了如何使用該程序確定序列同一性的描述。某些情況中，相對(duì)它所來(lái)源的天然存在病毒株的氨基酸序列，I^reF抗原含有一或多個(gè)氨基酸修飾(例如除了以上提到的穩(wěn)定修飾)。這種差別可以是一或多個(gè)氨基酸的添加、缺失或取代。變體的差別通常不超過(guò)氨基酸殘基的大約1<%，或2%，或5%，或10(%，或15%，或20%。例如，與SEQIDNO:6、8、10、18、20和/或22的示范性I^reF抗原多肽序列相比，變體I^reF抗原(包括ft~eF-G)多肽序列可以包含1個(gè)或2個(gè)，或最多5個(gè)，或最多大約10個(gè)，或最多大約15個(gè)，或最多大約50個(gè)，或最多大約100個(gè)氨基酸的差異。因此，就RSVF或G蛋白或者I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)而言的變體一般與參照序列(例如SEQID而2、4、6、8、10、18、20和/或22所顯示的參照序列)，或者本文公開的任何示范性1^評(píng)抗原具有至少80%、或85%，更常見(jiàn)的至少大約90%或以上，比如95%，或者甚至98%或99%的序列同一性。包含在本公開中作為特點(diǎn)之一的其他變體是I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)，所述I^reF抗原包含選自W02008114149中公開的天然存在變體的全部或部分核苷酸或氨基酸序列。其他變體可以來(lái)自遺傳漂變，或者可能利用定點(diǎn)或隨機(jī)突變?nèi)斯ぶ苽?，或者通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)已有變體的重組制備。這些額外的變體就本文公開的I^reF(和I^reF-G)抗原來(lái)說(shuō)，也是合適的。例如，修飾可以是不會(huì)改變所得I^reF抗原的構(gòu)象或免疫原性表位的一或多個(gè)氨基酸(比如2個(gè)氨基酸、3個(gè)氨基酸、4個(gè)氨基酸、5個(gè)氨基酸，最多大約10個(gè)氨基酸或者更多)的取代。替代地或者另外地，修飾可以包括一或多個(gè)氨基酸的缺失和/或一或多個(gè)氨基酸的添加。的確，如果需要的話，一或多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域可以是合成多肽，所述合成多肽不對(duì)應(yīng)任何單一病毒株，而是包含來(lái)自多個(gè)病毒株的亞序列成分，或者甚至來(lái)自通過(guò)比對(duì)多個(gè)RSV病毒株的多肽推測(cè)的共有序列。在某些實(shí)施方案中，一或多個(gè)多肽結(jié)構(gòu)域通過(guò)添加構(gòu)成標(biāo)簽的氨基酸序列被修飾，所述標(biāo)簽?zāi)軌騾f(xié)助后續(xù)的加工或純化。這類標(biāo)簽可以是抗原或表位標(biāo)簽、酶標(biāo)簽或多聚組氨酸標(biāo)簽。標(biāo)簽一般位于蛋白的一端或者另一端，比如抗原或融合蛋白的C末端或N末端。編碼PREF抗原的核酸本公開的另一個(gè)方面涉及編碼以上描述的抗原的重組核酸。更明確地說(shuō)，所述核酸編碼包含可溶性F蛋白多肽抗原的多肽，其中所述F蛋白多肽抗原包含RSVF蛋白多肽的F2結(jié)構(gòu)域和Fl結(jié)構(gòu)域，核酸所編碼的多肽包含選自以下的至少一個(gè)修飾(i)添加包含異源三聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；(ii)缺失至少一個(gè)弗林酶切割位點(diǎn)；(iii)缺失至少一個(gè)非弗林酶切割位點(diǎn)；(iv)缺失pep27結(jié)構(gòu)域的一或多個(gè)氨基酸；和(ν)在F蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的疏水結(jié)構(gòu)域中取代或添加至少一個(gè)親水氨基酸。任選地，所述多核苷酸編碼糖基化位點(diǎn)帶有修飾的I^reF抗原。這類多肽的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)已在上文詳細(xì)公開。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本文的教導(dǎo)，可以容易地確定編碼所述多肽中任一個(gè)和所有多肽的核苷酸序列，包括序列表中提供的示范性序列和以其他方式包括在本公開的序列(例如通過(guò)引用并入的)。在某些實(shí)施方案中，重組核酸經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化以便在選中的原核或真核宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。例如，SEQIDNOs:5、12、17、19和21是編碼I^reF抗原的序列的不同非限制性例子，這些序列經(jīng)密碼子優(yōu)化用于在哺乳動(dòng)物(例如CH0)細(xì)胞中表達(dá)。為了協(xié)助其復(fù)制和表達(dá)，可以將核酸并入載體，比如原核或真核表達(dá)載體。包含重組I^reF抗原編碼核酸的宿主細(xì)胞也是本公開的特點(diǎn)。適合的宿主細(xì)胞包括原核(即細(xì)菌)宿主細(xì)胞，比如大腸桿菌；和大量的真核宿主細(xì)胞，包括真菌(例如酵母)細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(比如CH0、VERO和HEK293細(xì)胞)。為了促進(jìn)其復(fù)制和表達(dá)，可以將核酸并入載體，比如原核或真核表達(dá)載體。雖然本文公開的核酸可以包含到各種載體(包括例如，細(xì)菌質(zhì)粒；噬菌體DNA；桿狀病毒；酵母質(zhì)粒；由質(zhì)粒和噬菌體DNA的組合衍生的載體；病毒DNA，比如痘苗病毒、腺病毒、雞痘病毒、假狂犬病病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和許多其他病毒)中的任一種，載體常常是適合產(chǎn)生多肽表達(dá)產(chǎn)物的表達(dá)載體。在表達(dá)載體中，編碼I^reF抗原的核酸通常被安排在引導(dǎo)mRNA合成的合適轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(啟動(dòng)子和任選地一或多個(gè)增強(qiáng)子)的附近和同一方向。即，目標(biāo)多核苷酸序列可操縱地連接著合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。這類啟動(dòng)子的例子包括CMV的立即早期啟動(dòng)子、LTR或SV40啟動(dòng)子、桿狀病毒的多角體蛋白(polyhedron)啟動(dòng)子、大腸桿菌Iac或trp啟動(dòng)子、噬菌體T7和λPl啟動(dòng)子，以及其他已知能夠調(diào)控基因在原核或真核細(xì)胞或者它們的病毒中的表達(dá)的啟動(dòng)子。表達(dá)載體一般還含有用于起始翻譯的核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子。載體任選包含合適的序列以便擴(kuò)增表達(dá)。此外，表達(dá)載體任選包含一或多個(gè)可選擇的標(biāo)記物基因從而提供選擇轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的表現(xiàn)型特征，比如對(duì)于真核細(xì)胞培養(yǎng)物，二氫葉酸還原酶或新霉素抗性；或者在大腸桿菌中比如卡那霉素、四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。表達(dá)載體還可以包含其他表達(dá)元件來(lái)提高例如翻譯效率。這些信號(hào)包括例如ATG起始密碼子和相鄰的序列。某些情況中，例如將翻譯起始密碼子和相關(guān)序列元件與目的多核苷酸序列(例如天然起始密碼子)同時(shí)插入合適的表達(dá)載體中。這種情況下不需要額外的翻譯調(diào)控信號(hào)。但對(duì)于只插入了多肽編碼序列或它的一部分的情況，要給編碼I^reF抗原的核酸的翻譯提供外源翻譯調(diào)控信號(hào)，包括ATG起始密碼子。起始密碼子的放置使它處于正確的閱讀框中以確保目的多核苷酸序列的翻譯。外源轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以來(lái)自各種來(lái)源，可以是天然的也可以是合成的。如果需要，可以通過(guò)包含適合所用細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子來(lái)進(jìn)一步提高表達(dá)效率(Scharfetal.(1994)ResultsProblCellDiffer20:125-62；Bitteretal.(1987)MethodsinEnzymol153:516-544)。某些情況中，編碼抗原的核酸(比如載體)包含一或多個(gè)其他序列元件，所述選中的序列元件用于提高和/或優(yōu)化I^reF編碼核酸在導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)的表達(dá)。例如，在某些實(shí)施方案中，編碼I^reF抗原的核酸包含內(nèi)含子序列，比如人皰疹病毒5內(nèi)含子序列(參見(jiàn)例如SEQIDN0:13)。內(nèi)含子已被反復(fù)證明當(dāng)它被恰當(dāng)?shù)刂糜谥亟M構(gòu)建體時(shí)，能夠增強(qiáng)同源和異源核酸的表達(dá)。另一類表達(dá)增強(qiáng)序列包括超基因元件，比如核基質(zhì)附著區(qū)(MatrixAttachmentRegion，或MAR)或類似的超基因元件，例如STAR元件(例如，比如Otteetal.，Biotechnol.Prog.23:801-807,2007中公開的那些STAR元件)。不受任何理論約束，MARs被認(rèn)為能夠介導(dǎo)靶DNA序列錨定到核基質(zhì)上，產(chǎn)生從異染色質(zhì)核心延伸出來(lái)的染色質(zhì)環(huán)結(jié)構(gòu)域。雖然MARs不含有任何明顯的共有序列或可識(shí)別的序列，它們最一致的特點(diǎn)似乎是整體的高A/T含量，C堿基在一條鏈上占優(yōu)勢(shì)。這些區(qū)域形成彎二級(jí)結(jié)構(gòu)，所述彎二級(jí)結(jié)構(gòu)易于發(fā)生鏈分離，可能含有作為鏈分離成核點(diǎn)的核心解旋元件(CUE)。已發(fā)現(xiàn)與MAR序列關(guān)聯(lián)的幾個(gè)富含AT的簡(jiǎn)單序列基序例如A-box、T-box、DNA解旋基序、SATBl結(jié)合位點(diǎn)(H-box，A/T/C25)和對(duì)于脊椎動(dòng)物或果蠅的共有拓?fù)洚悩?gòu)酶II位點(diǎn)。示范性MAR序列在已公開的美國(guó)專利申請(qǐng)20070178469和國(guó)際專利申請(qǐng)W002/074969(文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文)中有描述。可用于增強(qiáng)I^reF抗原編碼核酸的表達(dá)的其他MAR序列包括Girodetal.，NatureMethods,4:747-753,2007中描述的雞溶菌酶MAR、MARp1-42,MARp1-6、MARp1-68和MARpx-四(分別在GenBank以登錄號(hào)EA423306、DI107030、DI106196、DI107561和DI106512公開)。技術(shù)人員能夠理解，可以通過(guò)選擇產(chǎn)生中等增強(qiáng)水平的MAR，比如報(bào)導(dǎo)過(guò)的MAR1-9來(lái)進(jìn)一步調(diào)控表達(dá)。如果需要，可以例如利用諸如MAR-Finder(在futuresoft.org/MarFinder網(wǎng)站提供)、SMARTest(genomatix.de網(wǎng)站提供)或SMARScanKLevitskyetal.,Bioinformatics15:582_592，1999)的軟件通過(guò)檢索序列數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定替代的MAR序列來(lái)提高I^reF抗原的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，MAR與I^reF抗原編碼序列在相同核酸(例如載體)上被導(dǎo)入(例如轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞。在替代的實(shí)施方案中，MAR被放在另外的核酸上(例如反式)導(dǎo)入，任選其與I^reF抗原編碼多核苷酸序列共整合。足夠指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員生成重組I^reF抗原核酸的示范性程序可以在Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989；Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,3ded.,ColdSpringHarborPress,2001；Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociates，1992(禾口2003年的補(bǔ)充)；以及Ausubeletal.，ShortProtocolsinMolecularBiology:ACompendiumofMethodsfromCurrentProtocolsinMolecularBiology,4thed.,Wiley&Sons,1999中找至lj。SEQIDNOs:5、7、9、12、13、17、19和21代表了編碼I^reF抗原多肽的示范性核酸。包含糖基化位點(diǎn)修飾的變體，例如在對(duì)應(yīng)SEQIDNO2中位點(diǎn)500的氨基酸帶有修飾的變體，可以通過(guò)改變(例如突變)(與例如SEQIDNO12的多核苷酸序列相比的)位點(diǎn)1408-1414附近的核苷酸來(lái)產(chǎn)生。編碼糖基化變體(例如糖基化效率提高的)的合適核苷酸序列包括aacgggt、aacaagt、aacggga和aacaaga。也可能使用替代的序列，比如消除糖基化位點(diǎn)的cagcagt。通過(guò)將選自任何已知或隨后發(fā)現(xiàn)的RSV株的類似F和G蛋白多肽序列進(jìn)行組裝可以產(chǎn)生其他變體，例如象W02008114149中公開的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以制備與示范性變體有序列同一性的其他序列變體。一般來(lái)說(shuō)，核酸變體編碼的多肽的氨基酸殘基差別不超過(guò)、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%。這就是說(shuō)，所編碼的多肽有至少80%、或85%，或更常見(jiàn)的有至少大約90%或以上，比如95%或者甚至98%或99%的序列同一性。本領(lǐng)域技術(shù)人員立即可以明白，編碼I^reF多肽的多核苷酸序列本身由于遺傳密碼的冗余性可能序列同一性小一些。某些情況中，相對(duì)它所來(lái)源的天然存在病毒株的氨基酸序列，PreF抗原含有一或多個(gè)氨基酸修飾(例如除了以上提到的穩(wěn)定修飾)。這種不同可以分別是一或多個(gè)核苷酸或氨基酸的添加、缺失或取代。變體的差別通常不超過(guò)大約1%、或2%、或5%、或10%、或15%、或20%的核苷酸殘基。例如，與SEQIDNO:5、7、9、12、13、17、19和/或21的示范性I^reF抗原核酸相比，變體I^reF抗原(包括I^reF-G)核酸可以包含1、或2、或最多5個(gè)、或最多大約10個(gè)、或最多大約15個(gè)、或最多大約50個(gè)、或最多大約100個(gè)核苷酸的差別。因此，就RSVF或G蛋白或I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)核酸而言的變體通常與參照序列，例如SEQIDNO:5、7、9、12、13、17、19和/或21所展示的參照序列相比，或者與本文公開的任何其他示范性I^reF抗原核酸相比有至少80%、或85%，更常見(jiàn)的是有至少大約90%或以上，比如95%或者甚至98%或99%的序列同一性。包含在本公開中作為特點(diǎn)之一的其他變體是I^reF抗原(包括ft~eF-G抗原)，所述抗原包含選自W02008114149中公開的天然存在變體的全部或部分核苷酸序列。其他變體可以來(lái)自遺傳漂變，或者可能利用定點(diǎn)或隨機(jī)突變?nèi)斯ぶ苽?，或者通過(guò)兩個(gè)或多個(gè)已有變體的重組制備。這些額外的變體就本文公開的PreF(和I^reF-G)抗原來(lái)說(shuō)，也是合適的。除了先前描述的變體核酸，與SEQIDNOs:1、3、5、7、9、12、13、17、19和/或21所代表的示范性核酸中的一或多個(gè)雜交的核酸也可以作為編碼I^reF抗原的核酸使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，除了以上討論的％序列同一性衡量標(biāo)準(zhǔn)，兩個(gè)核酸之間序列相似性的另一個(gè)指標(biāo)是相互雜交的能力。兩個(gè)核酸的序列越相似，它們能夠在越嚴(yán)緊的條件下雜交。雜交條件的嚴(yán)緊程度是序列依賴性的，在不同環(huán)境參數(shù)下不同。因此，造成特定嚴(yán)緊程度的雜交條件根據(jù)所選雜交方法和雜交核酸序列的組成及長(zhǎng)度而變化。通常，雜交溫度和雜交緩沖液的離子強(qiáng)度(特別是Na+和/或Mg++濃度)決定了雜交的嚴(yán)緊度，盡管清洗時(shí)間也會(huì)對(duì)嚴(yán)緊度有影響。一般選擇的嚴(yán)緊條件比特定序列在限定離子強(qiáng)度和PH下的熱變性溫度(Tm)低大約5°C-20°C。其中Tm是靶序列有50%與完全匹配的探針發(fā)生雜交時(shí)的溫度(在限定離子強(qiáng)度和PH情況下)。核酸雜交的條件以及嚴(yán)緊度計(jì)算方法可以在例如Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001；Tijssen,HybridizationWithNucleicAcidProbes,PartITheoryandNucleicAcidPreparation,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,ElsevierScienceLtd.,NY,NY,1993禾口Ausubeletal.ShortProtocolsinMolecularBiology,4thed.，Johnffiley&Sons,Inc.，1999中找到。為了本公開的目的，“嚴(yán)緊條件”涵蓋這樣的條件，在所述條件下只有當(dāng)雜交分子與靶序列之間的錯(cuò)配低于25%，雜交才會(huì)發(fā)生。為了更準(zhǔn)確的定義，可以將“嚴(yán)緊條件”分成更具體的嚴(yán)緊水平。因此，用于本文“溫和嚴(yán)緊”條件是在該條件下有25%以上序列錯(cuò)配的分子不發(fā)生雜交的條件；“中等嚴(yán)緊”條件是在該條件下有15%以上錯(cuò)配的分子不發(fā)生雜交的條件，“高度嚴(yán)緊”條件是在該條件下有10%以上錯(cuò)配的序列不發(fā)生雜交的條件?！俺瑖?yán)緊”條件是在該條件下有6%以上錯(cuò)配的序列不發(fā)生雜交的條件。相反，在“低嚴(yán)緊”條件下雜交的核酸包括那些序列同一性低得多的核酸，或者只在核酸的非常短亞序列有序列同一性的核酸。因此，應(yīng)當(dāng)明白本公開涵蓋的各種核酸變體能夠與SEQIDNOs:1,3,5,7、9、12、13、17、19和/或21中的至少一個(gè)幾乎全長(zhǎng)雜交。制備RSV抗原件多肽的方法本文公開的抗原(包括I^reF-G抗原，和適用的情況中的G抗原)是利用重組蛋白表達(dá)和純化的成熟操作過(guò)程產(chǎn)生的。足夠指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員的程序可在以下參考文獻(xiàn)中找至丨JSambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,200；禾口Ausubeletal.ShortProtocolsinMolecularBiology,4thed.，JohnWiley&Sons，Inc.，999。其他具體細(xì)節(jié)在下文提供。將編碼抗原的重組核酸通過(guò)各種公知程序?qū)胨拗骷?xì)胞，所述程序根據(jù)選定的載體和宿主細(xì)胞，包括比如電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(例如利用商品脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑，比如LIP0FECTAMINE2000或TRANSFECTIN)、磷酸鈣沉淀、感染、轉(zhuǎn)染等。SEQIDNOs:5、7、9、12、13、17、19和21提供了編碼I^reF抗原(包括I^reF-G抗原)的示范性核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，SEQIDN0s:5、7、9、12、13、17、19和21僅用于說(shuō)明，并非用于限制。例如，與SEQIDNOs:5、7和9編碼的蛋白(例如SEQIDNOs:6、8和10代表的)相同，但只有遺傳密碼冗余不同(比如象SEQIDNO:12中顯示的，替代的密碼子優(yōu)化產(chǎn)生的)的多核苷酸序列，可以代替SEQIDNOs:5、7和9的示范性序列使用。對(duì)SEQIDN0s:17、19禾口21也是這樣。類似地，可以采用SEQIDNO:13所顯示的包含表達(dá)增強(qiáng)元件的多核苷酸序列，所述表達(dá)增強(qiáng)元件是比如固有內(nèi)含子(或通過(guò)添加啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、內(nèi)含子或其他類似元件)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，這些修飾的組合也是合適的。類似地，選自任何RSVA或RSVB株的同源序列，和/或有相當(dāng)大序列同一性的其他序列也可以用于表達(dá)I^reF抗原。的確，以前公開的任何變體核酸都適合導(dǎo)入宿主細(xì)胞，用于產(chǎn)生I^reF抗原(包括ft~eF-G抗原)和適用的情況下產(chǎn)生G多肽。例如，某些情況中，變體核酸經(jīng)過(guò)修飾改變了糖基化模式，例如象上文描述的通過(guò)取代氨基酸位點(diǎn)500(相對(duì)SEQIDNO:2而言，例如SEQIDNO17)附近的一或多個(gè)氨基酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)改變糖基化模式，結(jié)合例如修飾切割識(shí)別位點(diǎn)能夠提高I^reF抗原在細(xì)胞培養(yǎng)中的產(chǎn)量。這種情況下，下文描述的表達(dá)和分離重組I^reF抗原的方法提供了增加I^reF抗原生產(chǎn)的過(guò)程，所述過(guò)程通過(guò)取代糖基化位點(diǎn)的一或多個(gè)氨基酸來(lái)改變I^reF抗原的糖基化模式，任選與如上所述修飾一或多個(gè)切割位點(diǎn)(比如非弗林酶或弗林酶切割識(shí)別位點(diǎn))組合使用。因此，包含重組抗原編碼核酸的宿主細(xì)胞也是本公開的一個(gè)特征。適合的宿主細(xì)胞包括原核(即細(xì)菌)宿主細(xì)胞，比如大腸桿菌；和無(wú)數(shù)真核宿主細(xì)胞，包括真菌(例如酵母，比如釀酒酵母和巴斯德畢赤酵母)細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞(比如CHO和HEK293細(xì)胞)。重組I^reF抗原核酸例如經(jīng)由載體(比如表達(dá)載體)被導(dǎo)入(例如轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞。正如上文描述過(guò)的，載體最一般是質(zhì)粒，但這類載體也可以是例如，病毒顆粒、噬菌體等。合適的表達(dá)宿主的例子包括細(xì)菌細(xì)胞，比如大腸桿菌、鏈霉菌和傷寒沙門氏菌；真菌細(xì)胞，比如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母和粗糙脈孢菌；昆蟲細(xì)胞，比如果蠅和草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)；哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比如3T3、COS、CH0、BHK,HEK293或Bowes黑素瘤；植物細(xì)胞，包括藻細(xì)胞等。某些情況中，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞可以用于產(chǎn)生重組I^reF抗原。某些實(shí)施方案中，挑選帶有穩(wěn)定整合的I^reF核酸的細(xì)胞(例如克隆)并用于產(chǎn)生重組I^reF抗原。宿主細(xì)胞可以培養(yǎng)在常規(guī)營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，所述培養(yǎng)基根據(jù)啟動(dòng)子的激活、挑選轉(zhuǎn)化子或擴(kuò)增插入的多核苷酸序列等需要進(jìn)行了改進(jìn)。諸如溫度、PH等的培養(yǎng)條件一般就是以前給表達(dá)選擇的宿主細(xì)胞使用的條件，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的，可參見(jiàn)本文引用的參考文獻(xiàn)，包括例如Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,thirdedition，Wiley-Liss，NewYork和該書引用的參考文獻(xiàn)。任選地，宿主細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清和/或無(wú)動(dòng)物制品的培養(yǎng)基中。本發(fā)明所述核酸對(duì)應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物還可以在非動(dòng)物細(xì)胞中產(chǎn)生，比如植物、酵母、真菌、細(xì)菌等。除了Sambrook、Berger和Ausubel，關(guān)于細(xì)胞培養(yǎng)的詳細(xì)描述可以在I^ayneetal.(1992)PlantCellandTissueCultureinLiquidSystemsJohnffiley&Sons,Inc.NewYork,NY；GamborgandPhillips(eds)(1995)PlantCell,TissueandOrganCulture；FundamentalMethodsSpringerLabManual,Springer-Verlag(BerlinHeidelbergNewYork)禾口AtlasandParks(eds)TheHandbookofMicrobiologicalMedia(1993)CRCPress,BocaRaton,FL中找至lj。在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)表達(dá)產(chǎn)物的預(yù)期用途，有大量表達(dá)載體可供選擇。例如，當(dāng)需要大量多肽或其片段用于產(chǎn)生抗體時(shí)，優(yōu)選采用能夠引導(dǎo)高水平表達(dá)易于純化的融合蛋白的載體。這類載體包括，但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體，比如BLUESCRIPTGtratagene)，該載體中目的編碼序列(例如以上描述的本發(fā)明的多核苷酸)可以連接到載體內(nèi)與編碼氨基端啟動(dòng)翻譯的甲硫氨酸和隨后的7個(gè)β-半乳糖苷酶殘基的序列讀框一致，從而產(chǎn)生有催化活性的半乳糖苷酶融合蛋白；PlN載體(VanHeeke&Schuster(1989)TBiolChem264:5503-5509)。某些實(shí)例中，核酸經(jīng)由適合在原核細(xì)胞(例如大腸桿菌細(xì)胞)內(nèi)導(dǎo)入和表達(dá)的載體被引入細(xì)胞。例如，包含編碼I^reF抗原的多核苷酸序列的核酸可以導(dǎo)入多種商品或?qū)Ｓ休d體中的任何一種，比如PET系列的表達(dá)載體(例如pET9b和pET2d)。IPTG誘導(dǎo)編碼序列的表達(dá)，造成高水平的蛋白表達(dá)。編碼I^reF抗原的多核苷酸序列在噬菌體T7啟動(dòng)子的引導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄。替代的載體，比如包含熱誘導(dǎo)ApL啟動(dòng)子的PURV22也是合適的。然后將表達(dá)載體導(dǎo)入(例如通過(guò)電穿孔)合適的細(xì)菌宿主。有許多合適的大腸桿菌株可供本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇(例如，Rosetta和BL21(DE!3)株已被證明適用于含有I^reF抗原編碼多核苷酸序列的重組載體的表達(dá))。類似地，在酵母(比如釀酒酵母)中，含有組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(比如α因子、乙醇氧化酶和PGH)的許多載體可以用于所需表達(dá)產(chǎn)物的生產(chǎn)。綜述參見(jiàn)Berger、AuSubel和例如Grantetal.(1987MethodsinEnzymologyl53:516-544)。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，有許多表達(dá)系統(tǒng)，包括基于質(zhì)粒和病毒的系統(tǒng)可供使用。另一個(gè)例子中，利用桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)(BEVS)，將編碼抗原的多核苷酸序列導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞。能夠感染昆蟲細(xì)胞的重組桿狀病毒可以利用商品載體、試劑盒和/或系統(tǒng)來(lái)制備，比如來(lái)自BDBioscience的BDBaculoGold系統(tǒng)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將編碼抗原的多核苷酸序列插入到pAcSG2轉(zhuǎn)移載體中。然后，宿主細(xì)胞SF9(草地貪夜蛾)用pAcSG2嵌合質(zhì)粒和BDBaculoGold共轉(zhuǎn)染，其中所述BDBaculoGold含有桿狀病毒-苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographacalifornicanuclearpolyhedrosisvirus,(AcNPV))的線性基因組DNA。轉(zhuǎn)染后，PACSG2質(zhì)粒和桿狀病毒基因組之間發(fā)生同源重組因而產(chǎn)生重組病毒。在一個(gè)例子中，PreF抗原在多角體蛋白啟動(dòng)子(pH)的調(diào)控下表達(dá)。類似的轉(zhuǎn)移載體可以利用其他啟動(dòng)子，比如Basic(Ba)和plO啟動(dòng)子來(lái)產(chǎn)生。類似地，可以采用替代的昆蟲細(xì)胞，比如與Sf9密切相關(guān)的SF21和來(lái)源于粉紋夜蛾(Trichoplusiani)的HighFive細(xì)胞系。更典型地，編碼抗原的多核苷酸被引入適合在真核(例如昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中導(dǎo)入和表達(dá)的表達(dá)載體。為了利于在選中的載體/宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，這些核酸經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化(例如，SEQIDNOs:5、7、9、12、13、17、19和21顯示的序列是為了在CHO細(xì)胞中表達(dá)經(jīng)過(guò)密碼子優(yōu)化的)。在一個(gè)示范性實(shí)施方案中，編碼I^reF抗原的多核苷酸序列被引入載體，比如LonzaBiologicals公司開發(fā)的pEE14載體。多肽在組成型啟動(dòng)子，比如立即早期CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子的引導(dǎo)下表達(dá)。挑選表達(dá)所述多肽的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞是根據(jù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在沒(méi)有谷氨酰胺來(lái)源的情況下能夠生長(zhǎng)進(jìn)行的。被成功引入PEE14的細(xì)胞能夠在沒(méi)有外源谷氨酰胺的情況下生長(zhǎng)，因?yàn)镻EE14載體表達(dá)GS(谷氨酰胺合成酶)酶。選中的細(xì)胞可以經(jīng)克隆擴(kuò)增并對(duì)所需I^reF多肽的表達(dá)進(jìn)行研究。任選宿主細(xì)胞是根據(jù)其對(duì)插入序列的表達(dá)的調(diào)控能力或者宿主細(xì)胞以預(yù)期方式加工表達(dá)蛋白的能力來(lái)進(jìn)行挑選的。所述蛋白修飾包括，但不限于糖基化(以及例如乙酰化、羧化、磷酸化、脂化和?；?。任選在宿主細(xì)胞中進(jìn)行翻譯后加工，例如(由弗林蛋白酶)將蛋白的前體形式切割為成熟形式。不同的宿主細(xì)胞，比如313、0)5、010、徹1^、8·、MDCK、293、WI38等有特定的細(xì)胞機(jī)器和特征性機(jī)制進(jìn)行這類翻譯后活動(dòng)，可供選擇以確保導(dǎo)入的外來(lái)蛋白的正確修飾和加工。為了長(zhǎng)期高產(chǎn)量地生產(chǎn)本文公開的重組抗原，一般使用穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)。例如，利用表達(dá)載體將穩(wěn)定表達(dá)I^reF抗原多肽的細(xì)胞系導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述表達(dá)載體含有病毒復(fù)制原點(diǎn)或內(nèi)源表達(dá)元件以及選擇性標(biāo)記基因。導(dǎo)入載體后，細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基中。選擇性標(biāo)記的目的是賦予抗性以便進(jìn)行挑選，它的存在保證那些能夠成功表達(dá)導(dǎo)入序列的細(xì)胞的生長(zhǎng)和回收。例如，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的抗性組或菌落可以利用適合該細(xì)胞類型的組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行增殖。任選在適合編碼蛋白的表達(dá)并從培養(yǎng)物中回收的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化了I^reF抗原編碼核酸的宿主細(xì)胞。正如以上指出的，如果需要，可以將宿主細(xì)胞培養(yǎng)在無(wú)血清(和/或無(wú)動(dòng)物產(chǎn)物)的培養(yǎng)基中。在轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞系并且宿主細(xì)胞生長(zhǎng)至合適的細(xì)胞密度后，通過(guò)適當(dāng)?shù)氖侄?例如溫度變化或化學(xué)誘導(dǎo))對(duì)所選的啟動(dòng)子進(jìn)行誘導(dǎo)，并將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)一段時(shí)間。任選地，培養(yǎng)基包含能夠減少蛋白酶對(duì)表達(dá)蛋白的降解的成分和/或添加物。例如，用于培養(yǎng)產(chǎn)生I^reF抗原的細(xì)胞的培養(yǎng)基可以包含蛋白酶抑制劑，比如螯合劑或小分子抑制劑(例如AZ11557272、AS111793等)，以便減少或消除細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外(例如基質(zhì))蛋白酶的不希望的切割。然后從培養(yǎng)基中回收分泌的多肽產(chǎn)物。替代地，可以通過(guò)離心收集細(xì)胞，經(jīng)物理或化學(xué)手段破碎，并保留得到的粗提取物進(jìn)一步純化。蛋白表達(dá)所采用的真核或微生物細(xì)胞可以通過(guò)任何方便的方法破碎，包括反復(fù)凍融、超聲波、機(jī)械破碎或利用細(xì)胞裂解劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法。表達(dá)的抗原可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的許多方法中的任何一種從重組細(xì)胞培養(yǎng)物中回收和純化，所述方法包括硫酸銨或乙醇沉淀、酸提取、過(guò)濾、超濾、離心、陰離子或陽(yáng)離子交換層析、磷酸纖維素層析、疏水相互作用層析、親和層析(例如利用本文提到的任何一種標(biāo)簽系統(tǒng))、羥磷灰石層析和凝集素層析。如果需要可以利用蛋白重折疊步驟來(lái)完成成熟蛋白的構(gòu)型。最后，在純化終末步驟中可以采用高效液相層析(HPLC)。除了以上提到的參考文獻(xiàn)，許多純化方法是本領(lǐng)域熟知的，包括例如下述文獻(xiàn)中列舉的Sandana(1997)BioseparationofProteins,AcademicPress,Inc.；禾口Bollagetal.(1996)ProteinMethods,2-Editionffiley-Liss,NY;ffalker(1996)TheProteinProtocolsHandbookHumanaPress,NJ,HarrisandAngal(1990)ProteinPurificationApplicationsAPracticalApproachIRLPressatOxford,Oxford,U.K.；Scopes(1993)ProteinPurificationPrinciplesandPracticeEditionSpringerVerlag,NY；JansonandRyden(1998)ProteinPurification!Principles,HighResolutionMethodsandApplications,SecondEditionWiley-VCH，NY:以及Walker(1998)ProteinProtocolsonCD-ROMHumanaPress,NJ.。在一個(gè)示范性實(shí)施方案中，按照以下純化方案從細(xì)胞中回收I^reF蛋白。編碼I^reF多肽的重組核酸被導(dǎo)入宿主CHO細(xì)胞后，將包含被導(dǎo)入多核苷酸序列的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞或經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的穩(wěn)定細(xì)胞群生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)條件適合細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)所需目的來(lái)說(shuō)可以接受的規(guī)模Π列如象Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,thirdedition,ffiley-Liss,NewYork和其中引用的參考文獻(xiàn)中描述的)。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞于37°C生長(zhǎng)在搖瓶或生物反應(yīng)器中的無(wú)血清培養(yǎng)基中，以2-3天的間隔進(jìn)行傳代。由在這些條件下擴(kuò)增的細(xì)胞建立起來(lái)的新培養(yǎng)物通常在生物反應(yīng)器中的無(wú)血清培養(yǎng)基中于27°C溫育5-7天，p02維持在20%，從而產(chǎn)生I^reF抗原。為了回收重組I^reF抗原，將細(xì)胞培養(yǎng)物離心，細(xì)胞培養(yǎng)物上清液保存在零下70°C以備后用。培養(yǎng)物上清液融化后，上清液用MilliQ水&稀釋，并用HCl調(diào)節(jié)到pH6.0。將稀釋后的上清液以75cm/h上樣到裝在BPG140/500柱子中的3LCMCeramicHyperDFF樹脂中，柱子已用20mM磷酸鹽(pH6.0)平衡。上樣后，用平衡緩沖液過(guò)柱以便回到UV基線。用5個(gè)柱體積(CV)的25mM磷酸緩沖液(pH7.0)清洗后，用含有0.IMNaCl的50mM磷酸緩沖液(pH7.0)進(jìn)行洗脫。CMHyperD洗脫級(jí)分用20mM磷酸鹽(pH7.0)3.3x稀釋，在270ml羥磷灰石II型柱子(裝在XK50中)上進(jìn)行處理，柱子已用20mMPO4(Na)緩沖液(pH7.0)以50mL/min平衡。柱子用平衡緩沖液(3CV)洗后，用含有0.5MNaCl的20mMP04(Na)(pH7.0)進(jìn)行洗脫。HA洗脫級(jí)分以15mL/min(與樹脂有10分鐘接觸時(shí)間)上樣到150mLCaptoAdhere柱子(裝在XK沈中)上進(jìn)行處理，柱子已用20mM磷酸鹽(pH7.0)平衡。用5CV含有0.IM精氨酸緩沖液的IOmM磷酸鹽(pH7.0)清洗后，用含有0.6M精氨酸的IOmM磷酸緩沖液(pH7.0)進(jìn)行洗脫。然后將CaptoAdhere洗脫級(jí)分濃縮大約IOx以便在制備性大小排阻層析(SEC)柱上處理。濃縮用50kDPellicon聚醚砜膜進(jìn)行。在SEC柱子上處理之前，材料經(jīng)PLAN0VA20NIOOcm2濾器過(guò)濾，作為清除病毒的步驟。該納米過(guò)濾步驟可以安排在Pellicon膜濃縮之前或者之后進(jìn)行。然后用500mLSuperdexS200柱子進(jìn)行制備SEC，IOmM磷酸鹽(Na/K2)、160mMNaCl緩沖液(PH6.5，對(duì)應(yīng)最終緩沖液)作為流動(dòng)相。將等同5%SEC柱體積的濃縮I^reF以2.6mL/min上樣到樹脂中。通常收集每份IOmL的級(jí)分。如果需要，將級(jí)分匯合在一起通過(guò)銀染和抗HCP(宿主細(xì)胞蛋白Western印跡在SDS膠上分析以便優(yōu)化產(chǎn)量同時(shí)減少HCP水平。在0.22μmMillex濾器(替代地可以使用Merivex濾器)上過(guò)濾后獲得純化好的批次。如果需要，純化的I^reF抗原制品在使用前可以保存在-70°C。替代地，PreF蛋白可以包含多聚組氨酸(例如6組氨酸)標(biāo)簽，所述標(biāo)簽可以用于協(xié)助純化。對(duì)于這種帶組氨酸標(biāo)簽的I^reF多肽，可以采用以下純化方案。在用固定化金屬離子親和層析(IMAC)進(jìn)行純化之前，細(xì)胞培養(yǎng)物上清液在緩沖液A(20mmBicine,pH8.5)中稀釋兩倍，pH調(diào)節(jié)至8.5。得到的溶液上樣到已用緩沖液A平衡好的柱體積23ml的QsepharoseFF柱子(GEHealthcare)上。PreF蛋白與某些宿主細(xì)胞雜質(zhì)一起被捕獲到柱子上?？赡軐?duì)IMAC純化步驟造成干擾的培養(yǎng)基成分沒(méi)有滯留，而是清除到穿流液中。蛋白通過(guò)200mM、400mM、600mM、800mM和IMNaCl逐步洗脫被分開和洗脫。目的PreF蛋白在200mMNaCl的第一個(gè)步驟中洗脫。任選地，利用SDSPAGE和Wfestern印跡(用抗His標(biāo)簽的抗體檢測(cè)帶標(biāo)簽的I^reF蛋白)可以監(jiān)測(cè)蛋白回收情況。在繼續(xù)純化前可以將級(jí)分匯合。(匯合的)含I^reF蛋白的洗脫級(jí)分在緩沖液B(20mMBicine、500mMNaCl、pH8.3)中稀釋3倍，pH被調(diào)節(jié)到8.3。得到的溶液上樣到加載氯化鎳(GEHealthcare)的例如柱體積5ml的已用緩沖液B平衡好的IMACs印haroseFF樹脂上。I^reF結(jié)合到樹脂上，大部分宿主細(xì)胞雜質(zhì)被洗脫到穿流液中。柱子用20mM咪唑清洗以便除去弱結(jié)合的雜質(zhì)。蛋白經(jīng)250mM咪唑一步洗脫。可以進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色的SDSPAGE和抗His標(biāo)簽^festern印跡來(lái)鑒定陽(yáng)性級(jí)分。由IMAC得到的集合然后可以利用Centricon濃縮裝置(Millipore)濃縮到至少150yg/ml的濃度，蛋白在補(bǔ)充有500mML-精氨酸的PBS緩沖液中透析。得到的蛋白用RCDC蛋白檢測(cè)法(BioRad)定量，并保存在-70或_80°C待用。免疫原件組合物和方法還提供了免疫原性組合物，所述組合物包含任何以上公開的I^reF抗原(比如SEQIDNOs:6、8、10、18、20和22所示范的那些)和藥物可接受載體或賦形劑。在某些實(shí)施方案中，通常即抗原不包含G蛋白成分的實(shí)施方案中(比如SEQIDNO:6)，免疫原性組合物可以包含分離的、重組的和/或純化的G蛋白?，F(xiàn)有技術(shù)已描述過(guò)許多合適的G蛋白，包括全長(zhǎng)重組G蛋白，和由G蛋白的一部分(比如氨基酸128-229或130-230)與融合伙伴(比如硫氧還蛋白)或者信號(hào)和/或前導(dǎo)序列(協(xié)助表達(dá)和/或純化)組成的嵌合蛋白。與I^reF抗原混合使用的示范性G蛋白可以在W02008114149、美國(guó)專利5，149，650、美國(guó)專利6，113，911、美國(guó)已公開申請(qǐng)20080300382和美國(guó)專利7，368，537中找到，這些文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文。正如對(duì)嵌合I^reF-G蛋白已指出的，更小的G蛋白片段，比如氨基酸149-2之間的部分，或者大約1到大約2之間的部分適合用于包括PreF(沒(méi)有G)和G的混合物中。正如以上討論過(guò)的，重要的考慮是免疫優(yōu)勢(shì)表位的存在，例如在氨基酸183-197區(qū)域內(nèi)包含的表位。替代地，這種組合物中可以采用全長(zhǎng)G蛋白。藥物可接受載體和賦形劑是公知的，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，載體或賦形劑可以有利地包含緩沖液。任選地，載體或賦形劑還含有至少一種穩(wěn)定溶解度和/或穩(wěn)定性的成分。助溶/穩(wěn)定劑的例子包括去污劑，例如月桂肌氨酸和/或Tween。替代的助溶/穩(wěn)定劑包括精氨酸和玻璃形成多元醇(比如蔗糖、海藻糖等)。大量藥物可接受載體和/或藥物可接受賦形劑是本領(lǐng)域已知的,在例如Remington'sPharmaceuticalSciences,byΕ.W.Martin,MackPublishingCo.,Easton,PA,5thEdition(975)中有描述。相應(yīng)地，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以選擇合適的賦形劑和載體來(lái)制備適合通過(guò)所選給藥途徑遞送給受試對(duì)象的制劑。合適的賦形劑包括，但不限于甘油、聚乙二醇(PEG)、山梨醇、海藻糖、N-月桂酰肌氨酸鈉鹽、L-脯氨酸、非去污的甜菜堿磺酸、鹽酸胍、脲、氧化三甲胺、KCl、Ca2+、Mg2+、Mn2+、Si2+和其他二價(jià)陽(yáng)離子相關(guān)鹽、二硫蘇糖醇、二硫赤蘚糖醇和β-巰基乙醇。其他賦形劑可以是去污劑(包括Tween80、Tween20、TritonX-00、NP_40、EmpigenBB、辛基葡萄糖苷、月Zwittergent3-08>Zwittergent3-0>Zwittergent3-2>Zwittergent3-4>Zwittergent3_6、CHAPS、脫氧膽酸鈉、十二烷基硫酸鈉、溴化十六烷基三甲胺)。任選地，免疫原性組合物還包含佐劑。就適合給予受試對(duì)象以便引發(fā)抗RSV的保護(hù)性免疫反應(yīng)的免疫原性組合物而言，佐劑的選擇要能夠引發(fā)特征在于產(chǎn)生干擾素-Y(IFN-y)的Thl型或Thl/Th2平衡型免疫反應(yīng)。通常挑選佐劑以便增強(qiáng)被給予組合物的受試對(duì)象或受試對(duì)象群體中的Thl型免疫反應(yīng)(或者作1/1112平衡型免疫反應(yīng))，所述免疫反應(yīng)特征在于0^-^的產(chǎn)生和分泌。例如，當(dāng)免疫原性組合物是要給予對(duì)RSV感染易感(或風(fēng)險(xiǎn)增加)的特定年齡組受試對(duì)象時(shí)，要挑選對(duì)受試對(duì)象或受試對(duì)象群體安全并有效的佐劑。因此，當(dāng)配制含有RSV抗原的免疫原性組合物用于老年受試對(duì)象(比如超過(guò)65歲的受試對(duì)象)給藥時(shí)，挑選在老年受試對(duì)象中安全有效的佐劑。類似地，當(dāng)含有I^reF抗原的免疫原性組合物是要給予新生兒或嬰兒受試對(duì)象(比如出生到兩歲的受試對(duì)象)時(shí)，挑選在新生兒和嬰兒中安全有效的佐齊U。對(duì)于挑選在新生兒和嬰兒中安全有效的佐劑的情況，佐劑劑量可以選擇是通常給予成年受試對(duì)象的劑量的稀釋液(或分劑量)。此外，一般挑選經(jīng)免疫原性組合物的給藥途徑給予時(shí)能夠增強(qiáng)Thl免疫反應(yīng)的佐劑。例如，當(dāng)配制用于經(jīng)鼻給藥的含有I^reF抗原的免疫原性組合物時(shí)，蛋白酶體和protollin是合適的Thl偏向型佐劑。相反，當(dāng)免疫原性組合物配制用于肌內(nèi)給藥時(shí)，適合挑選包含3D-MPL、角鯊烯(例如QS21)、脂質(zhì)體、和/或油和水乳劑中的一種或多種的佐劑。適合與I^reF抗原組合使用的一種佐劑是無(wú)毒的細(xì)菌脂多糖衍生物。合適的脂質(zhì)A無(wú)毒衍生物的例子是單磷酰脂質(zhì)A或更具體地說(shuō)是3-脫?；鶈瘟柞Ｖ|(zhì)A(3D-MPL)。3D-MPL由GlaxoSmithKlineBiologicalsN.A.以MPL的名字銷售，在本文件中稱為MPL或3D-MPL。參見(jiàn)例如，美國(guó)專利4，436，727,4,877，611,4,866，034和4，912，094。3D-MPL主要促進(jìn)有IFN-y(Thl)表現(xiàn)型的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。3D-MPL可以根據(jù)GB2220211A中公開的方法生產(chǎn)。從化學(xué)上來(lái)說(shuō)，它是帶有3、4、5或6個(gè)?；湹?-脫酰基單磷酰脂質(zhì)A的混合物。在本發(fā)明的組合物中，可以使用小顆粒3D-MPL。小顆粒3D-MPL的顆粒大小使它能夠經(jīng)0.22μm濾器過(guò)濾除菌。W094/21292中描述了這種制劑。脂多糖，比如3D-MPL，在每個(gè)人類劑量的免疫原性組合物中可以使用1_50μg。這種3D-MPL可以按大約25μg的水平使用，例如20-30μg，合適的是21-μg或22-μg或23-27μg或M-沈μg，或者25μg。另一個(gè)實(shí)施方案中，人類劑量的免疫原性組合物中包含大約ομg水平的3D-MPL，例如5-15μg,合適的是6-14μg,例如7-13μg或8-12μg或9-11μg，或者10μg。再一個(gè)實(shí)施方案中，人類劑量的免疫原性組合物中包含大約5μg水平的3D-MPL，例如1-9μg，或2-8μg，或者合適的是3-7μg或4-μg，或者5μg。在其他實(shí)施方案中，脂多糖可以是如美國(guó)專利6，005，099和歐洲專利07^47!3B1中描述的β(1-6)葡萄糖胺二糖。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)這些文獻(xiàn)中的教導(dǎo)，很容易制備出各種脂多糖，比如3D-MPL。這些文獻(xiàn)均通過(guò)引用并入本文。除了以上提到的免疫刺激劑(與LPS或MPL或3D-MPL結(jié)構(gòu)相似的)，是以上MPL結(jié)構(gòu)一部分的?；瘑翁呛投茄苌镆彩呛线m的佐劑。在其他實(shí)施方案中，佐劑是脂質(zhì)A的合成衍生物，其中的某些被描述為TLR-4激動(dòng)劑，包括但不限于0M174(2-脫氧-6_o-[2-脫氧-2-[(R)-3-十二酰氧四環(huán)-癸酰氨]-4-o-磷酸基-β-D-吡喃葡萄糖基]-2-[(R)-3-羥基十四酰氨]_α-D-吡喃葡萄糖基二氫磷酸酯)，(W095/14026)；OM294DP(3S，9R)-3—[(R)-十二酰氧十四酰氨]-4-氧-5-氮雜-9(R)-[(R)-3-羥基十四酰氨]癸烷-1，10-二醇1，10-雙(二氫磷酸酯)(W099/64301和WO00/0462)；和OM197MP_AcDP(3S-，9R)_3_[(R)-十二酰氧十四酰氨]-4-氧-5-氮雜-9-[(R)-3-羥基十四酰氨]癸烷-1，10-二醇，1-二氫磷酸鹽10-(6-氨基己酸酯)(W001/46127)。其他可以使用的TLR4配體是烷基葡萄糖胺磷酸酯(AGPs)，比如W098/50399或美國(guó)專利6，303，347(還公開了AGPs的制備過(guò)程)中公開的那些，合適的是RC527或RC529或者美國(guó)專利6，764，840中公開的AGPs的藥物可接受鹽。某些AGI3s是TLR4激動(dòng)劑，某些是TLR4拮抗劑。兩種都被認(rèn)為可以作為佐劑使用。其他能夠經(jīng)由TLR-4引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)(Sabroeetal，JI2003pl630_5)的合適的TLR-4配體是例如，來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂多糖及其衍生物或者它們的片段，特別是LPS的無(wú)毒衍生物(比如3D-MPL)。其他合適的TLR激動(dòng)劑是熱震驚蛋白(HSP)10、60、65、70、75或90；表面活性蛋白A、透明質(zhì)酸寡糖、硫酸肝素片段、纖連蛋白片段、纖維蛋白原肽和b-防御素-2以及胞壁酰二肽(MDP)。在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑是HSP60、70或90。其他合適的TLR-4配體在WO2003/011223和WO2003/099195中有描述，比如W02003/011223的4_5頁(yè)或者W02003/099195的3_4頁(yè)公開的化合物I、化合物II和化合物III，特別是W02003/011223中公開為ER803022、ER803058、ER803732、ER804053、ER804057、ER804058、ER804059、ER804442、ER804680和ER804764的那些化合物。例如一個(gè)合適的TLR-4配體是ER804057。其他TLR激動(dòng)劑也可以作為佐劑使用。名詞“TLR激動(dòng)劑”是指這樣的試劑，所述試劑能夠直接作為配體或者通過(guò)產(chǎn)生內(nèi)源或外源配體間接引起經(jīng)由TLR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)。這些天然或合成TLR激動(dòng)劑可以作為替代的或額外的佐劑使用。Kaisho&Akira,BiochimicaetBiophysicaActal589:1_13，2002中提供了TLRs作為佐劑受體的簡(jiǎn)短綜述。這些潛在的佐劑包括，但不限于TLR2、TLR3、TLR7、TLR8和TLR9的激動(dòng)齊IJ。相應(yīng)地，在一個(gè)實(shí)施方案中，佐劑和免疫原性組合物還包含選自TLR-I激動(dòng)劑、TLR-2激動(dòng)劑、TLR-3激動(dòng)劑、TLR-4激動(dòng)劑、TLR-5激動(dòng)劑、TLR-6激動(dòng)劑、TLR-7激動(dòng)劑、TLR-8激動(dòng)齊U、TLR-9激動(dòng)劑或它們的組合的佐劑。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由TLR-I弓丨起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的TLR激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由TLR-I引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的合適的TLR激動(dòng)劑選自三?；?LPs)；酚溶性modulin；結(jié)核分枝桿菌LP；模擬細(xì)菌脂蛋白乙?；被说腟_(2，3-雙(棕櫚酰氧基)-(2-RS)-丙基)-N-棕櫚酰-(R)-Cys-(S)-Ser-(S)-Lys(4)-0H,三鹽酸(Pam3Cys)LP；和來(lái)自伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)的OspALP。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由TLR-2引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的TLR激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由TLR-2引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的合適的TLR激動(dòng)劑是來(lái)自結(jié)核分枝桿菌、伯氏疏螺旋體或蒼白螺旋體的脂蛋白、肽聚糖、細(xì)菌脂肽；來(lái)自包括金黃色葡萄球菌的種的肽聚糖；脂磷壁酸、甘露糖醛酸、奈瑟氏菌孔蛋白、細(xì)菌纖毛、耶爾森氏菌毒力因子、CMV毒粒、麻疹病毒血凝素以及來(lái)自酵母的酵母聚糖中的一種或多種。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由TLR-3弓丨起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的TLR激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由TLR-3引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的合適的TLR激動(dòng)劑是雙鏈RNA(dsRNA)或聚肌胞苷酸(PolyIC)，后者是與病毒感染相關(guān)聯(lián)的分子核酸形式。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由TLR-5引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的TLR激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由TLR-5引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的合適的TLR激動(dòng)劑是細(xì)菌鞭毛蛋白。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由TLR-6引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的TLR激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由TLR-6引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的合適的TLR激動(dòng)劑是分枝桿菌脂蛋白、二?；疞P和酚溶性modulin。其他TLR6激動(dòng)劑在W02003/043572中有描述。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由TLR-7引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的TLR激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由TLR-7引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的合適的TLR激動(dòng)劑是單鏈RNA(ssRNA)、洛索立賓(loxoribine，位點(diǎn)N7和C8的鳥嘌呤核苷類似物)或咪唑喹啉化合物或其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，TLR激動(dòng)劑是咪喹莫特(imiquimod)。其他TLR7激動(dòng)劑在WO2002/085905中有描述。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由TLR-8引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的TLR激動(dòng)劑。能夠經(jīng)由TLR-8引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的合適的TLR激動(dòng)劑是單鏈RNA(ssRNA)、具有抗病毒活性的咪唑喹啉分子，例如雷西莫特(resiquimod，R848)。雷西莫特也能被TLR-7識(shí)別。其他可以使用的TLR-8激動(dòng)劑包括WO2004/071459中描述的那些。在替代實(shí)施方案中，使用了能夠經(jīng)由TLR-9弓丨起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的TLR激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，能夠經(jīng)由TLR-9引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的合適的TLR激動(dòng)劑是HSP90。替代地，能夠經(jīng)由TLR-9引起信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)的TLR激動(dòng)劑是細(xì)菌或病毒DNA，含有未甲基化的CpG核苷酸的DNA，在特定序列語(yǔ)境中被稱為CpG基序。含有CpG的寡核苷酸誘發(fā)占優(yōu)勢(shì)的Thl反應(yīng)。這些寡核苷酸是公知的，在例如WO96/02555、WO99/33488以及美國(guó)專利6，008，200和5，856，462中有描述。合適的CpG核苷酸是CpG寡核苷酸。用于本發(fā)明的免疫原性組合物中的合適寡核苷酸是含有CpG的寡核苷酸，任選含有被至少3個(gè)，合適的是至少6個(gè)或更多個(gè)核苷酸隔開的兩個(gè)或更多個(gè)二核苷酸CpG基序。CpG基序是胞嘧啶核苷酸和后面的鳥嘌呤核苷酸。本發(fā)明的CpG寡核苷酸通常是脫氧核苷酸。在特定實(shí)施方案中，寡核苷酸中的核苷酸間鍵合是二硫代磷酸酯，或者合適的是硫代磷酸酯鍵，雖然磷酸二酯和其他核苷酸間鍵也在發(fā)明的范圍內(nèi)。還包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的是帶有混合的核苷酸間鍵合的寡核苷酸。生產(chǎn)硫代磷酸寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在美國(guó)專利5，666，153,5,278，302和WO95/26204中有描述?？梢耘c抗原一起用于免疫原性組合物的其他佐劑，例如單獨(dú)或者與3D-MPL或本文描述的另一種佐劑組合使用的佐劑是皂苷，比如QS21。Lacaille-Dubois,MandWagnerH.(1996.Areviewofthebiologicalandpharmacologicalactivitiesofsaponins.Phytomedicinevol2pp363-386)提供了關(guān)于皂苷的教導(dǎo)。皂苷是廣泛分布在植物和海洋動(dòng)物界的類固醇或三萜甙。皂苷的特點(diǎn)是在水中形成搖動(dòng)時(shí)發(fā)泡的膠態(tài)溶液并能沉淀膽固醇。當(dāng)皂苷靠近細(xì)胞膜時(shí)，它們能夠在膜上產(chǎn)生孔樣結(jié)構(gòu)導(dǎo)致膜破裂。紅細(xì)胞溶血即是該現(xiàn)象的一個(gè)例子，這是某些但并非全部皂苷的屬性。皂苷已知可以作為用于系統(tǒng)給藥的疫苗中的佐劑。各種皂苷的佐劑和溶血活性已有廣泛研究(Lacaille-DuboisandWagner，同前)。例如，QuilA(來(lái)源于的樹皮南美樹種莫利那肥皂草皂樹(QuillajaSaponariaMolina))及其組分在US5，057，540和"Saponinsasvaccineadjuvants，，，Kensil,C.R.,CritRevTherDrugCarrierSyst,1996,12(1-2):1-55;以及EP0362279B1中有描述。包含QuilA部分的顆粒結(jié)構(gòu)，被稱為免疫刺激復(fù)合物(ImmuneStimulatingComplexes,ISC0MS)是溶血性的，已被用于疫苗制備(Morein，B.,EP0109942B1；WO96/11711；WO96/33739)。溶血皂苷QS21和QS17(QuilA的HPLC純化組分)被描述為強(qiáng)力的系統(tǒng)佐劑，它們的生產(chǎn)方法在美國(guó)專利.5，057，540和EP0362279B1中公開，所述專利通過(guò)引用并入本文。被用于系統(tǒng)疫苗接種研究的其他皂苷包括來(lái)源于其他植物物種，比如絲石竹屬(Gypsophila)和肥皂草屬(Saponaria)的皂苷(Bomfordetal.,Vaccine,10(9):572-577,1992)。QS21是來(lái)源于莫利那肥皂草皂樹皮的HPLC純化的無(wú)毒組分。美國(guó)專利5，057，540中公開了生產(chǎn)QS21A的方法。含有QS21的非反應(yīng)性佐劑制劑在WO96/33739中有描述。以上提到的文獻(xiàn)通過(guò)引用并入本文。所述免疫活性皂苷，比如QS21，在每個(gè)免疫原性組合物人類劑量中可以按照1到50μg之間的量使用。有益的是QS21以大約25μg的水平使用，例如20-30μg之間，合適的是21-μg之間或22-μg之間或23-27μg之間或M-沈μg之間，或者是25yg。另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物的人類劑量中包含大約IOyg水平的QS21，例如5禾口15μg之間，合適的是6-14μg之間，例如7-13μg之間或8-12μg之間或9-11μg之間，或者是10μg。再一個(gè)實(shí)施方案中，免疫原性組合物的人類劑量中包含大約5μg水平的QS21，例如1-9μg之間或2-8μg之間，或者合適的是3-7μg或4-6μg之間，或者是5μg。這種包含QS21和膽固醇的制劑已被證實(shí)當(dāng)與抗原一起成劑時(shí)是成功的Thl刺激佐劑。因此，例如，PreF多肽適合與包含QS21和膽固醇組合的佐劑一起用于免疫原性組合物中。任選地，佐劑還可以包含礦物鹽，比如鋁或鈣鹽，特別是氫氧化鋁、磷酸鋁和磷酸鈣。例如，含有3D-MPL和鋁鹽(例如氫氧化鋁或“明礬”)聯(lián)用的佐劑適合用于配制給予人受試對(duì)象的含有I^reF抗原的免疫原性組合物。另一類適合用于含I^reF抗原的制劑的Thl型佐劑包括基于OMP的免疫刺激組合物。基于OMP的免疫刺激組合物尤其適合作為粘膜佐劑，例如用于鼻內(nèi)給藥?；贠MP的免疫刺激組合物是一類來(lái)自革蘭氏陰性細(xì)菌(包括，但不限于奈瑟氏菌)的外膜蛋白(OMPs，包括某些孔蛋白)制品(參見(jiàn)例如Lowelletal.，J.Exp.Med.167=658,1988；Lowe11etal.，Science240:800，1988；Lynchetal.，Biophys.J.45:104，1984；Lowell,in"NewGenerationVaccines"2nded.,MarcelDekker,Inc.,NewYork,Basil,HongKong,page193，1997；美國(guó)專利5，726，292；美國(guó)專利4，707，543)，可以作為載體來(lái)用或用在免疫原(比如細(xì)菌或病毒抗原)組合物中。某些基于OMP的免疫刺激組合物可以稱為“蛋白體O^roteosomes)”，它們是疏水的并且人可以安全使用。所述蛋白體有能力自動(dòng)組裝成大約20nm到大約SOOnm的囊泡或囊泡樣OMP簇，并與蛋白抗原(Ags)，特別是含有疏水部分的抗原非共價(jià)地合并、協(xié)作、關(guān)聯(lián)(例如靜電地或者疏水地)，或以其他方式合作。任何產(chǎn)生處于囊泡或囊泡樣形式中的外膜蛋白成分的制備方法，包括多分子膜結(jié)構(gòu)或者一或多個(gè)OMPs構(gòu)成的熔融球狀OM組合物，都包含在蛋白體的定義中。蛋白體可以按照例如現(xiàn)有技術(shù)(參見(jiàn)例如美國(guó)專利5，726，292或美國(guó)專利5，985，觀4)的描述制備。蛋白體還可以含有來(lái)自制備OMP孔蛋白的細(xì)菌(例如奈瑟氏菌)的內(nèi)源脂多糖或脂肪寡糖(分別是LPS或L0S)，其中脂多糖或脂肪寡糖只占整個(gè)OMP制品的2%以下。蛋白體主要由化學(xué)提取的腦膜炎奈瑟氏菌的外膜蛋白(OMPs)(主要是孔蛋白A和B以及4型0ΜΡ)組成，利用去污劑保持在溶液中(LowellGH.ProteosomesforImprovedNasal,Oral,orInjectableVaccines.InLevineMM,WoodrowGC,KaperJB,CobonGS,eds,NewGenerationVaccines.NewYork:MarcelDekker,Inc.1997；193-206)。蛋白體可以與多種抗原通過(guò)例如滲濾或常規(guī)透析過(guò)程成劑，所述抗原是例如來(lái)自病毒來(lái)源的純化或重組蛋白，包括本文公開的I^reF多肽。逐漸去除去污劑使得形成直徑大約100-200nm的顆粒狀疏水復(fù)合物(LowellGH.ProteosomesforImprovedNasal,Oral,orInjectableVaccines.InLevineMM,WoodrowGC,KaperJB,CobonGS,eds,NewGenerationVaccines.NewYork=MarcelDekker,Inc.1997；193-206)?！ǖ鞍左wLPS或ftOtollin"用于本文是指混合蛋白體制品，例如通過(guò)外源添加至少一種脂多糖來(lái)提供OMP-LPS組合物(可以作為免疫刺激組合物)。因此OMP-LPS組合物可以由I^rotollin的兩種基本成分組成，所述組合物包含(1)由革蘭氏陰性菌，比如腦膜炎奈瑟氏菌制備的蛋白體的外膜蛋白制品(例如ftOjimmt)，和(2)—或多種脂多糖的制品。脂肪寡糖可以是內(nèi)源的(例如OMP蛋白體制品天然含有的)，可以與來(lái)自外源制備的脂肪寡糖(例如由與OMP制品來(lái)源不同的培養(yǎng)物或微生物制備的)的OMP制品混合或組合，或者可以是它們的組合。這些外源加入的LPS可以與OMP制品來(lái)自相同的革蘭氏陰性細(xì)菌，或者來(lái)自不同的革蘭氏陰性細(xì)菌。Protollin也應(yīng)被理解為任選包含脂質(zhì)、糖脂、糖蛋白、小分子等，以及它們的組合。Protollin可以按照例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開2003/0044425中的描述進(jìn)行制備。不同佐劑的組合，比如以上提到的佐劑的組合，也可以與I^reF抗原一起用于組合物。例如，正如已經(jīng)提到的，QS21可以與3D-MPL—起成劑。QS213D-MPL的比率一般在110到101的水平；比如15到51，常常基本是11。通常，比率在2.51到113D-MPLQS21的范圍內(nèi)。另一個(gè)組合佐劑制品包含3D-MPL和鋁鹽，比如氫氧化鋁。當(dāng)組合配制時(shí)，這種組合可以增強(qiáng)抗原特異性Thl免疫反應(yīng)。某些情況中，佐劑制品包含諸如鈣或鋁鹽的礦物質(zhì)鹽，例如磷酸鈣、磷酸鋁或氫氧化鋁。存在鋁的情況下，例如與3D-MPL組合的情況，其量一般在每劑大約100μg和Img之間，比如從大約100μg或大約200μg到大約750μg,比如大約500μg。某些實(shí)施方案中，佐劑包含油和水乳劑，例如水包油乳劑。水包油乳劑的一個(gè)例子是在水性載體中包含可代謝油，比如角鯊烯；母生育酚，比如生育酚，例如α-生育酚；和表面活性劑，比如山梨醇三油酸酯(Span85)或聚環(huán)氧乙烷山梨醇單油酸酯(Tween80)。在某些實(shí)施方案中，水包油乳劑不含有任何其他免疫刺激劑(特別是不含有無(wú)毒脂質(zhì)A衍生物，比如3D-MPL；或皂苷，比如QS21)。水性載體可以是例如磷酸鹽緩沖液。此外，水包油乳劑可以含有span85和/或卵磷脂和/或三辛酸甘油酯。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了疫苗組合物。所述疫苗組合物包含抗原或抗原組合物，和包含水包油乳劑的佐劑組合物，以及任選的一或多種其他免疫刺激劑，其中所述水包油乳劑包含0.5-10mg可代謝油(合適的有角鯊烯)、0.5-llmg母生育酚(合適的有生育酚，比如α-生育酚)和0.4-4mg乳化劑。在一個(gè)特定實(shí)施方案中，佐劑制品包含制備成乳劑，比如水包油乳劑形式的3D-MPL。某些情況中，乳劑顆粒的直徑大小如WO94/21292中公開的低于0.2μm。例如，3D-MPL顆粒小到可以經(jīng)0.22μm膜過(guò)濾除菌(如歐洲專利0689454中描述的)。替代地，3D-MPL可以制備成脂質(zhì)體制劑。任選地，含有3D-MPL(或其衍生物)的佐劑還包含其他免疫刺激成分。選擇的佐劑在免疫原性組合物要給予的群體中是安全有效的。對(duì)于成年和老年群體，制劑含有的佐劑成分通常比嬰兒制劑中的多。在使用水包油乳劑的特定制劑中，所述乳劑可以包含其他成分，例如象膽固醇、角鯊烯、α-生育酚；和/或去污劑，比如Tween80或Span85。在示范性制劑中，這些成分存在的量如下大約l_50mg膽固醇、2-10%角鯊烯、2-10%α-生育酚和0.3-3%Tween80。一般來(lái)說(shuō)，角鯊烯α-生育酚的比率等于或小于1，這樣能夠提供更穩(wěn)定的乳劑。某些情況中，制劑還可以含有穩(wěn)定劑。當(dāng)含有I^reF多肽抗原的免疫原性組合物是配制用于嬰兒給藥時(shí)，要確定佐劑的劑量在嬰兒受試對(duì)象中是有效并且相對(duì)沒(méi)有反應(yīng)性的。通常，嬰兒制劑中的佐劑劑量比為成年人(例如65歲及以上的成年人)設(shè)計(jì)的制劑中使用的量少(例如劑量可能是給予成年人的制劑中提供的劑量的一部分)。例如，3D-MPL在每劑中的量通常在lyg-200yg的范圍，比如10-100μg或者10μg-50μg。嬰兒劑量一般在該范圍的較低一端，例如大約1μg-大約50μg，比如從大約2μg，或大約5μg，或大約10μg到大約25μg或大約50μg。通常，對(duì)于制劑中使用了QS21的情況，范圍是相當(dāng)?shù)?并且符合以上指出的比率)。對(duì)于油和水乳劑(例如水包油乳劑)的情況，提供給兒童或嬰兒的佐劑劑量可以是給予成年人受試對(duì)象的劑量的一部分。實(shí)施例9提供了免疫原性組合物效力的證明，所述組合物含有PreF抗原組合了不同劑量的示范性水包油佐劑。免疫原性組合物一般含有免疫保護(hù)量(或其分劑量)的抗原，并且可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)制備。免疫原性組合物，包括要給予人受試對(duì)象的那些，它們的制備概括描述于PharmaceuticalBiotechnology,Vol.61VaccineDesign—thesubunitandadjuvantapproach,editedbyPowellandNewman,PlenumPress,1995禾口NewTrendsandDevelopmentsinVaccines,editedbyVolleretal.,UniversityParkPress,Baltimore,Maryland,U.S.A.1978。在脂質(zhì)體內(nèi)的包封由例如Fullerton(美國(guó)專利4,235,877)描述過(guò)。蛋白與大分子的偶聯(lián)在LiWiite的美國(guó)專利4，372，945和Armor等的美國(guó)專利4，474，757中有公開。一般來(lái)說(shuō)，每劑免疫原性組合物中的蛋白量選擇能夠在典型受試對(duì)象中誘發(fā)免疫保護(hù)反應(yīng)，但沒(méi)有明顯有害副作用的量。這一語(yǔ)境下的免疫保護(hù)不一定意味著完全抗感染；它意味著抗某些癥狀或疾病，特別是抗與病毒關(guān)聯(lián)的嚴(yán)重疾病的保護(hù)作用。根據(jù)所采用的具體免疫原，抗原的量可能不同。通常，每個(gè)人類劑量可以預(yù)期包含I-IOOOyg蛋白，比如大約1μg-大約100μg，例如，大約1μg-大約50μg，比如大約1μg、大約2μg、大約5μg、大約10μg、大約15μg、大約20μg、大約25μg、大約30μg、大約40μg或大約50μg。免疫原性組合物中使用的量根據(jù)受試對(duì)象群體(例如嬰兒或老年人)來(lái)選擇。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究，包括觀察受試對(duì)象中的抗體效價(jià)和其他反應(yīng)，可以給特定組合物確定最佳用量。在接受初始疫苗接種后，受試對(duì)象可以在大約4周后接受加強(qiáng)劑。應(yīng)當(dāng)指出，無(wú)論選擇了何種佐劑，其在最終制劑中的濃度經(jīng)計(jì)算對(duì)目標(biāo)群體是安全有效的。例如，用于在人中引發(fā)抗RSV的免疫反應(yīng)的免疫原性組合物適合給予嬰兒(例如從出生到1歲的嬰兒，比如首次給藥時(shí)年齡為0-6個(gè)月)。引發(fā)抗RSV的免疫反應(yīng)的免疫原性組合物也適合給予老年人(例如單獨(dú)，或者與流感抗原和/或其他COPD相關(guān)病原體的抗原聯(lián)合給藥)。可以理解，這些不同應(yīng)用中可以選擇不同佐劑，每種情況的最佳佐劑及其濃度可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)經(jīng)驗(yàn)決定。在某些實(shí)施方案中，免疫原性組合物是能夠減少或防止感染RSV的疫苗。某些實(shí)施方案中，免疫原性組合物是減少或防止感染RSV后的病理反應(yīng)的疫苗。任選地，含有I^reF抗原的免疫原性組合物與至少一種來(lái)自RSV之外的病原生物體的其他抗原一起成劑。例如，所述病原生物體可以是呼吸道病原體(比如引起呼吸道感染的病毒或細(xì)菌)。某些情況中，免疫原性組合物含有來(lái)自RSV之外的病原病毒的抗原，所述病毒是比如引起呼吸道感染的病毒，比如流感或副流感病毒。其他實(shí)施方案中，可以選擇額外的抗原來(lái)協(xié)助給藥或者減少給受試對(duì)象提供抗多種感染性生物體的保護(hù)作用所需的接種次數(shù)。例如，可以使用來(lái)源于流感、乙肝、白喉、破傷風(fēng)、百日咳、流感嗜血桿菌、脊髓灰質(zhì)炎、鏈球菌或肺炎球菌等中的任何一種或多種的抗原。相應(yīng)地，抗原或其編碼核酸在制備藥物中的用途也是本公開的特征之一，其中所述藥物用于接觸或感染了RSV(之后治療性的或者之前預(yù)防性的)的治療。類似地，在受試對(duì)象中引發(fā)抗RSV的免疫反應(yīng)的方法也是本公開的特征之一。所述方法包括將免疫有效量的包含I^reF抗原的組合物給予受試對(duì)象，比如人受試對(duì)象。組合物常常包含能夠引發(fā)Thl型免疫反應(yīng)的佐劑。組合物被配制用于引發(fā)針對(duì)RSV的特異性免疫反應(yīng)，而不會(huì)在接觸RSV后加重病毒疾病。這就是說(shuō)，組合物被配制并且導(dǎo)致Thl型免疫反應(yīng)，該免疫反應(yīng)減少或防止感染RSV，和/或減少或防止感染RSV后的病理反應(yīng)。雖然組合物可以通過(guò)多種不同途徑進(jìn)行給藥，最經(jīng)常地，免疫原性組合物經(jīng)由肌內(nèi)或鼻內(nèi)給藥途徑遞送。免疫原性組合物一般含有免疫保護(hù)量(或其分劑量)的抗原，并且可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)制備。免疫原性組合物，包括要給予人受試對(duì)象的那些，它們的制備概括描述于PharmaceuticalBiotechnology,Vol.61VaccineDesign—thesubunitandadjuvantapproach,editedbyPowellandNewman,PlenumPress,1995禾口NewTrendsandDevelopmentsinVaccines,editedbyVolleretal.,UniversityParkPress,Baltimore,Maryland,U.S.A.1978。在脂質(zhì)體內(nèi)的包封由例如Fullerton(美國(guó)專利4,235,877)描述過(guò)。蛋白與大分子的偶聯(lián)在LiWiite的美國(guó)專利4，372，945和Armor等的美國(guó)專利4，474，757中有公開。一般來(lái)說(shuō)，每劑免疫原性組合物中的蛋白量選擇能夠在典型受試對(duì)象中誘發(fā)免疫保護(hù)反應(yīng)，但沒(méi)有明顯有害副作用的量。這一語(yǔ)境下的免疫保護(hù)不一定意味著完全抗感染；它意味著抗某些癥狀或疾病，特別是抗與病毒關(guān)聯(lián)的嚴(yán)重疾病的保護(hù)作用。根據(jù)所采用的具體免疫原，抗原的量可能不同。通常，每個(gè)人類劑量可以預(yù)期包含I-IOOOyg蛋白，比如大約1μg-大約100μg，例如，大約1μg-大約50μg，比如大約1μg、大約2μg、大約5μg、大約10μg、大約15μg、大約20μg、大約25μg、大約30μg、大約40μg或大約50μg。免疫原性組合物中使用的量根據(jù)受試對(duì)象群體(例如嬰兒或老年人)來(lái)選擇。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)研究，包括觀察受試對(duì)象中的抗體效價(jià)和其他反應(yīng)，可以給特定組合物確定最佳用量。在接受初始疫苗接種后，受試對(duì)象可以在大約4-12周后接受加強(qiáng)劑。例如，在將含有I^reF抗原的免疫原性組合物給予嬰兒個(gè)體時(shí)，初始和后續(xù)的接種可以與同時(shí)期要給予的其他疫苗一起給予。以下實(shí)施例僅供闡明某些特定特征和/或?qū)嵤┓桨浮＿@些實(shí)施例不應(yīng)被理解為使發(fā)明限于所描述的特定特征或?qū)嵤┓桨?。?shí)施例實(shí)施例1示范性PreF抗原基于這樣一個(gè)預(yù)測(cè)，即針對(duì)F蛋白的融合前構(gòu)象產(chǎn)生的免疫反應(yīng)優(yōu)先包含的抗體能夠防止膜融合所涉及的結(jié)合、構(gòu)象轉(zhuǎn)換和/或其他事件，從而提高了保護(hù)性反應(yīng)的效力，因此為了將蛋白穩(wěn)定在它的融合前構(gòu)象，對(duì)I^reF抗原相對(duì)天然RSVF蛋白進(jìn)行了修飾。圖IA和B示意了RSVFO和示范性I^reF重組抗原的特性。圖IA代表了RSVFO蛋白。FO是由574個(gè)氨基酸組成的前蛋白。FO前蛋白在翻譯后被蛋白水解加工和糖基化。信號(hào)肽(后來(lái)被信號(hào)肽酶去除)將FO前蛋白的翻譯定靶到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RE)上進(jìn)行。RE中的新生肽然后在多個(gè)位點(diǎn)(以三角形代表)被N-糖基化。弗林蛋白酶對(duì)FO的切割產(chǎn)生F2和Fl肽結(jié)構(gòu)域，它們折疊并一起組裝成F2-F1異質(zhì)二聚體的三聚體(即，3份F2-F1)。在天然狀態(tài)下，F(xiàn)蛋白通過(guò)其C端區(qū)域內(nèi)的跨膜螺旋錨定在膜上。FO多肽的其他特性包括15個(gè)半胱氨酸、4個(gè)已被研究的中和表位、2個(gè)卷曲螺旋區(qū)和脂化基序。圖IB顯示了示范性抗原的特性。為了構(gòu)建I^reF抗原，對(duì)FO多肽進(jìn)行了修飾以便穩(wěn)定F蛋白的融合前構(gòu)象，從而保留F蛋白的優(yōu)勢(shì)免疫原表位，所述優(yōu)勢(shì)免疫原表位即是RSV病毒在與宿主細(xì)胞結(jié)合并融合前呈遞的表位。相對(duì)FO多肽，向抗原中引入了以下穩(wěn)定突變。首先，在FO多肽胞外結(jié)構(gòu)域的C末端放置一個(gè)穩(wěn)定卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域來(lái)代替FO的膜錨定結(jié)構(gòu)域。其次，去除pep27肽(在天然蛋白中位于F2和Fl結(jié)構(gòu)域之間)。第三，將兩個(gè)弗林蛋白酶基序都除去。在替代的實(shí)施方案(命名為I^reFJl和ft~eF_V2)中，給C端結(jié)構(gòu)域添加了RSVG蛋白的免疫活性部分(例如氨基酸149-229)。其他實(shí)施方案中，引入修飾來(lái)改變糖基化和/或減少弗林蛋白酶之外的蛋白酶的切割。實(shí)施例2從CHO細(xì)胞產(chǎn)牛和純化PreF重組蛋白編碼示范性I^reF抗原的重組多核苷酸序列被導(dǎo)入宿主CHO細(xì)胞進(jìn)行I^reF抗原的產(chǎn)生。將包含被導(dǎo)入多核苷酸序列的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞或經(jīng)過(guò)擴(kuò)增的穩(wěn)定細(xì)胞群生長(zhǎng)在培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)條件適合細(xì)胞生長(zhǎng)到對(duì)所需目的來(lái)說(shuō)可以接受的規(guī)模(例如象Freshney(1994)CultureofAnimalCells,aManualofBasicTechnique,thirdedition,ffiley-Liss,New^rk及其中引用的參考文獻(xiàn)概括描述的)。一般來(lái)說(shuō)，細(xì)胞于37°C,5%CO2下生長(zhǎng)在搖瓶中的無(wú)血清培養(yǎng)基中，以2-3天的間隔進(jìn)行傳代，或者在生物反應(yīng)器中于生長(zhǎng)，p02維持在20%。為了回收重組I^reF抗原，將細(xì)胞培養(yǎng)物離心，細(xì)胞培養(yǎng)物的上清保存在大約-80°C待用。對(duì)于進(jìn)一步分析，取兩升細(xì)胞培養(yǎng)物上清液用純化水&稀釋，用NaOH調(diào)節(jié)pH9.5。上清液以Hml/min的速度上樣到已用20mM哌嗪(pH9.5)平衡過(guò)的QSepharoseFF離子交換柱(60ml，11.3cm)中。柱子用出發(fā)緩沖液洗后，用20柱體積的NaCl進(jìn)行洗脫，NaCl梯度在0-0.5M(級(jí)分大小IOml)。級(jí)分在SDSPAGE膠上通過(guò)銀染和^festern印跡分析。然后將含有I^reF蛋白的級(jí)分匯合做進(jìn)一步處理。匯合的Q步驟洗脫級(jí)分(130mls)用Millipore的帶有PellliconXLPESBiomax100(麗CO10，OOODa)膜盒的TFF系統(tǒng)經(jīng)緩沖液交換到IOmM硫酸鹽(pH7.0)中。得到的材料PH為7.0，電導(dǎo)率為1.8mS/cm。取IOOml該樣品以5ml/min上樣到用IOmMPO4(Na)緩沖液(pH7.0)平衡好的IOml羥基磷灰石II型(HATII)膠(XK16，高度=5cm)中。柱子用出發(fā)緩沖液洗后，以20柱體積的IOmM到200mMP04(Na)(pH7.0)進(jìn)行梯度洗脫。再次在SDSPAGE上通過(guò)銀染和考馬斯亮藍(lán)分析級(jí)分，合并陽(yáng)性的級(jí)分。親和層析后，用Vivaspin20濃縮單元，10，OOODaMWCO將合并的級(jí)分濃縮并將緩沖液交換為DPBS(pH7.4)。終產(chǎn)物大約13ml。蛋白濃度經(jīng)Lowry分析法檢測(cè)為195μg/ml。純度大于95%。該純化的I^reF抗原制品經(jīng)過(guò)濾除菌，保存在-20°C待用。實(shí)施例3:CH0細(xì)胞中產(chǎn)生的PreF重組蛋白的表征在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的I^reF重組蛋白通過(guò)非對(duì)稱場(chǎng)流分離(AFF-MALS)分析并與包含RSVF和G蛋白成分的嵌合抗原進(jìn)行比較。AFF-MALS允許在最小的基質(zhì)相互作用情況下，根據(jù)分子大小將液流中的蛋白種類分開，并通過(guò)多角度光散射進(jìn)一步分析確定分子量。圖2A顯示純化的TO物質(zhì)在最終的PBS緩沖液中65%以上處于高分子量寡聚物(1000-100000KDa)，只有3%保持單體形式。圖2B顯示純化的I^reF蛋白在PBS緩沖液中73%折疊成三聚體形式。物質(zhì)的10%處于1000到20000KDa的寡聚物。這些結(jié)果表明CHO細(xì)胞中表達(dá)的重組I^reF蛋白和天然狀態(tài)預(yù)期的一樣折疊成三聚體。純化的I^reF蛋白還與戊二醛交聯(lián)，其雙重目的是確認(rèn)蛋白在磷酸緩沖液中的溶解性和形成與re蛋白進(jìn)行體內(nèi)評(píng)估比較的凝聚物(見(jiàn)以下實(shí)施例7)。已知戊二醛交聯(lián)能夠很好地評(píng)估蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)，在Biochemistry，3610230-10239(1997)和Eur.J.Biochem.，271:4284-4292(2004)中有描述。蛋白與1%、2%和5%戊二醛交聯(lián)劑于4°C溫育4小時(shí)，加入NaBH4阻斷反應(yīng)。過(guò)多的戊二醛通過(guò)PBS緩沖液脫鹽柱去除。得到的蛋白經(jīng)^Onm的吸光度定量，通過(guò)變性還原條件下的SDSPAGE評(píng)估。確認(rèn)大部分純化重組I^reF在PBS溶液中以三聚體遷移。SDSPAGE證實(shí)需要將溫育溫度提高到23°C，才能將大部分三聚體蛋白轉(zhuǎn)化為高分子量的凝聚物。實(shí)施例4:PreF抗原引起的體外中和抑制通過(guò)ELISA篩選來(lái)自志愿者的人血清的抗RSVA反應(yīng)性，用于中和抑制(Ni)檢驗(yàn)法，血清的相對(duì)稀釋度是根據(jù)以前給每個(gè)血清樣品建立的可能RSV中和滴度確定的。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，血清與濃度為25μg/ml的抑制蛋白TreF或?qū)φ盏鞍?，后者基本?duì)應(yīng)美國(guó)專利5，194，595中公開的命名為Rixre的嵌合TO)在含有50%199-H培養(yǎng)基、0.5%FBS、2mM谷氨酰胺、50μg/mlgenamycin(全部購(gòu)自Invitrogen)的DMEM中混合，于37°C在回轉(zhuǎn)輪上溫育1.5到2小時(shí)。取20μ1血清和蛋白的梯度稀釋液在圓底96孔板中與RSVA混合，為了優(yōu)化每個(gè)血清樣品的抑制范圍所述RSVA已進(jìn)行了滴定。得到的混合液于33°C在5%CO2(為了維持pH)下溫育20分鐘。然后將血清-抑制劑-病毒混合液移入預(yù)先接種了Vero細(xì)胞的平底96孔板，于33°C溫育2小時(shí)，然后加入160μ1培養(yǎng)基。培養(yǎng)板繼續(xù)在33°C，5%C02下溫育5_6天，直至進(jìn)行NI滴度檢測(cè)的免疫熒光試驗(yàn)。用溶于磷酸緩沖液(PBS)的仲甲醛固定1小時(shí)后，培養(yǎng)板用2%牛奶/PBS和封閉緩沖液封閉。每孔加入山羊抗RSV抗體(BiodesignInternation；1400)，不經(jīng)清洗于室溫(RT)溫育2小時(shí)。樣品用PBS洗2次，向孔中加入溶于封閉緩沖液的抗山羊IgG-FITC(Sigma;1400)。培養(yǎng)板再在RT溫育2小時(shí)，同上洗2次，然后讀數(shù)。檢測(cè)到彡1的熒光合胞體時(shí)，孔被認(rèn)為是陽(yáng)性的。利用Spearman-Karber(SK)方法計(jì)算50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)，NI百分比計(jì)算為[(0yg/ml抑制蛋白的中和效價(jià)-25μg/ml抑制蛋白的中和效價(jià))/0μg/ml抑制蛋白的中和效價(jià)]X100。圖3顯示的示范性結(jié)果表明在測(cè)試的21個(gè)供體中，16個(gè)I^reF的NI比TO的高。實(shí)施例5:PreF抗原是具有免疫原性的為了證實(shí)I^reF抗原的免疫原性，小鼠間隔兩周IM免疫兩次，免疫使用preF(6.5、3.1、0·63,0.13和0.025μg/ml)和1/20人劑量的含有3DMPL和QS21的Thl佐劑(“AS01E”)，或者preF(l、0.2和0.04μg/ml)和1/10人劑量的含有3DMPL和鋁的Thl佐劑(“AS04C”)，三周后收集血清。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序，通過(guò)ELISA對(duì)匯合的血清樣品確定抗原特異性IgG抗體效價(jià)。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，96孔板包埋純化的滅活RSVA、RSVB和同源preF蛋白，并于4°C溫育過(guò)夜。血清樣品在封閉緩沖液中梯度稀釋，開始是原始濃度的150，還有出發(fā)濃度為200ng/ml的純化的小鼠IgG(Sigma,ON)，室溫溫育2小時(shí)。用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(Sigma,ON)檢測(cè)結(jié)合的抗體。3，3A，5，5A-四甲基聯(lián)苯胺(TMB,BDOptEIATM,BDBiosciences,ON)用作HRP的底物。每孔加入50μ1IMH2S04來(lái)終止反應(yīng)。每孔450nm處的吸光值用MolecularDevices微量培養(yǎng)板讀板儀(MolecularDevices,USA)檢測(cè)。圖4A和4B描述的代表性結(jié)果顯示用preF抗原免疫后，引發(fā)了抗RSVA和RSVB的強(qiáng)效價(jià)。實(shí)施例6=PreF引發(fā)中和抗體評(píng)估了小鼠血清樣品中和抗體的存在和量，所述小鼠按照以上實(shí)施例5中的描述免疫。來(lái)自免疫動(dòng)物的匯合血清從18的出發(fā)稀釋度開始在96孔板的RSV培養(yǎng)基中梯度稀釋?duì)苔?well)。對(duì)照孔僅含有RSV培養(yǎng)基，或者150的山羊抗RSV抗體(Biodesigninternational)。代表性RSVA或B株的500-1000感染劑量加到孔中，培養(yǎng)板在33°C，5%0)2溫育20分鐘，然后將混合液轉(zhuǎn)移到預(yù)先接種了IxlO5細(xì)胞/mLVero細(xì)胞的96孔平底培養(yǎng)板中。細(xì)胞在33°C，5%CO2溫育大約2小時(shí)，補(bǔ)充培養(yǎng)基，然后在相同的溫度下溫育5-6天。除去上清液，培養(yǎng)板用PBS清洗，用1%溶于PBS的仲甲醛將附著的細(xì)胞固定1小時(shí)，然后進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)分析，用山羊抗RSV—抗和抗山羊IgG-FITC檢測(cè)。圖5A和5B分別顯示的代表性結(jié)果表明在用preF免疫過(guò)的動(dòng)物的血清中檢測(cè)到了抗兩種RSV株的顯著中和抗體。實(shí)施例7=PreF提供抗RSV攻擊的保護(hù)小鼠如上所述以兩周間隔IM免疫兩次，第二次注射三周后用RSVA攻擊。通過(guò)測(cè)量攻擊后肺中存在的病毒來(lái)評(píng)價(jià)抗RSV的保護(hù)作用。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，麻醉后無(wú)菌取出免疫動(dòng)物的肺，在15ml管中用兩個(gè)體積的IOml/肺的RSV培養(yǎng)基中洗。然后將肺稱重，各用自動(dòng)Potter勻漿儀(Fisher，N印ean0N)在RSV培養(yǎng)基中勻漿，于4°C以^55xg離心2分鐘。上清液中存在的病毒通過(guò)梯度稀釋(8個(gè)重復(fù)，從110開始)到96孔板中預(yù)先接種的Vero細(xì)胞(ATCC#CCL-81)單層上并溫育6天來(lái)測(cè)定滴度。在1%仲甲醛/PBS(pH7.2)中固定后，用山羊抗RSV—抗和標(biāo)記FITC的抗山羊IgG二抗通過(guò)間接IFA檢測(cè)RSV。圖6A和B顯示的代表性結(jié)果表明在有佐劑的情況下，給予等于或高于0.04μg的劑量引發(fā)了抗RSV的強(qiáng)保護(hù)作用。實(shí)施例8=PreF不會(huì)誘發(fā)攻擊后肺嗜酸性粒細(xì)胞的募集為了評(píng)估抗原在進(jìn)行免疫和之后的攻擊后激發(fā)加重的疾病的可能性，小鼠組(5只小鼠/組)各用(a)IOyg戊二醛處理的preF、(b)IOygpreF或(c)IOyg不含佐劑的TO免疫兩次。加強(qiáng)劑后3周用RSVA攻擊小鼠，攻擊后的第4天進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(BAL)。根據(jù)巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，進(jìn)行了每個(gè)小鼠BAL中總的白血病浸潤(rùn)枚舉以及差異枚舉(300個(gè)細(xì)胞)。給每只動(dòng)物總細(xì)胞數(shù)量乘上嗜酸粒細(xì)胞的差異百分比。代表的是每組的幾何平均值，置信界限為95%。圖7顯示的代表性結(jié)果表明preF免疫和攻擊后，嗜酸粒細(xì)胞沒(méi)有被募集到肺中。此外，這些結(jié)果表明preF抗原的可溶性質(zhì)，與特意使之凝集的preF形式(戊二醛處理)或re抗原(天然凝聚的)相比，并不更偏愛(ài)嗜酸粒細(xì)胞。實(shí)施例9與水包油乳劑佐劑稀釋液一起成劑的PreF抗原的免疫原件小鼠接受與示范性水包油佐劑一起成劑的250ngpreF，所述佐劑是人“完全”劑量(AS03A，10.70mg角鯊烯、11.88mgDL-α-生育酚、4.85mg聚山梨醇酯80)的1/10(AS03A)、1/2劑量(AS(XBB)、1/4劑量(AS03C)或沒(méi)有佐劑。對(duì)照小鼠只接受AS03A或PBS。小鼠在第0和第14天被免疫。第39天(第2劑后15天)進(jìn)行血液、腎細(xì)胞采集和攻擊。攻擊后4天將肺勻漿進(jìn)行RSV滴定?？乖禺愋訧gG抗體效價(jià)通過(guò)ELISA給各個(gè)血清樣品確定。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，96孔板用純化的滅活RSVA包埋，于4°C溫育過(guò)夜。血清樣品從1200開始在封閉緩沖液中梯度稀釋，和出發(fā)濃度為200ng/ml的純化小鼠IgG(Sigma，ON)—起，于37°C溫育2小時(shí)。用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的抗小鼠IgG(Sigma，ON)檢測(cè)結(jié)合的抗體。3，3A，5，5A-四甲基聯(lián)苯胺(TMB,BDOptEIATMjBDBiosciences,ON)用作HRP的底物。每孔加入50μ11MH2S04來(lái)終止反應(yīng)。每孔450nm處的吸光值用MolecularDevices微量培養(yǎng)板讀板儀(MolecularDevices,USA)檢測(cè)。結(jié)果如圖8所示。在來(lái)自用preF組合AS03A、AS0!3B或AS03C免疫的小鼠的血清中，觀察到濃度大約250，000ng/mL的抗RSVIgG,而在來(lái)自只用preF免疫的小鼠的血清中觀察到很少(1^8ng/ml)。來(lái)自免疫動(dòng)物的匯合血清從18的稀釋度開始在96孔板RSV培養(yǎng)基中梯度稀釋(20μ1/孔)。對(duì)照孔僅含有RSV培養(yǎng)基或者150的山羊抗RSV抗體(Biodesigninternational)。加入RSVLong株，培養(yǎng)板在33°C溫育20分鐘，混合液轉(zhuǎn)移到預(yù)先接種IxlO5細(xì)胞/mLVero細(xì)胞的96孔平底板中。相同溫度溫育5-6天后，移去上清液；培養(yǎng)板用PBS洗，附著的細(xì)胞用溶于PBS的仲甲醛固定1小時(shí)，然后進(jìn)行間接免疫熒光(IFA)。圖9顯示，無(wú)論與preF聯(lián)合給予的AS03的量是多少，RSV中和抗體效價(jià)保持一致(lllog2)，而免疫沒(méi)有用AS03的小鼠中RSV中和抗體效價(jià)顯著低(61og2)。將免疫動(dòng)物麻醉后無(wú)菌取肺，在2個(gè)體積IOml/肺的RSV培養(yǎng)基在15ml管中洗。然后將它們稱重，用自動(dòng)Potter勻漿儀(Fisher，NepeanON)在RSV培養(yǎng)基中分別勻漿，于41在沈55秘離心2分鐘。滴定上清液中存在的病毒。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，肺勻漿以8個(gè)重復(fù)從110開始梯度稀釋到96孔板中預(yù)先接種的Vero細(xì)胞(ATCC#CCL-81)單層上，溫育5-6天。RSV通過(guò)間接IFA檢測(cè)。圖10顯示的結(jié)果表明，用preF組合AS03A、AS0;3B或AS03C免疫的小鼠中觀察到的保護(hù)作用沒(méi)有差別，而免疫沒(méi)有使用AS03的小鼠中觀察到的保護(hù)作用較少。這些結(jié)果顯示抗原可以與濃度范圍很廣的佐劑共同配制產(chǎn)生能夠引發(fā)抗RSV的免疫反應(yīng)的組合物。序列表SEQIDNO1編碼RSV參照融合蛋白的核苷酸序列A2株GenBank登錄號(hào)U50362atggagttgctaatcctcaaagcaaatgcaattaccacaatcctcactgcagtcacatttgttttgcttctggtcaaaacatcactgaagaattttatcaatcaacatgcagtgcagtagcaaaggctatcttagtgctctgagaactggttggtataccagtgttataactatagattaagtaatatcaaggaaaataagtgtaatggaacagatgctaaggtaaaattgataaacaagaattagataaatataaaaatgctgtaacagaattgcagttgctcatgcaaagcacccagcaacaaacaatcgagccagaagagaactaccaaggtttatgaattatacactcaaaatgccaaaaaaaccaatgtaacattaagcaagaaaaggaaaagaagatttcttggtttttgttaggtgttggatctgcaatcgccagtggcgttgctgtatctaaggtcctgcacctgaaggggaagtgaacaagatcaaaagtgctctactatccacaaacaaggctgtagtcagttatcaaatggagttagtgtcttaaccagcaaagtgttagacctcaaaaactatatagaaaacaattgttacctattgtgaacaagcaaagctgcagcatatcaaatatagcaactgtatagagttccaacaaaagaacaacagactactagagattaccagggaatttagtgttaagcaggtgtaactacacctgtaagcacttacatgttaactaatagtgaattattgtcattatcaatgatatgcctataacaaatgatcagaaaaagttaatgtccaacaatgttcaaatgttagacagcaaagttactctatcatgtccataataaaagaggaagtcttagcatatgtgtacaattaccactatatggtgttatagatacaccctgttggaaactacacacatccccctatgtacaaccaacacaaaagaagggtccaacatctgtttaacaagaactgacagaggtggtactgtgacaatgcaggatcagtatctttcttcccacaagctgaaacatgtaaagtcaatcaaatcgagtattttgtgacacaatgaacagtttaacattaccaagtgaagtaaactctgcaatgttgacatattcaaccccaaatatgattgtaaaattatgacttcaaaaacgatgtaagcagctccgttatcacatctctaggagccattgtgtcatgctatggcaaaacaaatgtacagcatccaataaaaatcgtggaatcataaagacattttctaacgggtgcgatatgtatcaaataaaggggtggacactgtgtctgtaggtaacacattatattatgtaaaaagcaagaaggtaaaagtctctatgtaaaaggtgaaccaataataaatttctatgacccttagtattcccctctgatgaatttgatgcatcaatatctcaagtcaacgagaagattaacagagcctagcatttattcgtaaatccgatgaattattacataatgtaaatgctggtaatccaccataaatatcatgataactactataattatagtgattatagtaatattgttatcttaattgctgttggactgctcttatactgtaaggccagaagcacaccagtcacactaagaaagatcaactgagtggtataaataatattgcatttagtaactaaSEQIDNO:2RSV參照F蛋白前體FO的氨基酸序列A2株GenBank登錄號(hào)AAB86664MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIATVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYS頂SIIKEEVLAYVVQLPWGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTINIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSNSEQIDNO3編碼RSV參照G蛋白的核苷酸序列Long株AtgtccaaaaacaaggaccaacgcaccgctaagacactagaaaagacctgggacactctcaatcatttattattcatatcatcgggcttatataagttaaatcttaaatctatagcacaaatcacattatccattctggcaatgataatctcaacttcacttataattacagccatcatattcatagcctcggcaaaccacaaagtcacactaacaactgcaatcatacaagatgcaacaagccagatcaagaacacaaccccaacatacctcactcaggatcctcagcttggaatcagcttctccaatctgtctgaaattacatcacaaaccaccaccatactagcttcaacaacaccaggagtcaagtcaaacctgcaacccacaacagtcaagactaaaaacacaacaacaacccaaacacaacccagcaagcccactacaaaacaacgccaaaacaaaccaccaaacaaacccaataatgattttcacttcgaagtgtttaactttgtaccctgcagcatatgcagcaacaatccaacctgctgggctatctgcaaaagaataccaaacaaaaaaccaggaaagaaaaccaccaccaagcctacaaaaaaaccaaccttcaagacaaccaaaaaagatctcaaacctcaaaccactaaaccaaaggaagtacccaccaccaagcccacagaagagccaaccatcaacaccaccaaaacaaacatcacaactacactgctcaccaacaacaccacaggaaatccaaaactcacaagtcaaatggaaaccttccactcaacctcctccgaaggcaatctaagcccttctcaagtctccacaacatccgagcacccatcacaaccctcatctccacccaacacaacacgccagtagSEQIDNO4RSV參照G蛋白的氨基酸序列MSKNKDQRTAKTLEKTWDTLNHLLFISSGLYKLNLKSIAQITLSILAMIISTSLIITAIIFIASANHKVTLTTAIIQDATSQIKNTTPTYLTQDPQLGISFSNLSEITSQTTTILASTTPGVKSNLQPTTVKTKNTTTTQTQPSKPTTKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDLKPQTTKPKEVPTTKPTEEPTINTTKTNITTTLLTNNTTGNPKLTSQMETFHSTSSEGNLSPSQVSTTSEHPSQPSSPPNTTRQSeqIDNO5針對(duì)CHO優(yōu)化了的押沖類似物的核苷酸序列aagcttgccaccatggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggcctteatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggcctgataatctagaSEQIDNO6PreF類似物的氨基酸序列MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPWGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCiaMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEASeqIDNO7針對(duì)CHO優(yōu)化了的i^reFG—Vl編碼核苷酸序列aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaagagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaactccgagctgctctccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggcctteatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaagagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggctggcggctctggcggcagcggcggctccaagcagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccttgctccatctgctccaacaaccctacctgctgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctggcaagaaaaccaccaccaagcctaccaagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaaggaagtgccaaccaccaagcaccaccaccatcaccactgataatctaSeqIDNO:8針對(duì)CHO的I^reFGja肽MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPI^YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTI^YYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEAGGSGGSGGSKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTKSeqIDNO:9針對(duì)CHO的i^reFG—V2編碼核苷酸序列aagcttgccaccatggagctgctgatcctcaagaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaagagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaagaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtcaagctgatcaagcaggaactggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgacaaactccgagctgctctccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccaaaaaaagctgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaagtcctggcctacgtcgtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaagagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggaaggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtcaacgagaagatcaaccagtccctggcctteatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaagagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggctggcggcaagcagcggcagaacaagcctcctaacaagcccaacaacgacttccacttcgaggtgttcaacttcgtgccttgctccatctgctccaacaaccctacctgctgggccatctgcaagagaatccccaacaagaagcctggcaagaaaaccaccaccaagcctaccaagaagcctaccttcaagaccaccaagaaggaccacaagcctcagaccacaaagcctaaggaagtgccaaccaccaagcaccaccaccatcaccactgataatctaSeqIDNO:10針對(duì)CHO的i^reFG—V2肽MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPI^YGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNHYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEAGGKQRQNKPPNKPNNDFHFEVFNFVPCSICSNNPTCWAICKRIPNKKPGKKTTTKPTKKPTFKTTKKDHKPQTTKPKEVPTTKSEQIDNO:11示范性卷曲螺旋(異亮氨酸拉鎖)EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEASEQIDNO12PreF抗原多核苷酸CH02atggagctgcccatcctgaagaccaacgccatcaccaccatcctcgccgccgtgaccctgtgcttcgccagcagccagaacatcacggaggagttctaccagagcacgtgcagcgccgtgagcaagggctacctgagcgcgctgcgcacgggctggtacacgagcgtgatcacgatcgagctgagcaacatcaaggagaacaagtgcaacggcacggacgcgaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgcggtgacggagctgcagctgctgatgcagagcacgccggcgacgaacaacaagttcctcggcttcctgctgggcgtgggcagcgcgatcgcgagcggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagtccgcgctgctgagcacgaacaaggcggtcgtgagcctgagcaacggcgtgagcgtgctgacgagcaaggtgctcgacctgaagaactacatcgacaagcagctgctgccgatcgtgaacaagcagagctgcagcatcagcaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccgcctgctggagatcacgcgggagttctccgtgaacgcaggcgtgacgacgcccgtgtctacgtacatgctgacgaacagcgagctgctcagcctgatcaacgacatgccgatcacgaacgaccagaagaagctgatgagcaacaacgtgcagatcgtgcgccagcagagctacagcatcatgagcatcatcaaggaggaggtgctggcatacgtggtgcagctgccgctgtacggcgtcatcgacacgccctgctggaagctgcacacgagcccgctgtgcacgaccaacacgaaggagggcagcaacatctgcctgacgcggacggaccggggctggtactgcgacaacgcgggcagcgtgagcttcttcccgctcgcggagacgtgcaaggtgcagagcaaccgcgtcttctgcgacacgatgaacagcctgacgctgccgagcgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaacccgaagtacgactgcaagatcatgacgagcaagaccgatgtcagcagcagcgtgatcacgagcctcggcgcgatcgtgagetgctacggcaagacgaagtgcacggcgagcaacaagaaccgcggcatcatcaagacgttcagcaacggctgcgactatgtgagcaacaagggcgtggacactgtgagcgtcggcaacacgctgtactacgtgaacaagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagccgatcatcaacttctacgacccgctcgtgttcccgagcgacgagttcgacgcgagcatcagccaagtgaacgagaagatcaaccagagcctggcgttcatccgcaagagcgacgagaagctgcacaacgtggaggacaagatcgaggagatcctgagcaagatctaccacatcgagaacgagatcgcgcgcatcaagaagctgatcggcgaggcgcatcatcaccatcaccattgaSEQIDNO:13帶有內(nèi)含子的押沖抗原多核苷酸atggagctgetgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgetccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtacgtgtcgggacttgtgttcccctttttttaataaaaagttatatctttaatgttatatacatatttcctgtatgtgatccatgtgcttatgactttgtttatcatgtgtttaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggccggaggtcaccaccaccatcaccactgaSEQIDNO:14合成連接序列GGSGGSGGSSEQIDNO:15弗林蛋白酶切割位點(diǎn)RARRSEQIDNO:16弗林蛋白酶切割位點(diǎn)RKRRSEQIDNO:17編碼i^reF—NGTL的核苷酸序列atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgetccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgctgggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaacgggaccctggcctteatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggccSEQIDNO:18PreF—NGTL的氨基酸序列MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPWGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCiaMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINGTLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEASEQIDNO:19編碼i^reF—L112Q的核苷酸序列atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgetccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgcagggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaaccagtccctggcctteatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggccSEQIDNO:20PreF_L112Q的氨基酸序列MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLQGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEASEQIDNO:21編碼PreF_NGTL_Ll12Q的核苷酸序列atggagctgctgatcctgaaaaccaacgccatcaccgccatcctggccgccgtgaccctgtgcttcgcctcctcccagaacatcaccgaggagttctaccagtccacctgctccgccgtgtccaagggctacctgtccgccctgcggaccggctggtacacctccgtgatcaccatcgagctgtccaacatcaaggaaaacaagtgcaacggcaccgacgccaaggtgaagctgatcaagcaggagctggacaagtacaagagcgccgtgaccgaactccagctgctgatgcagtccacccctgccaccaacaacaagtttctgggcttcctgcagggcgtgggctccgccatcgcctccggcatcgccgtgagcaaggtgctgcacctggagggcgaggtgaacaagatcaagagcgccctgctgtccaccaacaaggccgtggtgtccctgtccaacggcgtgtccgtgctgacctccaaggtgctggatctgaagaactacatcgacaagcagctgctgcctatcgtgaacaagcagtcctgctccatctccaacatcgagaccgtgatcgagttccagcagaagaacaaccggctgctggagatcacccgcgagttctccgtgaacgccggcgtgaccacccctgtgtccacctacatgctgaccaactccgagctgctgtccctgatcaacgacatgcctatcaccaacgaccagaaaaaactgatgtccaacaacgtgcagatcgtgcggcagcagtcctacagcatcatgagcatcatcaaggaagaggtgctggcctacgtggtgcagctgcctctgtacggcgtgatcgacaccccttgctggaagctgcacacctcccccctgtgcaccaccaacaccaaggagggctccaacatctgcctgacccggaccgaccggggctggtactgcgacaacgccggctccgtgtccttcttccctctggccgagacctgcaaggtgcagtccaaccgggtgttctgcgacaccatgaactccctgaccctgccttccgaggtgaacctgtgcaacatcgacatcttcaaccccaagtacgactgcaagatcatgaccagcaagaccgacgtgtcctccagcgtgatcacctccctgggcgccatcgtgtcctgctacggcaagaccaagtgcaccgcctccaacaagaaccggggaatcatcaagaccttctccaacggctgcgactacgtgtccaataagggcgtggacaccgtgtccgtgggcaacacactgtactacgtgaataagcaggagggcaagagcctgtacgtgaagggcgagcctatcatcaacttctacgaccctctggtgttcccttccgacgagttcgacgcctccatcagccaggtgaacgagaagatcaacgggaccctggccttcatccggaagtccgacgagaagctgcataacgtggaggacaagatcgaggagatcctgtccaaaatctaccacatcgagaacgagatcgcccggatcaagaagctgatcggcgaggccSEQIDNO:22PreF_NGTL_L112Q的氨基酸序列MELLILKTNAITAILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKSAVTELQLLMQSTPATNNKFLGFLQGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPLAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINGTLAFIRKSDEKLHNVEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA權(quán)利要求1.重組呼吸道合胞病毒(RSV)抗原，其包含含有RSVF蛋白多肽的F2結(jié)構(gòu)域和F1結(jié)構(gòu)域的可溶性F蛋白多肽，其中所述F蛋白多肽包含至少一個(gè)使糖基化改變的修飾。2.權(quán)利要求1所述的重組RSV抗原，其中所述F蛋白多肽包含至少一個(gè)選自下述的修飾(i)添加包含異源三聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列；()缺失至少一個(gè)弗林蛋白酶切割位點(diǎn)；(iii)缺失至少一個(gè)非弗林蛋白酶的切割位點(diǎn)；(iv)缺失ρ印27結(jié)構(gòu)域的一或多個(gè)氨基酸；和(ν)在F蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的疏水結(jié)構(gòu)域中取代或添加至少一個(gè)親水氨基酸。3.權(quán)利要求1所述的重組RSV抗原，其中所述使糖基化改變的修飾包含取代一或多個(gè)氨基酸，所述一或多個(gè)氨基酸包含和/或鄰接對(duì)應(yīng)SEQIDNO2中位點(diǎn)500的氨基酸。4.權(quán)利要求1或3所述的重組RSV抗原，其中對(duì)應(yīng)SEQIDNO2中位點(diǎn)500-502的氨基酸選自NGS、NKS、NGT、NKT。5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述使糖基化改變的修飾包含谷氨酰胺取代，是在對(duì)應(yīng)SEQIDNO2中位點(diǎn)500的氨基酸處的取代。6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中可溶性F蛋白多肽在F2結(jié)構(gòu)域和Fl結(jié)構(gòu)域之間包含完整的融合肽。7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述至少一個(gè)修飾包含添加含有異源三聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。8.權(quán)利要求7所述的重組RSV抗原，其中所述異源三聚化結(jié)構(gòu)域被定位到Fl結(jié)構(gòu)域的C端。9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其包含F(xiàn)2結(jié)構(gòu)域和Fl結(jié)構(gòu)域，而沒(méi)有居中的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。10.權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原組裝成多聚體。11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原組裝成三聚體。12.權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中&結(jié)構(gòu)域包含對(duì)應(yīng)SEQIDNO:2的參照F蛋白前體多肽(ig中氨基酸沈-105的RSVF蛋白多肽的至少一部分。13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中F1結(jié)構(gòu)域包含對(duì)應(yīng)SEQIDNO:2的參照F蛋白前體多肽(ig中氨基酸137-516的RSVF蛋白多肽的至少一部分。14.權(quán)利要求1-13中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中F2結(jié)構(gòu)域包含對(duì)應(yīng)SEQIDNO:2的參照F蛋白前體多肽(Ftl)中氨基酸沈-105的RSVF蛋白多肽，和/或F1結(jié)構(gòu)域包含對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的參照F蛋白前體多肽(F。)中氨基酸137-516的RSVF蛋白多肽。15.權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原選自a)包含SEQIDNO22的多肽；b)SEQIDNO:21編碼的或者與SEQIDNO:21在嚴(yán)緊條件下基本全長(zhǎng)雜交的多核苷酸序列編碼的多肽；c)與SEQIDNO22有至少95%序列同一性的多肽。16.權(quán)利要求1-15中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中F2結(jié)構(gòu)域包含RSVF蛋白多肽的氨基酸1-105。17.結(jié)構(gòu)域帶有完整的融合肽，但沒(méi)有居中的pep27結(jié)構(gòu)域。18.權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述異源三聚化結(jié)構(gòu)域包含卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。19.權(quán)利要求18所述的重組RSV抗原，其中所述多聚化結(jié)構(gòu)域包含異亮氨酸拉鏈。20.權(quán)利要求19所述的重組RSV抗原，其中所述異亮氨酸拉鎖結(jié)構(gòu)域包含SEQIDNO11的氨基酸序列。21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原在F蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的疏水結(jié)構(gòu)域中包含至少一個(gè)親水氨基酸取代或添加。22.權(quán)利要求21所述的重組RSV抗原，其中所述疏水結(jié)構(gòu)域是F蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的HRB卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域。23.權(quán)利要求22所述的重組RSV抗原，其中所述HRB卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域包含在對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的參照F蛋白前體(Ftl)中氨基酸512的位點(diǎn)上帶電荷殘基取代中性殘基。24.權(quán)利要求23所述的RSV抗原，其中HRB卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域包含在對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的參照F蛋白前體(Ftl)中氨基酸512的位點(diǎn)上賴氨酸或谷氨酰胺取代亮氨酸。25.權(quán)利要求21所述的重組RSV抗原，其中所述疏水結(jié)構(gòu)域是F蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的HRA結(jié)構(gòu)域。26.權(quán)利要求25所述的重組RSV抗原，其中HRA結(jié)構(gòu)域包含在對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的參照F蛋白前體(Ftl)中氨基酸105的位點(diǎn)后添加帶電荷的殘基。27.權(quán)利要求沈所述的重組RSV抗原，其中HRA結(jié)構(gòu)域包含在對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的參照F蛋白前體(！^中氨基酸105的位點(diǎn)后添加賴氨酸。28.權(quán)利要求21-27中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原在F蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的HRA結(jié)構(gòu)域中至少包含親水氨基酸的第一取代或添加；在HRB結(jié)構(gòu)域中至少包含親水氨基酸的第二取代或添加。29.權(quán)利要求1-中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含消除天然F蛋白前體(Ftl)中存在的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)的至少一個(gè)氨基酸添加、缺失或取代。30.權(quán)利要求四所述的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含氨基酸添加、缺失或取代，這些修飾消除了對(duì)應(yīng)SEQIDNO2的參照F蛋白前體中氨基酸105-109的位點(diǎn)上的，對(duì)應(yīng)氨基酸133-136的位點(diǎn)上的，或者對(duì)應(yīng)氨基酸105-109和133-136這兩個(gè)位點(diǎn)上的弗林蛋白酶切割位點(diǎn)。31.權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中F1和F2多肽結(jié)構(gòu)域的序列對(duì)應(yīng)RSVALong株的序列。32.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含多肽的多聚體。33.權(quán)利要求1-31中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，其中所述RSV抗原包含多肽的三聚體。34.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原，和藥物可接受載體或賦形劑。35.權(quán)利要求34所述的免疫原性組合物，還包含佐劑。36.權(quán)利要求35所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含3D-MPL、QS21、水包油乳劑和明礬(Alum)中的至少一個(gè)。37.權(quán)利要求36所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑包含水包油乳劑。38.權(quán)利要求36或37所述的免疫原性組合物，其中所述水包油乳劑包含母生育酚。39.權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述水包油乳劑每個(gè)人類劑量中包含低于5mg的角鯊烯。40.權(quán)利要求35-39中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中所述佐劑適合給予新生兒。41.權(quán)利要求34-40中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，其中當(dāng)免疫原性組合物包含權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原時(shí)，所述免疫原性組合物還包含G蛋白多肽，所述G蛋白多肽含有對(duì)應(yīng)RSVG蛋白多肽中氨基酸位點(diǎn)149-2的氨基酸序列。42.權(quán)利要求34-41中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物，還包含除RSV之外的病原生物體的至少一種其他抗原。43.重組核酸，包含編碼權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原的多核苷酸序列。44.權(quán)利要求43所述的重組核酸，其中所述編碼RSV抗原的多核苷酸序列為了在選定的宿主細(xì)胞中表達(dá)進(jìn)行了密碼子優(yōu)化。45.權(quán)利要求43或44所述的重組核酸，其中所述核酸包含選自以下的多核苷酸序列a)包含SEQIDN0:21的多核苷酸序列；b)編碼SEQIDNO22的多核苷酸序列；c)與SEQIDNO21在嚴(yán)緊條件下基本全長(zhǎng)雜交的多核苷酸序列；d)與SEQIDNO:21有至少95%序列同一性的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列不對(duì)應(yīng)天然RSV株。46.載體，所述載體包含權(quán)利要求43-45中任一項(xiàng)所述的重組核酸。47.宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含權(quán)利要求43或44所述的核酸或者權(quán)利要求46所述的載體。48.權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的RSV抗原在制備治療RSV感染的藥物中的用途。49.權(quán)利要求48所述的RSV抗原或核酸的用途，其中所述藥物為了預(yù)防性治療RSV感染而給藥。50.引發(fā)抗呼吸道合胞病毒(RSV)的免疫反應(yīng)的方法，所述方法包括將包含權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原的組合物或者權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物給予受試對(duì)象。51.權(quán)利要求50所述的方法，其中給予包含RSV抗原的組合物引發(fā)了RSV特異性免疫反應(yīng)，但不會(huì)在接觸RSV后加重病毒性疾病。52.權(quán)利要求50或51所述的方法，其中所述免疫反應(yīng)包括保護(hù)性免疫反應(yīng)，其減少或防止感染RSV和/或減少或防止感染RSV后的病理反應(yīng)。53.權(quán)利要求50-52中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述受試對(duì)象是人受試對(duì)象。54.權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原或權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物用于醫(yī)藥。55.權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)所述的重組RSV抗原或權(quán)利要求34-42中任一項(xiàng)所述的免疫原性組合物用于防止或治療RSV相關(guān)疾病。56.產(chǎn)生糖基化模式被改變的重組RSV抗原的方法，所述方法包括(i)在宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求43-45中任一項(xiàng)所述的核酸；和(ii)分離由此表達(dá)的重組RSV抗原。57.提高RSV融合蛋白多肽的表達(dá)的方法，所述方法包括在宿主細(xì)胞中表達(dá)編碼RSV融合蛋白多肽的核酸，所述核酸包含會(huì)產(chǎn)生氨基酸添加、缺失或取代的至少一個(gè)突變，其中所述氨基酸添加、缺失或取代使得所編碼的RSV融合蛋白多肽與天然RSV融合蛋白相比，改變了的糖基化位點(diǎn)，從而改變了糖基化位點(diǎn)的RSV融合蛋白多肽，與不含所述氨基酸添加、缺失或取代的RSV融合蛋白相比，表達(dá)被提高。58.權(quán)利要求57所述的方法，其中編碼RSV融合蛋白多肽的核酸還包含其他突變，所述突變產(chǎn)生的氨基酸添加、缺失或取代能夠消除所編碼的RSV融合蛋白多肽中的肽酶切割位點(diǎn)ο59.權(quán)利要求57或58所述的方法，其中RSV融合蛋白多肽是被穩(wěn)定在融合前構(gòu)象中的重組融合蛋白多肽。全文摘要本公開提供了重組呼吸道合胞病毒(RSV)抗原及其制備和使用方法，包括用于治療和/或防止RSV感染的免疫原性組合物(例如疫苗)。文檔編號(hào)A61K39/155GK102481359SQ201080037770公開日2012年5月30日申請(qǐng)日期2010年6月24日優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日發(fā)明者G·J·M·F·P·鮑杜克斯,J·L·魯爾,N·布萊斯,P·雷奧爾特,S·L·西爾申請(qǐng)人:葛蘭素史密斯克萊生物公司,魁北克益得生物醫(yī)學(xué)公司