專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)抑制唐氏綜合征基因的天然反義轉(zhuǎn)錄物治療唐氏綜合征基因相關(guān)疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請(qǐng)要求2009年6月26日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)61/220，747和2009年8 月21日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?1/235，752的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)唐氏綜合征(Dow Syndrome)基因和相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。背景DNA-RNA和RNA-RNA雜交對(duì)包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯在內(nèi)的核酸功能的許多方面均很重要。雜交對(duì)檢測(cè)特定核酸或改變其表達(dá)的各種技術(shù)也很重要。例如，反義核苷酸通過(guò)與靶RNA雜交擾亂基因表達(dá)，從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。反義DNA具有額外的特點(diǎn)是，DNA-RNA雜合體作為存在于大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型中的核糖核酸酶H消化活性的底物?？蓪⒎戳x分子遞送到細(xì)胞中，正如寡脫氧核苷酸(ODN)的情況，或可自?xún)?nèi)源基因?qū)⑵浔磉_(dá)為RNA分子。FDA最近批準(zhǔn)了一種反義藥物VITRAVENE (用于治療巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎)，這反映了反義物具有治療效用。概述在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通過(guò)使用靶向天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的反義寡核苷酸導(dǎo)致相應(yīng)的有義基因上調(diào)而抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物作用的方法。本文還預(yù)期可通過(guò)被視為屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的siRNA、核酶和小分子實(shí)現(xiàn)對(duì)天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制?！獋€(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)，其中所述寡核苷酸與包含以下核苷酸內(nèi)的5-30個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性=SEQ ID NO 3的1-3814、SEQ ID NO 4的1-633、 SEQ ID NO 5 的 1-497 和 SEQ ID NO 6 的 1-545。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向唐氏綜合征基因多核苷酸的天然反義序列， 例如SEQ ID NO :3-6所示核苷酸及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID N0:7-24所示。另一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)，其中所述寡核苷酸與唐氏綜合征基因多核苷酸的反義序列的反向互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性。另一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括將所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)，其中所述寡核苷酸與唐氏綜合征基因反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性；。在一個(gè)實(shí)施方案中，組合物包含一種或多種與有義和/或反義唐氏綜合征基因多核苷酸結(jié)合的反義寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含一種或多種修飾或取代核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含一個(gè)或多個(gè)修飾鍵。在又一個(gè)實(shí)施方案中，修飾核苷酸包含修飾堿基，其包含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、2’-0_甲基、氟-或碳、亞甲基或其它鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選修飾核苷酸是鎖定核酸分子，包括a-L-LNA。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將該寡核苷酸經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)給予患者。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸以藥物組合物給予。治療方案包括將反義化合物給予患者至少一次；然而，可對(duì)這種治療進(jìn)行修改以在一段時(shí)間內(nèi)包括多個(gè)劑量。該治療可與一種或多種其它治療類(lèi)型結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可將寡核苷酸包封在脂質(zhì)體中或與載體分子(例如膽固醇、TAT肽)連接。下文闡述其它方面。附圖簡(jiǎn)述

圖1是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的柱狀圖，表示與對(duì)照相比，!fepG2細(xì)胞用使用Lipofectamine 2000弓丨入的硫代磷酸酯寡核苷酸治療后，DYRKlAmRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明，在用設(shè)計(jì)成DYRKla反義Hs. 713879 (CUR-0885-CUR-0890)的寡核苷酸之一治療后48 小時(shí)，!fepG2細(xì)胞中DYRKlA mRNA的水平顯著提高。表示為CUR-0891、CUR-0892、CUR_0893、 CUR-0885、CUR-0889、CUR-0889、CUR-0886、CUR-0888 和 CUR-0590 的條形柱分別相當(dāng)于用 SEQ ID NO 7-15治療的樣品。圖2是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的柱狀圖，表示與對(duì)照相比，用使用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸治療Vero細(xì)胞后，DYRKlA mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。實(shí)時(shí)PCR 結(jié)果表明，用設(shè)計(jì)為DYRKlA反義Hs. 713879的寡核苷酸之一治療后48小時(shí)，Vero細(xì)胞中的DYRKlA mRNA的水平顯著提高。表示為⑶R-0889的條形柱相當(dāng)于用SEQ ID NO 11治療的樣品。圖3是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的柱狀圖，表示與對(duì)照相比，用使用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸治療H印G2細(xì)胞后DSCRl mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。表示為 CUR-0902、CUR-0901、CUR-0900、CUR-0899、CUR-0905、CUR-0906、CUR-0904 和 CUR-0907 的條形柱分別相當(dāng)于用SEQ ID NO: 16-23治療的樣品。圖4是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的柱狀圖，表示與對(duì)照相比，用使用Lipofectamine 2000 引入的硫代磷酸酯寡核苷酸治療Vero細(xì)胞后DSCRl mRNA的倍數(shù)變化+標(biāo)準(zhǔn)差。表示為 ⑶R-0907和⑶R-0904的條形柱分別相當(dāng)于用SEQ ID NO 23和22治療的樣品。序列表描述SEQ ID NO 人(Homo sapiens)雙重特異性酪氨酸-(Y)-磷酸化調(diào)節(jié)激酶 1A(DYRK1A)，轉(zhuǎn)錄物變體 3，mRNA (NCBI 登錄號(hào)NM_101395)。SEQ ID NO 2 人鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)子1 (RCANl)，轉(zhuǎn)錄物變體1，mRNA(NCBI登錄號(hào)NM_004414)。SEQ ID NO 3-6 : SEQ ID NO :3 天然 DYRKlA 反義序列(Hs. 713879) ； SEQ ID NO: 4 天然 DYRKlA 反義序列(Hs. 624346) ；SEQ ID NO 5 天然 DSCRl 反義序列(Hs. 664668)禾口 SEQ ID NO 6 天然 DSCRl 反義序列(DA403464)SEQ ID NO :7_24 反義寡核苷酸?！畆，表示RNA，*表示硫代磷酸酯鍵。詳述下面參照用于說(shuō)明的實(shí)例應(yīng)用來(lái)描述本發(fā)明的幾個(gè)方面。應(yīng)當(dāng)理解的是，本文給出許多具體細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法以供全面理解本發(fā)明。然而，相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)易了解的是，不需要一個(gè)或多個(gè)具體細(xì)節(jié)或者用其它方法便可實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明不受行動(dòng)或事件的順序的限制，因?yàn)槟承┬袆?dòng)可以不同順序發(fā)生和/或與其它行動(dòng)或事件同時(shí)發(fā)生。此夕卜，并不是所有列舉的行動(dòng)或事件都是實(shí)施本發(fā)明的方法所必需的。本文公開(kāi)的所有基因、基因名稱(chēng)和基因產(chǎn)物旨在與本文公開(kāi)的組合物和方法適用的任何物種的同源物相對(duì)應(yīng)。因此，所述術(shù)語(yǔ)包括但不限于人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。 要理解的是，當(dāng)公開(kāi)特定物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，這種公開(kāi)旨在只是示例性的，不得解釋為限制，除非在其出現(xiàn)的上下文中有明確說(shuō)明。因此，例如，對(duì)于本文公開(kāi)的基因，其在某些實(shí)施方案中涉及哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列，旨在包括其它動(dòng)物(包括但不限于其它哺乳類(lèi)、魚(yú)類(lèi)、兩棲類(lèi)、爬行類(lèi)和鳥(niǎo)類(lèi))的同源和/或直系同源的基因和基因產(chǎn)物。在實(shí)施方案中，基因或核酸序列為人的基因或核酸序列。定義本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于描述具體實(shí)施方案的目的，并無(wú)意限制本發(fā)明。本文使用的單數(shù)形式還旨在包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文中另有明確說(shuō)明。此外，就用于發(fā)明詳述和/ 或權(quán)利要求書(shū)的術(shù)語(yǔ)“包括”、“具有”、“有”或其變體而言，這類(lèi)術(shù)語(yǔ)旨在以類(lèi)似術(shù)語(yǔ)“包含” 的方式是包括性的。術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”意指在由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測(cè)定的特定值的可接受的誤差范圍內(nèi)，這部分取決于該值是如何測(cè)量或確定的，即測(cè)量系統(tǒng)的局限。例如，“約”可指根據(jù)本領(lǐng)域?qū)嵺`在1或超過(guò)1的標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)。或者，“約”可意味著給定值的高達(dá)20%、優(yōu)選高達(dá) 10%、更優(yōu)選高達(dá)5%、還更優(yōu)選高達(dá)的范圍?；蛘?，特別對(duì)于生物系統(tǒng)或過(guò)程，該術(shù)語(yǔ)可指在數(shù)值的數(shù)量級(jí)范圍內(nèi)，優(yōu)選5倍以?xún)?nèi)，更優(yōu)選2倍以?xún)?nèi)。在本申請(qǐng)和權(quán)利要求書(shū)中描述特定值時(shí)，除非另有說(shuō)明，否則應(yīng)假定術(shù)語(yǔ)“約”的含義在該特定值的可接受的誤差范圍內(nèi)。本文所用術(shù)語(yǔ)“mRNA”是指目前已知的靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物和可以闡明的任何其它轉(zhuǎn)錄物?！胺戳x寡核苷酸”或“反義化合物”是指與另外的RNA或DNA (靶RNA、DNA)結(jié)合的 RNA或DNA分子。例如，如果是RNA寡核苷酸，則其通過(guò)RNA-RNA相互作用與另外的RNA靶標(biāo)結(jié)合，并改變靶RNA的活性。反義寡核苷酸可上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意在包括從治療、診斷或其它觀點(diǎn)來(lái)看是有用的任何外源RNA或DNA分子。這類(lèi)分子包括例如反義RNA或DNA分子、干擾RNA(RNAi)、微小RNA、誘騙RNA (decoy RNA)分子、siRNA、酶 RNA (enzymatic RNA)、治療性編輯 RNA (therapeutic editing RNA)及激動(dòng)劑 RNA和拮抗劑RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接體(alternate splicer)、引物、探針和與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。 因此，可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入這些化合物。在本發(fā)明的情況下，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 或其模擬物的寡聚體或多聚體。術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”還包括天然和/或修飾單體或鍵的線性或環(huán)狀寡聚體，所述單體或鍵包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α-異頭形式、肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。通過(guò)單體與單體相互作用的常規(guī)方式，例如Watson-Crick型堿基配對(duì)、Hoogsteen型或反向H00gsteen型堿基配對(duì)等，寡核苷酸能夠與靶多核苷酸特異性結(jié)合。寡核苷酸可以是“嵌合的”，也就是說(shuō)由不同區(qū)(region)組成。在本發(fā)明的情況下，“嵌合”化合物是含有兩個(gè)或更多個(gè)化學(xué)區(qū)(例如DNA區(qū)、RNA區(qū)、PNA區(qū)等)的寡核苷酸。每個(gè)化學(xué)區(qū)由至少一個(gè)單體單元(即在寡核苷酸化合物的情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸通常包含至少一個(gè)區(qū)，其中寡核苷酸被修飾以具有一種或多種所需性質(zhì)。寡核苷酸的所需性質(zhì)包括但不限于例如對(duì)核酸酶降解的抗性提高、細(xì)胞攝取提高和/或?qū)Π泻怂岬慕Y(jié)合親合力提高。因此，寡核苷酸的不同區(qū)可具有不同的性質(zhì)?？梢陨鲜鰞煞N或更多種寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類(lèi)似物的混合結(jié)構(gòu)形成本發(fā)明的嵌合寡核苷酸。寡核苷酸可由以“登記簿(register)，，方式連接(也就是說(shuō)單體像在天然DNA中一樣連續(xù)連接)或通過(guò)間隔區(qū)連接的區(qū)組成。間隔區(qū)旨在構(gòu)成區(qū)之間的共價(jià)“橋”，在某些情況下長(zhǎng)度不超過(guò)約100個(gè)碳原子。間隔區(qū)可攜帶不同的官能，例如具有正電荷或負(fù)電荷、 攜帶特殊的核酸結(jié)合性質(zhì)(嵌入劑、溝結(jié)合劑(groove binder)、毒素、熒光團(tuán)等)、具有親脂性、誘導(dǎo)特殊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，例如誘導(dǎo)α "螺旋的含丙氨酸的肽。本文使用的“唐氏綜合征基因”包括所有的家族成員、突變體、等位基因、片段、種類(lèi)(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。本文所用術(shù)語(yǔ)‘雙重特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶1A’、‘雙重特異性YAKl相關(guān)激酶，、DYRK、DYRKl、hMNB、HP86、MNB、MNBH和蛋白激酶minibrain同源物，在文獻(xiàn)中被視為相同的，在本申請(qǐng)中可互換使用。本文所用術(shù)語(yǔ)DSCR1、唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)基因1、RCAm鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)子1、 Adapt78、ADAPT78、Calcipressin-l、CSPl、DSCl、MCIPl、肌細(xì)胞富含的鈣調(diào)磷酸酶相互作用蛋白 1 (Myocyte-enriched calcineurin-interacting protein 1)、RCN 1 禾口 丐調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)子1在文獻(xiàn)中被視為是相同的，在本申請(qǐng)中可互換使用。本文所用術(shù)語(yǔ)“對(duì)……有特異性的寡核苷酸”或“靶向……的寡核苷酸”是指具有以下序列的寡核苷酸(i)能夠與靶基因的一部分形成穩(wěn)定復(fù)合體，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過(guò)理論計(jì)算和/ 或體外測(cè)定來(lái)確定。下面的實(shí)施例中描述了測(cè)定雜交復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性的示例性測(cè)定。本文所用術(shù)語(yǔ)“靶核酸”包括DNA、由這類(lèi)DNA轉(zhuǎn)錄的RNA (包括前mRNA和mRNA) 以及來(lái)源于這類(lèi)RNA的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾該核酸的正常功能。這種通過(guò)與靶核酸特異性雜交的化合物對(duì)靶核酸功能的調(diào)節(jié)通常稱(chēng)為“反義”。被干擾的DNA的功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的RNA的功能包括所有重要功能，例如RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、剪接 RNA得到一種或多種mRNA物類(lèi)，以及RNA可參與或促進(jìn)的催化活性。這種干擾靶核酸功能的總體效果是調(diào)節(jié)編碼產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)。RNA干擾“RNAi”由與其“靶”核酸序列具有序列特異同源性的雙鏈RNA(dsRNA)分子介導(dǎo)。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，介體是5-25核苷酸的“小干擾”RNA雙鏈體(siRNA)。 通過(guò)稱(chēng)為切酶的RNA酶加工dsRNA得到siRNA。siRNA雙鏈體產(chǎn)物被募集到稱(chēng)為RISC (RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。雖然不希望受任何特定理論的束縛，但認(rèn)為 RISC被引導(dǎo)至靶核酸(適宜為mRNA)，其中siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用而介導(dǎo)催化方式的切割。可按照本發(fā)明使用的小干擾RNA，可根據(jù)本領(lǐng)域眾所周知且本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方法合成并使用。用于本發(fā)明方法的小干擾RNA適宜包含約1-約50個(gè)核苷酸(nt)。在非限制性實(shí)施方案的實(shí)例中，siRNA可包含約5-約40nt、約5-約30nt、約 10-約30nt、約15-約25nt或約20-25個(gè)核苷酸。通過(guò)應(yīng)用自動(dòng)比對(duì)核酸序列并指明同一性或同源性區(qū)的計(jì)算機(jī)程序，有助于合適寡核苷酸的選擇。例如，通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)(例如GenBank)或通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，運(yùn)用這類(lèi)程序比較所得到的核酸序列。比較一系列物種的核酸序列可供選出物種間具有適當(dāng)同一性程度的核酸序列。在未測(cè)序的基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡可供確定靶物種和其它物種基因之間的同一性程度。通過(guò)在本領(lǐng)域眾所周知的不同嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，可得到同一性的近似測(cè)量。這些方法可供選擇與待受控制的受試者的靶核酸序列具有高度互補(bǔ)性而與其它物種的相應(yīng)核酸序列具有較低程度互補(bǔ)性的寡核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的是，在選擇用于本發(fā)明的合適基因區(qū)時(shí)有相當(dāng)?shù)淖杂??！懊窻NA”是指具有酶促活性的RNA分子。酶核酸(核酶)通過(guò)首先與靶RNA結(jié)合而起作用。這種結(jié)合通過(guò)酶核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，所述酶核酸的靶結(jié)合部分與起切割靶 RNA的作用的該分子的酶促部分保持得十分靠近。因此，酶核酸首先識(shí)別，隨后通過(guò)堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，并且一旦與正確位點(diǎn)結(jié)合，便起酶的作用切割靶RNA。所謂“誘騙RNA”是指模擬配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA分子。因此，誘騙RNA與天然結(jié)合靶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特定的配體。例如，已表明，HIV反式激活反應(yīng)(TAR) RNA過(guò)表達(dá)可用作“誘餌”，并且有效結(jié)合HIVtat蛋白，從而防止其與HIV RNA中編碼的TAR序列結(jié)合。這意指具體實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，這不過(guò)是一個(gè)實(shí)例，可采用本領(lǐng)域廣為人知的技術(shù)容易地產(chǎn)生其它實(shí)施方案。本文所用術(shù)語(yǔ)“單體”通常表示通過(guò)磷酸二酯鍵或其類(lèi)似物連接形成大小從幾個(gè)單體單元(例如約3-4個(gè))到約數(shù)百個(gè)單體單元的寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵的類(lèi)似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、氨基磷酸酯等，如下文更全面的描述。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”包括天然存在的核苷酸以及非天然存在的核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)清楚的是，后來(lái)在自然界中發(fā)現(xiàn)了之前被視為“非天然存在”的各種核苷酸。因此， “核苷酸”不僅包括已知含有嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，而且還包括其雜環(huán)類(lèi)似物及互變異構(gòu)體。其它核苷酸類(lèi)型的說(shuō)明性實(shí)例是含有以下的分子腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、 尿嘧啶、嘌呤、黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、N4，N4-亞乙基胞嘧啶、N6，N6-亞乙基-2，6- 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5- (C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶(pseudoisocytosine)、2_羥基_5_甲基-4-三唑并吡啶、異胞嘧啶(化0(^切&1^)、異鳥(niǎo)嘌呤、肌苷和美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?，432，272 中描述的“非天然存在的”核苷酸。術(shù)語(yǔ)“核苷酸”意在包括全部的實(shí)例及其類(lèi)似物和互變異構(gòu)體。尤其引人關(guān)注的核苷酸是含有腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，它們被認(rèn)為是與人的治療和診斷應(yīng)用有關(guān)的天然存在的核苷酸。核苷酸包含天然 2'-脫氧和 2'-羥基糖(例如 Kornberg 和 Baker，DNA R印lication，第二版(Freeman, San Francisco, 1992)所述)以及它們的類(lèi)似物。提及核苷酸時(shí)的“類(lèi)似物”包括具有修飾堿基部分和/或修飾糖部分的合成核苷酸。這種類(lèi)似物包括設(shè)計(jì)成提高結(jié)合性質(zhì)(例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等)的合成核苷酸。本文使用的“雜交”是指寡聚化合物的大致互補(bǔ)鏈的配對(duì)。配對(duì)的一種機(jī)制包括氫鍵結(jié)合，其可以是寡聚化合物鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的Watson-Crick、 Ho0gsteen或反向Hodgsteen氫鍵結(jié)合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通過(guò)形成氫鍵而配對(duì)的互補(bǔ)核苷酸。雜交可在不同的情況中發(fā)生。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以產(chǎn)生功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下(即在體內(nèi)測(cè)定或治療性治療情況中的生理?xiàng)l件和體外測(cè)定情況中進(jìn)行測(cè)定的條件下)該反義化合物非特異性結(jié)合非靶核酸序列時(shí)，反義化合物是“可特異性雜交的”。本文所用表述“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件”是指本發(fā)明的化合物可與其靶序列雜交，但只與最低限度的其它序列雜交的條件。嚴(yán)格條件是序列依賴(lài)性的，在不同的環(huán)境下不同，而在本發(fā)明的情況下，寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴(yán)格條件”通過(guò)寡聚化合物的性質(zhì)和組成以及對(duì)其進(jìn)行研究的測(cè)定法來(lái)確定。通常，嚴(yán)格雜交條件包括低濃度(< 0. 15M) 的含Na++或K++等無(wú)機(jī)陽(yáng)離子的鹽(即低離子強(qiáng)度)、溫度高于20°C _25°C卻低于寡聚化合物靴序列復(fù)合體的Tm，和存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲亞砜或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，對(duì)于每的甲酰胺，雜交率降低1. 1%。高嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例是0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC)/0. 1% (w/v)SDS在60°C下為時(shí)30分鐘。本文所用“互補(bǔ)的”是指在一條或兩條寡聚鏈上的兩個(gè)核苷酸之間精確配對(duì)的能力。例如，如果反義化合物某一位置上的核堿基(nucleobase)能夠與靶核酸(所述靶核酸是DNA、RNA或寡核苷酸分子)某一位置上的核堿基發(fā)生氫鍵結(jié)合，則認(rèn)為寡核苷酸和靶核酸之間的氫鍵結(jié)合位置是互補(bǔ)位置。當(dāng)每個(gè)分子中足夠數(shù)目的互補(bǔ)位置被可相互發(fā)生氫鍵結(jié)合的核苷酸占據(jù)時(shí)，寡聚化合物和其它DNA、RNA或寡核苷酸分子彼此互補(bǔ)。因此，“可特異性雜交的”和“互補(bǔ)的”兩個(gè)術(shù)語(yǔ)用來(lái)表明在足夠數(shù)量的核苷酸內(nèi)足以使寡聚化合物和靶核酸之間發(fā)生穩(wěn)定的特異性結(jié)合的精確配對(duì)程度或互補(bǔ)性。本領(lǐng)域認(rèn)識(shí)到，寡聚化合物序列不必與其可特異性雜交的靶核酸序列100%互補(bǔ)。 此外，寡核苷酸可越過(guò)一個(gè)或多個(gè)區(qū)段雜交，使得間插或相鄰區(qū)段不參與雜交事件(例如環(huán)結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明寡聚化合物與其靶向的靶核酸序列內(nèi)的靶區(qū)具有至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、或至少約99%的序列互補(bǔ)性。例如，反義化合物中18/20的核苷酸與靶區(qū)互補(bǔ)并因此與之特異性雜交的反義化合物可呈90%互補(bǔ)性。在該實(shí)例中，剩余的非互補(bǔ)核苷酸可集簇或散布在互補(bǔ)核苷酸之間，不必彼此鄰接或與互補(bǔ)核苷酸鄰接。同樣地，長(zhǎng)度為18個(gè)核苷酸且具有兩側(cè)是與靶核酸完全互補(bǔ)的兩個(gè)區(qū)的4(四)個(gè)非互補(bǔ)核苷酸的反義化合物與靶核酸具有77. 8%的總體互補(bǔ)性，并因此落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。反義化合物與靶核酸的區(qū)的互補(bǔ)性百分比可利用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基礎(chǔ)局部比對(duì)檢索工具(basic local alignment search tools))和PowerBLAST程序按常規(guī)測(cè)定。同源性、序列同一性或互補(bǔ)性百分比可通過(guò)例如 Gap 禾呈序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix 版本第 8 版，Genetics Computer Group,University Research Park,Madison Wis)使用默認(rèn)設(shè)置測(cè)定，該程序利用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. Appl. Math.，(1981) 2，482-489)。本文所用術(shù)語(yǔ)“熱解鏈溫度(Tm) ”是指在規(guī)定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下，與靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸有50%與靶序列雜交達(dá)到平衡的溫度。嚴(yán)格條件通常是指其中鹽濃度在pH 7.0-8. 3下為至少約0.01-1. OM Na離子濃度(或其它鹽)，溫度對(duì)于短寡核苷酸(例如10-50個(gè)核苷酸)為至少約30°C的條件。嚴(yán)格條件也可以加入去穩(wěn)定劑(例如甲酰胺) 的方式實(shí)現(xiàn)。本文所用“調(diào)節(jié)”是指提高(刺激)或降低(抑制)基因的表達(dá)。術(shù)語(yǔ)“變體”當(dāng)在多核苷酸序列情況下使用時(shí)，可包括與野生型基因有關(guān)的多核苷酸序列。該定義也可包括例如“等位”變體、“剪接”變體、“物種”變體或“多態(tài)”變體。剪接變體可與參比分子具有顯著同一性，但通常由于mRNA加工過(guò)程中外顯子的可變剪接而具有更多或更少量的多核苷酸。相應(yīng)多肽可具有另外的功能域或缺乏結(jié)構(gòu)域。物種變體是指物種彼此不同的多核苷酸序列。本發(fā)明特別利用了野生型基因產(chǎn)物的變體。變體在核酸序列中可產(chǎn)生至少一個(gè)突變，并可導(dǎo)致產(chǎn)生改變的mRNA或者其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或不改變的多肽。任何給定的天然或重組基因可具有0、1或多個(gè)等位形式。產(chǎn)生變體的常見(jiàn)突變一般歸因于核苷酸的天然缺失、添加或取代。這些變化類(lèi)型的每一種可在給定序列中單獨(dú)發(fā)生或與其它變化聯(lián)合發(fā)生一次或多次。所得多肽通常相互之間具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列的變異。多態(tài)變體還可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)或單個(gè)堿基突變，其中多核苷酸序列因一個(gè)堿基而不同。SNP的存在可表明例如某群體具有疾病狀態(tài)的傾向，即易感性與抗性。衍生多核苷酸包括經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的核酸，例如氫被烷基、酰基或氨基置換。衍生物 (例如衍生寡核苷酸)可包括非天然存在的部分，例如改變的糖部分或糖間鍵。這其中的實(shí)例是硫代磷酸酯和本領(lǐng)域已知的其它含硫種類(lèi)。衍生核酸還可含有標(biāo)簽，包括放射性核苷酸、酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。“衍生”多肽或“衍生”肽是經(jīng)過(guò)以下修飾的多肽或肽例如通過(guò)糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/烷化、?；?、化學(xué)偶聯(lián)或溫和福爾馬林處理。衍生物也可被修飾以含有可直接或間接檢測(cè)的標(biāo)記，包括但不限于放射性同位素標(biāo)記、熒光標(biāo)記和酶標(biāo)記。本文所用術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”或“患者”意在包括例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長(zhǎng)耳鹿、水貂、哺乳動(dòng)物、猴、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、禽、雞、爬行動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)、昆蟲(chóng)和蜘蛛。“哺乳動(dòng)物”涵蓋通常處在醫(yī)療護(hù)理下的溫血哺乳動(dòng)物(例如人和馴養(yǎng)動(dòng)物)。實(shí)例包括貓、犬、馬、牛和人，以及僅僅是人。“治療”涵蓋治療哺乳動(dòng)物的疾病狀態(tài)，包括(a)預(yù)防在哺乳動(dòng)物中發(fā)生該疾病狀態(tài)，尤其是該哺乳動(dòng)物易患該疾病狀態(tài)但尚未確診患病時(shí)；(b)抑制該疾病狀態(tài)，例如抑制其進(jìn)展；和/或(c)減輕該疾病狀態(tài)，例如引起該疾病狀態(tài)消退直到達(dá)到所需終點(diǎn)。治療還包括改善疾病的癥狀(例如減少疼痛或不適)，其中這種改善可直接影響或不影響該疾病 (例如病因、傳播、表達(dá)等)。本文所用“癌癥”是指哺乳動(dòng)物中存在的所有類(lèi)型的癌癥或腫瘤或惡性腫瘤，包括但不限于白血病、淋巴瘤、黑素瘤、癌和肉瘤。癌癥自身表現(xiàn)為“腫瘤”或包含癌癥惡性細(xì)胞的組織。腫瘤實(shí)例包括肉瘤和癌，例如但不限于纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內(nèi)皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內(nèi)皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、 尤因瘤(Ewing' s tumor)、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結(jié)腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、 髓樣癌、支氣管癌、腎細(xì)胞癌、肝細(xì)胞瘤、膽管癌、絨膜癌、精原細(xì)胞瘤、胚胎癌、維爾姆斯瘤 (Wilms' tumor)、宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細(xì)胞瘤、聽(tīng)神經(jīng)瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤?？赏ㄟ^(guò)所公開(kāi)的本發(fā)明的組合物治療的其它癌癥包括但不限于例如霍奇金病(Hodgkin' s Disease)、非霍奇金淋巴瘤、 多發(fā)性骨髓瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、橫紋肌肉瘤、原發(fā)性血小板增多癥、原發(fā)性巨球蛋白血癥、小細(xì)胞肺瘤、原發(fā)性腦瘤、胃癌、結(jié)腸癌、惡性胰島瘤、惡性類(lèi)癌、膀胱癌、癌前皮膚病變、睪丸癌、淋巴瘤、甲狀腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食管癌、生殖泌尿道癌、惡性高鈣血癥、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、腎上腺皮質(zhì)癌和前列腺癌?！吧窠?jīng)系統(tǒng)疾病或障礙”指神經(jīng)系統(tǒng)和/或視覺(jué)系統(tǒng)的任何疾病或障礙?！吧窠?jīng)系統(tǒng)疾病或障礙”包括涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)(腦、腦干和小腦)、外周神經(jīng)系統(tǒng)(包括顱神經(jīng)) 和自主神經(jīng)系統(tǒng)(其部分位于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)二者中)的疾病或障礙。神經(jīng)系統(tǒng)障礙的實(shí)例包括但不限于頭痛、木僵和昏迷、癡呆、癲癇發(fā)作、睡眠障礙、創(chuàng)傷、感染、腫瘤、神經(jīng)眼科學(xué)疾病、運(yùn)動(dòng)障礙、脫髓鞘病、脊髓病癥及外周神經(jīng)、肌肉和神經(jīng)肌接點(diǎn)的病癥。癮癖和精神病包括但不限于雙相性精神障礙和精神分裂癥，而且還包括在神經(jīng)系統(tǒng)障礙的定義中。下面是可使用本發(fā)明的組合物和方法治療的若干神經(jīng)系統(tǒng)障礙、癥狀、體征和綜合征的名目獲得性癲癇性失語(yǔ)；急性播散性腦脊髓炎；腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；年齡相關(guān)性黃斑變性；胼胝體發(fā)育不全；失認(rèn)癥；艾卡迪綜合征(Aicardi syndrome)；亞力山大病(Alexander disease)；阿爾珀斯病(Alpers' disease)；交叉性偏癱；血管性癡呆；肌萎縮性側(cè)索硬化；無(wú)腦畸形；安吉爾曼綜合征(Angelman syndrome)；血管瘤??；缺氧癥； 失語(yǔ)癥；失用癥；蛛網(wǎng)膜囊腫；蛛網(wǎng)膜炎；阿-?；?Anronl-Chiari malformation)； 動(dòng)靜脈畸形；阿斯珀格綜合征(Asperger syndrome)；共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(ataxia telegiectasia)；注意力不集中的過(guò)度反應(yīng)癥；孤獨(dú)癥；植物神經(jīng)功能紊亂(autonomic dysfunction)；背痛；巴騰病(Batten disease)；貝切特病(Behcet' s disease)；面神經(jīng)麻痹(Bell' s palsy)；良性自發(fā)性瞼痙攣；良性焦距協(xié)調(diào)(benign focal)；肌萎縮；良性顱內(nèi)高血壓；賓斯旺格病(Binswanger' s disease)；瞼痙攣；Bloch Sulzberger綜合征； 臂叢神經(jīng)損傷；腦膿腫；腦損傷；腦腫瘤(包括多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤)；脊柱腫瘤；布朗-塞卡爾綜合征(Brown-Sequard syndrome)；卡納萬(wàn)病(Canavan disease)；腕管綜合征；灼性神經(jīng)痛；中樞性疼痛綜合征；腦橋中央髓鞘溶解；頭部障礙(cephalic disorder)；腦動(dòng)脈瘤；腦動(dòng)脈硬化；腦萎縮；大腦性巨人癥；大腦性癱瘓；夏-馬-圖病(Charcot-Marie-Tooth disease)；化療引起的神經(jīng)病變及神經(jīng)性疼痛；希阿利畸形(Chiari malformation)；舞蹈病；慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)??；慢性疼痛；慢性區(qū)域疼痛綜合征；科-勒綜合征 (Coffin Lowry syndrome)；昏迷，包括持續(xù)性植物狀態(tài)；先天性面癱；皮質(zhì)基底節(jié)變性； 顱動(dòng)脈炎；顱縫早閉；克-雅病(Creutzfeldt-Jakob disease)；累積性創(chuàng)傷障礙；庫(kù)欣綜合征(Cushing' s syndrome)；巨細(xì)胞包涵體??；巨細(xì)胞病毒感染；舞蹈眼-舞蹈腳綜合征；丹-沃綜合征(Dandy Walker syndrome) ；Dawson?。坏履ξ靼＞C合征(Morsier' s syndrome)；代熱林-克隆普克麻痹(Dejerine-Klumke palsy)；癡呆；皮肌炎；糖尿病性神經(jīng)??；彌漫性硬化；自主神經(jīng)功能異常；書(shū)寫(xiě)困難；誦讀困難；張力失常；早期幼兒癲癇性腦病；空蝶鞍綜合征；腦炎；腦膨出；腦三叉神經(jīng)血管瘤病；癲癇；歐勃麻痹(Erb' s palsy)；特發(fā)性震顫；法布里病(Fabry' s disease)；法爾綜合征(Fahr' s syndrome)； 昏厥；家族性痙攣性癱瘓；熱性癲癇發(fā)作；費(fèi)希爾綜合征(Fisher syndrome)；弗里德賴(lài)希共濟(jì)失調(diào)；額顳癡呆和其它“Tau病變”；高歇病(Gaucher' s disease)；格斯特曼綜合征(Gerstmarm' s syndrome)；巨細(xì)胞動(dòng)脈炎；巨細(xì)胞包涵體??；球形細(xì)胞腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；格-巴綜合征(globoid cell leukodystrophy) ;HTLV-1相關(guān)脊髓病；哈-斯病 (Hallervorden-Spatz disease)；顱腦損傷；頭痛；偏側(cè)面肌痙攣；遺傳性痙攣性截癱；多神經(jīng)炎型遺傳性共濟(jì)失調(diào)；耳部帶狀皰疹(herpes zoster oticus)；帶狀皰疹；Hirayama 綜合征；HIV相關(guān)癡呆和神經(jīng)病(亦為AIDS的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn))；前腦無(wú)裂畸形；亨廷頓舞蹈病(Huntington' s disease)和其它多谷氨酰胺重復(fù)疾??；積水性無(wú)腦畸形；腦積水； 皮質(zhì)醇增多癥；低氧；免疫介導(dǎo)的腦脊髓炎；包涵體肌炎；色素失調(diào)癥；嬰兒植烷酸貯積病； 嬰兒雷夫敘姆病；嬰兒痙攣癥；炎性肌??；顱內(nèi)囊腫；顱內(nèi)高血壓；儒貝爾綜合征(Joubert syndrome)；克-塞綜合征(Keams-Sayre syndrome)；肯尼迪病(Kennedy disease)； Kinsboume綜合征；克-費(fèi)綜合征(Klippel Feil syndrome)；克拉伯病(Krabbe disease)； _ — (Kugelberg-ffelander disease)；(Lafora disease) ；IlJ-SIJL
無(wú)力綜合征(Lambert-Eaton myasthenic syndrome) ；Landau-Kleffner 綜合征；側(cè)髓(瓦倫伯格)綜合征；學(xué)習(xí)不能；利氏病(Leigh' s disease)；倫-格綜合征(Lermox-Gustaut syndrome)；累-奈綜合征(Lesch-Nyhan syndrome)；腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；路易體癡呆(Lewy body dementia)；無(wú)腦回；閉鎖綜合征；Lou Gehrig病(即運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病或肌萎縮性側(cè)索硬化癥)；腰椎間盤(pán)病(lumbar disc disease)；萊姆病(Lyme disease)—神經(jīng)系統(tǒng) jp 3a δΕ ；Machado-Joseph ^ ； IeL |3 (macrencephaly/megalencephaly) ； _ _ _ ☆ H (Melkersson-Rosenthal syndrome)；梅尼埃病(Menieres disease)；腦膜炎；門(mén)克其j 病 (Menkes disease)；異染性腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；小頭畸形；偏頭痛；Miller Fisher綜合征； 小中風(fēng)(mini-stroke)；線粒體肌病；默比厄斯綜合征(Mobius syndrome)；單肢肌萎縮； 運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元??；腦底異常血管網(wǎng)??；粘多糖貯積癥；多發(fā)梗塞性癡呆；多灶性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病； 多發(fā)性硬化和其它脫髓鞘性病癥；多系統(tǒng)萎縮伴隨體位性低血壓；肌營(yíng)養(yǎng)不良；重癥肌無(wú)力；髓鞘破壞性(myelinoclastic)彌漫性硬化癥；嬰兒肌陣攣性腦??；肌陣攣；肌?。幌忍煨约?qiáng)直；發(fā)作性睡病；神經(jīng)纖維瘤?。豢咕癫∷帎盒跃C合征；AIDS的神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)； 狼瘡神經(jīng)性后遺癥；神經(jīng)性肌強(qiáng)直；神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥；神經(jīng)細(xì)胞遷移障礙；尼-皮病(Niemann-Pick disease) ；O' Sullivan-McLeod綜合征；枕神經(jīng)痛；隱性脊柱神經(jīng)管閉合不全序列征；Ohtahara綜合征；橄欖體腦橋小腦萎縮；視性眼肌陣攣；視神經(jīng)炎；直立性低血壓；過(guò)度使用綜合征；感覺(jué)異常；神經(jīng)退行性疾病或障礙(帕金森病(Parkinson' s disease)、亨廷頓舞蹈病、阿爾茨海默病(Alzheimer' s disease)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、癡呆、多發(fā)性硬化和其它與神經(jīng)元細(xì)胞死亡有關(guān)的疾病與障礙)；先天性肌強(qiáng)直??；類(lèi)腫瘤性疾?。魂嚢l(fā)性發(fā)作(paroxysmal attack)；帕-羅綜合征(Parry Romberg syndrome)；佩-梅病(Pelizaeus-Merzbacher disease)；周期性麻搏；外周神經(jīng)?。煌葱陨窠?jīng)病變和神經(jīng)性疼痛；持續(xù)性植物狀態(tài)；全身性發(fā)育遲緩；感光性噴嚏反射；植烷酸貯積病；皮克病(Pick' s disease)；神經(jīng)挾捏(pinched nerve)；垂體瘤；多肌炎；腦穿通畸形；脊髓灰質(zhì)炎后綜合征；皰疹后神經(jīng)痛；感染后腦脊髓炎；體位性低血壓；普_韋綜合征(Prader-Willi syndrome)；原發(fā)性側(cè)索硬化癥；朊病毒??；進(jìn)行性偏側(cè)面肌萎縮；進(jìn)行性多灶性白質(zhì)腦病；進(jìn)行性硬化灰質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良；進(jìn)行性核上性麻痹；腦假瘤；拉姆齊-亨特綜合征(Ramsay-Hunt syndrome) (I型和II型)；Rasmussen腦炎；反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良綜合征；雷夫敘姆病；重復(fù)性動(dòng)作障礙；重復(fù)性應(yīng)激損傷；下肢不寧綜合征；逆轉(zhuǎn)錄病毒相關(guān)的脊髓病；雷特綜合征(Rett syndrom)；雷耶綜合征(Reye' s syndrome)；舞蹈病(Saint Vitus dance)；山德霍夫病(Sandhoff disease)；謝爾德病(Schilder' s disease)；腦裂畸形；視隔發(fā)育不良(s印to-optic dysplasia)；驚嚇?gòu)雰壕C合征；帶狀皰疹；希-德綜合征(Shy-Drager syndrome)；斯耶格倫綜合征(Sjogren' s syndrome)； 睡眠呼吸暫停；索托斯綜合征(Soto' s syndrome)；痙攣；脊柱裂；脊髓損傷；脊髓腫瘤； 脊髓性肌萎縮；僵人綜合征；中風(fēng)；斯-韋綜合征(Sturge-Weber syndrome)；亞急性硬化性全腦炎；皮層下動(dòng)脈硬化性腦??；西德納姆舞蹈病(Sydenham chorea)；暈厥；脊髓空洞癥；遲發(fā)性運(yùn)動(dòng)障礙；泰-薩病(Tay-Sachs disease)；顳動(dòng)脈炎；脊髓栓系綜合征；先天性肌強(qiáng)直；胸出口綜合征；三叉神經(jīng)痛；托德麻痹(Todd' s paralysis)；圖雷特綜合征(Tourette syndrome)；短暫性腦缺血發(fā)作；傳染性海綿狀腦?。粰M貫性脊髓炎；外傷性腦損傷；震顫；三叉神經(jīng)痛；熱帶痙攣性截癱；結(jié)節(jié)性硬化癥；血管性癡呆(多發(fā)梗塞性癡呆)；血管炎，包括顳動(dòng)脈炎；希-林病(Von Hippel-Lindau disease)；瓦倫伯格綜合征 (Wallenberg' s syndrome)；韋-霍病(Werdnig-Hoffman disease)；韋斯特綜合征(West syndrome)；頸部扭傷(whiplash)；威廉斯綜合征(Williams syndrome) ；Wildon 病和澤爾韋格綜合征(Zellweger syndrome)。 “炎癥”是指與單核細(xì)胞、白細(xì)胞和/或嗜中性粒細(xì)胞的局部遷移和吸引有關(guān)的一種和多種全身性炎性狀況。炎癥的實(shí)例包括但不限于因致病生物(包括革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、病毒、真菌和寄生物(例如原生動(dòng)物和蠕蟲(chóng)))感染、移植排斥(包括腎、肝、 心臟、肺或角膜等實(shí)體器官排斥以及骨髓移植排斥包括移植物抗宿主病(GVHD))導(dǎo)因局限性慢性或急性自身免疫反應(yīng)或變態(tài)反應(yīng)導(dǎo)致的炎癥。自身免疫病包括急性腎小球性腎炎； 類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎；慢性腎小球性腎炎；炎性腸病，例如克羅恩病(Crohn' s disease)、潰瘍性結(jié)腸炎和壞死性小腸結(jié)腸炎；粒細(xì)胞輸注相關(guān)綜合征；炎性皮膚病，例如接觸性皮炎、特應(yīng)性皮炎、牛皮癬；系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性甲狀腺炎、多發(fā)性硬化和糖尿病的某些形式或受試者的自身免疫系統(tǒng)攻擊導(dǎo)致病理性組織破壞的任何其它自身免疫狀態(tài)。變態(tài)反應(yīng)包括變應(yīng)性哮喘、慢性支氣管炎、急性過(guò)敏反應(yīng)和遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。全身炎性疾病狀態(tài)，包括與創(chuàng)傷、燒傷、缺血事件(例如心臟、腦、腸或外周血管系統(tǒng)中的血栓性事件，包括心肌梗死和中風(fēng))后再灌注相關(guān)的炎癥、膿毒癥、ARDS或多器官功能障礙綜合征。炎性細(xì)胞募集也出現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣硬化斑中。炎癥包括但不限于非霍奇金淋巴瘤、韋格納肉芽腫病(Wegener' s granulomatosis)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto ‘ s thyroiditis)、肝細(xì)胞癌、胸腺萎縮、慢性胰腺炎、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、反應(yīng)性淋巴樣增生、骨關(guān)節(jié)炎、潰瘍性結(jié)腸炎、乳頭狀癌、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎、急性膽囊炎、慢性膽囊炎、肝硬化、慢性涎腺炎、腹膜炎、急性胰腺炎、慢性胰腺炎、慢性胃炎、子宮內(nèi)膜異位(adenomyosis/ endometriosis)、急性宮頸炎、慢性宮頸炎、淋巴增生、多發(fā)性硬化、特發(fā)性血小板減少性紫癜繼發(fā)性肥大、原發(fā)性IgA腎病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、肺氣腫、慢性腎盂腎炎和慢性膀胱炎。心血管疾病或病癥包括可能引起缺血或由心臟再灌注引起的病癥。實(shí)例包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈疾病、肉芽腫性心肌炎、慢性心肌炎(非肉芽腫性)、原發(fā)性肥厚型心肌病、外周動(dòng)脈疾病(PAD)、中風(fēng)、心絞痛、心肌梗死、由心臟停搏引起的心血管組織損傷、由心臟分流術(shù)引起的心血管組織損傷、心源性休克和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的或者涉及心臟或血管系統(tǒng)的功能障礙或組織損傷的相關(guān)病況，尤其是但不限于與唐氏綜合征基因活化有關(guān)的組織損傷。CVS疾病包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、肉芽腫性心肌炎、心肌梗死、心臟瓣膜病繼發(fā)性心肌纖維化、無(wú)梗塞型心肌纖維化、原發(fā)性肥厚型心肌病和慢性心肌炎(非肉芽腫性)。與氧化應(yīng)激有關(guān)的疾病或病癥的實(shí)例包括但不限于動(dòng)脈粥樣硬化、帕金森病、心臟衰竭、心肌梗死、阿爾茨海默病、慢性疲勞綜合征、肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、多發(fā)性硬化、肝臟疾病或病癥、胃腸疾病或病癥、糖尿病、癌癥、自身免疫、免疫相關(guān)疾病或障礙、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或病癥、神經(jīng)退行性疾病或病癥、神經(jīng)修復(fù)和麻痹、神經(jīng)內(nèi)分泌分化、炎性疾病、肌肉疾病或病癥、與感染性生物有關(guān)的疾病或病癥等。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶標(biāo)在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包含唐氏綜合征基因的核酸序列，包括而不限于與唐氏綜合征基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包含DYRKl的核酸序列，包括而不限于與DYRKl基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包含DSCRl的核酸序列，包括而不限于與DSCRl基因有關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。DYRKIA (雙重特異性酪氨酸磷酸化-調(diào)節(jié)激酶1A)是在酪氨酸殘基自身磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸激酶。該蛋白質(zhì)含有核定位信號(hào)，并定位于剪接因子區(qū)室(核小點(diǎn))，但還存在于胞質(zhì)中。DYRKIA具有寬的底物譜，包括轉(zhuǎn)錄因子、剪接因子和突觸蛋白。它在所有組織和細(xì)胞中無(wú)所不在地進(jìn)行表達(dá)，但是表達(dá)不均勻，其中在胚胎腦和成體腦中具有高水平。 人DYRKIA基因被認(rèn)為是若干唐氏綜合征特征的候選基因，包括由于其位于染色體21上的唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)中及其在腦功能中的作用所致智力遲鈍。值得注意的是，DYRKIA的果蠅屬(Drosophila)直向同源物的蠅突變體(Minibrain)，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)元的數(shù)量減少。由于DYRKla遭破壞的等位基因而是雜合的小鼠的存活力降低、生長(zhǎng)延遲和行為改變。DYRKla編碼雙重特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶(DYRK)家族的成員。該成員含有核靶向信號(hào)序列、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈模體和高保守性13個(gè)連續(xù)組氨酸的重復(fù)序列。它催化其在絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸殘基上的自身磷酸化，可在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用，并且可參與腦發(fā)育。該基因是果蠅mnbOiiinibrain)基因和大鼠 Dyrk基因的同源物。DYRKla位于染色體21的唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)中，并且被視為與唐氏綜合征相關(guān)的學(xué)習(xí)缺陷的強(qiáng)候選基因。該基因的可變剪接產(chǎn)生在5’ UTR中或3’編碼區(qū)中彼此不同的若干轉(zhuǎn)錄物變體。這些變體編碼至少五種不同的同種型。唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)蛋白I(DSCRl)是VEGF靶基因和內(nèi)皮細(xì)胞中的抗炎信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。人基因(DSCRl)是存在于人染色體21(HC21)的最小區(qū)域內(nèi)的50-100個(gè)基因之一，其存在大于2個(gè)拷貝時(shí)，會(huì)引起智力遲鈍，統(tǒng)稱(chēng)唐氏綜合征(DS)。DSCRl屬于保守蛋白質(zhì)的家族，亦稱(chēng)calcipressin或調(diào)制性鈣調(diào)磷酸酶相互作用蛋白(MCIP)，在人中包含共有結(jié)合鈣調(diào)磷酸酶的能力的 3 個(gè)成員，即 DSCR1IMCIP1、ZAKI-4/DSCR1L1IMCIP2 和 DSCR1L2/MCIP3。 DSCRl起小的胞質(zhì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的作用，該分子由Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性絲氨酸/蘇氨酸蛋白質(zhì)磷酸酶2B(PP2B)或鈣調(diào)磷酸酶A (CnA)調(diào)節(jié)。許多癌癥類(lèi)型的發(fā)生率在患有唐氏綜合征的個(gè)體中顯著下降，一般認(rèn)為這種廣泛的癌癥保護(hù)作用是由染色體21的額外拷貝上231個(gè)超數(shù)基因中的一種或多種的表達(dá)增加所賦予的。這類(lèi)基因之一是唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)蛋白1(DSCR1，亦稱(chēng)為RCAN1)，其編碼通過(guò)鈣調(diào)磷酸酶途徑抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)介導(dǎo)的血管生成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)。DSCRI在唐氏綜合征組織中和在唐氏綜合征小鼠模型中增加。雖然不希望受理論的束縛，但因DSCRl 連同另一個(gè)染色體21基因DYRKla所致鈣調(diào)磷酸酶活性的減弱，可能足以顯著地減少血管生成。(DSCRl)的別名包括唐氏綜合征候選區(qū)-I、RCANI鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)子1、Adapt78、 ADAPT78、Calcipressin-I、CSPl、DSCl、DSCRl、MCIPl、肌細(xì)胞富含的鈣調(diào)磷酸酶相互作用蛋白1、RCNl、鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)子1。DYRKla編碼雙重特異性酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)激酶(DYRK)家族的成員。該成員含有核靶向信號(hào)序列、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈模體和高保守性13個(gè)連續(xù)組氨酸的重復(fù)序列。它催化其在絲氨酸/蘇氨酸和酪氨酸殘基上的自身磷酸化，可在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用，并且可參與腦發(fā)育。該基因是果蠅mnbOiiinibrain)基因和大鼠 Dyrk基因的同源物。DYRKla位于染色體21的唐氏綜合征關(guān)鍵區(qū)中，并且被視為與唐氏綜合征相關(guān)的學(xué)習(xí)缺陷的強(qiáng)候選基因。該基因的可變剪接產(chǎn)生在5’ UTR中或3’編碼區(qū)中彼此不同的若干轉(zhuǎn)錄物變體。這些變體編碼至少五種不同的同種型。位于DSCR上的DYRKIA和RCANI基因，與DS患者的典型特征及其對(duì)DS的神經(jīng)缺陷的發(fā)病機(jī)制的影響密切相關(guān)。DYRKIA使若干轉(zhuǎn)錄因子(例如CREB和NFAT)、胞吞復(fù)雜蛋白質(zhì)(endocytic complex protein)和AD連鎖基因產(chǎn)物磷酸化。同時(shí)，RCANI是鈣調(diào)磷酸酶A的內(nèi)源抑制劑，而且認(rèn)為其不均衡的活性引起DS和AD中主要的神經(jīng)元和/或非神經(jīng)元機(jī)能障礙。令人感興趣的是，這兩者均促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶缺陷、突觸可塑性改變、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)受損和DS中的AD樣神經(jīng)病理學(xué)。在一些實(shí)施方案中，反義寡核苷酸用于預(yù)防或治療與唐氏綜合征基因家族成員有關(guān)的疾病或病癥?？梢杂糜墒褂盟龇戳x化合物獲得的干細(xì)胞再生的細(xì)胞/組織治療的示例性唐氏綜合征基因介導(dǎo)的疾病和病癥包括與DYRKla或DSCRl的突變體、異常表達(dá)或功能有關(guān)的疾病或障礙；癌癥、血管生成疾病或障礙、細(xì)胞凋亡疾病或障礙、細(xì)胞增殖性疾病或障礙、炎癥、心血管疾病或病癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或障礙、唐氏綜合征、阿爾茨海默病、智力遲鈍、記憶受損、三體性、神經(jīng)病理學(xué)、神經(jīng)退行性疾病或障礙、心肌細(xì)胞肥大、血管異常(例如嬰兒血管瘤、血管生成依賴(lài)性血管腫瘤、血管畸形等)、高同型半胱氨酸血癥 (Hyperhomocysteinemia)、成骨細(xì)胞分化受損、破骨細(xì)胞發(fā)生、線粒體功能受損、氧化應(yīng)激、 與鈣調(diào)磷酸酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受損有關(guān)的疾病或障礙、與血管生成調(diào)節(jié)受損有關(guān)的疾病或障礙、鈣介導(dǎo)的應(yīng)激和與APC和/或Axin功能缺陷或受損有關(guān)的疾病或障礙。在另一個(gè)實(shí)施方案中，唐氏綜合征基因天然反義序列的反義寡核苷酸治療有發(fā)生心臟疾病或病癥風(fēng)險(xiǎn)或已發(fā)生心臟疾病或病癥的患者。例如磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶及其下游靶標(biāo)(NFAT家族的轉(zhuǎn)錄因子)的活化導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。雙重特異性酪氨酸(Y)磷酸化調(diào)節(jié)激酶IA(DYRKla)能夠直接使NFAT磷酸化來(lái)拮抗鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。反義寡核苷酸在心臟疾病或病癥(例如心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng))治療中調(diào)節(jié)DYRKla。在實(shí)施方案中，包含DYRKla和/或DSCRl的反義寡核苷酸預(yù)防或治療與體內(nèi)生理異常水平、活性、功能、表達(dá)有關(guān)的疾病，其還可改變這些分子直接或間接參與的生理途徑。 因此，一種或多種DYRKla和/或DSCRl反義寡核苷酸可用于預(yù)防疾病或病癥或治療這些患
者ο在另一個(gè)實(shí)施方案中，DYRKla和/或DSCRl天然反義序列的反義寡核苷酸治療有發(fā)生心臟疾病或病癥風(fēng)險(xiǎn)或已發(fā)生心臟疾病或病癥的患者。例如，磷酸酶鈣調(diào)磷酸酶及其下游靶標(biāo)(NFAT家族的轉(zhuǎn)錄因子)的活化導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大。雙重特異性酪氨酸(Y)磷酸化調(diào)節(jié)激酶IA(DYRKla)能夠通過(guò)直接使NFAT磷酸化來(lái)拮抗鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。反義寡核苷酸在心臟疾病或病癥(例如心肌細(xì)胞的肥大反應(yīng))的治療中調(diào)節(jié)DYRKla。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸對(duì)唐氏綜合征基因的多核苷酸(其包括而不限于非編碼區(qū))有特異性。唐氏綜合征基因靶標(biāo)包括唐氏綜合征基因的變體；唐氏綜合征基因的突變體，包括SNP ；唐氏綜合征基因的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選所述寡核苷酸是反義RNA分子。按照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不只限于唐氏綜合征基因多核苷酸，而是延伸到唐氏綜合征基因的任何同種型、受體、同源物、非編碼區(qū)等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸靶向唐氏綜合征基因靶標(biāo)的天然反義序列 (編碼區(qū)和非編碼區(qū)的天然反義序列)，包括而不限于其變體、等位基因、同源物、突變體、 衍生物、片段及互補(bǔ)序列。優(yōu)選所述寡核苷酸是反義RNA或DNA分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括其中不同堿基存在于化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上的變體。例如，如果第一核苷酸是腺嘌呤，則可產(chǎn)生在該位置上含有胸苷、鳥(niǎo)苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的變體。這可在反義化合物的任何位置上進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，反義化合物和靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約 50%-約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60% -約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70% -約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80% -約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起活性喪失，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列非特異性結(jié)合時(shí)，反義化合物是可特異性雜交的。這樣的條件包括，即體內(nèi)測(cè)定或治療性治療情況中的生理?xiàng)l件和體外測(cè)定情況中進(jìn)行測(cè)定的條件。當(dāng)反義化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起效用喪失，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下(即在體內(nèi)測(cè)定或治療性治療情況中的生理?xiàng)l件下和在體外測(cè)定情況中進(jìn)行測(cè)定的條件下)該反義化合物與非靶序列非特異性結(jié)合時(shí)，則不論該反義化合物是DNA、RNA、嵌合體、取代物等，其都是可特異性雜交的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包括而不限于利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列、一個(gè)或多個(gè)SEQ ID NO :3-6所示序列等的唐氏綜合征基因的靶向調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，表達(dá)或功能上調(diào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 與對(duì)照相比，表達(dá)或功能下調(diào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，包含SEQ ID NO :7- 所示核酸序列的寡核苷酸包括利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸，較短片段或較長(zhǎng)片段，修飾鍵等。修飾鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可與本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類(lèi)似物部分連接的磷衍生物(或修飾磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯(alkanephosphate)、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類(lèi)似物的制備和將它們整合入核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸中本身亦是已知的，不必在此贅述。本領(lǐng)域技術(shù)人員還為治療用途控制反義序列的特異性和靈敏度。在動(dòng)物和人的疾病狀態(tài)的治療中已利用反義寡核苷酸作為治療部分。已將反義寡核苷酸安全有效地給予人，許多臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。因此已確定的是，寡核苷酸可以是有用的治療方式，其可被設(shè)計(jì)用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物(尤其人)的治療方案。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡聚反義化合物(特別是寡核苷酸)與靶核酸分子結(jié)合并調(diào)節(jié)由靶基因編碼的分子的表達(dá)和/或功能。被干擾的DNA功能包括例如復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。 被干擾的RNA功能包括所有重要功能，例如RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、剪接RNA產(chǎn)生一種或多種mRNA和RNA可能參與或促進(jìn)的催化活性。功能可被上調(diào)或抑制，視所需功能而定。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、 可變剪接體、引物、探針及與靶核酸的至少一部分雜交的其它寡聚化合物。同樣地，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明的情況下，反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步驟過(guò)程。該過(guò)程通常始于識(shí)別待調(diào)節(jié)其功能的靶核酸。該靶核酸可以是例如其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞基因(或轉(zhuǎn)錄自該基因的mRNA)，或來(lái)自病原體的核酸分子。在本發(fā)明中，靶核酸編碼唐氏綜合征基因。靶向過(guò)程通常還包括測(cè)定將發(fā)生反義相互作用的靶核酸內(nèi)的至少一個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)，使得產(chǎn)生所需要的作用(例如調(diào)節(jié)表達(dá))。在本發(fā)明的情況下，術(shù)語(yǔ)“區(qū)”定義為具有至少一種可鑒定結(jié)構(gòu)、功能或特性的靶核酸的一部分。區(qū)段在靶核酸的區(qū)中?！皡^(qū)段”定義為靶核酸中區(qū)的更小部分或次級(jí)部分。本發(fā)明所用“位點(diǎn)”定義為靶核酸中的位置。
在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與唐氏綜合征基因的天然反義序列結(jié)合并調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因(SEQ ID NO :1-3)的表達(dá)和/或功能。反義序列的實(shí)例包括SEQ ID NOS 4-30。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與唐氏綜合征基因多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段結(jié)合并調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因的表達(dá)和/或功能。區(qū)段包含唐氏綜合征基因有義或反義多核苷酸的至少五個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸對(duì)唐氏綜合征基因的天然反義序列有特異性，其中寡核苷酸與唐氏綜合征基因的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因的表達(dá)和 /或功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物包含SEQ ID NOS :7- 所示序列，利用例如 PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、較短片段或較長(zhǎng)片段、修飾鍵等。修飾鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物。可與本發(fā)明的修飾寡核苷酸的糖或糖類(lèi)似物部分連接的磷衍生物(或修飾磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、烷基磷酸酯、 鏈烷磷酸酯、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類(lèi)似物的制備和將它們整合入核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸本身亦是已知的，不必在此贅述。如本領(lǐng)域所知，由于翻譯起始密碼子一般是5' -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中；在對(duì)應(yīng)的DNA分子中是5' -ATG)，故翻譯起始密碼子也稱(chēng)為“AUG密碼子”、“起始密碼子”或 “AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有RNA序列為5' -GUG、5' -UUG或5' -CUG的翻譯起始密碼子；已表明5' -AUA、5' -ACG和5' -CUG在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語(yǔ)“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可包括多種密碼子序列，但是在所有情況下起始氨基酸通常為甲硫氨酸(在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有兩個(gè)以上的備選起始密碼子，在特定細(xì)胞類(lèi)型或組織中或在特定系列條件下可優(yōu)先將任一個(gè)用于翻譯起始。在本發(fā)明的情況下，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”是指體內(nèi)用于起始轉(zhuǎn)錄自編碼唐氏綜合征基因的基因的mRNA翻譯的一個(gè)或多個(gè)密碼子，而不考慮這種密碼子的序列?；虻姆g終止密碼子(或“終止密碼子”)可具有三種序列即5' -UAA、5' -UAG和 5 ‘ -UGA (對(duì)應(yīng)的 DNA 序列分別是 5 ‘ -TAA、5 ‘ -TAG 和 5 ‘ -TGA)之一。術(shù)語(yǔ)“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”是指這類(lèi)mRNA或基因的一部分，其包含在任何方向(即5'或3')上自翻譯起始密碼子起的約25-約50個(gè)連續(xù)核苷酸。同樣地，術(shù)語(yǔ)“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”是指這類(lèi)mRNA或基因的一部分，其包含在任何方向(即5'或3')上自翻譯終止密碼子起的約25-約50個(gè)連續(xù)核苷酸。因此， “起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或翻譯終止密碼子區(qū))均為可用本發(fā)明的反義化合物有效靶向的區(qū)。本領(lǐng)域已知可讀框(ORF)或“編碼區(qū)”是指翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)，亦即可有效靶向的區(qū)。在本發(fā)明的情況下，靶區(qū)是包含基因可讀框(ORF)的翻譯起始密碼子或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)。另一個(gè)靶區(qū)包含5'非翻譯區(qū)(5' UTR)，本領(lǐng)域中已知其是指在5'方向上從翻譯起始密碼子開(kāi)始的mRNA部分，因此包含mRNA在5'加帽位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上的對(duì)應(yīng)核苷酸)。又一個(gè)靶區(qū)包含3'非翻譯區(qū)(3‘ UTR)，本領(lǐng)域中已知其是指在3 ‘方向上從翻譯終止密碼子開(kāi)始的mRNA部分，因此包含mRNA在翻譯終止密碼子和3'末端之間的核苷酸(或基因上的對(duì)應(yīng)核苷酸)。mRNA的5'加帽位點(diǎn)含有與mRNA 的5'-最末端殘基通過(guò)5' -5'三磷酸酯鍵連接的N7-甲基化鳥(niǎo)苷殘基。mRNA的5'帽區(qū)被認(rèn)為包括5'帽子結(jié)構(gòu)本身以及鄰近加帽位點(diǎn)的前50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)靶區(qū)是5'帽區(qū)。雖然一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物被直接翻譯，但是多數(shù)包含一個(gè)或多個(gè)稱(chēng)為“內(nèi)含子” 的區(qū)，這些區(qū)在轉(zhuǎn)錄物翻譯之前從轉(zhuǎn)錄物上切下。剩余(因此被翻譯)的區(qū)被稱(chēng)為“外顯子”，被剪接在一起形成連續(xù)的mRNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在異常剪接涉及疾病或特定剪接產(chǎn)物的過(guò)度產(chǎn)生涉及疾病的情況下，靶向剪接位點(diǎn)(即內(nèi)含子-外顯子連接點(diǎn)或外顯子-內(nèi)含子連接點(diǎn))特別有用。因重排或缺失引起的異常融合連接點(diǎn)是靶位點(diǎn)的另一個(gè)實(shí)施方案。通過(guò)兩個(gè)(或更多個(gè))mRNA的剪接加工從不同基因來(lái)源產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱(chēng)為 “融合轉(zhuǎn)錄物”。利用靶向例如DNA或前mRNA的反義化合物可有效靶向內(nèi)含子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)結(jié)合， 并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與天然反義多核苷酸結(jié)合，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸與有義多核苷酸結(jié)合，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。可變RNA轉(zhuǎn)錄物可產(chǎn)生自DNA的相同基因組區(qū)。這些可變轉(zhuǎn)錄物通常稱(chēng)為“變體”。 更具體而言，“前mRNA變體”是產(chǎn)生自相同基因組DNA的轉(zhuǎn)錄物，與其它產(chǎn)生自相同基因組 DNA的轉(zhuǎn)錄物在它們的起始或終止位置方面不同，并同時(shí)含有內(nèi)含子和外顯子序列。當(dāng)在剪接過(guò)程中切除一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)或其部分時(shí)，前mRNA變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體是經(jīng)加工的前mRNA變體，每個(gè)獨(dú)特的前mRNA變體由于剪接必定總是產(chǎn)生獨(dú)特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱(chēng)為“可變剪接變體”。如果未發(fā)生前mRNA變體的剪接，那么前mRNA變體與mRNA變體相同?？赏ㄟ^(guò)利用開(kāi)始或終止轉(zhuǎn)錄的可變信號(hào)產(chǎn)生變體。前mRNA和mRNA可具有多于一個(gè)的起始密碼子或終止密碼子。產(chǎn)生自利用可變起始密碼子的前mRNA或mRNA的變體稱(chēng)為該前mRNA或mRNA的“可變起始變體”。利用可變終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物稱(chēng)為該前mRNA或 mRNA的“可變終止變體”。一種具體類(lèi)型的可變終止變體是“polyA變體”，其中產(chǎn)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生自轉(zhuǎn)錄機(jī)器對(duì)“polyA終止信號(hào)”之一的可變選擇，從而產(chǎn)生在獨(dú)特的polyA位點(diǎn)終止的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明的情況下，本文所述變體類(lèi)型也是靶核酸的實(shí)施方案。靶核酸上反義化合物與之雜交的部位定義為活性反義化合物靶向的靶區(qū)的長(zhǎng)度為至少5個(gè)核苷酸的部分。雖然本文闡述了某些示例性靶區(qū)段的具體序列，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到， 這些用于闡明和描述本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實(shí)施方案。根據(jù)此公開(kāi)內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定其它靶區(qū)段。長(zhǎng)度5-100個(gè)核苷酸、包含選自說(shuō)明性靶區(qū)段中的一段至少五( 個(gè)連續(xù)核苷酸的靶區(qū)段被認(rèn)為也適合靶向。靶區(qū)段可包含含有說(shuō)明性靶區(qū)段之一的5'末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列(剩余核苷酸為同一 DNA或RNA的連續(xù)序列段，以緊接靶區(qū)段的5'末端上游開(kāi)始，并持續(xù)直到該DNA或RNA含有約5-約100個(gè)核苷酸)。同樣，靶區(qū)段由包含說(shuō)明性靶區(qū)段之一的3'末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列表示(剩余核苷酸是同一 DNA 或RNA的連續(xù)序列段，以緊接靶區(qū)段的3'末端下游開(kāi)始，并持續(xù)直到該DNA或RNA含有約 5-約100個(gè)核苷酸)。備有本文所述靶區(qū)段的本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在無(wú)過(guò)度實(shí)驗(yàn)的情況下鑒定其它靶區(qū)段。只要已鑒定了一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)，便選擇與靶標(biāo)充分互補(bǔ)(即足夠充分并以足夠特異性雜交)的反義化合物，以得到所需要的效果。在本發(fā)明實(shí)施方案中，寡核苷酸與特定靶標(biāo)的反義鏈結(jié)合。寡核苷酸長(zhǎng)度為至少 5個(gè)核苷酸，可以對(duì)其進(jìn)行合成使每個(gè)寡核苷酸靶向重疊序列，從而合成的寡核苷酸覆蓋靶多核苷酸的完整長(zhǎng)度。靶標(biāo)還包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)反義寡核苷酸靶向特定核酸。反義化合物靶向特定核酸是多步驟過(guò)程。該過(guò)程通常始于鑒定待調(diào)節(jié)功能的核酸序列。這可以是例如其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或轉(zhuǎn)錄自該基因的mRNA)，或者非編碼多核苷酸，例如非編碼 RNA (ncRNA)?？蓪NA分為(1)被翻譯成蛋白質(zhì)的信使RNA (mRNA)和⑵不編碼蛋白的 RNA(ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反義轉(zhuǎn)錄物及其它含有高密度的終止密碼子并缺乏任何大范圍“可讀框”的轉(zhuǎn)錄單位(TU)。許多ncRNA似乎起始于編碼蛋白的基因座的3'非翻譯區(qū)(3' UTR)的起始位點(diǎn)。ncRNA通常很少，且已由FANTOM公司測(cè)序的ncRNA中至少一半似乎未被聚腺苷酸化。由于顯而易見(jiàn)的原因，大多數(shù)研究人員已聚焦于經(jīng)加工并輸出到胞質(zhì)中的聚腺苷酸化mRNA。最近表明，非聚腺苷酸化的核RNA類(lèi)別可能非常大，且許多這樣的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生自基因間區(qū)。ncRNA可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制是通過(guò)與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對(duì)。可將通過(guò)堿基配對(duì)起作用的RNA分為(1)順式編碼RNA，其在相同基因位置但在與它們作用的RNA的相對(duì)鏈上被編碼，因此與其靶標(biāo)具有完全互補(bǔ)性，和( 反式編碼RNA，其在不同于它們起作用的RNA的染色體位置上被編碼，且通常不具有與其靶標(biāo)進(jìn)行完全堿基配對(duì)的潛力。雖然不希望受理論的束縛，但是通過(guò)本文所述反義寡核苷酸對(duì)反義多核苷酸的干擾可改變相應(yīng)有義信使RNA的表達(dá)。然而，這種調(diào)節(jié)可以是不一致的(反義敲減引起信使 RNA增加)或一致的(反義敲減引起伴隨的信使RNA減少)。在這些情況下，反義寡核苷酸可靶向反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，以引起其敲減或隔離?？梢韵嗤绞桨邢蚓幋a或非編碼反義序列，且任一種均能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)的有義轉(zhuǎn)錄物-以一致或不一致的方式。用以鑒定新的針對(duì)靶標(biāo)使用的寡核苷酸的策略可基于通過(guò)反義寡核苷酸或調(diào)節(jié)所需靶標(biāo)的任何其它方法敲減反義RNA轉(zhuǎn)錄物。策略1 在不一致的調(diào)節(jié)情況中，反義轉(zhuǎn)錄物的敲減提高常規(guī)(有義)基因的表達(dá)。如果后者的基因編碼已知或推定的藥物靶標(biāo)，那么可想象得到，其反義對(duì)應(yīng)物的敲減可模仿受體激動(dòng)劑或酶刺激劑的作用。策略2 在一致調(diào)節(jié)的情況中，可同時(shí)敲減反義和有義轉(zhuǎn)錄物，從而實(shí)現(xiàn)常規(guī)(有義)基因表達(dá)的協(xié)同性減少。例如，如果利用反義寡核苷酸完成敲減，則可利用該策略應(yīng)用一個(gè)靶向有義轉(zhuǎn)錄物的反義寡核苷酸和另一個(gè)靶向相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的反義寡核苷酸，或者應(yīng)用同時(shí)靶向重疊的有義和反義轉(zhuǎn)錄物的單個(gè)有效的對(duì)稱(chēng)反義寡核苷酸。按照本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)及與靶核酸的至少一部分雜交并調(diào)節(jié)其功能的其它寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、類(lèi)DNA、類(lèi) RNA及其混合物，或者可以是這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、 環(huán)狀或發(fā)夾狀的寡聚化合物，并可含有結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或端部凸起、錯(cuò)配或環(huán)。按常規(guī)制備線性反義化合物，但可將其連接或另外制備成環(huán)狀和/或分支的反義化合物。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈或者具有足夠的自我互補(bǔ)性以允許雜交和形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈。兩條鏈可內(nèi)部連接留下游離的3' 或5'末端，或者可連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可含有5'或者3'末端的突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。雙鏈化合物任選地可包括末端的突出端。其它修飾可包括與末端之一、選定核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵之一連接的綴合基。或者，兩條鏈可通過(guò)非核酸部分或連接基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsRNA可呈自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子的形式，該發(fā)夾型分子自身對(duì)折形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過(guò)在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsRNA發(fā)夾來(lái)實(shí)現(xiàn)，但是在某些實(shí)施方案中，基因表達(dá)或功能被上調(diào)。當(dāng)由兩條鏈形成或由呈自身對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子的形式的單鏈形成時(shí)，兩條鏈(單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick方式進(jìn)行堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。一旦被引入系統(tǒng)，本發(fā)明化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以影響靶核酸的切割或其它修飾，或可通過(guò)基于占用的機(jī)制起作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可被描述為“類(lèi)DNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-脫氧糖，且通常具有T而非U堿基)或 “類(lèi)RNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-羥基或2'-修飾糖，且通常具有U而非T堿基)。 核酸螺旋可采取多于一種類(lèi)型的結(jié)構(gòu)，最常見(jiàn)的是A型和B型。一般認(rèn)為，具有類(lèi)似B型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類(lèi)DNA”，而那些具有類(lèi)似A型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類(lèi)RNA”。在一些(嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可同時(shí)包含A型區(qū)和B型區(qū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所需寡核苷酸或反義化合物包括以下的至少一種反義 RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、含修飾鍵的反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾 RNA (siRNA)；微小干擾RNA(miRNA)；小時(shí)序 RNA (stRNA)；或者短發(fā)夾 RNA (shRNA)；小 RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)或其組合。dsRNA還可激活基因表達(dá)，這是一種被稱(chēng)為“小RNA誘導(dǎo)的基因激活”或RNAa的機(jī)制。靶向基因啟動(dòng)子的dsRNA誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活。在人細(xì)胞中利用稱(chēng)為“小激活 RNA” (saRNA)的合成 dsRNA 證實(shí)了 RNAa。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)小雙鏈RNA (dsRNA)(例如小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA))是稱(chēng)為RNA干擾(RNAi)的進(jìn)化保守機(jī)制的引發(fā)劑。RNAi總是引起基因沉默。然而，在緊接的實(shí)施例部分詳述的情況下，表明寡核苷酸提高唐氏綜合征基因多核苷酸及其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsRNA也可作為小激活RNA(saRNA)。雖然不希望受理論的束縛，但通過(guò)靶向基因啟動(dòng)子的序列，saRNA在稱(chēng)為dsRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活(RNAa)的現(xiàn)象中誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文鑒定的“靶區(qū)段”可用于篩選調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因多核苷酸表達(dá)的其它化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”是降低或提高編碼唐氏綜合征基因的核酸分子的表達(dá)且包含與靶區(qū)段互補(bǔ)的至少5個(gè)核苷酸部分的化合物。篩選方法包括下列步驟使編碼有義或天然反義的唐氏綜合征基因多核苷酸的核酸分子的靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，選擇降低或提高編碼唐氏綜合征基因多核苷酸的核酸分子表達(dá)的一種或多種候選調(diào)節(jié)齊U，例如SEQ ID NO :7-24. 一旦表明一種或多種候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如降低或提高) 編碼唐氏綜合征基因多核苷酸的核酸分子的表達(dá)，那么調(diào)節(jié)劑便可用于唐氏綜合征基因多核苷酸功能的進(jìn)一步探索性研究，或用作本發(fā)明的研究、診斷或治療物質(zhì)。靶向天然反義序列調(diào)節(jié)靶基因的功能。例如，唐氏綜合征基因(例如登錄號(hào) NM_101395和NM_004414)。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)是唐氏綜合征基因的反義多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向唐氏綜合征基因多核苷酸的有義和/或天然反義序列 (例如登錄號(hào)NM_101395和NM_004414)、變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、 片段及其互補(bǔ)序列。優(yōu)選所述寡核苷酸是反義分子，所述靶標(biāo)包括反義和/或有義唐氏綜合征基因多核苷酸的編碼區(qū)和非編碼區(qū)。本發(fā)明的靶區(qū)段還可與本發(fā)明的其各自的互補(bǔ)反義化合物結(jié)合，以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。本領(lǐng)域已證實(shí)這類(lèi)雙鏈寡核苷酸部分通過(guò)反義機(jī)制調(diào)節(jié)靶標(biāo)表達(dá)并調(diào)節(jié)翻譯以及RNA加工。此外，可對(duì)雙鏈部分進(jìn)行化學(xué)修飾。例如，已表明，這種雙鏈部分通過(guò)雙鏈體的反義鏈與靶標(biāo)進(jìn)行經(jīng)典雜交而抑制該靶標(biāo)，從而引發(fā)靶標(biāo)的酶促降解。在一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向唐氏綜合征基因多核苷酸(例如登錄號(hào) NM_101395和NM_004414)、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段及互補(bǔ)序列。優(yōu)選所述寡核苷酸是反義分子。按照本發(fā)明的實(shí)施方案，靶核酸分子不只限于唐氏綜合征基因，而是延伸到唐氏綜合征基因分子的任何同種型、受體、同源物等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向唐氏綜合征基因多核苷酸的天然反義序列， 例如，SEQ ID NO :3-6所示多核苷酸及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID NO :7- 所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與唐氏綜合征基因反義序列的核酸序列(包括而不限于與唐氏綜合征基因多核苷酸有關(guān)的非編碼有義和/或反義序列)互補(bǔ)或結(jié)合，并調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與SEQ ID NO :3_6所示的唐氏綜合征基因天然反義序列的核酸序列互補(bǔ)或結(jié)合，并調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因分子的表達(dá)和/或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NOS :7_24的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的序列，并調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因分子的表達(dá)和/或功能。多核苷酸靶標(biāo)包含唐氏綜合征基因，包括其家族成員、唐氏綜合征基因的變體；唐氏綜合征基因的突變體，包括SNP ；唐氏綜合征基因的非編碼序列；唐氏綜合征基因的等位基因；物種變體、片段等。優(yōu)選所述寡核苷酸是反義分子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向唐氏綜合征基因多核苷酸的寡核苷酸包括反義RNA， 干擾RNA (RNAi)，短干擾RNA (siRNA)；微小干擾RNA (miRNA)；小時(shí)序RNA(stRNA)或短發(fā)夾 RNA(shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)或小激活RNA (saRNA)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，靶向唐氏綜合征基因多核苷酸(例如SEQ ID NO :3_6)調(diào)節(jié)這些靶標(biāo)的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，表達(dá)或功能上調(diào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，與對(duì)照相比，表達(dá)或功能下調(diào)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義化合物包含SEQ ID NO :7- 所示序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、較短片段或較長(zhǎng)片段、修飾鍵等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，SEQ ID NO 7~24包含一個(gè)或多個(gè)LNA核苷酸。所需靶核酸的調(diào)節(jié)可以本領(lǐng)域已知的若干方法進(jìn)行。例如，反義寡核苷酸、SiRNA 等。酶核酸分子(例如核酶)是能夠催化多種反應(yīng)中的一種或多種的核酸分子，包括以核苷酸堿基序列特異性方式重復(fù)切割其它分離的核酸分子的能力。這樣的酶核酸分子可用于例如靶向幾乎任何RNA轉(zhuǎn)錄物。因?yàn)樗鼈兊男蛄刑禺愋?，反式切割酶核酸分子顯示作為用于人疾病的治療藥物的前景。酶核酸分子可被設(shè)計(jì)成切割細(xì)胞RNA背景中的特異性RNA靶標(biāo)。這樣的切割事件使 mRNA變得無(wú)功能，使該RNA不表達(dá)蛋白質(zhì)。如此，可選擇性抑制與疾病狀態(tài)有關(guān)的蛋白質(zhì)的合成。通常，具有RNA切割活性的酶核酸首先通過(guò)結(jié)合靶RNA而起作用。這種結(jié)合通過(guò)酶核酸的靶結(jié)合部分而發(fā)生，該靶結(jié)合部分與起切割靶RNA作用的該分子的酶促部分保持得十分靠近。因此，酶核酸首先識(shí)別并接著通過(guò)互補(bǔ)堿基配對(duì)結(jié)合靶RNA，一旦結(jié)合到正確位點(diǎn)，則進(jìn)行酶促作用切割靶RNA。這種靶RNA的策略性切割將破壞其直接合成編碼蛋白的能力。在酶核酸已結(jié)合并切割其RNA靶標(biāo)之后，便從該RNA上釋放出來(lái)，尋找另一個(gè)靶標(biāo)， 并可重復(fù)地結(jié)合并切割新靶標(biāo)。數(shù)種方法例如體外選擇(進(jìn)化)策略已被用于發(fā)展能夠催化例如切割和連接磷酸二酯鍵和酰胺鍵等多種反應(yīng)的新的核酸催化劑。催化活性最優(yōu)的核酶的研發(fā)主要?dú)w因于為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的目的而使用切割RNA 的核酶的任何策略。例如，錘頭核酶在飽和(IOmM)濃度的Mg2+輔因子存在下以約Imin-I 的催化速率(kcat)起作用。已表明人工“RNA連接酶”核酶以約IOOmin-I的速率催化相應(yīng)的自我修飾反應(yīng)。此外，已知具有由DNA組成的底物結(jié)合臂的某些修飾錘頭核酶以接近 IOOmin-I的多倍周轉(zhuǎn)率(multiple turn-over rate)催化RNA切割。最后，用某些核苷酸類(lèi)似物取代錘頭的催化核心內(nèi)的特定殘基得到催化率提升10倍的修飾核酶。這些研究結(jié)果說(shuō)明，核酶可以比大多數(shù)天然自切割核酶體外表現(xiàn)的顯著高的催化速率促進(jìn)化學(xué)轉(zhuǎn)變。因此有可能的是，可優(yōu)化某些自切割核酶的結(jié)構(gòu)以獲得最大的催化活性，或者可產(chǎn)生RNA磷酸二酯切割速率顯著更快的全新的RNA模體。在1987年首次表明，符合“錘頭”模型的RNA催化劑對(duì)RNA底物的分子間切割?；厥誖NA催化劑，并使之與多種RNA分子反應(yīng)，證明了它確實(shí)有催化性。根據(jù)“錘頭”模體設(shè)計(jì)的催化性RNA已被用于通過(guò)在催化性RNA中進(jìn)行適當(dāng)堿基改變以切割特定靶序列來(lái)維持與靶序列的必要堿基配對(duì)。這使得能夠利用催化性RNA切割特定靶序列，并且表明了按照“錘頭”模型設(shè)計(jì)的催化性RNA可能體內(nèi)切割特定的底物RNA。RNA干擾(RNAi)已成為調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的有力工具。 該方法需要利用表達(dá)質(zhì)?；虿《竞捅患庸こ蓅iRNA的小發(fā)夾RNA的編碼序列將小干擾 RNA (siRNA)作為RNA自身或DNA遞送。該系統(tǒng)能夠?qū)⑶皊iRNA有效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中它們有活性，并允許使用受調(diào)節(jié)和組織特異的啟動(dòng)子進(jìn)行基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸或反義化合物包含核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體，或其模擬物、嵌合體、類(lèi)似物或同源物。該術(shù)語(yǔ)包括由天然存在的核苷酸、糖和共價(jià)核苷間(骨架)鍵組成的寡核苷酸以及起類(lèi)似作用的具有非天然存在部分的寡核苷酸。由于所需性質(zhì)，例如細(xì)胞吸收增加、對(duì)靶核酸的親和力提高以及在核酸酶存在下穩(wěn)定性增強(qiáng)，因此通常需要優(yōu)于天然形式的這類(lèi)修飾或取代的寡核苷酸。按照本發(fā)明，寡核苷酸或“反義化合物”包括反義寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類(lèi)似物或同源物)、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA和與靶核酸的至少一部分雜交并調(diào)節(jié)其功能的其它寡聚化合物。因此，它們可以是DNA、RNA、類(lèi)DNA、類(lèi)RNA或其混合物， 或者可以是這些中的一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾狀的寡聚化合物，并可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或端部凸起、錯(cuò)配或環(huán)。按常規(guī)制備線性反義化合物，但可將其連接或另外制備成環(huán)狀和/或分支狀。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈或者具有足夠的自我互補(bǔ)性以允許雜交和形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈。兩條鏈可內(nèi)部連接留下游離的3'或5'末端，或者可連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含5'或者3'末端的突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。 雙鏈化合物任選可包括末端上的突出端。其它修飾可包括連接至末端之一、選定核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵之一的綴合基?；蛘撸瑑蓷l鏈可通過(guò)非核酸部分或連接基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsRNA可呈自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子的形式，該發(fā)夾型分子自身對(duì)折形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的?；虮磉_(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過(guò)在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsRNA發(fā)夾來(lái)實(shí)現(xiàn)。當(dāng)由兩條鏈形成或由呈自身對(duì)折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子形式的單鏈形成時(shí)，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick 方式進(jìn)行堿基配對(duì)的互補(bǔ)RNA鏈。一旦被引入系統(tǒng)，本發(fā)明化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以影響靶核酸的切割或其它修飾，或者可通過(guò)基于占用的機(jī)制起作用。通常，核酸(包括寡核苷酸) 可被描述為“類(lèi)DNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-脫氧糖，且通常具有T而非U堿基)或 “類(lèi)RNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-羥基或2'-修飾糖，且通常具有U而非T堿基)。 核酸螺旋可采取多于一種類(lèi)型的結(jié)構(gòu)，最常見(jiàn)的是A型和B型。一般認(rèn)為，具有類(lèi)似B型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類(lèi)DNA”，而那些具有類(lèi)似A型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類(lèi)RNA”。在一些(嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可同時(shí)包含A型區(qū)和B型區(qū)。本發(fā)明的反義化合物可包含長(zhǎng)度為約5-約80個(gè)核苷酸(即約5-約80個(gè)連接核苷)的反義部分。這是指反義化合物的反義鏈或部分的長(zhǎng)度。換言之，本發(fā)明的單鏈反義化合物包含約5-約80個(gè)核苷酸，本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如dsRNA)包含長(zhǎng)度為約 5-約80個(gè)核苷酸的有義和反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解的是，這包括以下長(zhǎng)度或其中任何范圍的反義部分:5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79 或 80 個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有長(zhǎng)度為10-50個(gè)核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解的是，這包括具有以下長(zhǎng)度或其中任何范圍的反義部分的寡核苷酸10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸長(zhǎng)度為15個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物或寡核苷酸化合物具有長(zhǎng)度為12或 13-30個(gè)核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解的是，這包括具有以下長(zhǎng)度或其中任何范圍的反義部分的反義化合物12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、28、四或30個(gè)核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括變體，其中在所述化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上存在不同堿基。例如，如果第一個(gè)核苷酸是腺苷，則可產(chǎn)生在該位置含有胸苷、鳥(niǎo)苷或胞苷的變體。這可在反義或dsRNA化合物的任何位置上完成。然后，利用本文所述方法檢驗(yàn)這些化合物，以測(cè)定其抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，反義化合物和靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約 40%-約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60% -約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70% -約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80% -約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，反義寡核苷酸(例如SEQ ID NO :4_30所示核酸分子)包含一個(gè)或多個(gè)取代或修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，核苷酸被鎖定核酸(LNA)取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向與唐氏綜合征基因有關(guān)的編碼和/或非編碼序列的有義和/或反義核酸分子的一個(gè)或多個(gè)區(qū)和SEQ ID NO :1-6所示序列。寡核苷酸還靶向SEQ ID NO 1-6的重疊區(qū)。本發(fā)明的某些寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。在本發(fā)明的情況下，“嵌合寡核苷酸”或 “嵌合體”是含有兩個(gè)以上化學(xué)上不同的區(qū)(每個(gè)區(qū)由至少一個(gè)核苷酸組成)的寡核苷酸。 這些寡核苷酸通常包含至少一個(gè)賦予一種或多種有益性質(zhì)(例如核酸酶抗性增加、細(xì)胞吸收增加、靶結(jié)合親和力提高)的修飾核苷酸區(qū)，以及作為能夠切割RNA:DNA或RNA:RNA雜合體的酶的底物的區(qū)。舉例來(lái)說(shuō)，RNA酶H是細(xì)胞內(nèi)切核酸酶，它切割RNA:DNA雙鏈體的RNA 鏈。因此，RNA酶H的活化導(dǎo)致對(duì)RNA靶標(biāo)的切割，從而極大地提高基因表達(dá)的反義調(diào)節(jié)的有效性。因此，比起與相同靶區(qū)雜交的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸，當(dāng)使用嵌合寡核苷酸時(shí)， 通常可利用較短的寡核苷酸獲得相似結(jié)果。可按常規(guī)通過(guò)凝膠電泳和必要時(shí)通過(guò)本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)檢測(cè)RNA靶標(biāo)的切割。在一個(gè)實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸包含經(jīng)修飾以提高靶結(jié)合親和力的至少一個(gè)區(qū)，并通常包含用作RNA酶H底物的區(qū)。按常規(guī)通過(guò)測(cè)量寡核苷酸/靶標(biāo)對(duì)的Tm來(lái)測(cè)定寡核苷酸對(duì)其靶標(biāo)(這種情況下為編碼ras的核酸)的親和力，Tm是寡核苷酸和靶標(biāo)解離時(shí)的溫度；解離通過(guò)分光光度法檢測(cè)。Tm越高，寡核苷酸對(duì)靶標(biāo)的親和力越大。本發(fā)明的嵌合反義化合物可形成為兩種或更多種上述寡核苷酸、修飾寡核苷酸、 寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的混合結(jié)構(gòu)。這樣的化合物在本領(lǐng)域中也稱(chēng)為雜合體或 gapmer。教導(dǎo)制備這種雜合體結(jié)構(gòu)的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，013，830、 5，149，797,5, 220，007,5, 256，775,5, 366，878,5, 403，711,5, 491，133,5, 565，350、5，623，065,5, 652，355,5, 652，356和5，700，922，上述各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被修飾的寡核苷酸區(qū)包含至少一個(gè)在糖的2'位置被修飾的核苷酸，最優(yōu)選2' -0-烷基、2' -0-烷基-0-烷基或2'-氟-修飾核苷酸。在其它實(shí)施方案中，RNA修飾包括在RNA 3'末端的嘧啶、脫堿基殘基或反向堿基的核糖上的2'-氟、 2'-氨基和2' 0-甲基修飾。這種修飾被常規(guī)整合到寡核苷酸中，已經(jīng)表明這些寡核苷酸針對(duì)給定靶標(biāo)具有比2'-脫氧寡核苷酸高的Tm(即較高的靶結(jié)合親和力)。這種親和力提高的作用極大地增強(qiáng)RNAi寡核苷酸對(duì)基因表達(dá)的抑制。RNA酶H是細(xì)胞內(nèi)切核酸酶， 它切割RNA DNA雙鏈體的RNA鏈；因此該酶的活化導(dǎo)致對(duì)RNA靶標(biāo)的切割，從而可極大地提高RNAi抑制的有效性?？砂闯Ｒ?guī)通過(guò)凝膠電泳證實(shí)RNA靶標(biāo)的切割。在另一個(gè)實(shí)施方案中，還對(duì)嵌合寡核苷酸進(jìn)行修飾以提高核酸酶抗性。細(xì)胞含有多種可降解核酸的外切核酸酶和內(nèi)切核酸酶。已表明許多核苷酸和核苷修飾使整合有它們的寡核苷酸比天然寡脫氧核苷酸對(duì)核酸酶消化更具抗性。按常規(guī)通過(guò)將寡核苷酸與細(xì)胞提取物或分離的核酸酶溶液一起孵育，隨時(shí)間變化測(cè)量余留的完整寡核苷酸的含量(一般通過(guò)凝膠電泳)，來(lái)測(cè)量核酸酶抗性。已被修飾以提高其核酸酶抗性的寡核苷酸保持完整的時(shí)間比未修飾寡核苷酸更長(zhǎng)。 已經(jīng)證明多種寡核苷酸修飾提高或賦予核酸酶抗性。目前更優(yōu)選含有至少一個(gè)硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸。在某些情況下，提高靶結(jié)合親和力的寡核苷酸修飾還能夠獨(dú)立地提高核酸酶抗性。一些所需的修飾可參見(jiàn) De Mesmaeker 等(1995) Acc. Chem. Res. ,28 :366_374。預(yù)期用于本發(fā)明的一些寡核苷酸的具體實(shí)例包括含有修飾骨架的寡核苷酸，修飾骨架例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵。大多數(shù)為具有硫代磷酸酯骨架和具有雜原子骨架的寡核苷酸，特別是 CH2—NH—0—CH2、CH, —N (CH3) —0—CH2 [稱(chēng)為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架]、 CH2—0—N (CH3) —CH2、CH2-N (CH3) —N (CH3) —CH2 和 0—N (CH3) —CH2—CH2 骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示為 0—P—0—CH。還優(yōu)選 De Mesmaeker 等(1995) Acc. Chem. Res. 28 366-374所披露的酰胺骨架。還優(yōu)選具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Summerton和狗11吐，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，034，506)。在其它實(shí)施方案中，例如寡核苷酸的肽核酸(PNA)骨架、 磷酸二酯骨架被聚酰胺骨架(核苷酸與聚酰胺骨架的氮雜氮原子直接或間接結(jié)合)置換。 寡核苷酸還可包含一個(gè)或多個(gè)取代糖部分。寡核苷酸在2'位置包含下述基團(tuán)之一 0H、 SH、SCH3、F、OCN、0CH30CH3、0CH30 (CH2) nCH3, 0 (CH2) nNH2 或 0_)nCH3，其中 η 為 1-約 10 ；Cl-ClO的低級(jí)烷基、烷氧基烷氧基、取代低級(jí)烷基、烷芳基或芳烷基；Cl ；Br ；CN ；CF3 ； 0CF3 ；0—、S—或 N-烷基；0—、S—或 N-烯基；S0CH3 ；S02CH3 ；0Ν02 ；Ν02 ；Ν3 ；ΝΗ2 ；雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代甲硅烷基；RNA切割基；報(bào)道基；嵌入劑；用于改進(jìn)寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)；或者用于改進(jìn)寡核苷酸的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)和其它具有類(lèi)似性質(zhì)的取代基。修飾包括2'-甲氧基乙氧基[2' -0-CH2CH20CH3, 亦稱(chēng)為'-0- -甲氧乙基)]。其它修飾包括2'-甲氧基O' -0-CH3),2'-丙氧基 (2' -0CH2CH2CH3)和2'-F)。也可在寡核苷酸的其它位置上產(chǎn)生類(lèi)似修飾，尤其是3'末端核苷酸的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸還可具有糖模擬物，例如取代呋喃戊糖基的環(huán)丁基。此外或備選地，寡核苷酸還可包含核堿基(本領(lǐng)域中通常簡(jiǎn)稱(chēng)為“堿基”)修飾或取代。本文所用“未修飾”或“天然”核苷酸包含腺嘌呤(A)、鳥(niǎo)嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括僅罕見(jiàn)或短暫存在于天然核酸中的核苷酸，例如次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶、尤其5-甲基胞嘧啶(亦稱(chēng)為5-甲基-2'脫氧胞嘧啶，且本領(lǐng)域通常稱(chēng)為5-Me-C)、5_羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基(gentobiosyl) HMC，以及合成核苷酸，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、 2_(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它雜取代烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮鳥(niǎo)嘌呤、7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和2，6-二氨基嘌呤?？砂绢I(lǐng)域已知的“通用”堿基，例如肌苷。已表明5-Me-C取代提高核酸雙鏈體穩(wěn)定性 0. 6-1. 20C (Sanghvi, Y. S.，載于 Crooke，S. Τ.和 Lebleu，B.，主編，Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993,H 276-278 M ) ^glllWM 基取代。本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾涉及將提高寡核苷酸的活性或細(xì)胞攝取的一個(gè)或多個(gè)部分或綴合物與寡核苷酸化學(xué)連接。這樣的部分包括但不限于脂部分(例如膽固醇部分、膽留烯基部分)、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇、巰基膽固醇)、脂肪鏈(例如十二烷二醇(dodecandiol)或i^一基殘基、磷脂例如二 -十六基-rac-甘油或1，2_ 二 _0_十六基-rac-甘油基-3-H-膦酸三乙銨)、聚胺或聚乙二醇鏈或金剛烷乙酸。包含親脂部分的寡核苷酸和用于制備這種寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，138，045、 5，218，105 和 5，459，255。給定寡核苷酸的所有位置不必一律被修飾，實(shí)際上可將不止一種上述修飾整合入單個(gè)寡核苷酸或甚至寡核苷酸的單個(gè)核苷中。本發(fā)明還包括作為上文定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子與包括但不限于以下的另一部分綴合 脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、糖類(lèi)、脂質(zhì)或聚烴化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)至IJ，可將這些分子與在糖、堿基或磷酸基的若干位置上包含核酸分子的任何核苷酸的一個(gè)或多個(gè)連接。本發(fā)明使用的寡核苷酸可合宜地按常規(guī)通過(guò)熟知的固相合成技術(shù)制備。用于這種合成的設(shè)備由包括Applied Biosystems在內(nèi)的若干供應(yīng)商出售。也可利用適于這種合成的任何其它方法；寡核苷酸的實(shí)際合成完全為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所掌握。同樣公知的是，利用類(lèi)似技術(shù)制備其它寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。同樣公知的是，利用類(lèi)似技術(shù)及市售的修飾amidite和可控孔度玻璃(controlled-pore glass, CPG)產(chǎn)品， 例如生物素、熒光素、吖啶或補(bǔ)骨脂素修飾的amidite和/或CPG (可獲自Glen Research, Sterling VA)，以合成熒光標(biāo)記寡核苷酸、生物素化寡核苷酸或其它修飾寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，使用修飾例如使用LNA單體以提高由例如M0E、ANA、FANA、PS等現(xiàn)有化學(xué)物質(zhì)組成的寡核苷酸的作用的效能、特異性和持續(xù)時(shí)間并拓寬寡核苷酸的給藥途徑。 這可通過(guò)用LNA單體取代現(xiàn)行寡核苷酸中的一些單體來(lái)實(shí)現(xiàn)。LNA修飾寡核苷酸可具有與母體化合物相似的大小，或者可較大或優(yōu)選較小。正是這類(lèi)LNA修飾寡核苷酸含有少于約 70%、更優(yōu)選少于約60%、最優(yōu)選少于50%的LNA單體，且它們的大小為約5_25個(gè)核苷酸， 更優(yōu)選為約12-20個(gè)核苷酸。修飾寡核苷酸骨架包括但不限于具有正常3' -5'鍵的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'烯化膦酸酯和手性膦酸酯在內(nèi)的甲基膦酸酯和其它烷基膦酸酯、亞膦酸酯、包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在內(nèi)的氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷基磷酸酯(boranophosphate)、它們的2' -5'連接的類(lèi)似物，以及具有反向極性的修飾寡核苷酸骨架，其中相鄰的核苷單元對(duì)為3' -5'連接至5' -3'或2' -5'連接至5' -2'。還包括多種鹽、混鹽和游離酸形式。教導(dǎo)制備上述含磷鍵的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，687，808、 4，469，863,4，476，301,5，023，243,5，177，196,5，188，897,5，264，423,5，276，019, 5，278，302,5, 286，717,5, 321，131,5, 399，676,5, 405，939,5, 453，496,5, 455，233、 5，466，677,5, 476，925,5, 519，126,5, 536，821,5, 541，306,5, 550，111,5, 563，253、 5，571，799,5, 587，361和5，625，050，所述每個(gè)專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本文不含磷原子的修飾寡核苷酸骨架具有由下述鍵組成的骨架短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵或者一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)核苷間鍵。這些包括具有嗎啉代鍵(部分由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、 亞砜和砜骨架；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙?；羌?；亞甲基甲酰乙?；土虼柞Ｒ阴；羌埽缓溝┑墓羌?；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基胼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架以及具有混N、0、S和CH2成分的其它骨架。教導(dǎo)制備上述寡核苷的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，034，506、 5，166，315,5，185，444,5，214，134,5，216，141,5，235，033,5，264，562,5，264，564, 5，405，938,5，434，257,5，466，677,5，470，967,5，489，677,5，541，307,5，561，225, 5，596，086,5，602，240,5，610，289,5，602，240,5，608，046,5，610，289,5，618，704, 5，623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437 和 5，677，439，各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在其它寡核苷酸模擬物中，核苷酸單元的糖和核苷間鍵(即骨架)均被新的基團(tuán)所取代。維持堿基單元以與合適的核酸靶化合物雜交。一種這樣的寡聚化合物，即已表明具有優(yōu)異雜交性質(zhì)的寡核苷酸模擬物稱(chēng)為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架、特別是氨基乙基甘氨酸骨架取代。核堿基被保留，并直接或間接與骨架的酰胺部分的氮雜氮原子結(jié)合。教導(dǎo)制備PNA化合物的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，539，082,5, 714，331和5，719，262，上述專(zhuān)利各通過(guò)引用結(jié)合到本文中。PNA化合物的更多教導(dǎo)可參見(jiàn) Nielsen 等(1991) Science 254，1497-1500。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有雜原子骨架的寡核苷，特別是-CH2-NH-0-CH2-、稱(chēng)為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架的_CH2_N(C H3) -0-CH2-、-CH2-0-N (CH3) -CH2-、_CH2N (CH3) -N (CH3) CH2-和 _0_N (CH3) -CH2-CH2-(其中天然磷酸二酯骨架表示為上文引用的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，489，677的-0-P-0-CH2-)以及上文引用的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，602，240的酰胺骨架。還有具有上文引用的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，034，506的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾寡核苷酸還可包含一個(gè)或多個(gè)取代糖部分。寡核苷酸在2'位置包含下述基團(tuán)之一 0H ；F ；0-、S-或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或者0烷基-0-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C到CO烷基(C to CO alkyl)或C2到
30CO 烯基和炔基(C2 to CO alkenyl and alkynyl)。特別是 0 (CH2) n0mCH3、0 (CH2) n，0CH3、 0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0(CH2)n0NH2 和 0(CH2n0N(CH2)nCH3) 2，其中 η 和 m 可以是 1-約 10。其它寡核苷酸在2'位置包含下列基團(tuán)之一C到CO (C to CO)、低級(jí)烷基、取代低級(jí)烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3、0CN, Cl、Br、CN、CF3、0CF3、S0CH3、 S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA切割基、報(bào)道基、嵌入劑、用于改進(jìn)寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)或用于改進(jìn)寡核苷酸的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)以及其它具有類(lèi)似性質(zhì)的取代基。修飾包括2'-甲氧基乙氧基0' -0-CH2CH20CH3，亦稱(chēng)為2' _0_(2-甲氧乙基)或2‘ -Μ0Ε)，即一種烷氧基烷氧基。 另一種修飾包括下文實(shí)施例所述的2' -二甲基氨基氧基乙氧基(即0(Cffi)20N(CH;3)2基， 亦稱(chēng)為2' -DMA(E)和2' -二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域亦稱(chēng)為2' _0_ 二甲基氨基乙氧基乙基或 2 ‘ -DMAE0E)，即 2 ‘ -0-CH2—0-CH2-N (CH2) 2。其它修飾包括2'-甲氧基O' -0CH3) ,2'-氨基丙氧基O' -0CH2CH2CH2NH2) 和2' -F)。類(lèi)似修飾也可在寡核苷酸的其它位置上進(jìn)行，尤其是3'末端核苷酸的糖的3'位置或2' -5'連接的寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸還可具有糖模擬物，例如取代呋喃戊糖基糖的環(huán)丁基部分。教導(dǎo)制備這種修飾糖結(jié)構(gòu)的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)4，981，957,5, 118，800,5, 319，080,5, 359，044、 5，393，878,5，446，137,5，466，786,5，514，785,5，519，134,5，567，811,5，576，427, 5，591，722,5,597，909,5,610，300,5,627，053,5,639，873,5,646，265,5,658，873、 5，670，633和5，700，920，各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。寡核苷酸還可包含核堿基(本領(lǐng)域中通常簡(jiǎn)稱(chēng)為“堿基”)修飾或取代。本文所用 “未修飾”或“天然”核苷酸包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥(niǎo)嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶 (T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括其它合成和天然核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶 (5-me-C) ；5-羥甲基胞嘧啶；黃嘌呤；次黃嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的6-甲基衍生物和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的2-丙基衍生物和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶；2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶； 6-氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-鹵基、8-氨基、 8-巰基、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤；5-鹵代尤其5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鳥(niǎo)嘌呤(7-methylquanine)和7_甲基腺嘌呤； 8-氮鳥(niǎo)嘌呤和8-氮腺嘌呤；7-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和7-脫氮腺嘌呤以及3-脫氮鳥(niǎo)嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。此外，核苷酸包括美國(guó)專(zhuān)利號(hào)3，687，808披露的核苷酸、“The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering，，，第 858-859 頁(yè)，Kroschwitz, J.I.主編，John Wiley & Sons，1990 披露的核苷酸；Englisch 等，"Angewandle Chemie，國(guó)際版”，1991，30，第 613 頁(yè)披露的核苷酸和 Sanghvi，Y. S.，第 15 章，“Antisense Research and Applications，，，第 289—302 頁(yè)，Crooke, S. Τ.禾口 Lebleu，B. ea. ，CRC Press, 1993 披露的核苷酸。這些核苷酸中的一些尤其可用于提高本發(fā)明寡聚化合物的結(jié)合親和力。這些包括5-取代嘧啶、6-氮嘧啶和N-2、N-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、 5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶取代提高核酸雙鏈體穩(wěn)定性 0. 6-1. 2°C (Sanghvi,Y. S. >Crooke,S. Τ.禾口 Lebleu,B.,主編，‘Antisense Research andApplications'，CRC Press, Boca Raton，1993，第 276-278 頁(yè))，且是現(xiàn)有的堿基取代，更尤其當(dāng)與2' -0甲氧乙基糖修飾組合時(shí)。教導(dǎo)制備上述修飾核苷酸以及其它修飾核苷酸的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 3，687，808 以及 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273,5, 367，066、 5，432，272、5，457，187、5，459，255、5，484，908、5，502，177、5，525，711、5，552，540、 5，587，469,5, 596，091,5, 614，617,5, 750，692 和 5，681，941，各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾涉及將提高寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的一個(gè)或多個(gè)部分或綴合物與寡核苷酸化學(xué)連接。這樣的部分包括但不限于脂質(zhì)部分，例如膽固醇部分、膽酸、硫醚(例如己基-S-三苯甲基硫醇、巰基膽固醇)、脂肪鏈(例如十二烷二醇或十一基殘基)、磷脂(例如二 -十六基-rac-甘油或1，2- 二 -0-十六基-rac-甘油基-3-H-膦酸三乙銨)、聚胺或聚乙二醇鏈或金剛烷乙酸、棕櫚基部分或者十八胺或己氨基-羰基_t羥膽固醇部分。教導(dǎo)制備這類(lèi)寡核苷酸綴合物的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、 5，578，717,5，580，731,5，580，731,5，591，584,5，109，124,5，118，802,5，138，045, 5，414，077,5，486，603,5，512，439,5，578，718,5，608，046,4，587，044,4，605，735, 4，667，025,4，762，779,4，789，737,4，824，941,4，835，263,4，876，335,4，904，582, 4，958，013,5，082，830,5，112，963,5，214，136,5，082，830,5，112，963,5，214，136, 5，245，022,5，254，469,5，258，506,5，262，536,5，272，250,5，292，873,5，317，098, 5，371，241,5, 391，723,5, 416，203,5, 451，463,5, 510，475,5, 512，667,5, 514，785、 5，565，552、5，567，810、5，574，142、5，585，481、5，587，371、5，595，726、5，597，696、 5，599，923,5, 599，928和5，688，941，各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。藥物發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物也可應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)和靶標(biāo)驗(yàn)證領(lǐng)域。本發(fā)明包括在藥物發(fā)現(xiàn)努力中利用本文鑒定的化合物和靶區(qū)段以闡明在唐氏綜合征基因多核苷酸和疾病狀態(tài)、表型或病況之間存在的關(guān)系。這些方法包括檢測(cè)或調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因多核苷酸， 包括將樣品、組織、細(xì)胞或生物體與本發(fā)明的化合物接觸，在治療后的某一時(shí)間測(cè)量唐氏綜合征基因多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相關(guān)表型或化學(xué)終點(diǎn)，并任選地將測(cè)量值與未治療樣品或用本發(fā)明另一化合物治療的樣品作比較。這些方法也可與其它實(shí)驗(yàn)平行或聯(lián)合進(jìn)行，以測(cè)定靶標(biāo)驗(yàn)證過(guò)程的未知基因的功能，或者測(cè)定作為治療或預(yù)防特定疾病、病況或表型的靶標(biāo)的特定基因產(chǎn)物的有效性。評(píng)價(jià)基因表達(dá)的上調(diào)或抑制外源核酸到宿主細(xì)胞或生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移可通過(guò)直接檢測(cè)細(xì)胞或生物體中核酸的存在情況而評(píng)價(jià)。這種檢測(cè)可通過(guò)本領(lǐng)域公知的若干方法完成。例如，外源核酸的存在情況可通過(guò)DNA印跡或利用特異擴(kuò)增與該核酸相關(guān)的核苷酸序列的引物通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng) (PCR)技術(shù)來(lái)檢測(cè)。外源核酸的表達(dá)也可利用包括基因表達(dá)分析在內(nèi)的常規(guī)方法測(cè)量。例如，可利用RNA印跡和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測(cè)和定量分析從外源核酸產(chǎn)生的mRNA。來(lái)自外源核酸的RNA表達(dá)也可通過(guò)測(cè)量酶活性或報(bào)道蛋白活性來(lái)檢測(cè)。例如，可按作為外源核酸正在產(chǎn)生效應(yīng)RNA的指示的靶核酸表達(dá)的減少或增加，來(lái)間接測(cè)量反義調(diào)節(jié)活性。基于序列保守，可設(shè)計(jì)并利用引物擴(kuò)增靶基因的編碼區(qū)。首先，可使用各基因的最高表達(dá)的編碼區(qū)建立模型對(duì)照基因，雖然可使用任何編碼或非編碼區(qū)。通過(guò)將各個(gè)編碼區(qū)插入報(bào)道編碼區(qū)及其poly (A)信號(hào)之間來(lái)裝配各對(duì)照基因。這些質(zhì)粒將產(chǎn)生在基因上游部分帶有報(bào)道基因和在3'非編碼區(qū)中帶有潛在RNAi靶標(biāo)的mRNA。通過(guò)報(bào)道基因的調(diào)節(jié)來(lái)測(cè)定各個(gè)反義寡核苷酸的有效性?？捎糜诒景l(fā)明方法的報(bào)道基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、 堿性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸糖苷酶(betaglucoronidase，⑶S)、 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、 青色熒光蛋白(CFP)、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)、螢光素酶(Luc)、胭脂氨酸合酶(N0Q、章魚(yú)堿合酶(0CQ及其衍生物?？衫枚喾N選擇標(biāo)記，其賦予對(duì)氨芐青霉素、博來(lái)霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、甲氨蝶呤、膦絲菌素、嘌呤霉素和四環(huán)素的抗性。測(cè)定報(bào)道基因的調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于熒光測(cè)定法(例如熒光光譜法、熒光活化細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、熒光顯微術(shù))、抗生素抗性測(cè)定?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法和本文其它部分描述的方法，測(cè)定DYRK1、 DSCRl蛋白和mRNA表達(dá)。例如，可采用免疫測(cè)定(例如ELISA)測(cè)量蛋白質(zhì)水平。用于 ELISA的唐氏綜合征基因抗體是市售的，例如來(lái)自R&D Systems (Minneapolis,麗)，Abcam， Cambridge, ΜΑ。在實(shí)施方案中，通過(guò)與對(duì)照樣品中唐氏綜合征基因表達(dá)進(jìn)行比較，來(lái)評(píng)價(jià)使用本發(fā)明的反義寡核苷酸治療的樣品(例如體內(nèi)或體外的細(xì)胞或組織)中的DYRK1、DSCR1表達(dá) (例如mRNA或蛋白質(zhì))。例如，可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，將蛋白質(zhì)或核酸的表達(dá)與模擬治療或未治療樣品中的表達(dá)進(jìn)行比較?；蛘撸筛鶕?jù)所需的信息，與用對(duì)照反義寡核苷酸(例如具有改變序列或不同序列)治療的樣品進(jìn)行比較。在另一實(shí)施方案中，可將治療樣品相對(duì)未治療樣品中唐氏綜合征基因蛋白質(zhì)或核酸表達(dá)的相異與治療樣品相對(duì)未治療樣品中不同核酸(包括研究人員認(rèn)為適當(dāng)?shù)娜魏螛?biāo)準(zhǔn)品，例如持家基因)表達(dá)的差異進(jìn)行比較。所觀察到的差異可以按需要表示為例如比率或分?jǐn)?shù)的形式，以便用于與對(duì)照比較。在實(shí)施方案中，與未治療樣品或用對(duì)照核酸治療的樣品相比，用本發(fā)明的反義寡核苷酸治療的樣品中唐氏綜合征基因mRNA或蛋白質(zhì)的水平提高或降低約1. 25倍-約10倍或更多。在實(shí)施方案中，唐氏綜合征基因mRNA或蛋白質(zhì)的水平提高或降低至少約1.25倍、至少約1. 3倍、至少約1. 4倍、至少約1. 5倍、至少約1. 6倍、至少約1. 7倍、至少約1. 8倍、至少約2倍、至少約2. 5倍、至少約3倍、至少約3. 5倍、至少約4倍、至少約4. 5倍、至少約5倍、 至少約5. 5倍、至少約6倍、至少約6. 5倍、至少約7倍、至少約7. 5倍、至少約8倍、至少約 8. 5倍、至少約9倍、至少約9. 5倍、或至少約10倍或更多。試劑盒、研究試劑、診斷劑和治療藥本發(fā)明的化合物可用于診斷、治療和預(yù)防，和用作研究試劑和試劑盒的組分。此夕卜，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員常常使用能夠以極高特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸，以闡明特定基因的功能或區(qū)分生物途徑的不同成員的功能。對(duì)于在試劑盒和診斷以及多種生物系統(tǒng)中的使用，本發(fā)明的化合物可單獨(dú)或與其它化合物或治療藥聯(lián)合用作差別分析和/或組合分析中的工具，以闡明在細(xì)胞和組織中表達(dá)的基因的部分或完整互補(bǔ)序列的表達(dá)模式。
本文所用術(shù)語(yǔ)“生物系統(tǒng)”或“系統(tǒng)”定義為表達(dá)或使之有能力表達(dá)唐氏綜合征基因產(chǎn)物的任何生物體、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織。這些包括但不限于人、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞、 細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植體及其組合。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，將用一種或多種反義化合物治療的細(xì)胞或組織中的表達(dá)模式與未用反義化合物治療的對(duì)照細(xì)胞或組織作比較，分析所產(chǎn)生模式的基因表達(dá)的不同水平，因?yàn)樗鼈兝缗c受檢基因的疾病關(guān)聯(lián)性、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、 結(jié)構(gòu)或功能有關(guān)?？稍谟绊懕磉_(dá)模式的其它化合物存在或不存在的情況下，對(duì)刺激或未刺激的細(xì)胞進(jìn)行這些分析。本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)分析方法的實(shí)例包括DNA陣列或微陣列(Brazma和 ViIo (2000) FEBS Lett.，480，17-24 ;Celis 等(2000) FEBS Lett.，480，2-16)、SAGE (基因表達(dá)系列分析)(Madden 等 Q000)Drug Discov. Today, 5,415-425)、READS (消化 cDNA 的限制酶擴(kuò)增)(Prashar 和 Weissman (1999)Methods Enzymo 1.，303，258-72)、TOGA (總基因表達(dá)分析)(Sutcliffe 等(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，97，1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)(Celis 等(2000)FEBS Lett. ,480,2-16 Jungblut 等，Electrophoresis, 1999，20，2100-10)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)測(cè)序(Celis 等，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480，2-16 ； Larsson 等，J. Biotechnol.，2000，洲，H3-57)、消減式 RNA 指紋分析(subtractive RNA fingerprinting, SuRF)(Fuchs 等(2000)Anal. Biochem. 286,91-98 ；Larson 等(2000) Cytometry 41，203-208)、消減式克隆(subtractive cloning)、差異展示(DD) (Jurecic 和 Belmont (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3，316-21)、比較基因組雜交(Carulli 等 (1998) J. Cell Biochem. Suppl.，31，286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going 和 Gusterson(1999)Eur. J. Cancer,35,1895-904)和質(zhì)譜法(To, Comb. (2000)Chem. High Throughput Screen,3,235-41)。本發(fā)明的化合物可用于研究和診斷，因?yàn)檫@些化合物與編碼唐氏綜合征基因的核酸雜交。例如，作為有效的唐氏綜合征基因調(diào)節(jié)劑以本文公開(kāi)的這種效率和在這樣的條件下雜交的寡核苷酸在有助于基因擴(kuò)增或檢測(cè)的條件下分別是有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要特異性檢測(cè)編碼唐氏綜合征基因的核酸分子的方法和用于檢測(cè)的所述核酸分子的擴(kuò)增，或者用于唐氏綜合征基因的其它研究。可通過(guò)本領(lǐng)域已知方法檢測(cè)本發(fā)明的反義寡核苷酸(尤其是引物和探針)與編碼唐氏綜合征基因的核酸的雜交。這樣的方法可包括將酶與寡核苷酸綴合、放射性標(biāo)記寡核苷酸或任何其它適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法。也可制備利用這種檢測(cè)方法檢測(cè)樣品中唐氏綜合征基因水平的試劑盒。為了治療用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員還對(duì)反義序列的特異性和靈敏度進(jìn)行控制。在動(dòng)物(包括人)疾病狀態(tài)的治療中已使用反義化合物作為治療部分。已將反義寡核苷酸藥物安全有效地給予人，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。因此確定的是，反義化合物可以是有用的治療方式，其可設(shè)計(jì)成用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物(尤其人)的治療方案。對(duì)于治療，通過(guò)給予本發(fā)明的反義化合物來(lái)治療動(dòng)物(優(yōu)選人)，所述動(dòng)物疑似患有可通過(guò)調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因多核苷酸的表達(dá)而治療的疾病或病癥。例如，在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，所述方法包括將治療有效量的唐氏綜合征基因調(diào)節(jié)劑給予需要治療的動(dòng)物的步驟。本發(fā)明的唐氏綜合征基因調(diào)節(jié)劑有效調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因的活性或調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因蛋白的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比對(duì)照，動(dòng)物的唐氏綜合征基因的活性或表達(dá)被抑制約10%。優(yōu)選動(dòng)物的唐氏綜合征基因的活性或表達(dá)被抑制約30%。更優(yōu)選動(dòng)物的唐氏綜合征基因的活性或表達(dá)被抑制50 %以上。因此，相比對(duì)照，寡聚化合物對(duì)唐氏綜合征基因mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)為至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、 至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少 99%或 100%。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比對(duì)照，動(dòng)物的唐氏綜合征基因的活性或表達(dá)提高約10%。 優(yōu)選動(dòng)物的唐氏綜合征基因的活性或表達(dá)提高約30 %。更優(yōu)選動(dòng)物的唐氏綜合征基因的活性或表達(dá)提高50%以上。因此，相比對(duì)照，寡聚化合物對(duì)唐氏綜合征基因mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)為至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、 至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。例如，可測(cè)量動(dòng)物的血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其它體液、組織或器官中的唐氏綜合征基因表達(dá)的減少。優(yōu)選包含在待分析的所述體液、組織或器官中的細(xì)胞含有編碼唐氏綜合征基因肽的核酸分子和/或唐氏綜合征基因蛋白自身?？赏ㄟ^(guò)將有效量的化合物加入合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體中，來(lái)將本發(fā)明的化合物用于藥物組合物。本發(fā)明的化合物和方法也可用于預(yù)防用途。綴合物本發(fā)明寡核苷酸的其它修飾涉及將提高寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞攝取的一個(gè)或多個(gè)部分或綴合物與寡核苷酸化學(xué)連接。這些部分或綴合物可包括與官能團(tuán)共價(jià)連接的綴合基，例如伯羥基或仲羥基。本發(fā)明的綴合基包括嵌入劑、報(bào)道分子、聚胺、 聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強(qiáng)寡聚體的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)和增強(qiáng)寡聚體藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。典型的綴合基包括膽固醇、脂質(zhì)、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、 羅丹明、香豆素和染料。在本發(fā)明的情況下，增強(qiáng)藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括提高攝取、提高降解抗性和/或加強(qiáng)與靶核酸的序列特異性雜交的基團(tuán)。在本發(fā)明的情況下，增強(qiáng)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改善本發(fā)明化合物的攝取、分布、代謝或排出的基團(tuán)。代表性綴合基披露于1992年10月23日提交的國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)朠CT/US92/09196和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，觀7，860， 所述文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。綴合部分包括但不限于脂部分(例如膽固醇部分)、膽酸、硫醚(例如己基-5-三苯甲基硫醇、巰基膽固醇)、脂肪鏈(例如十二烷二醇或十一基殘基)、磷脂(例如二 -十六基-rac-甘油或1，2- 二 -0-十六基-rac-甘油基_3_H膦酸三乙銨)、聚胺或聚乙二醇鏈、或金剛烷乙酸、棕櫚基部分、或十八烷基胺或己氨基-羰基-氧基膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸還可與例如以下的活性藥物綴合阿司匹林、華法林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、芬布芬、酮洛芬、(S)_(+)_普拉洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2，3， 5-三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪(benzothiadiazide)、氯噻嗪、二氮雜草、吲哚美辛(indomethicin)、巴比妥類(lèi)藥物、頭孢菌素、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗菌藥或抗生素。教導(dǎo)制備這類(lèi)寡核苷酸綴合物的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，828，979,4, 948，882,5, 218，105,5, 525，465,5, 541，313,5, 545，730,5, 552，538、 5，578，717,5，580，731,5，580，731,5，591，584,5，109，124,5，118，802,5，138，045, 5，414，077,5，486，603,5，512，439,5，578，718,5，608，046,4，587，044,4，605，735, 4，667，025,4，762，779,4，789，737,4，824，941,4，835，263,4，876，335,4，904，582, 4，958，013,5，082，830,5，112，963,5，214，136,5，082，830,5，112，963,5，214，136, 5，245，022,5，254，469,5，258，506,5，262，536,5，272，250,5，292，873,5，317，098,
355，371，241, 5，391，723、5，416，203, 5，451，463、5，510，475、5，512，667、5，514，785、 5，565，552、5，567，810、5，574，142、5，585，481、5，587，371、5，595，726、5，597，696、 5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941。制劑本發(fā)明的化合物還可與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物混合物一起混合、包封、綴合或者以其它方式締合，作為例如脂質(zhì)體、靶向受體的分子、口服、直腸、局部或其它制劑，以有助于攝取、分布和/或吸收。教導(dǎo)制備這種有助于攝取、分布和/或吸收的制劑的代表性美國(guó)專(zhuān)利包括但不限于美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，108，921,5, 354，844,5, 416，016,5, 459，127、 5，521，291,5，543，165,5，547，932,5，583，020,5，591，721,4，426，330,4，534，899, 5，013，556,5, 108，921,5, 213，804,5, 227，170,5, 264，221,5, 356，633,5, 395，619、 5，416，016,5，417，978,5，462，854,5，469，854,5，512，295,5，527，528,5，534，259, 5，543，152,5, 556，948,5, 580，575和5，595，756，各專(zhuān)利通過(guò)引用結(jié)合到本文中。雖然不必在載體情況下給予反義寡核苷酸以調(diào)節(jié)靶標(biāo)表達(dá)和/或功能，但是本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于表達(dá)反義寡核苷酸的表達(dá)載體構(gòu)建體，其包含啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子基因序列，并具有強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子活性，或者可在所需情況下誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明實(shí)踐包括用適當(dāng)?shù)暮怂徇f送系統(tǒng)給予至少一種前述反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包含與多核苷酸有效連接的非病毒載體。這種非病毒載體的實(shí)例只包括寡核苷酸(例如SEQ ID NO :7-24中的任一種或多種)，或包括與合適的蛋白質(zhì)、多糖或脂質(zhì)制備物組合的寡核苷酸。其它合適的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，通常為來(lái)自腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、 依賴(lài)輔助病毒的腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒或日本血凝病毒-脂質(zhì)體(HVJ)復(fù)合體中至少一種的序列。優(yōu)選病毒載體包含與多核苷酸有效連接的強(qiáng)真核啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子。另外，載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。反轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一種基于HIV的病毒載體包含至少兩個(gè)載體，其中g(shù)ag和 pol基因來(lái)自HIV基因組，env基因來(lái)自另一種病毒。優(yōu)選DNA病毒載體。這些載體包括痘病毒載體(例如正痘病毒載體或禽痘病毒載體)、皰疹病毒載體(例如單純性皰疹I(lǐng)型病毒 (HSV)載體)、腺病毒載體和腺伴隨病毒載體。本發(fā)明的反義化合物包括任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯或這種酯的鹽，或者任何其它在給予動(dòng)物(包括人)時(shí)能夠(直接或間接)提供其生物活性代謝物或殘余物的化合物。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的生理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽即保留所需要的母體化合物的生物活性且不使其具有不希望的毒理學(xué)作用的鹽。對(duì)于寡核苷酸，藥學(xué)上可接受的鹽及其應(yīng)用的實(shí)例另參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，287, 860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明反義化合物的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以多種方式給予，視需要局部治療還是需要全身治療和待治療部位而定。給藥可以是局部的(包括經(jīng)眼和粘膜，包括陰道和直腸遞送)；經(jīng)肺，例如通過(guò)吸入或吹入粉劑或氣霧劑 (包括通過(guò)噴霧器)；氣管內(nèi)；鼻內(nèi)；表皮和透皮；口服或胃腸外。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、 動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥。對(duì)于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織，可通過(guò)例如注射或輸注到腦脊髓液中來(lái)完成給藥。將反義RNA給予到腦脊髓液中，參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2007/0117772“MethodS for slowing familial ALS disease progression (用于減緩家族性 ALS 疾病進(jìn)展的方法)”， 其通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。當(dāng)預(yù)定將本發(fā)明的反義寡核苷酸給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞時(shí)，可與能夠促進(jìn)主題反義寡核苷酸穿透血腦屏障的一種或多種物質(zhì)一起給予。例如可在內(nèi)嗅皮質(zhì)或海馬中進(jìn)行注射。在例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，632，427 "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons (腺病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到髓質(zhì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中)”(通過(guò)引用結(jié)合到本文中的)中，闡述了通過(guò)將腺病毒載體給予肌肉組織中的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元來(lái)遞送神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。本領(lǐng)域已知直接將載體遞送到腦例如紋狀體、丘腦、海馬或黑質(zhì)，并可參見(jiàn)例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 6，756，523“Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain(用于奪夕卜源基因轉(zhuǎn)移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)尤其大腦細(xì)胞中的腺病毒載體)”(通過(guò)引用結(jié)合到本文中)中。給藥可以通過(guò)注射快速進(jìn)行，或通過(guò)緩慢輸注或緩釋制劑給藥在一段時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。亦可將主題反義寡核苷酸與提供所需藥學(xué)或藥效學(xué)性質(zhì)的物質(zhì)連接或綴合。例如，可將反義寡核苷酸與本領(lǐng)域已知的促進(jìn)透過(guò)血腦屏障滲透或轉(zhuǎn)運(yùn)的任何物質(zhì)(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的抗體)偶聯(lián)，并通過(guò)靜脈內(nèi)注射給藥?？蓪⒎戳x化合物與例如使反義化合物更有效和/或提高反義化合物透過(guò)血腦屏障轉(zhuǎn)運(yùn)的病毒載體相連。亦可通過(guò)例如輸注糖或氨基酸來(lái)破壞滲透性血腦屏障，所述糖包括但不僅限于內(nèi)消旋赤藻糖醇、木糖醇、D(+)半乳糖、D⑴乳糖、D⑴木糖、衛(wèi)矛醇、肌醇、L(-)果糖、D(-)甘露醇、D(+)葡萄糖、D(+)阿拉伯糖、D(-)阿拉伯糖、纖維二糖、D(+)麥芽糖、D(+)棉子糖、L⑴鼠李糖、D⑴蜜二糖、 D(-)核糖、核糖醇、D(+)阿拉伯糖醇、L(-)阿拉伯糖醇、D(+)巖藻糖、L(-)巖藻糖、D(-)來(lái)蘇糖、L(+)來(lái)蘇糖和L(-)來(lái)蘇糖；所述氨基酸包括但不限于谷氨酰胺、賴(lài)氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、纈氨酸和?；撬?。用于提高血腦屏障滲透的方法和材料闡述于例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 4，866，042 "Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier (遞送遺傳物質(zhì)通過(guò)血腦屏障的方法)、6，四4，520 "Material for passage through the blood-brain barrier (用于穿 il H 屏障白勺方 ^去)，，禾口 6，936，589 "Parenteral delivery systems (胃腸外遞送系統(tǒng))”，所述文獻(xiàn)均通過(guò)引用以其整體結(jié)合在本文中。為了幫助攝取、分布和/或吸收，可將主題反義化合物與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物的混合物(例如脂質(zhì)體、靶向受體的分子、口服制劑、直腸制劑、局部制劑或其它制劑) 混合、包封、綴合或以其它方式締合。例如，制劑中可包含陽(yáng)離子脂質(zhì)以促進(jìn)寡核苷酸攝取。 顯示促進(jìn)攝取的一種所述組合物是LIP0FECTIN (可獲自GIBC0-BRL，Bethesda, MD)。帶有至少一個(gè)2' -0-甲氧乙基修飾的寡核苷酸被認(rèn)為尤其可用于口服給藥。用于局部給藥的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓齊 、噴霧劑、液體劑和散劑。常規(guī)藥學(xué)載體、水性、粉狀或油狀基料、增稠劑等可能是必要或所需的。包被避孕套、手套等也可能是有用的?？砂凑罩扑幑I(yè)中公知的傳統(tǒng)技術(shù)制備可合宜地以單位劑型提供的本發(fā)明的藥物制劑。這樣的技術(shù)包括使活性成分與藥用載體或賦形劑混合的步驟。通常，通過(guò)使活性成分與液體載體或細(xì)碎的固體載體或者二者均一且緊密地混合，并視需要使產(chǎn)物成形來(lái)制備制劑?？蓪⒈景l(fā)明的組合物配制成多種可能劑型中的任何一種，例如但不限于片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿劑、軟凝膠劑、栓劑和灌腸劑。還可將本發(fā)明的組合物配制為水性介質(zhì)、非水性介質(zhì)或混合介質(zhì)中的混懸劑。水性混懸劑還可包含增加混懸劑粘度的物質(zhì)， 其包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖?；鞈覄┻€可包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液劑、乳劑、泡沫劑和含脂質(zhì)體的制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可包含一種或多種滲透促進(jìn)劑、載體、賦形劑或其它活性或無(wú)活性成分。乳劑一般為一種液體以小滴形式分散在另一種液體中的多相系，小滴直徑通常大于0. 1 μ m。乳劑可包含除分散相外的其它組分和活性藥物，活性藥物可作為水相、油相中的溶液或自身作為分離相存在。還包括微乳劑作為本發(fā)明的實(shí)施方案。乳劑及其使用是本領(lǐng)域公知的，此外參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，287, 860。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明所用術(shù)語(yǔ)“脂質(zhì)體”是指由排列在一個(gè)或多個(gè)球形雙分子層中的兩親脂質(zhì)組成的囊泡。脂質(zhì)體為單層或多層囊泡，其具有由親脂物質(zhì)形成的膜和含有待遞送組合物的水性?xún)?nèi)部。陽(yáng)離子脂質(zhì)體為帶正電荷的脂質(zhì)體，其被認(rèn)為與帶負(fù)電荷的DNA分子相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體。pH敏感或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體被認(rèn)為誘捕DNA，而不是具有DNA的復(fù)合體。陽(yáng)離子和非陽(yáng)離子脂質(zhì)體均已用于遞送DNA到細(xì)胞。脂質(zhì)體還包括“空間穩(wěn)定”脂質(zhì)體，本文所用的該術(shù)語(yǔ)是指包含一種或多種特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體。當(dāng)被摻入到脂質(zhì)體中時(shí)，這些特化脂質(zhì)導(dǎo)致脂質(zhì)體的循環(huán)壽命比缺乏這種特化脂質(zhì)的脂質(zhì)體延長(zhǎng)?？臻g穩(wěn)定脂質(zhì)體的實(shí)例是這樣的脂質(zhì)體其中脂質(zhì)體的形成囊泡的脂質(zhì)部分的一部分包含一種或多種糖脂或用一種或多種親水聚合物衍生，例如聚乙二醇 (PEG)部分。脂質(zhì)體及其使用另參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，觀7，860。本發(fā)明的藥物制劑和組合物還可包含表面活性劑。藥物制品、制劑和乳劑中的表面活性劑的使用是本領(lǐng)域公知的。表面活性劑及其使用另參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，287, 860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用多種滲透促進(jìn)劑，以實(shí)現(xiàn)核酸尤其是寡核苷酸的有效遞送。除了協(xié)助非親脂性藥物跨細(xì)胞膜擴(kuò)散外，滲透促進(jìn)劑還提高親脂性藥物的通透性。滲透促進(jìn)劑可歸類(lèi)為屬于五大類(lèi)(即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑)之一。滲透促進(jìn)劑及其使用另參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，觀7，860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，按照制劑的預(yù)期應(yīng)用(即給藥途徑)對(duì)制劑進(jìn)行常規(guī)設(shè)計(jì)。用于局部給藥的制劑包括這樣的制劑其中本發(fā)明的寡核苷酸與局部遞送物質(zhì)混合，局部遞送物質(zhì)例如脂質(zhì)、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類(lèi)固醇、螯合劑和表面活性劑。脂質(zhì)和脂質(zhì)體包括中性的(例如二油酰-磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰性的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和陽(yáng)離子型(例如二油酰四甲氨基丙基DOTAP和二油酰-磷脂酰乙醇胺D0TMA)。對(duì)于局部或其它給藥，可將本發(fā)明的寡核苷酸包封到脂質(zhì)體中，或者可與脂質(zhì)體(特別是陽(yáng)離子型脂質(zhì)體)形成復(fù)合體?；蛘?，可將寡核苷酸與脂質(zhì)(特別是陽(yáng)離子脂質(zhì)) 絡(luò)合。脂肪酸和酯、其藥學(xué)上可接受的鹽及其應(yīng)用另參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，287, 860。用于口服給藥的組合物和制劑包括散劑或顆粒劑、微粒劑(microparticulate)、 納米粒劑(nanoparticulate),水或非水介質(zhì)中的混懸劑或溶液劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、小藥囊劑、片劑或小片。增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是所需的。口服制劑是其中本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種滲透促進(jìn)劑、表面活性劑和螯合劑聯(lián)合給予的制劑。表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。膽汁酸/鹽和脂肪酸及其應(yīng)用另參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，287, 860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。還有滲透促進(jìn)劑的組合，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽的組合。特別是十二烷酸、癸酸和UDCA的鈉鹽的組合。 其它滲透促進(jìn)劑包括聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本發(fā)明的寡核苷酸可以顆粒形式(包括噴霧干燥顆粒)口服遞送，或絡(luò)合形成微?；蚣{米粒。寡核苷酸絡(luò)合劑及其應(yīng)用另參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，287, 860，其通過(guò)引用結(jié)合到本文中。用于胃腸外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥的組合物和制劑可包括無(wú)菌水溶液，該無(wú)菌水溶液還可含有緩沖劑、稀釋劑和其它合適添加劑，例如但不限于滲透促進(jìn)劑、載體化合物及其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供含有一種或多種寡聚化合物和一種或多種其它通過(guò)非反義機(jī)制起作用的化療藥物的藥物組合物。這種化療藥物的實(shí)例包括但不限于癌癥化療藥物，例如柔紅霉素、道諾霉素、放線菌素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、依索比星、博來(lái)霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、氯乙亞硝脲、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴胼、六甲蜜胺、五甲密胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥(niǎo)嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氮胞苷、羥基脲、脫氧考福霉素、4-羥基過(guò)氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、甲氨蝶呤(MTX)、秋水仙堿、泰素(taxol)、長(zhǎng)春新堿、長(zhǎng)春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他濱、替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時(shí)，這樣的化療藥物可單獨(dú)使用(例如5-FU和寡核苷酸)、序貫使用(例如5-FU和寡核苷酸使用一段時(shí)間后接著用MTX和寡核苷酸)或者與一種或多種其它這樣的化療藥物聯(lián)用 (例如5-FU、MTX和寡核苷酸，或者5-FU、放射療法和寡核苷酸)?？寡姿幬?包括但不限于非留類(lèi)抗炎藥物和皮質(zhì)類(lèi)固醇)和抗病毒藥物(包括但不限于利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)也可與本發(fā)明的組合物組合。反義化合物和其它非反義藥物的組合也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。兩種以上組合的化合物可同時(shí)或序貫使用。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包含一種或多種靶向第一核酸的反義化合物(尤其寡核苷酸)和一種或多種靶向第二核酸靶標(biāo)的其它反義化合物。例如，第一靶標(biāo)可以是唐氏綜合征基因的特定反義序列，第二靶標(biāo)可以是另一核苷酸序列的區(qū)。或者，本發(fā)明的組合物可包含兩種或更多種靶向相同唐氏綜合征基因核酸靶標(biāo)的不同區(qū)的反義化合物。本文闡明了反義化合物的多個(gè)實(shí)例，其它可選自本領(lǐng)域已知的合適化合物。兩種或更多種組合的化合物可同時(shí)或序貫使用。給藥—般認(rèn)為治療組合物的制劑及其后續(xù)用藥(給藥)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握。給藥取決于待治療的疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和響應(yīng)性，具有持續(xù)數(shù)天至數(shù)月的療程，或者直到實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)減輕?？筛鶕?jù)對(duì)患者體內(nèi)蓄積藥物的測(cè)量來(lái)計(jì)算最佳給藥方案。普通技術(shù)人員可容易地測(cè)定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。最佳劑量可視各種寡核苷酸的相對(duì)效能而變化，且通?？筛鶕?jù)被認(rèn)為在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中有效的EC50來(lái)估計(jì)。通常， 劑量為0. 01 μ g-100g/kg體重，可每天、每周、每月或每年給予一次或多次，或者每2-20年給予一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地根據(jù)測(cè)量的藥物在體液或組織中的停留時(shí)間和濃度估計(jì)給藥重復(fù)率。在成功治療后，可能需要患者進(jìn)行維持治療以防止疾病狀態(tài)復(fù)發(fā)，其中以維持劑量給予寡核苷酸，維持劑量為0. 01 μ g-100g/kg體重，每天一次或多次至每20年一次。在實(shí)施方案中，患者用以下藥物劑量治療至少約1、至少約2、至少約3、至少約4、 至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10、至少約15、至少約20、至少約 25、至少約30、至少約35、至少約40、至少約45、至少約50、至少約60、至少約70、至少約80、 至少約90或至少約100mg/kg體重。反義寡核苷酸的某些注射劑量闡述于例如美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 7, 563, 884 "Antisense modulation of PTPlB expression (PTP1B 表達(dá)的反義調(diào)節(jié))”，其通過(guò)引用以其整體結(jié)合到本文中。雖然上文描述了本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，它們僅通過(guò)實(shí)例提供而并非限制。依據(jù)本文公開(kāi)內(nèi)容可對(duì)所公開(kāi)的實(shí)施方案作出多種改變，而又不偏離本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明的廣度和范圍將不受任何上述實(shí)施方案的限制。本文提及的所有文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中。本申請(qǐng)中引用的所有出版物和專(zhuān)利文獻(xiàn)通過(guò)引用結(jié)合到本文中用于所有目的，其程度與每個(gè)獨(dú)立出版物或?qū)＠墨I(xiàn)所單獨(dú)指明的一樣。至于在本文件中對(duì)多種參考文獻(xiàn)的引用，申請(qǐng)人不承認(rèn)任何具體參考文獻(xiàn)對(duì)于他們的發(fā)明是“現(xiàn)有技術(shù)”。以下實(shí)施例對(duì)發(fā)明組合物和方法的實(shí)施方案進(jìn)行了說(shuō)明。
實(shí)施例以下非限制性實(shí)施例用來(lái)闡明本發(fā)明的選定實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解的是，所示組分要素的比例和備選方案中的變化對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，并屬于本發(fā)明實(shí)施方案的范圍內(nèi)。實(shí)施例1 對(duì)唐氏綜合征基因的反義核酸分子和/或唐氏綜合征基因多核苷酸的有義鏈有特異性的反義寡核苷酸的設(shè)計(jì)如上所述，術(shù)語(yǔ)“對(duì)……有特異性的寡核苷酸”或“靶向…的寡核苷酸”是指具有下述序列的寡核苷酸其(i)能夠與靶基因的一部分形成穩(wěn)定的復(fù)合體，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定的雙鏈體。通過(guò)應(yīng)用自動(dòng)比對(duì)核酸序列并指明同一性或同源性區(qū)的計(jì)算機(jī)程序，有助于選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账?。這種程序用于比較所得核酸序列，例如通過(guò)檢索數(shù)據(jù)庫(kù)(例如GenBank) 或通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序。比較多個(gè)物種的核酸序列使能夠選擇在物種間具有適當(dāng)?shù)耐恍猿潭鹊暮怂嵝蛄小Ｔ谖礈y(cè)序基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡以供測(cè)定靶物種和其它物種的基因間的同一性程度。通過(guò)在本領(lǐng)域熟知的不同嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，可獲得同一性的近似測(cè)量。這些方法可供選擇這樣的寡核苷酸，即對(duì)待受控制的受試者的靶核酸序列具有高度互補(bǔ)性，而對(duì)其它物種的對(duì)應(yīng)核酸序列具有較低程度的互補(bǔ)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解的是，在選擇用于本發(fā)明的合適基因區(qū)方面有相當(dāng)大的自由。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件(即在體內(nèi)測(cè)定或治療性治療情況下的生理?xiàng)l件和體外測(cè)定情況下進(jìn)行測(cè)定的條件)下該反義化合物與非靶核酸序列非特異性結(jié)合時(shí)，反義化合物是“可特異性雜交的”。本文所述寡核苷酸的雜交性質(zhì)可通過(guò)本領(lǐng)域已知的一種或多種體外測(cè)定來(lái)確定。 例如，可通過(guò)利用解鏈曲線測(cè)定來(lái)確定靶天然反義序列和潛在藥物分子之間的結(jié)合強(qiáng)度而獲得本文所述寡核苷酸的性質(zhì)?？衫萌魏我汛_立的測(cè)量分子間相互作用強(qiáng)度的方法(例如解鏈曲線測(cè)定)來(lái)估計(jì)靶天然反義序列和潛在藥物分子(Molecule)之間的結(jié)合強(qiáng)度。解鏈曲線測(cè)定測(cè)定天然反義序列/Molecule復(fù)合體發(fā)生從雙鏈構(gòu)象到單鏈構(gòu)象快速轉(zhuǎn)變的溫度。該溫度被公認(rèn)為兩個(gè)分子間相互作用強(qiáng)度的可靠度量。可利用實(shí)際的天然反義RNA分子的cDNA拷貝或相當(dāng)于Molecule的結(jié)合位點(diǎn)的合成DNA或RNA核苷酸進(jìn)行解鏈曲線測(cè)定?？色@得多種裝有所有用于進(jìn)行該測(cè)定的必需試劑的試劑盒(例如Applied Biosystems he. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包括合適的緩沖溶液，緩沖溶液含有一種雙鏈DNA (dsDNA)結(jié)合染料(例如ABI HRM染料、STOR Green、 SYTO等)。dsDNA染料的性質(zhì)在于其游離形式幾乎不發(fā)出熒光，但與dsDNA結(jié)合時(shí)是強(qiáng)熒光的。為進(jìn)行該測(cè)定，將cDNA或相應(yīng)的寡核苷酸與Molecule以具體制造商的方案規(guī)定的濃度混合。將混合物加熱到95°C以解離所有預(yù)先形成的dsDNA復(fù)合體，之后緩慢冷卻至室溫或試劑盒制造商規(guī)定的其它更低溫度，以使DNA分子退火。然后，將新形成的復(fù)合體緩慢加熱到95°C，并同時(shí)連續(xù)收集由反應(yīng)產(chǎn)生的熒光量的數(shù)據(jù)。熒光強(qiáng)度與反應(yīng)中存在的 dsDNA量成反比。數(shù)據(jù)采集可利用與試劑盒兼容的實(shí)時(shí)PCR儀器(例如ABI，s StepOne Plus Real Time PCR System或LightTyper instrument, Roche Diagnostics, Lewes,UK)。通過(guò)利用合適的軟件(例如LightTyper(Roche)或 SDS Dissociation Curve, ABI)將熒光對(duì)溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)(y軸上的-d(熒光)/dT)對(duì)溫度(χ軸)作圖，構(gòu)建解鏈峰。 分析數(shù)據(jù)，以鑒定dsDNA復(fù)合體快速轉(zhuǎn)變成單鏈分子的溫度。該溫度稱(chēng)為T(mén)m，與兩個(gè)分子間的相互作用強(qiáng)度成正比。Tm通常大于40°C。實(shí)施例2 唐氏綜合征基因多核苷酸的調(diào)節(jié)用反義寡核苷酸治療!fepG2細(xì)胞使得自ATCC (目錄號(hào)HB-8065)的H印G2細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/raSS (Hyclone 目錄號(hào) SH30024 或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV)+10 % FBS (Mediatech 目錄號(hào) ΜΤ;35-0Il-CV) +青霉素 / 鏈霉素(Mediatech 目錄號(hào) MT30-002-CD)中在 37°C和 5% CO2 下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，將細(xì)胞以1. 5XlOVml的密度再次接種到6孔板中并在37°C和5% CO2 下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基更換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋至20 μ M的濃度。將2 μ 1該溶液與400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào)31985-070) 和 4μ1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019) —起在室溫下孵育 20 分鐘， 并加到具有HepG2細(xì)胞的6孔板各孔中。含有2 μ 1代替寡核苷酸溶液的水的類(lèi)似混合物用作模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)
41基。在加入反義寡核苷酸48小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，并按照制造商說(shuō)明書(shū)利用!Iomega的SV Total RNA Isolation System(目錄號(hào) Z3105)或 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試劑盒(目錄號(hào)74181)提取細(xì)胞RNAt^feOOng RNA加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，按制造商方案所述利用 Thermo Scientif ic 的 Verso cDNA 試劑盒(目錄號(hào) AB1453B)或 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (目錄號(hào) 4368813)進(jìn)行該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用 ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號(hào) 4369510)禾口 ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay :Hs00176369_ml*Hs00176369_ml，Applied Biosystems Inc. ,Foster City CA)設(shè)計(jì)的引物/探針，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR，使用得自該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA監(jiān)測(cè)基因表達(dá)。采用Mx4000 循環(huán)變溫加熱器(Stratagene)，使用以下PCR循環(huán)50°C 2分鐘、95°C 10分鐘，40個(gè)循環(huán) (950C 15 秒，60°C 1 分鐘)。根據(jù)治療樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間的18S-標(biāo)準(zhǔn)化dCt值的差異，計(jì)算用反義寡核苷酸治療后基因表達(dá)的倍數(shù)變化。結(jié)果實(shí)時(shí)PCR 結(jié)果表明，用設(shè)計(jì)為 DYRKla 反義 Hs. 713879 (CUR-0885-CUR-0890)的寡核苷酸之一治療后48小時(shí)，HepG2細(xì)胞中DYRKla mRNA的水平顯著提高(圖1)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明，用設(shè)計(jì)為DSCRl反義DA403464的寡核苷酸之一治療后48小時(shí)，HepG2細(xì)胞的DSCRl mRNA水平顯著提高(圖2)。用反義寡核苷酸治療Vero 76細(xì)胞使得自ATCC (目錄號(hào)CRL-1587)的Vero 76細(xì)胞在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(MEM/ EBSS(Hyclone 目錄號(hào) SH30024，或 Mediatech 目錄號(hào) MT-10-010-CV)+10 % FBS (Mediatech 目錄號(hào)ΜΤ;35-0Il-CV) +青霉素/鏈霉素(Mediatech目錄號(hào)MT30-002-CI))中于37°C和5% CO2下生長(zhǎng)。在實(shí)驗(yàn)前一天，將細(xì)胞以1.5X105/ml的密度再次接種到6孔板中并在37°C 和5% CO2下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基更換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋為20 μ M的濃度。將2 μ 1該溶液與400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號(hào) 31985-070)和 4μ 1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號(hào) 11668019) 一起在室溫下孵育20分鐘，并加入具有Vero 76細(xì)胞的6孔板的各孔中。含有2 μ 1代替寡核苷酸溶液的水的類(lèi)似混合物用作模擬轉(zhuǎn)染對(duì)照。在37°C和5% CO2下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸48小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，并按照制造商說(shuō)明書(shū)利用 Promega 的 SV Total RNA Isolation System(目錄號(hào) Z3105)或 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation試劑盒(目錄號(hào)74181)提取細(xì)胞RNA。將600ngRNA加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， 按制造商方案所述利用Thermo kientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號(hào)AB 1453B)或 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(目錄號(hào) 4368813)進(jìn)行該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 禾Ij用 ABI Taqman Gene Expression Mix(目錄號(hào) 4369510)禾口由 ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay :Hs00176369_ml 禾口 Hs00176369_ml, Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計(jì)的引物/探針，通過(guò)實(shí)時(shí)PCR用得自該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA監(jiān)測(cè)基因表達(dá)。采用Mx4000循環(huán)變溫加熱器(Stratagene)或乂印01^ Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems)，使用以下 PCR 循環(huán)50°C 2 分鐘、95°C 10 分鐘，40 個(gè)循環(huán) (95°C 15 秒，60°C 1 分鐘)。根據(jù)治療樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間的18S-標(biāo)準(zhǔn)化dCt值的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸治療后基因表達(dá)的倍數(shù)變化。
實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明，在用設(shè)計(jì)為DYRKla反義Hs. 713879的寡核苷酸之一治療后48 小時(shí)，Vero細(xì)胞的DYRKla mRNA水平顯著提高(圖3)。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果表明，在用設(shè)計(jì)為DSCRl反義DA403464的寡核苷酸之一治療后48 小時(shí)，Vero細(xì)胞的DSCRlmRNA水平顯著提高。(圖4)。雖然按照一種或多種實(shí)現(xiàn)方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了解釋和說(shuō)明，但是在閱讀和理解本說(shuō)明書(shū)和附圖時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員便會(huì)想到等同的改變和變化。此外，雖然可能僅按照若干實(shí)現(xiàn)方式之一來(lái)公開(kāi)本發(fā)明的具體特征，但是當(dāng)對(duì)于任何給定或具體的應(yīng)用可能是需要且有利時(shí)，這種特征可與其它實(shí)現(xiàn)方式的一個(gè)或多個(gè)其它特征聯(lián)合。本說(shuō)明書(shū)的摘要可供讀者快速查明本技術(shù)公開(kāi)的性質(zhì)。它的提交不應(yīng)理解為用來(lái)解釋或限制所附權(quán)利要求書(shū)的范圍或含義。
權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與至少一種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)，其中所述至少一種寡核苷酸與包含以下核苷酸內(nèi)的5-30個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少 50%序列同一性SEQ ID NO :3 的 1-3814、SEQ ID NO :4 的 1-633、SEQ ID NO :5 的 1-497 和 SEQ ID NO 6 的 1-545。
2.—種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與至少一種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)，其中所述至少一種寡核苷酸與唐氏綜合征基因多核苷酸的天然反義序列的反向互補(bǔ)序列具有至少50% 序列同一性。
3.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與至少一種長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)，其中所述寡核苷酸與唐氏綜合征基因多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%序列同一性。
4.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與靶向唐氏綜合征基因多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中與對(duì)照相比，體內(nèi)或體外提高唐氏綜合征基因的功能和/或表達(dá)。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向唐氏綜合征基因多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向包含唐氏綜合征基因多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向唐氏綜合征基因多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包含一種或多種選自以下的修飾至少一種修飾糖部分、至少一種修飾核苷間鍵、至少一種修飾核苷酸及其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾糖部分2' -0-甲氧基乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾核苷間鍵硫代磷酸酯、2' -0甲氧基乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、類(lèi)似物、衍生物及其組合。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包含SEQID N0:7-24所示的至少一種寡核苷酸序列。
14.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度為5-30個(gè)核苷酸的至少一種短干擾RNA (siRNA)寡核苷酸接觸，體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因的功能和/或表達(dá)，所述至少一種siRNA寡核苷酸對(duì)唐氏綜合征基因多核苷酸的反義多核苷酸有特異性，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與唐氏綜合征基因多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少50%序列同一性。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述寡核苷酸同與唐氏綜合征基因多核苷酸的反義和/ 或有義核酸分子互補(bǔ)的至少約5個(gè)連續(xù)核酸的序列具有至少80%序列同一性。
16.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因的功能和/或表達(dá)的方法，所述方法包括使所述細(xì)胞或組織與長(zhǎng)度約為5-30個(gè)核苷酸、對(duì)唐氏綜合征基因多核苷酸的有義和/ 或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列有特異性的至少一種反義寡核苷酸接觸，體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織的唐氏綜合征基因的功能和/或表達(dá)，其中所述至少一種反義寡核苷酸與SEQ ID NO :1-6所示至少一種核酸序列具有至少50%序列同一性。
17.一種包含至少一種修飾的合成的修飾寡核苷酸，其中所述至少一種修飾選自至少一種修飾糖部分、至少一種修飾核苷酸間鍵、至少一種修飾核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸是與正常對(duì)照相比體內(nèi)或體外與唐氏綜合征基因雜交并調(diào)節(jié)其功能和/或表達(dá)的反義化合物。
18.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下的核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
19.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一個(gè)硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵骨架。
21.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種修飾核苷酸，所述修飾核苷酸選自肽核酸、鎖定核酸(LNA)、類(lèi)似物、衍生物及其組合。
22.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾核苷酸硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
23.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包括選自以下的修飾核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、類(lèi)似物、衍生物及其組合。
24.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含選自以下的至少一種修飾糖部分2' -0-甲氧基乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
25.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含多種修飾，其中所述修飾包含選自以下的修飾糖部分2' -0-甲氧基乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
26.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長(zhǎng)度為至少約5-30個(gè)核苷酸，并與唐氏綜合征基因多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述寡核苷酸與唐氏綜合征基因多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約20%序列同一性。
27.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與唐氏綜合征基因多核苷酸的反義和 /或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約80%序列同一性。
28.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與正常對(duì)照相比，體內(nèi)或體外與至少一種唐氏綜合征基因多核苷酸雜交并調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能。
29.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQID N0:7_24所示序列。
30.一種組合物，其包含對(duì)一種或多種唐氏綜合征基因多核苷酸有特異性的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸與SEQID NO :7_24所示任一種核苷酸序列相比具有至少約40%序列同一性。
32.權(quán)利要求30的組合物，其中所述寡核苷酸包含SEQID NO :7_24所示核苷酸序列。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中SEQID NO 7~24所示寡核苷酸包含一種或多種修飾或取代。
34.權(quán)利要求33的組合物，其中所述一種或多種修飾選自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、 肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。
35.一種預(yù)防或治療與至少一種唐氏綜合征基因多核苷酸和/或至少一種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病的方法，所述方法包括將治療有效量的至少一種反義寡核苷酸給予患者，從而預(yù)防或治療與至少一種唐氏綜合征基因多核苷酸和/或至少一種其編碼產(chǎn)物有關(guān)的疾病，所述反義寡核苷酸與所述至少一種唐氏綜合征基因多核苷酸的天然反義序列結(jié)合，并調(diào)節(jié)所述至少一種唐氏綜合征基因多核苷酸的表達(dá)。
36.權(quán)利要求35的方法，其中與至少一種唐氏綜合征基因多核苷酸有關(guān)的疾病選自 與DYRKla或DSCRl的突變體、異常表達(dá)或功能有關(guān)的疾病或病癥；癌癥、血管生成疾病或病癥、細(xì)胞凋亡疾病或病癥、細(xì)胞增殖性疾病或病癥、炎癥、心血管疾病或病癥、神經(jīng)系統(tǒng)疾病或障礙、唐氏綜合征、阿爾茨海默病、智力遲鈍、記憶受損、三體性、神經(jīng)病理學(xué)、神經(jīng)退行性疾病或病癥、心肌細(xì)胞肥大、血管異常(例如嬰兒血管瘤、血管生成依賴(lài)性血管腫瘤、血管畸形等)、高同型半胱氨酸血癥、成骨細(xì)胞分化受損、破骨細(xì)胞發(fā)生、線粒體功能受損、氧化應(yīng)激、與鈣調(diào)磷酸酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受損有關(guān)的疾病或病癥、與血管生成調(diào)節(jié)受損有關(guān)的疾病或病癥、鈣介導(dǎo)的應(yīng)激和與APC和/或Axin功能缺陷或受損有關(guān)的疾病或病癥。
37.一種鑒定和選擇用于體內(nèi)給予的至少一種寡核苷酸的方法，所述方法包括選擇與疾病狀態(tài)有關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包含至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的至少一種寡核苷酸，所述至少5個(gè)連續(xù)核苷酸與所選擇的靶多核苷酸互補(bǔ)或與所選擇的靶多核苷酸的反義多核苷酸互補(bǔ)；在嚴(yán)格雜交條件下，測(cè)量反義寡核苷酸和所述靶多核苷酸或所選擇的靶多核苷酸的反義多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；并根據(jù)所得信息選擇用于體內(nèi)給予的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及反義寡核苷酸，所述反義寡核苷酸尤其通過(guò)靶向唐氏綜合征基因的天然反義多核苷酸來(lái)調(diào)節(jié)唐氏綜合征基因的表達(dá)和/或功能。本發(fā)明還涉及這些反義寡核苷酸的鑒定及其在治療與唐氏綜合征基因表達(dá)有關(guān)的疾病和病癥中的用途。
文檔編號(hào)A61K31/713GK102482672SQ201080038661
公開(kāi)日2012年5月30日 申請(qǐng)日期2010年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月26日
發(fā)明者J·科拉德, 謝爾曼 O·霍爾科瓦 申請(qǐng)人:歐科庫(kù)爾納有限責(zé)任公司