專利名稱：對(duì)人血漿樣品中的至少一種病原體滅活的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種對(duì)人血漿樣品的至少一種病原體滅活的方法、通過該方法獲得的血漿以及用于應(yīng)用所述方法的設(shè)備。所獲得的血漿是一種生物活性漿液，其中的至少一種病原體被滅活。所述方法以及通過所述方法獲得的產(chǎn)品對(duì)于治療和非治療領(lǐng)域中的應(yīng)用尤其有用。在下面的說明中，在本文的結(jié)尾重新列出了括號(hào)中的引用文件(R6f)。
背景技術(shù)：
目前，通過化學(xué)方法來確保人血漿的安全性。人血漿的安全性可以看作為對(duì)病原體的滅活以及確保其治療特性。這涉及到在血漿中添加易于使其受到污染的化學(xué)物質(zhì)(例如溶劑和清洗劑等)的方法，與化學(xué)物質(zhì)相結(jié)合的方法以及物理-化學(xué)方法，例如通過給定波長(zhǎng)(例如UV)的發(fā)光輻射而與照射相關(guān)的光敏分子，或者熱處理，例如在添加蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑后在60°c下進(jìn)行巴斯德氏消毒、過濾、伽馬福射...(Ref. I), C. Naegelen等人的[Evolution des techniques de preparation des produits sanguins labiles(PSL)inactivation des pathogenes dans Ies PSL], Transfusion Cliniqueet Biologique
16(2006)pp. 179-189。由于這些方法都要向人血漿中添加外來物質(zhì)，因此導(dǎo)致方法需要有清除和/或凈化血漿的步驟，否則其將影響血漿的性質(zhì)，因而這些方法受到限制。這一最終步驟使得不能獲得“同一(identique)”血漿。實(shí)際上，化學(xué)物質(zhì)從來都不能被完全清除并可能通過例如積累產(chǎn)生長(zhǎng)期毒性。另外，在較高溫度下(即高于或等于60°C)處理血漿使所具備的蛋白質(zhì)變性，因此還不得不添加化學(xué)產(chǎn)物以便穩(wěn)定蛋白質(zhì)。眾所周知，在農(nóng)產(chǎn)品加工領(lǐng)域中，在高壓下的處理方法用于對(duì)諸如霉菌、細(xì)菌以及病毒(在某些情況下)進(jìn)行滅活。例如A. JOFRE等人[LWTFood Science and Technology42 (5) (2009), 924-928 頁，題為 “Efficiency ofhigh hydrostatic pressure at 600MPaagainst food-borne micro-organismsby challenge test convenience，，] (Ref. 2)描述了采用600MPa的壓強(qiáng)以確保食品的安全。還采用了其它方法對(duì)病原體滅活，例如“Staphylococcus aureus (S. aureus)dans du jambon (火腿中的金黃色葡萄球菌)”(C. C TASSOU 等，“Temperature-assistedhigh hydrostatic pressure inactivation ofStaphylococcus aureus in a ham modelsystem !evaluation in selective andnon selective medium，，, J. Applied Microbiology104(2008)，1764-1773) (Ref. 3)。獲得的結(jié)果顯示需要在20°C下施加500MPa的壓強(qiáng)45分鐘以將存在的病原體量降到十萬分之一。在400MPa的壓強(qiáng)下55°C的中等加熱情況下，在處理的前7分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)降至百萬分之一。該文獻(xiàn)中使用的壓強(qiáng)和溫度不能使人血漿保持生物活性。很明顯，以往的工作依然利用如下事實(shí)尤其需要達(dá)到較高的壓強(qiáng)值(約500MPa)以在常溫下實(shí)現(xiàn)降低，也就是說，在典型環(huán)境(例如胰蛋白胨鹽的適宜條件)下,20 °C下金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus (S. aureus))總體降至百萬分之一 [Y. RIGALDIE :“Sur I’ impact destraitements sous Hautes Pressions dans ladecontamination et lasterilization de formes pharmaceutiques renfermantdes moleculestherapeutiques sensibles aux procedes energetiques，，， Thesedel，UniversiteBordeaux I (2002 年 7 月 I 日)，序號(hào) 2526 (Ref. 4)]。對(duì)金黃色葡萄球菌的某些病原體滅活所需的較高的壓強(qiáng)值是在保持人血漿的生物活性的情況下適當(dāng)?shù)剡\(yùn)用對(duì)所述血漿中的病原體滅活的方法的主要限制。此外，Y.RIGALDIE 等的[“Pharmaceuticals perspectives of HighPressures a soft tool for sterilization of fragile drugs，，，Defect andDiffusion Forum208-209 (2002)，55-58 (Ref. 5)]表明，一方面，在600MPa下通過10分鐘的持續(xù)高壓處理對(duì)金黃色葡萄球菌滅活可實(shí)現(xiàn)在典型環(huán)境下(例如胰蛋白胨鹽的適宜條件)99%到99. 9%的 消除，另一方面，相比于常溫溫度，低溫(_17°C )對(duì)于滅活效果不明顯。眾所周知，人血漿具有特定的生物學(xué)特性。實(shí)際上，血漿含有約3%的多種蛋白質(zhì)。在比例上占得最多的蛋白質(zhì)有白蛋白，抗體或免疫球蛋白，纖維蛋白原，α I抗胰蛋白酶，α 2巨球蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，脂蛋白(HDL和LDL)。其還帶有凝固因子，凝固因子在大多數(shù)情況下被用作為基準(zhǔn)以測(cè)量血漿的生物活性。當(dāng)凝固因子(尤其是存在于血漿中的VIIIc，V以及 XI 因子)的活性大于 50%時(shí)(Pharmacopee Europeenne 5. 6 01/2007 :1646 (Ref. 6)),血漿有“生物活性”。通過某些蛋白質(zhì)，血漿可以與某些微生物的膜相互作用(A. KUNERT等，The Journal of Immunologyl79 (2007)，2979-2988 (Ref. 7))，或者導(dǎo)致孢子形成(在血漿中引入由50%的營養(yǎng)體形式的枯草桿菌(B. subtilis)以及50%的孢子形式的枯草桿菌構(gòu)成的懸液液將很快引起近乎完全的孢子形成)。多項(xiàng)研究表明，在-10°C下以200到500MPa的壓強(qiáng)處理血漿對(duì)于血漿產(chǎn)品的保存是不利的，并且這種方法不應(yīng)用來對(duì)血漿產(chǎn)品中的病毒和微生物滅活(A. M. MATSER等，“High Pressure processing for preservation ofblood produts，，，High PressureResearch 25(2005)，p.37-41) (Ref. 8)。國際申請(qǐng)WO 02/056824(Ref. 9)描述了利用與保持血漿的生物活性不匹配的壓強(qiáng)值來對(duì)血漿產(chǎn)品滅菌的方法。測(cè)試了不同的溫度和壓力組合，然而這些組合不允許保持VIIIc, V以及XI凝固因子的活性從而獲得具有生物活性的人血漿。此外，在該文獻(xiàn)中，方法依賴于病原體而不同；這使得這些方法難以在工業(yè)上應(yīng)用。現(xiàn)有技術(shù)中還進(jìn)行了其它試驗(yàn)以便對(duì)血漿中的金黃色葡萄球菌滅活(F.TA0等的“Deciphering Mechanisms for Infectious Agent InactivationUsing Cyclic HighPressure or Pressure Cycling Technology，，，(BBIInc. -Boston Biomedica Inc.)BIOPHYSICS 2003-Poster 021604(Ref. 10))。在S. DUSING 等的文章中[“Inactivation of viruses in plasmaby cycledpulses of high pressure，，，Trends in High Pressure BioscienceandBiotechnology, Ed. R. HAYASHI, Elsevier Science BV (2002) ] (Ref. 11)，僅考慮了應(yīng)用壓強(qiáng)的實(shí)施方式，尤其是被低溫(即，約_20°C )下300秒的正常環(huán)境壓強(qiáng)間隔開的60秒高壓(即大約在400到500MPa之間)的循環(huán)。在該文獻(xiàn)中使用的壓強(qiáng)對(duì)于保持人血漿生物活性而言并不適合。因此，本領(lǐng)域中存在緩解現(xiàn)有技術(shù)中的這些缺陷、不便以及障礙的現(xiàn)實(shí)需要，尤其需要使得能夠?qū)θ搜獫{中的至少一種病原體滅活，并且還能夠確保血漿蛋白質(zhì)(例如VIIIc, V，和XI因子)的活性，以便使血漿具有生物學(xué)活性的方法。本領(lǐng)域中還存在找出使得能夠?qū)θ搜獫{中的至少一種病原體滅活并且還能夠在不引入外部產(chǎn)品(例如化學(xué)產(chǎn)品)以及后續(xù)凈化步驟以清除所引入的易于造成毒性(通過例如，積累或所有其它過程)的情況下保持生物活性的方法。尤其是，本領(lǐng)域存在找出使得能夠降低成本、減少滅活所需時(shí)間以及改善對(duì)至少一種病原體滅活的效率，同時(shí)保持人血漿的生物活性的更有效的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過提供一種包括至少5個(gè)循環(huán)的對(duì)人血漿樣品的至少一種病原體進(jìn)行 滅活的方法，能夠顯著地克服現(xiàn)有技術(shù)中的這些缺陷、不便和障礙，所述5個(gè)循環(huán)中的每個(gè)包括-將初始?jí)簭?qiáng)Ptl的樣品增壓至壓強(qiáng)P1,P1介于190到210MPa之間，由于增壓而使血漿在壓強(qiáng)P1下的溫度在-10°c到-3°c之間，-可以在110到130秒的時(shí)間段范圍內(nèi)維持壓強(qiáng)P1，以及-使樣品降壓至壓強(qiáng)P。，-實(shí)現(xiàn)在47.5到52. 5MPa s—1之間的針對(duì)所述增壓的壓強(qiáng)增加速度和針對(duì)所述降壓的壓強(qiáng)減小速度。換言之，本發(fā)明的目的在于一種對(duì)人血漿樣品中的至少一種病原體滅活的方法，所述方法包括至少5個(gè)循環(huán)，所述5個(gè)循環(huán)中的每一個(gè)-使所述樣品從其初始?jí)簭?qiáng)Ptl增壓至壓強(qiáng)P1,P1在190到210MPa之間，由于增壓所述血漿在壓強(qiáng)P1下的溫度介于-10°C到-3°c之間，-可將壓強(qiáng)P1維持110到130秒的時(shí)間，以及-以47.5到52. 5MPa s_1的速度V1實(shí)現(xiàn)所述增壓和所述降壓。發(fā)明人以不同尋常并且完全出人意料的方式證明了組合本發(fā)明的方法中定義的不同參數(shù)能夠以遠(yuǎn)高于現(xiàn)有技術(shù)中的方法的效率對(duì)至少一種病原體滅活，并且還能夠保持所處理的人血漿樣品的生物活性。另外，發(fā)明人以不同尋常并且出人意料的方式證明了本發(fā)明的方法的特征對(duì)于生物靶標(biāo)(例如，至少一種病原體)的滅活具有輔助效果，因此允許在保持人血漿樣品的生物活性的同時(shí)對(duì)所述目標(biāo)進(jìn)行滅活。此外，本發(fā)明的方法允許對(duì)至少一種病原體滅活而不會(huì)引入額外物質(zhì)并且不需要凈化步驟，因此能夠縮短時(shí)間并降低成本。由此本發(fā)明的方法有利于對(duì)存在于人血漿中的至少一種病原體滅活而且還保持所述人血漿樣品的生物活性。在此，“人血漿樣品”意為源自任意血統(tǒng)、年齡、性別、身高和/或體重的人的血漿樣品。樣品還可以預(yù)先經(jīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何技術(shù)處理以便例如，利于保存(通過例如冷凍)。
在此，“滅活”意為抑制至少一種病原體或一組病原體的生物活性。例如，滅活使得病原體的生物活性不能恢復(fù)?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意方法證實(shí)滅活。例如，其可能涉及病原體停止在適合其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)以及/或者活性病原體的傳播停止[“Pathogen inactivationtechniques”，J. P. R. PELLETIER, S. TRANSUE, E. L. SNYDER,BestPractice & Research Clinic Haematology vol. 19 (I) (2006), pp. 205-242](Ref. 12)。在此，“病原體”意為本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的任何生物體。例如，其可能涉及細(xì)菌、霉菌、病毒、酵母、傳染性蛋白質(zhì)和/或寄生生物。例如，病原體可以選自包括記載在Pharmacopee Europeenne 6.0,5.ITextesGeneraux sur la microbiologie 01/2008 50101 (Ref. 13)中的歐洲藥典中的病原體的組，例如，其可能涉及導(dǎo)致疾病的病原體，例如白色念球菌(Candida albicans)、黑曲霉菌(Aspergillus Niger)、枯草桿菌,還涉及導(dǎo)致傳染的病原體，例如金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa)。在此，“絕熱”意為遵從熱力學(xué)第一定律，封閉系統(tǒng)中溫度的升高或降低是由于加壓或減壓(尤其是液體或氣體組分的加壓或減壓)導(dǎo)致的。[E. HECHT‘PhysiqueIditeur De Boech (1999)](Ref. 14)在此，初始?jí)簭?qiáng)Ptl為在實(shí)施本發(fā)明的方法之前所述樣品所處的壓強(qiáng)。例如，壓強(qiáng)Ptl可以等于大氣壓強(qiáng)，或者小于P1的任何血漿存儲(chǔ)壓強(qiáng)。初始?jí)簭?qiáng)可以例如，約為O. IMPa0在本發(fā)明中，“壓強(qiáng)的增加和/或減小的速度”是由兆帕斯卡每秒(MPa · S^1)表示的速度。其可以是線性和/或可變的，在后者的情況下，更恰當(dāng)?shù)卣f該變化是動(dòng)態(tài)的。根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)由本發(fā)明的方法處理的人血漿樣品優(yōu)選地容納在本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的能夠承受本發(fā)明的方法壓強(qiáng)的任意容器內(nèi)。例如，在密封和/或可變形容器(例如用于輸血的抽取管、塑料袋、無菌器皿，例如在Y. LAMBERT，G. DEMAZEAU，A. LARGETEAU，S. LAB0RDE-CR0UBIT, M. CABANNES 以及 J. M. B0UVIER, [ “Newpackaging solutions forhigh pressure treatments of foods，，。High PressureResearch. 2000,voI 19,207-212](Ref. 15)中說明的專用包裝)中。例如，該包裝可以包括化學(xué)上和生物上與血漿相容的內(nèi)表面以及在化學(xué)上(例如滲透性上等，如 Pharmacop6e Europeenne 5. O 01/2005 :30203 (Ref. 16)所記載的)與中間運(yùn)輸相容的外表面。包裝可以包括例如連接件，即允許填裝或清空所述包裝的組件。例如，連接件允許在應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的方法之后，添裝人血漿以及/或者進(jìn)行人血漿的治療應(yīng)用。例如，密封包裝可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任意包裝并且優(yōu)選確保以下四種標(biāo)準(zhǔn)(i)所述包裝及其連接件的保存；(ii)封裝的內(nèi)表面及其連接件與血漿之間的化學(xué)相容性，以及外部與加壓下的中間運(yùn)輸?shù)南嗳菪裕?iii)尤其保持隔斷特性，以避免透過隔板的化學(xué)氣體或分子的傳遞；(iv)保證包裝的化學(xué)完整性，即不使化學(xué)分子滲入血漿容器。在本發(fā)明中，可以借助加壓下液體運(yùn)輸來以均勻方式施壓。在本發(fā)明中，“以均勻方式施壓”意為在樣品的所有點(diǎn)上均勻施壓。在本發(fā)明中，“傳遞介質(zhì)”可以為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的能夠在本發(fā)明的方法中應(yīng)用的任意介質(zhì)。例如，其可以涉及便于應(yīng)用的液體介質(zhì)，并且通常依據(jù)熔化溫度來選擇(尤其是在低溫下應(yīng)用時(shí))，例如熔化溫度低于樣品的處理溫度的介質(zhì)，例如無極性液態(tài)介質(zhì)(如正己烷，乙二醇)，或者有極性介質(zhì)(例如，丙醇，正丁醇，乙醇，乙酸，異丙醇，優(yōu)選的液態(tài)傳遞介質(zhì)可以從包括如下物質(zhì)的組中選擇乙二醇和水的混合物，例如Kryo 30Lauda,以及乙醇。有利地，均勻施壓允許以均勻方式增壓或降壓而不會(huì)在樣品的所有點(diǎn)上造成壓強(qiáng)梯度。在本發(fā)明中，“人血漿樣品的生物活性”意為血漿中VIIIc、V和XI因子的活性高于由歐洲藥典針對(duì)病毒滅活的人血衆(zhòng)的規(guī)定所給出的50%的活性(Pharmacop6e Europeenne5.6 01/2007 :1646 (Ref. 6))并且/或者對(duì)于VIIIc因子高于70%而對(duì)于V和XI因子高于50% (如法國法律所要求的(Ref. 17))。在本發(fā)明中，在增壓之前樣品的初始溫度Ttl可以按照升壓速度V1、壓強(qiáng)傳遞介質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)以及壓強(qiáng)值決定。例如，初始溫度可以在-18°C到-3°C之間。根據(jù)本發(fā)明的方法的具體實(shí)施方式
，加壓和/或減壓是絕熱的。在本發(fā)明中，壓強(qiáng)P1可以等于200MPa。在本發(fā)明中，血漿在壓強(qiáng)P1下的溫度在-10°C到-3 V之間，優(yōu)選為-8 V到_4°C，更為優(yōu)選地約為-5°C。在本發(fā)明中，對(duì)于每個(gè)循環(huán)壓強(qiáng)P1可以維持110到130秒，例如每個(gè)循環(huán)維持120秒。本發(fā)明的目的還在于利用前面限定的方法對(duì)人血漿中的至少一種病原體或一組病原體滅活。本發(fā)明的目的還在于利用前面限定的方法獲得人血漿。 根據(jù)本發(fā)明的方法獲得的人血漿可以優(yōu)選地用于醫(yī)療領(lǐng)域，例如用于不同疾病的治療，用于如法國產(chǎn)品狀況和衛(wèi)生安全協(xié)會(huì)的文件“Transfusion de plasma fraiscongele produits, indications” (2002) (Ref. 18)中所記載的輸血用途，以及所有其它疾病的治療。通過本發(fā)明的方法獲得的血漿有利地具有歐洲藥典以及法國法律所規(guī)定的人血漿生物特性。借助下面以舉例說明的目的給出并通過附圖描述的實(shí)例的說明，本領(lǐng)域技術(shù)人員將進(jìn)一步理解其它優(yōu)點(diǎn)。


-圖IA到IC是表示血漿蛋白質(zhì)的活性按照兆帕斯卡(MPa)的壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))的百分比(縱坐標(biāo))的直方圖。尤其是，其分別表示壓強(qiáng)值對(duì)VIIIc凝固因子的活性的影響(圖1A)，對(duì)V凝固因子的影響(圖1B)，對(duì)XI凝固因子的影響(圖1C)，施加的速度為3. 33MPa s'施加時(shí)間(還被稱之為加壓維持)在常溫溫度下為10分鐘。-圖2A到2C是針對(duì)三種施壓速度的表示血漿蛋白質(zhì)的活性按照MPa壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))的百分比(縱坐標(biāo))的直方圖。尤其是，其分別表示在不同壓強(qiáng)值(100，150，以及200MPa)下施壓速度對(duì)VIIIc凝固因子的活性的影響(圖2A)，對(duì)V凝固因子的影響(圖2B)，對(duì)XI凝固因子的影響(圖2C)，在常溫溫度下施壓持續(xù)10分鐘。-圖3A到3C是針對(duì)同一處理的總持續(xù)時(shí)間的表示血漿蛋白質(zhì)的活性按照MPa壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))在不同施壓模式下的百分比(縱坐標(biāo))的直方圖。施壓速度在常溫溫度下為
3.33MPa · s'尤其是圖3A，3B和3C分別表示按照連續(xù)模式(10分鐘)、循環(huán)模式(5個(gè)兩分鐘的循環(huán))以及20個(gè)30秒的循環(huán)的施壓模式對(duì)于VIIIc凝固因子、V凝固因子和XI凝固因子的影響。-圖4A到4C是針對(duì)兩個(gè)不同溫度值(常溫和_15°C)表示血漿蛋白質(zhì)的活性按照MPa壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))的百分比(縱坐標(biāo))的直方圖。施壓速度大于或等于SOMPa·^并且施壓溫度為10分鐘。尤其是，圖4A，4B和4C分別表示溫度按照壓強(qiáng)值對(duì)凝固因子的影響。-圖5A到5C是表示血漿蛋白質(zhì)的活性按照MPa壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))、施壓速度以及溫度的百分比(縱坐標(biāo))的直方圖。尤其是，圖5A到5C分別表示較快的施壓速度、循環(huán)施壓以及溫度的結(jié)合對(duì)于VIIIc、V以及XI凝固因子的活性的影響，其中施壓速度大于或等于50MPa · s_\進(jìn)行每次時(shí)間為兩分鐘的5次重復(fù)并且溫度為-15°C。-圖6是針對(duì)如下的處理特征參數(shù)表示借助溫度(橫坐標(biāo))的對(duì)人血液中的金黃 色葡萄球菌進(jìn)行滅活(縱坐標(biāo))的圖施壓速度為50MPa μ—1，循環(huán)施壓的模式為5個(gè)時(shí)間為2分鐘的循環(huán)并且壓強(qiáng)為200MPa。尤其是，該圖表示溫度對(duì)于通過高壓對(duì)懸浮在人血漿中的金黃色葡萄球菌的極端影響。-圖7是針對(duì)從200MPa到300MPa的壓強(qiáng)值表示借助溫度(橫坐標(biāo))來對(duì)人血漿中的金黃色葡萄球菌滅活(縱坐標(biāo))的圖。-圖8是借助溫度(橫坐標(biāo))對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、黑曲霉菌、白色念珠菌滅活(縱坐標(biāo))的圖。尤其是，該圖表示溫度對(duì)懸浮在人血漿中的4種微生物滅活的影響。-圖9是表示借助壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))和施壓速度對(duì)金黃色葡萄球菌滅活(縱坐標(biāo))的直方圖。尤其是，該圖表示在選擇約_5°C下的5個(gè)2分鐘的循環(huán)的施壓模式的情況下，施壓速度對(duì)懸浮在人血液中的金黃色葡萄球菌滅活的影響。-圖10是針對(duì)不同的施壓速度值表示凝固因子的活性按照壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))的百分比(縱坐標(biāo))。圖IOA表示VIIIc因子(FVIIIc)的活性百分比，圖IOB表示V因子(FV)的活性百分比。尤其是，該圖表示在低溫下(約_5°C度)的循環(huán)處理(5X2min)過程中施壓速度對(duì)凝固因子的活性的影響。-圖11是表示在光學(xué)顯微鏡(物鏡X100)下觀察到的先前受小鼠伯氏瘧原蟲(Plasmodium berghei) (A)污染的血衆(zhòng)的照片和經(jīng)“高壓下血衆(zhòng)安全處理的方法”(B)處理后的照片。(N :細(xì)胞核，C :細(xì)胞質(zhì)，V:液泡)-圖12表示由Western印跡分析的人血漿樣品(已被或者未被倉鼠朊病毒(263K)的感染性蛋白質(zhì)感染的人血漿樣品)的結(jié)果,TIx :未經(jīng)過本方法處理的感染對(duì)照，HPIx :經(jīng)本方法處理的感染對(duì)照，TNx :未經(jīng)本方法處理的陰性對(duì)照，HPNx :經(jīng)本方法處理的陰性對(duì)照。-圖13是表示按壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))示出殺滅效率(l’efficacit6destructrice,ED)(縱坐標(biāo))的直方圖。施壓速度為3. 33MPa · s—1，施壓模式為連續(xù)施壓，處理持續(xù)時(shí)間為10分鐘并且處理溫度為25°C。-圖14是表示按壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))示出殺滅效率(ED)(縱坐標(biāo))的直方圖。施壓速度為3. 33MPa · s—1 (被填充滿的棒)或者50MPa · s—1 (有陰影線的棒)。
-圖15是表示按壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))示出殺滅效率(ED)(縱坐標(biāo))的直方圖。施壓速度為3.33MPa* s'施壓模式為5個(gè)兩分鐘的循環(huán)(有陰影線的棒)，20個(gè)三十秒的循環(huán)(空白棒)，或者I個(gè)十分鐘的循環(huán)(被填充滿的棒)。-圖16是表示按壓強(qiáng)(橫坐標(biāo))示出殺滅效率(ED)(縱坐標(biāo))的直方圖。溫度為_5°C (有陰影線的棒)或25°C (被填充滿的棒)。-圖17是表示按溫度(橫坐標(biāo))示出對(duì)金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、白色念球菌、黑曲霉菌、枯草桿菌(縱坐標(biāo))的滅活。-圖18A和18B是按兆帕(MPa)壓強(qiáng)⑵(橫坐標(biāo))示出血漿蛋白質(zhì)活性百分比 (% act)(縱坐標(biāo))的直方圖。尤其是，其分別表示壓強(qiáng)值對(duì)VIIIc凝固因子的活性的影響(18A)和對(duì)V凝固因子的影響(18B)。-圖19表示按稀釋因子(橫坐標(biāo))示出的熒光強(qiáng)度(縱坐標(biāo))。叉對(duì)應(yīng)于利用本方法獲得的結(jié)果(HP)，黑色方塊表示借助對(duì)照“T”獲得的結(jié)果。-圖20表示按稀釋因子(橫坐標(biāo))示出的熒光強(qiáng)度(縱坐標(biāo))。叉對(duì)應(yīng)于利用本方法獲得的結(jié)果(HP)，黑色方塊表示借助對(duì)照“T”獲得的結(jié)果。-圖21表示FACS的圖。圖中SSC對(duì)應(yīng)于與細(xì)胞復(fù)雜度相關(guān)的信號(hào)，F(xiàn)SC:與細(xì)胞的相對(duì)大小相關(guān)的信號(hào)，“event”對(duì)應(yīng)于所限定的總體中的事件(細(xì)胞)總數(shù)，% Parent對(duì)應(yīng)于按百分比表示的所限定的總體中事件數(shù)量相比于事件總數(shù)，并且“mean”對(duì)應(yīng)于熒光強(qiáng)度的平均值。示例示例I :在高壓處理之后人血漿生物活性的測(cè)量抽取約4mL的新鮮人血漿樣品并將其放置在密封試管中，然后置于_30°C下冷凍，以待在高壓下進(jìn)行處理。處理?xiàng)l件如下30秒內(nèi)施加IOOMPa壓強(qiáng)的加壓速度(3. 33MPa s4)，在適當(dāng)壓強(qiáng)下以連續(xù)方式處理10分鐘，也就是說從IOOMPa到250MPa，并且環(huán)境溫度為20°C左右。樣品被放置在通過“法馬通”式直接壓縮實(shí)現(xiàn)的液相高壓產(chǎn)生裝置中，傳遞介質(zhì)為乙二醇/水的混合物(Kryo 30Lauda)。能夠理解通過連續(xù)加壓可實(shí)現(xiàn)在給定值下的恒定加壓。凝固因子活性選擇VIIIc因子、V因子XI因子作為基準(zhǔn)以確定人血漿的生物活性。通過在STA C.K PREST(斯達(dá)戈診斷公司)操作說明書(Ref. 19)中描述的部分凝血活酶時(shí)間法來測(cè)定處理之前和之后的活性。該測(cè)量法旨在在腦磷脂和活化劑存在的情況下，測(cè)量耗盡待測(cè)定免疫因子的血漿的凝固時(shí)間，缺乏的凝固因子由測(cè)試樣品提供。然后，對(duì)于每種凝固因子，利用高壓處理之后的活性值與高壓處理之前的活性值之間的比確定剩余活性百分比。針對(duì)這三種凝固因子而言的壓強(qiáng)值對(duì)剩余活性百分比的影響如圖IA到圖IC所
/Jn o如圖I所示的凝固因子的剩余活性關(guān)于壓強(qiáng)的分析表明，在IOOMPa和250MPa壓強(qiáng)下(或1000巴和2500巴)進(jìn)行處理之后，XI因子的活性幾乎未受影響，相反，VIIIc因子和V因子在壓強(qiáng)范圍內(nèi)對(duì)壓強(qiáng)非常敏感，導(dǎo)致較大的活性損失，即，對(duì)于約250MPa的壓強(qiáng)，損失約80%到100%的程度。如該示例所表明的，在壓強(qiáng)從IOOMPa增加到250MPa的情況下對(duì)血漿進(jìn)行處理導(dǎo)致VIIIc和V因子的活性的顯著降低，由此可以想到，所有的人血漿安全處理，即所有通過施加高壓來對(duì)微生物病原體滅活的方法都伴隨著較大的凝固因子活性損失，因此血漿的生物活性受損。示例2 :在依賴加壓速度的高壓處理之后人血漿生物活性的測(cè)量按照示例I中所描述的方法處理新鮮的人血漿。處理?xiàng)l件為在20°C溫度左右，以連續(xù)方式進(jìn)行從100到250MPa范圍內(nèi)的給定壓強(qiáng)下持續(xù)10分鐘的處理。施壓速度可以改變。在該示例中，選擇了三種速度，一方面速度值之間明顯不同，另一方面這些值對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言可以通過工業(yè)設(shè)備實(shí)現(xiàn)，這些速度為30秒達(dá)到IOOMPa(或3. 33MPa · s—1)(等于在示例I中使用的加壓速度值)，12秒達(dá)到IOOMPa (8. 33MPa · s—1)以及 2 秒達(dá)到 IOOMPa (50MPa · s—1)。將樣品放置在通過“法馬通”式直接壓縮實(shí)現(xiàn)的液相高壓產(chǎn)生裝置中來獲得3. 33MPa · s—1和8. 33MPa · s—1的速度，其中傳遞介質(zhì)為乙二醇/水的混合物(Kryo30Lauda)。對(duì)于50MPa · s—1的速度，利用在內(nèi)部設(shè)置諸如乙醇的傳遞介質(zhì)的間接壓縮實(shí)現(xiàn) 的高壓生成設(shè)備來獲得。在處理之后，按照如在不例I中描述的凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)的活性百分比來測(cè)量人血漿的生物活性，活性百分比是利用部分凝血活酶時(shí)間測(cè)量的。圖2示出了在壓強(qiáng)值相同但加壓速度改變(3. 33MPa · s—1，8. 33MPa · s—1和50MPa · s-1)的情況下每種活性因子相對(duì)于高壓處理之前的剩余活性百分比。對(duì)圖2所示結(jié)果的分析表明，至少對(duì)于IOOMPa和250MPa之間的壓強(qiáng)而言，無論是什么樣的處理壓強(qiáng)值和凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)屬性，從3. 33Mpa · s^1到50MPa · S-1范圍內(nèi)的加壓速度對(duì)凝固因子的活性都只有較小影響(接近于測(cè)量誤差)。在考慮現(xiàn)有文獻(xiàn)中記載的技術(shù)教導(dǎo)(例如國際申請(qǐng)W000/48641(Ref. 20)中，其中聲稱達(dá)到直至IOOOMPa · S-1的相當(dāng)快的增加)的情況下，加壓速度對(duì)于血漿生物活性沒有影響的結(jié)論是令人驚訝的。另外，利用工業(yè)設(shè)備來實(shí)施相當(dāng)快速的增壓很難實(shí)現(xiàn)。示例3 :在依賴加壓模式的高壓處理之后人血漿生物活性的測(cè)量按照示例I中描述的方法準(zhǔn)備新鮮的人血漿。高壓處理的條件為等同于30秒內(nèi)達(dá)到IOOMPa的恒定加壓速度(即3. 33MPa · s—1)，20°C程度的溫度，在從IOOMPa到250MPa可變的壓強(qiáng)下持續(xù)10分鐘的處理。樣品被放置在通過“法馬通”式直接壓縮實(shí)現(xiàn)的液相高壓產(chǎn)生裝置中，傳遞介質(zhì)為乙二醇/水的混合物(Kryo 30Lauda)。按照連續(xù)模式或循環(huán)模式改變加壓模式，連續(xù)模式即在10分鐘的時(shí)間內(nèi)保持恒定壓強(qiáng)，循環(huán)模式即在所選壓強(qiáng)下進(jìn)行每次2分鐘的5次重復(fù)或在所選壓強(qiáng)下進(jìn)行每次30秒的20次重復(fù)。在例如樣品壓強(qiáng)的情況下，循環(huán)對(duì)應(yīng)于在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間長(zhǎng)度內(nèi)保持壓強(qiáng)并對(duì)樣品降壓。循環(huán)的持續(xù)時(shí)間是按其能夠被轉(zhuǎn)換成工業(yè)級(jí)的方式而選擇的。在處理之后，按照如在示例I中描述的凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)的剩余活性百分比來測(cè)量人血漿的生物活性，凝固因子的活性是利用借助STA C.K PREST(斯達(dá)戈診斷公司)使用說明(Ref. 19)中描述的部分凝血活酶時(shí)間法測(cè)量的。圖3中給出在對(duì)應(yīng)于3. 33MPa · s—1的加壓速度和20°C程度的溫度的條件下完成三種類型的處理(一種連續(xù)模式和兩種循環(huán)模式)后，針對(duì)被作為參考選取的三種凝固因子的剩余活性而獲得的值。循環(huán)模式的加壓(每次2分鐘重復(fù)5次)與持續(xù)10分鐘并且被施加同一壓強(qiáng)值的連續(xù)模式加壓(施加速度和溫度恒定)的比較表明VIIIc因子和V因子之間的特性差別。與其它兩種凝固因子相比，XI因子始終呈現(xiàn)出特定的特性，其活性不怎么或者幾乎不受壓強(qiáng)干擾(接近與測(cè)量誤差)。如在該示例中示出的，在循環(huán)加壓模式下，與VIIIc因子相比V因子更為敏感，也就是說，與在同一壓強(qiáng)值的連續(xù)施加的情況相比，在循環(huán)施加的情況下其活性被更多地保存。更意外和令人驚訝的是，相對(duì)于20次每次30秒的循環(huán)，這種現(xiàn)象在對(duì)應(yīng)于每次2分鐘重復(fù)5次的情況下更為明顯。 示例4 :在依賴溫度的高壓處理之后人血漿生物活性的測(cè)量按照示例I中描述的方法準(zhǔn)備新鮮的人血漿。處理?xiàng)l件為等于50MPa .s—1的恒定施壓速度，在IOOMPa和300MPa之間的壓強(qiáng)下持續(xù)10分鐘的連續(xù)處理。將樣品放置在利用在內(nèi)部設(shè)置諸如乙醇的傳遞介質(zhì)的間接壓縮實(shí)現(xiàn)的高壓生成設(shè)備中。在該示例中，測(cè)試了兩種不同的處理溫度，即常溫溫度(約20°C )及接近_15°C的負(fù)溫度。按照如在示例I中描述的凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)的剩余活性百分比來測(cè)量人血漿的生物活性，凝固因子的活性是利用借助STA C.K PREST(斯達(dá)戈診斷公司)使用說明(Ref. 19)中描述的部分凝血活酶時(shí)間法測(cè)量的。圖4中給出在兩種不同溫度(約20°C和-15°C )下進(jìn)行處理(兩秒達(dá)到IOOMPa的加壓速度(即50MPa s—1)，連續(xù)模式下持續(xù)10分鐘的處理)之后，被作為參考選取的三種凝固因子的剩余活性百分比(相對(duì)于高壓處理之前的活性)。令人意外和驚訝的是，三種凝固因子關(guān)于溫度的改變(約20°C和_15°C )具有不同的特性。XI因子對(duì)溫度不敏感(在實(shí)驗(yàn)誤差范圍內(nèi))，并無論在哪種情況下均保持了近乎90%的活性。相反，在低溫下有利于VIIIc因子和V因子的活性保持。特別是對(duì)于V因子而言這種現(xiàn)象尤為顯著。例如在_15°C、220MPa的壓強(qiáng)下，V因子的活性高于50% (與歐洲藥典的規(guī)范相適應(yīng))，而在同一壓強(qiáng)下處于常溫溫度(約20°C)時(shí)，其活性相當(dāng)?shù)?約10% )。如該示例中表明的,對(duì)于保持VIIIc因子和V因子的活性而言，在低溫和加壓速度之間存在重要的協(xié)同效果，V因子的情況明確地表明了這一點(diǎn)。示例5 :在把處理中的三種特征參數(shù)(加壓速度、加壓模式和低溫)相關(guān)聯(lián)地來進(jìn)行高壓處理之后人血漿生物活性的測(cè)量按照示例I中詳述的處理準(zhǔn)備新鮮的人血漿。將樣品放置在利用在內(nèi)部設(shè)置諸如乙醇的傳遞介質(zhì)的間接壓縮實(shí)現(xiàn)的高壓生成設(shè)備中。處理方法在于把有關(guān)壓強(qiáng)的一組參數(shù)相關(guān)聯(lián)加壓速度、加壓模式和溫度，尤其是低溫，即約-15°C的溫度。
測(cè)試了 IOOMPa和250MPa之間的不同壓強(qiáng)值。相關(guān)參數(shù)值對(duì)于加壓速度而言為50MPa s'對(duì)于施加模式而言為每次2分鐘重復(fù)5次的循環(huán)并且溫度約為_15°C。在示例I中已作為參考選取的凝固因子(VIIIc因子，V因子和XI因子)的剩余活性百分比已經(jīng)如示例I中所示通過部分凝血活酶時(shí)間法測(cè)量。圖5中示出在上述條件下進(jìn)行處理之后三種凝固因子的剩余活性百分比(相對(duì)于高壓處理之前的活性)。如該示例中所表明的，令人意外并感到驚訝的是，對(duì)于VIIIc因子和和V因子，通過將相關(guān)參數(shù)與壓強(qiáng)參數(shù)相關(guān)聯(lián)觀察到相當(dāng)好的協(xié)同效果(對(duì)于V因子觀察到更明顯的效果)。例如，在240MPa(即2400巴)的壓強(qiáng)下，V因子的活性為90%的程度并且VIIIc因子的活性接近70%。這些活性值與法國法律(2003年5月28日，J. 0.第123號(hào)，2003年4月29日頒布的法令，確定了不穩(wěn)定血液產(chǎn)品列表及特性)相適應(yīng)，還使得所獲得的人血漿用于醫(yī)療應(yīng)用。如果考察其中僅考慮了壓強(qiáng)值的示例1，則可觀察到在250MPa下VIIIc因子的活性值接近10%而V因子的活性接近于O。如該示例中所表明的，把與壓強(qiáng)相關(guān)的三種參數(shù)(加壓速度，加壓模式和溫度)相結(jié)合令人驚訝地使得能夠保持凝固因子的活性并由此保持人血漿的生物活性。示例6 :依賴于溫度在高壓下對(duì)人血漿中的病原體滅活的示例
金黃色葡萄球菌是一種經(jīng)常被檢驗(yàn)到的病原體并且引發(fā)多種疾病。在該示例中該病原體被選作范例。通過在胰酶大豆瓊脂(TCS) (AES Chemunex)上培養(yǎng)48小時(shí)來在胰蛋白胨鹽培養(yǎng)液中(TS) (AES Chemunex)制備金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)密集懸浮液(即108UFC/mL，UFC :菌落形成單位)。該懸浮液用來按照每IOmL該懸浮液用于300mL血衆(zhòng)來污染人血衆(zhòng)。之后將受污染的血漿樣品置于無菌且密封的試管中，并隨后保存在冷凍柜中以待通過滅活方法進(jìn)行處理。在滅活處理之前和之后，實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品計(jì)數(shù)以便確定處理的殺滅效果。為此，在TS培養(yǎng)液中實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的分級(jí)稀釋。對(duì)于每次稀釋，按照如下方式接種兩個(gè)培養(yǎng)皿將ImL稀釋液放入皿底部，然后倒入過冷狀態(tài)的TCS瓊脂。在經(jīng)過均勻化和凝膠作用之后，將充滿樣品的皿在35°C的恒溫箱中放置48小時(shí)。包含15到300個(gè)的分離菌落的皿隨后被選擇以進(jìn)行計(jì)數(shù)，在對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)之后通過以下計(jì)算確定金黃色葡萄球菌的濃度
ScN =-
(^1 +0.1 X^2) X ￠/其中N :金黃色葡萄球菌的濃度(UFC/mL)E c :對(duì)所有選定皿計(jì)算的菌落總數(shù)H1 :在第一稀釋度中選定的皿的數(shù)量n2 :在第二稀釋度中選定的皿的數(shù)量d :第一次稀釋的稀釋比例隨后以如下方式計(jì)算處理的殺滅效率ED = -log (N/N0)其中ED:殺滅效率
N :高壓處理之后金黃色葡萄球菌的濃度Ntl :高壓處理之前金黃色葡萄球菌的濃度所采用的滅活處理為示例5中描述的處理。對(duì)于恒定的壓強(qiáng)值(200MPa)，相關(guān)參數(shù)值為50MPa -s^1的速度，每次2分鐘重復(fù)5次的施加模式。僅選取溫度可變(從約_25°C到約35°C )。將樣品放置在利用在內(nèi)部設(shè)置諸如乙醇的傳遞介質(zhì)的間接壓縮實(shí)現(xiàn)的高壓生成設(shè)備中。圖6示出在這樣的處理過程中溫度對(duì)于金黃色葡萄球菌的殺滅效率的影響。令人意外并且感到驚訝的是，在-10°C到_5°C的較窄溫度范圍內(nèi)，對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅效率相當(dāng)高。通過對(duì)同一設(shè)備改變傳遞介質(zhì)(用乙二醇/水的混合物(Kryo30Lauda)替代乙醇)也會(huì)觀察到同樣的現(xiàn)象。對(duì)于非常低的溫度(低于_10°C )，由于金黃 色葡萄球菌關(guān)于所施加處理的敏感性快速地降低(殺滅效率ED急劇降低)，因此看起來溫度的作用是很關(guān)鍵的，在溫度高于_5°C時(shí)變化開始變得更明顯。如該示例中所證明的，本發(fā)明的借助把與壓強(qiáng)值相關(guān)的3個(gè)參數(shù)(加壓速度，加壓模式和溫度)適當(dāng)結(jié)合的方法對(duì)金黃色葡萄球菌的滅活具有協(xié)同效果。另外，令人驚訝的是，如圖6所示那樣，可以看出存在使得金黃色葡萄球菌的滅活加劇的溫度范圍。例如在_15°C到-10°C之間，殺滅效率從I. 5顯著提高到5，這樣的增加是完全出人意料的。示例7 :依賴于溫度和壓強(qiáng)值在高壓下對(duì)人血漿中的病原體滅活的示例在示例6中，壓強(qiáng)值被固定在200MPa。同時(shí)保持與壓強(qiáng)相關(guān)的參數(shù)值(施加速度50MPa s'以及每次2分鐘重復(fù)5次的循環(huán)施加模式)，發(fā)明人進(jìn)行了研究以評(píng)估是否能在多種壓強(qiáng)值(200MPa，250MPa，300MPa)下，觀察到在狹窄溫度范圍內(nèi)對(duì)于金黃色葡萄球菌的殺滅效率提高的令人驚訝的效果。換言之，該示例的目的在于研究在200MPa下觀察到的對(duì)金黃色葡萄球菌的滅活是否還可以在其它壓強(qiáng)下觀察到，尤其是在250MPa和300MPa壓強(qiáng)下。制備方法和樣品的計(jì)數(shù)與在示例6中說明的相同。將樣品放置在利用在內(nèi)部設(shè)置諸如乙醇的傳遞介質(zhì)的間接壓縮實(shí)現(xiàn)的高壓生成設(shè)備中。圖7給出在三種壓強(qiáng)值下依賴于溫度的金黃色葡萄球菌的殺滅效率的演進(jìn)，與處理有關(guān)的其它參數(shù)保持恒定(50MPa S-1的施加速度以及每次2分鐘重復(fù)5次的循環(huán)施加模式)，對(duì)圖7的分析表明一種完全特別的現(xiàn)象。如該示例所示，在介于200MPa和300MPa的壓強(qiáng)范圍內(nèi)，在特定的溫度區(qū)間中(尤其是在-5°C ±_2°C的狹窄范圍內(nèi))對(duì)病原體的滅活最佳.另外，令人驚訝的是，可以在壓強(qiáng)的區(qū)間內(nèi)觀察到對(duì)金黃色葡萄球菌的滅活增強(qiáng)，殺滅滅活隨著壓強(qiáng)的增大而加強(qiáng)。示例8 :依賴于溫度在高壓下對(duì)人血漿中的病原體滅活的示例在示例6中，壓強(qiáng)值被固定在200MPa。在該示例中，與壓強(qiáng)相關(guān)的參數(shù)值如下50MPa S-1的施加速度以及每次2分鐘重復(fù)5次的循環(huán)施加模式。在將壓強(qiáng)保持在例如，200MPa的情況下，發(fā)明人進(jìn)行了研究以確定針對(duì)歐洲藥典中的其它病原體(諸如綠膿桿菌(ATCC 9027)，白色念珠菌(ATCC 10231)以及黑曲霉菌(ATCC 16404))是否也可以觀察到如在特定溫度區(qū)間內(nèi)對(duì)金黃色葡萄球菌殺滅效率的提高這樣的令人驚訝的結(jié)果。制備方法和對(duì)受金黃色葡萄球菌及綠膿桿菌污染的血漿樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法與示例6中描述的相同。對(duì)于白色念珠菌和黑曲霉菌，除了培養(yǎng)基為沙氏瓊脂(AESChemunex)以及培養(yǎng)溫度為28°C之外，進(jìn)程與前述相同。通過在28°C在包含沙氏瓊脂的Roux瓶中培養(yǎng)菌株14小時(shí)來獲得黑曲霉菌的孢子，并且在存在玻璃微珠的情況下通過用水和吐溫80 (0. 5g/L)的混合液清洗Roux瓶來回收孢子。將樣品放置在利用在內(nèi)部設(shè)置諸如乙醇的傳遞介質(zhì)的間接壓縮實(shí)現(xiàn)的高壓生成設(shè)備中。令人意外并且感到驚訝的是，對(duì)圖8的分析表明，盡管病原體在結(jié)構(gòu)上存在很大區(qū)別(兩種細(xì)菌金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球形菌，綠膿桿菌為革蘭氏陰性桿菌，一種孢子形式的霉菌黑曲霉菌，以及一種酵母白色念珠菌)，特 定的范圍或特定的溫度區(qū)間仍具有增強(qiáng)的殺滅效率。該溫度區(qū)間(溫度等于_6°C ±5°C)覆蓋了對(duì)于金黃色葡萄球菌而言的區(qū)間(接近于測(cè)量誤差)。在較低溫度下(即低于_5°C )觀察到的這種不同尤其依賴于每種微生物關(guān)于壓強(qiáng)的敏感度。如該示例中表明的，本發(fā)明的把與壓強(qiáng)值關(guān)聯(lián)的參數(shù)(加壓速度、加壓模式以及溫度)進(jìn)行特定組合的方法對(duì)于生物靶標(biāo)的組的滅活具有協(xié)同效果。示例9 :依賴于加壓速度在高壓下對(duì)病原體滅活的示例為了評(píng)估加壓速度在與滅活處理相關(guān)的三種參數(shù)(加壓速度、加壓模式以及溫度)中對(duì)協(xié)同現(xiàn)象的貢獻(xiàn)，在以下條件下處理被金黃色葡萄球菌(按照示例6描述的規(guī)則準(zhǔn)備)污染的人血漿每次2分鐘重復(fù)5次的循環(huán)施壓模式，溫度約_5°C，并且壓強(qiáng)為200MPa、250Mpa或300MPa。對(duì)于每個(gè)處理，使用兩種施壓速度即3. 33MPa s_1和50MPa S^10圖9中示出了獲得的結(jié)果。所采用的規(guī)則、制備以及計(jì)數(shù)與示例6中的相同。將樣品放置在通過“法馬通”式直接壓縮實(shí)現(xiàn)的液相高壓產(chǎn)生裝置中來獲得3. 33MPa *s_1的速度，其中傳遞介質(zhì)為乙二醇/水的混合物(Kryo 30Lauda)。對(duì)于50MPa *s_1的速度，利用在內(nèi)部設(shè)置諸如乙醇的傳遞介質(zhì)的間接壓縮實(shí)現(xiàn)的高壓生成設(shè)備來獲得。圖9中示出的結(jié)果很好地表明，為了獲得最好的效果，應(yīng)當(dāng)在采用循環(huán)加壓模式下(每次2分鐘重復(fù)5次)的同時(shí)將較快的加壓速度(50MPa -s^1)與負(fù)溫度(約_5°C )相關(guān)聯(lián)，以便獲得對(duì)金黃色葡萄球菌滅活的協(xié)同效果。尤其是在200MPa下，由于使用3. 33MPa -s^1的加壓速度時(shí)處理的殺滅效率ED (病原體滅活)非常低(為零)，而在使用50MPa S-1的加壓速度時(shí)殺滅效率達(dá)到5，從而顯著地示出了協(xié)同效果。另外可以看出，與循環(huán)加壓模式(MA)，即5個(gè)每次2分鐘的循環(huán)以及_5°C的溫度相關(guān)聯(lián)的該加壓速度(VA)對(duì)于金黃色葡萄球菌的滅活起到主要作用。從圖9的結(jié)果與在后面的示例14中的圖14觀察到的結(jié)果之間的對(duì)比可以看出，對(duì)于金黃色葡萄球菌的滅活而言，與壓強(qiáng)相關(guān)的參數(shù)，即加壓速度、加壓模式以及溫度的特定選擇取得了的令人意外的、未被描述過的協(xié)同效果。
因此本發(fā)明的方法允許借助協(xié)同效果來對(duì)人血漿中的病原體滅活。示例10 :利用滅活方法對(duì)人血漿中的至少一種病原體滅活的示例為了評(píng)估在約_5°C的溫度下進(jìn)行循環(huán)處理(每次2分鐘重復(fù)5次)的過程中加壓速度對(duì)保持凝固因子(VIIIc因子和V因子)活性的影響，測(cè)試了兩種使壓強(qiáng)增加(從150MPa 到 250MPa)的加壓速度(3. 33MPa s_1 和 50MPa s—1)。將樣品放置在通過“法馬通”式直接壓縮實(shí)現(xiàn)的液相高壓產(chǎn)生裝置中來獲得3. 33MPa *s_1的速度，其中傳遞介質(zhì)為乙二醇/水的混合物(Kryo 30Lauda)。對(duì)于50MPa *s_1的速度，利用在內(nèi)部設(shè)置諸如乙醇的傳遞介質(zhì)的間接壓縮實(shí)現(xiàn)的高壓生成設(shè)備來獲得。圖10中示出在前述的條件下實(shí)施滅活方法之后，VIIIc凝固因子和V凝固因子的剩余活性百分比(相比于實(shí)施滅活方法之前的活性)。對(duì)圖10的研究表明加壓速度值幾乎不對(duì)VIIIc因子和V因子活性的保持造成影 響。示例9中表明，當(dāng)這一參數(shù)適當(dāng)?shù)嘏c循環(huán)處理(每次2分鐘重復(fù)5次)以及較低溫度(T = -60C ±5°C )結(jié)合時(shí)，該較快的加壓速度(50MPa s—1)能夠相當(dāng)顯著地增強(qiáng)對(duì)病原體滅活的方法的殺滅(滅活)效率(協(xié)同效應(yīng))。此外重要的是，應(yīng)指出通過選擇200MPa的壓強(qiáng)，50MPa s—1的加壓速度，每次2分鐘重復(fù)5次的循環(huán)以及約_5°C程度的溫度，可以使VIIIc因子的活性保持高于70%，而且使V因子的活性保持高于50%，這意味著同時(shí)符合歐洲藥典的要求(凝固因子的活性高于50%) (Ref. 6)以及法國法律的要求(除VIIIc因子以外的凝固因子的活性高于50%，而VIIIc因子的活性高于70% ) (Ref. 17)。因此，如該示例所表明的，本發(fā)明允許在保持人血漿的生物活性的同時(shí)對(duì)其中的至少一種病原體滅活。示例11 :利用本發(fā)明的方法對(duì)小鼠伯氏瘧原蟲(血內(nèi)寄生生物)和布氏布氏錐蟲(細(xì)胞外原生動(dòng)物)滅活隨后針對(duì)易于污染血液產(chǎn)品的如下寄生生物范例測(cè)試了根據(jù)本發(fā)明的對(duì)病原體滅活的方法，其中一種寄生生物為小鼠伯氏瘧原蟲(血內(nèi)寄生生物)，另一種為布氏布氏錐蟲(細(xì)胞外原生動(dòng)物)。對(duì)于這兩種寄生生物中的每一種，處理了 10份受污染的小鼠(小白鼠)血樣品。與壓強(qiáng)相關(guān)的參數(shù)值為50MPa S-1的加壓速度，每次2分鐘重復(fù)5次的加壓模式，以及約_5°C的溫度，0. IMPa的初始?jí)簭?qiáng)以及200MPa的壓強(qiáng)。將樣品放置在利用在內(nèi)部設(shè)置諸如乙醇的傳遞介質(zhì)的間接壓縮實(shí)現(xiàn)的高壓生成設(shè)備中。在保管未處理的樣品對(duì)照的同時(shí)保證其溫度(在30分鐘內(nèi)使樣品平衡在-15°C)。用光學(xué)顯微鏡觀察每份樣品，之后注入到小鼠中。下面的表I中示出了顯微鏡的觀察結(jié)果以及與在注入一個(gè)月之后存活小鼠的數(shù)量有關(guān)的結(jié)果。表I :顯微鏡的觀察結(jié)果以及存活小鼠的數(shù)量
權(quán)利要求
1.一種對(duì)人血漿樣品中的至少一種病原體滅活的方法，其特征在于，所述方法至少包括5次循環(huán)，每次循環(huán)包括 -將所述樣品從其初始?jí)簭?qiáng)Ptl增壓至壓強(qiáng)P1, P1介于190MPa到2IOMPa之間，從P。增壓到P1,由于所述增壓，血漿在壓強(qiáng)P1下的溫度介于-10°C到_3°C之間， -能夠在介于110秒到130秒之間的時(shí)間長(zhǎng)度內(nèi)保持壓強(qiáng)P1, -使所述樣品降壓至壓強(qiáng)Po， -所述增壓的壓強(qiáng)增大速度和所述降壓的壓強(qiáng)減小速度被實(shí)現(xiàn)為從47. 5MPa · s—1到52. 5MPa· s_1之間的速度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述增壓和所述降壓是絕熱的。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其中病原體從如下的組中選擇所述組包括細(xì)菌、霉菌、酵母、病毒、感染性蛋白質(zhì)和/或寄生生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I到3中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品在增壓之前的初始溫度介于-18°C到_3°C之間。
5.根據(jù)權(quán)利要求I到4中任意一項(xiàng)所述的方法，其中初始?jí)簭?qiáng)Ptl為O.IMPa0
6.根據(jù)權(quán)利要求I到5中任意一項(xiàng)所述的方法，其中壓強(qiáng)P1被持續(xù)保持120秒的時(shí)間長(zhǎng)度。
7.根據(jù)權(quán)利要求I到6中任意一項(xiàng)所述的方法，其中壓強(qiáng)P1等于200MPa。
8.根據(jù)權(quán)利要求I到7中任意一項(xiàng)所述的方法，其中所述樣品處于密封包裝中。
9.根據(jù)權(quán)利要求I到8中任意一項(xiàng)所述的方法，其中借助壓強(qiáng)傳遞介質(zhì)以均勻方式施加壓強(qiáng)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述壓強(qiáng)傳遞介質(zhì)是極性或非極性液態(tài)介質(zhì)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的方法，其中所述壓強(qiáng)傳遞介質(zhì)是乙二醇和水的混合物和/或乙醇。
12.如權(quán)利要求I所述的方法的用途，用于有選擇地消除人血漿中的至少一種病原體的應(yīng)用。
13.一種按照權(quán)利要求I到12中任意一項(xiàng)所述的方法獲得的人血漿。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人血漿樣品中的至少一種病原體滅活的方法，所述方法包括絕熱壓縮所述樣品，由于所述壓縮，所述血漿在P1壓強(qiáng)下的溫度在-10℃到-3℃之間，可選地將壓強(qiáng)Pi保持110秒到130秒之間，以及使所述樣品絕熱降壓。本發(fā)明還涉及使用根據(jù)本發(fā)明的方法并且涉及通過本發(fā)明的方法獲取的血漿。所述方法以及通過所述方法獲得的產(chǎn)品對(duì)于治療和非治療領(lǐng)域中的應(yīng)用尤其有用。
文檔編號(hào)A61L2/00GK102762231SQ201080037784
公開日2012年10月31日 申請(qǐng)日期2010年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月3日
發(fā)明者佐蘭·伊萬諾維奇, 吉恩·羅坎, 格拉爾德·德馬佐, 讓-保羅·莫雷爾, 讓-米歇爾·布瓦龍, 諾爾文尼?！だ锿咛m, 阿蘭·拉爾熱托 申請(qǐng)人:法國國家血液中心, 波爾多第一大學(xué), 瑟加蘭-波爾多大學(xué)