專利名稱：抗原性Tau肽及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包含連接至諸如病毒樣顆粒(VLP)等免疫原性載體的抗原性tau肽 (tau peptide)的免疫原、免疫原性組合物及藥物組合物,其用于治療tau相關(guān)的神經(jīng)學(xué)病癥或病狀，例如阿爾茨海默病(Alzheimer, s disease)及輕度認(rèn)知損傷(Mild Cognitive Impairment)。本發(fā)明還涉及制備這些免疫原、免疫原性組合物及藥物組合物的方法及其于醫(yī)藥中的用途。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病也稱為阿爾茨海默癡呆或AD，其是一種造成記憶喪失及嚴(yán)重精神衰退的進(jìn)行性神經(jīng)變性病癥或病狀。AD是最常見的癡呆形式，占所有癡呆的一半以上。據(jù)估計，全世界超過2600萬人遭受AD影響，預(yù)計隨著人口老齡化在2050年以前該數(shù)字會變成四倍(Brookmeyer 等人，Alzheimer' s&Dementia 3:186-191(2007))?？紤]到 AD 患者在診斷后平均存活8至10年且需要高水平的日常護(hù)理，除喪失生命及降低生活質(zhì)量外，對社會造成的經(jīng)濟(jì)成本也非常巨大。在早期，抱怨自己略微記憶喪失及意識錯亂的患者被鑒定為患有輕度認(rèn)知損傷(MCI)，在一些情況下其會發(fā)展成典型的阿爾茨海默病癥狀，導(dǎo)致嚴(yán)重的智力及社會能力障礙。通常,阿爾茨海默病(AD)的特征在于腦中神經(jīng)炎斑(neuritic plaque)及神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle)的聚積,導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡，隨后進(jìn)行性認(rèn)知衰退。 大多數(shù)當(dāng)前可用的AD療法集中于治療癥狀，但不一定終止疾病進(jìn)展。因此，顯然需要新的途徑以鑒別出能夠保護(hù)神經(jīng)元免受AD衰弱效應(yīng)的療法。大多數(shù)目前用于治療AD的治療途徑是基于廣為接受的“淀粉樣蛋白級聯(lián)假說(amyloid cascade hypothesis)”。此觀點將病理生理學(xué)作用歸因于淀粉樣蛋白-β (Αβ )，該淀粉樣蛋白-β是單體至寡聚體形式的神經(jīng)毒素(neurotoxin)及突觸毒素 (synaptotoxin)、同時以聚合物形式沉積于淀粉樣蛋白斑(amyloid plaque)中，這是AD病理學(xué)的特征之一?？挂幌盗笑ˇ滦问降膯慰寺】贵w被認(rèn)為是有效的，這是因為其使血腦平衡(brain-blood equilibrium)向血液偏移，由此降低腦中的A β儲量。AD病理生理學(xué)的特征不僅在于Αβ沉積于老年斑中，且還包括神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)的聚積。NFT是由成對螺旋纖維與高度磷酸化的tau蛋白連接在一起而形成的原纖維。Tau可在多于30個不同絲氨酸及蘇氨酸殘基(Hanger等人，J. Neurochem. 71 : 2465-2476(1998))以及數(shù)個酪氨酸殘基(Lebouvier等人，JAD 18 :1-9(2009))處經(jīng)多種激酶而短暫磷酸化。在AD中，激酶與磷酸酶活性明顯不平衡，導(dǎo)致產(chǎn)生以NFT形式聚集和堆積的tau蛋白的高度磷酸化形式。輕度認(rèn)知損傷(MCI)最通常定義為具有可測量的記憶損傷，該記憶損傷超出了通常對衰老所的預(yù)期，但未顯示其他癡呆或AD癥狀。MCI似乎代表著介于與正常衰老及早期癡呆有關(guān)的認(rèn)知變化之間的過渡狀態(tài)。當(dāng)主要癥狀是記憶喪失時，此類型的MCI進(jìn)一步細(xì)定義為遺忘型MCI?；加写藖喰蚆CI的個體最可能以每年約10-15%的比率發(fā)展成AD (Grundman M 等人，Arch Neurol. 61, 59-66, 2004)。2005 年公布的一項大規(guī)模研究作為第一個臨床試驗顯示出在第一年試驗期間對MCI患者進(jìn)行治療可延遲轉(zhuǎn)變至AD (Petersen RC等人，NEJM 352，2379-2388，2005)，表明這些患者也代表了對于AD治療干預(yù)的是可行的群體。最近的研究報導(dǎo)，在病原性tau的纏結(jié)小鼠模型中接種抗磷酸化tau肽的疫苗可導(dǎo)致腦中聚積的tau減少并改善與纏結(jié)有關(guān)的行為缺陷(Asuni等人，J. Neurosci. 27 9115-9129(2007))。盡管高度磷酸化的tau及NFT對認(rèn)知喪失及AD進(jìn)展的影響尚未完全了解，但最近的意見表明僅靶向淀粉樣蛋白并不足以在整個病程期間看到改善，這使得靶向其他的或替代的靶標(biāo)成為必須(Oddo等人，J. Biol. Chem. 281 :39413 (2006))。有鑒于此， 可能需要靶向tau蛋白的疾病構(gòu)象的活性疫苗途徑來產(chǎn)生對于AD及MCI有效的治療疫苗。此外，除AD及MCI外還有許多疾病也與tau病變(tau pathology或tauopathies) 有關(guān)，其也可能得益于特異性靶向所涉及致病形式的tau疫苗。這些疾病包括例如額顳癡呆、帕金森病(Parkinson, s disease)、皮克病(Pick' s disease)、進(jìn)行性核上麻痹、 和肌萎縮側(cè)索硬化/帕金森病-癡呆綜合癥(參見，例如Spires-Jones等人，TINS 32 150-9(2009))。發(fā)明概述本發(fā)明提供包含至少一種抗原性tau肽的新的免疫原、免疫原性組合物和藥物組合物，所述抗原性tau肽能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、特別是抗體應(yīng)答，導(dǎo)致產(chǎn)生針對呈致病的高度磷酸化狀態(tài)的自身抗原tau的抗體效價。此類免疫原、免疫原性組合物及藥物組合物展現(xiàn)出多種期望的特性，例如能夠誘導(dǎo)免疫應(yīng)答、特別是抗體應(yīng)答，對于與高度磷酸化tau有關(guān)的神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病及MCI)的誘導(dǎo)及發(fā)展具有治療效果。在一個方面，本發(fā)明提供包含至少一種連接至免疫原性載體的抗原性tau肽的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含選自以下的磷酸-tau表位pSer_396磷酸-tau表位、 pThr-231/pSer-235 憐酸-tau 表位、pThr-231 憐酸-tau 表位、pSer-235 憐酸-tau 表位、 pThr-212/pSer-214 磷酸-tau 表位、pSer-202/pThr-205 磷酸-tau 表位，以及表位。在一個實施例中,所述磷酸-tau表位是pSer-396磷酸-tau表位。在又一實施例中，所述磷酸-tau表位是pThr-231/pSer_235磷酸-tau表位。在又一實施例中，所述磷酸-tau表位是pThr-231磷酸-tau表位,在又一實施例中，所述磷酸_tau表位是pSer_235 磷酸-tau表位。在又一實施例中,所述磷酸-tau表位是pThr-212/pSer_214磷酸-tau表位。在又一實施例中，所述磷酸-tau表位是pSer-202/pThr_205磷酸-tau表位。在又一實施例中，所述磷酸-tau表位是pTyrl8磷酸-tau表位。在另一方面，本發(fā)明提供包含至少一種連接至免疫原性載體的抗原性tau肽的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含選自SEQ ID NO :4、6_26、105及108-112的氨基酸序列。在一個實施例中，所述抗原性tau肽通過式(G)nC表示的接頭共價連接至所述免疫原性載體，其中所述接頭位于所述肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中η是 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在又一實施例中，所述接頭位于所述tau肽的N端，且其中η 為I或2。在另一實施例中，所述接頭位于所述tau肽的C端，且其中η為I或2。在又一實施例中，所述抗原性tau肽包含選自SEQ ID NO :4及6_13的氨基酸序列。在又一實施例中，所述抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :4及6_13的氨基酸序列組成。在又一實施例中，所述抗原性tau肽由SEQ ID NO 11中所示的氨基酸序列組成。在另一實施例中，所述抗原性tau肽包含選自SEQ ID NO :14_19的氨基酸序列。 在又一實施例中，所述抗原性tau肽由選自SEQ ID NO : 14-19的氨基酸序列組成。在又一實施例中，所述抗原性tau肽由SEQ ID NO 16中所示的氨基酸序列組成。在另一實施例中，所述抗原性tau肽包含選自SEQ ID NO :20_24的氨基酸序列。 在又一實施例中，所述抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :20-24的氨基酸序列組成。在又一實施例中，所述抗原性tau肽由SEQ ID NO 21中所示的氨基酸序列組成。在另一實施例中，所述抗原性tau肽包含選自SEQ ID NO :105及108-112的氨基酸序列。在又一實施例中，所述抗原性tau肽由選自SEQ IDNO :105及108-112的氨基酸序列組成。在又一實施例中，所述抗原性tau肽由SEQ ID NO :105中所示的氨基酸序列組成。在一個方面，本發(fā)明提供任何本文所述的免疫原，其中所述免疫原性載體為血藍(lán)蛋白(例如KLH)、血清白蛋白、球蛋白、提取自蛔蟲屬的蛋白質(zhì)、或失活的細(xì)菌毒素。在一個方面，本發(fā)明提供任何本文所述的免疫原，其中所述免疫原性載體選自由 HBcAg VLP, HBsAg VLP及Qbeta VLP組成的組的病毒樣顆粒。在一個實施例中，本發(fā)明提供包含至少兩種本文所述免疫原的組合物。在又一實施例中，所述組合物包含至少三種本文所述的免疫原。在一個實施例中，本發(fā)明提供包含至少兩種本文所述免疫原的組合物，其中a) 第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO 4及6_13的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :14-19的氨基酸序列組成。在另一實施例中，本發(fā)明提供包含至少兩種本文所述免疫原的組合物，其中a) 第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO 4及6_13的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :20-24的氨基酸序列組成。在另一實施例中，本發(fā)明提供包含至少兩種本文所述免疫原的組合物，其中a) 第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :14-19的氨基酸序列組成；且幻第二種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :20-24的氨基酸序列組成。在又一實施例中，本發(fā)明提供包含至少兩種本文所述免疫原的組合物，其中a) 第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO 4及6_13的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽選自SEQ ID NO :105及108-112。在又一實施例中，本發(fā)明提供包含至少兩種本文所述免疫原的組合物，其中a) 第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :14-19的氨基酸序列組成；且幻第二種免疫原的抗原性tau肽選自SEQ ID NO :105及108-112。在又一實施例中，本發(fā)明提供包含至少兩種本文所述免疫原的組合物，其中a) 第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :20-24的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽選自SEQ ID NO :105及108-112。在另一實施例中，本發(fā)明提供包含本文所述四種免疫原中的至少三種免疫原的組合物，其中a)第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :4及6_13的氨基酸序列組成山)第二種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ IDNO :14-19的氨基酸序列組成；且c)第三種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQ ID NO :20-24的氨基酸序列組成；d)第四免種疫原的抗原性tau肽選自SEQ ID NO :105及108-112。
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在又一實施例中，本發(fā)明提供任何本文所述的組合物，其中所述抗原性tau肽中的每一種獨立地通過式(G)nC所表示的接頭共價連接至所述免疫原性載體，其中這些接頭中的每一種獨立地位于所述tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中各個η 獨立地為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在又一實施例中，本發(fā)明提供任何本文所述的組合物，其中所述接頭中的每一種位于該tau肽的N端且其中各η獨立地為I或2。在另一方面，本發(fā)明提供包含四種免疫原中的至少三種免疫原的組合物，其中a) 第一種免疫原包含至少一種連接至Qbeta VLP的抗原性tau肽,其中所述抗原性tau肽由 SEQ ID NO: 11組成，且其中所述肽通過式(G)nCK表示的接頭共價連接至所述VLP，其中所述接頭位于所述tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(以6)11-肽)，且其中11是1或2山)第二種免疫原包含至少一種連接至Qbeta VLP的抗原性tau肽,其中所述抗原性tau肽由SEQ IDNO 16組成，且其中所述肽通過式(G)nC表示的接頭共價連接至所述VLP，其中所述接頭位于所述tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中η是I或2;且c)第三種免疫原包含至少一種連接至Qbeta VLP的抗原性tau肽,其中所述抗原性tau肽由SEQ ID NO 21組成，且其中所述肽經(jīng)由式(G)nC表示的接頭共價連接至所述VLP，其中所述接頭位于所述tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C (G)n-肽)，且其中η是I或2 ;d)第四種免疫原包含至少一種連接至Qbeta VLP的抗原性tau肽,其中所述抗原性tau肽由SEQ IDNO :105 組成，且其中所述肽通過式(G)nC表示的接頭共價連接至所述VLP，其中所述接頭位于所述 tau肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)，且其中η為I或2。在一個實施例中，第一、第二及第三免疫原的所述接頭中的每一種位于所述抗原性tau肽中的每一種的N端，且其中對于所述接頭中的每一種，η為2。在另一方面，本發(fā)明提供包含任何本文所述免疫原或組合物的組合物，其進(jìn)一步包含至少一種佐劑，所述佐劑選自明帆、含CpG寡核苷酸、及基于阜苷的佐劑。在又一方面，本發(fā)明提供包含任何本文所述的免疫原或組合物、及藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。在一個實施例中，至少一種佐劑是選自CpG 7909 (SEQ ID NO :27)、 CpG 10103 (SEQ ID NO 28)及 CpG 24555 (SEQID NO 29)的含 CpG 寡核苷酸。在又一方面，本發(fā)明提供包含任何本文所述免疫原或組合物、及藥物可接受的賦形劑的藥物組合物。在另一方面，本發(fā)明提供一種免疫方法，其包括向哺乳動物施用任何本文所述的免疫原、組合物或藥物組合物。例如，在一個方面，所述施用是通過使用醫(yī)藥有效劑量的任何本文所述免疫原、組合物或藥物組合物來實施。在另一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物tau相關(guān)神經(jīng)學(xué)病癥的方法，其包括向所述哺乳動物施用治療有效量的任何本文所述的免疫原、免疫原性組合物或藥物組合物。在一個方面,所述施用是通過使用醫(yī)藥有效劑量的任何本文所述免疫原、組合物或藥物組合物來實施。在另一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物tau相關(guān)神經(jīng)學(xué)病癥的方法，其包括向所述哺乳動物施用a)醫(yī)藥有效劑量的任何本文所述的免疫原、免疫原性組合物或藥物組合物；及《醫(yī)藥有效劑量的至少一種佐劑。在一個實施例中，所述至少一種佐劑選自明礬、含 CpG寡核苷酸及基于皂苷的佐劑。在又一實施例中，所述至少一種佐劑是選自CpG 7909 (SEQ ID NO 27), CpG 10103 (SEQ ID N0:28)、以及 CpG 24555 (SEQ ID NO 29)的含 CpG 寡核苷酸。在又一實施例中，所述神經(jīng)學(xué)病癥時阿爾茨海默病。在另一實施例中，所述神經(jīng)學(xué)病癥被診斷為輕度認(rèn)知損傷。在另一實施例中，所述神經(jīng)學(xué)病癥被診斷為遺忘型MCI。在另一實施例中，本發(fā)明提供了任何本文所述的免疫原、組合物或藥物組合物用于制造藥物的用途。例如，在一個方面，所述藥物可用于治療哺乳動物tau相關(guān)的神經(jīng)學(xué)病癥。在一個實施例中，所述神經(jīng)學(xué)病癥位阿爾茨海默病。在另一實施例中，所述神經(jīng)學(xué)病癥被診斷為輕度認(rèn)知損傷(MCI)。在另一實施例中，所述神經(jīng)學(xué)病癥被診斷為遺忘型MCI。在又一方面，本發(fā)明提供應(yīng)答任何本文所述免疫方法而產(chǎn)生的分離的抗體，其中所述抗體特異性結(jié)合高度磷酸化形式的人類tau。在又一方面，本發(fā)明提供治療哺乳動物tau相關(guān)神經(jīng)學(xué)病癥的方法，其包括向所述哺乳動物施用特異性結(jié)合高度磷酸化形式的人類tau的抗體，且其中所述抗體是應(yīng)答任何本文所述免疫方法而產(chǎn)生。在又一方面，本發(fā)明提供任何本文所述抗體用以制造用于治療哺乳動物tau相關(guān)神經(jīng)學(xué)病癥的藥物的用途。在一個實施例中，所述神經(jīng)學(xué)病癥為阿爾茨海默病。在另一實施例中，所述神經(jīng)學(xué)病癥被診斷為輕度認(rèn)知損傷(MCI)。在另一實施例中，所述神經(jīng)學(xué)病癥被診斷為遺忘型MCI。在又一方面中，本發(fā)明提供一種分離的肽，其由選自SEQ ID NO :4、6至26、31至76 以及105至122的氨基酸序列組成或基本上由上述氨基酸序列所組成。在又一方面，本發(fā)明提供編碼任何所述分離肽的分離核酸。在又一方面，本發(fā)明提供包含任何所述核酸的表達(dá)載體。在又一方面，本發(fā)明提供包含任何所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。附圖簡述圖IA及IB顯示了如實施例5所述的經(jīng)皮下免疫的Balb/c小鼠組的描述，以及效價和選擇性結(jié)果。用300 μ g肽、100 μ g肽-KLH或100 μ g肽-VLP經(jīng)皮下免疫Balb/c小鼠。在列出的情形中用50μ TiterMax Gold(Alexis Biochemicals)作為佐劑。在抗原特異性效價確定測定法(參見實施例13)中所測試的血清稀釋度介于I : 30至I : 7，290 范圍內(nèi)。圖2顯示如實施例5所述的經(jīng)免疫的Balb/c小鼠組的描述、以及效價結(jié)果。經(jīng)皮下免疫Balb/c小鼠。在列出的情形中使用50 μ L TiterMax Gold作為佐劑。在抗原特異性效價確定測定法(參見實施例13)中所測試的血清稀釋度介于I : 900至I : 1，968，300 范圍內(nèi)。圖3顯示如實施例6所進(jìn)一步闡述的經(jīng)皮下免疫的Balb/c小鼠的描述。使用IOOyg肽初免，并使用IOOyg肽-VLP加強(qiáng)免疫。在列出的情形中使用750 μ g明礬 (Al(OH)3)作為佐劑。在抗原特異性效價確定測定法(參見實施例13)中測試的血清稀釋度介于I : 800至I : 1,750,000范圍內(nèi)。ND意指未進(jìn)行測定。圖4A、4B及4C顯示如實施例7所述的經(jīng)肌內(nèi)免疫的TG4510++小鼠的結(jié)果。圖4A 顯示組I至7的效價結(jié)果，而圖4B顯示組8至17的效價結(jié)果。圖4C顯示組I至6的選擇性結(jié)果。CPG是CpG-24555。明礬是Al (OH) 3。在抗原特異性效價確定測定法(參見實施例 13)中測試的血清稀釋度介于I : 5，000至I : 15，800，000范圍內(nèi)。ND意指未進(jìn)行測定。圖5顯示如實施例8所述的免疫小鼠的描述。通過肌內(nèi)(IM)或皮下(SC)途徑免疫Balb/c小鼠。在列出的情形中使用9(^8肽；1^。在列出的情形中使用1，595 μ g明礬 (Al (OH)3)、20 μ g CpG-24555及12 μ g ABI SCO-1OO0在抗原特異性效價確定測定法(參見實施例13)中測試的血清稀釋度介于I : 5，000至I : 15，800，000范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)曲線檢測的下限為O. 0025mg/mL。NA意指不適用。圖6顯示如實施例11所述的經(jīng)免疫小鼠的描述。經(jīng)肌內(nèi)免疫Balb/c小鼠。使用 100 μ g肽-VLP。在列出的情形中使用252 (750) μ g明礬(Al (OH) 3)。在抗原特異性效價確定測定法(參見實施例13)中測試的血清稀釋度介于I : 500至I : 2，720，000范圍內(nèi)。 ND意指未進(jìn)行測定。圖7顯示如實施例11所述的經(jīng)免疫小鼠的描述。經(jīng)肌內(nèi)免疫Balb/c小鼠。使用 750 Ug明礬(Al(OH)3)作為佐劑。在抗原特異性效價確定測定法(參見實施例13)中測試的血清稀釋度介于I : 500至I : 15，800，000范圍內(nèi)。圖8顯示如實施例12所述的經(jīng)免疫小鼠的描述。經(jīng)肌內(nèi)免疫TG4510-/_(野生型同窩)小鼠。列出時，使用IOOyg各肽-VLP進(jìn)行第O天的初免以及第14天的加強(qiáng)免疫。 使用所列出的量的明礬(Al (OH)3)。采集“未治療”組的血清。在抗原特異性效價確定測定法(參見實施例13)中測試的血清稀釋度介于I : 5，000至I : 15，800，000范圍內(nèi)。圖9顯示如實施例12所述的經(jīng)免疫小鼠的描述。經(jīng)肌內(nèi)免疫TG4510-/_(野生型同窩)小鼠。使用IOOyg的各種肽-VLP進(jìn)行第O天的初免以及第14天的加強(qiáng)免疫。不使用明礬或使用504 μ g明礬(Al (OH)3)。在第21天采集脾。顯示如經(jīng)干擾素-γΤ細(xì)胞 ELIspot (參見實施例14)所測量的每5χ105個脾細(xì)胞的斑點數(shù)量。獲得一組3只脾的結(jié)果。肽HBV-I (SEQ IDNO 77)為不相關(guān)的肽。BSA為不相關(guān)的蛋白質(zhì)。ND表示未進(jìn)行測定。 *表示相對于適當(dāng)?shù)牟幌嚓P(guān)肽或蛋白質(zhì)P小于O. 05。

圖10顯示人類tau同種型2 (Genbank登記號為NP_005901)的氨基酸序列(SEQ ID NO 30)。發(fā)明詳述定義及一般技術(shù)除非本文另有定義，否則結(jié)合本發(fā)明使用的科學(xué)及技術(shù)術(shù)語將具有那些本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常了解的含義。通常，結(jié)合以下所使用的命名及關(guān)于以下的技術(shù)已為本領(lǐng)域所熟知且在本領(lǐng)域常用本文所述的細(xì)胞及組織培養(yǎng)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)及蛋白質(zhì)與核酸化學(xué)、雜交、分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、及醫(yī)學(xué)與醫(yī)藥化學(xué)。除非另有說明，否則本發(fā)明方法及技術(shù)通常按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法并如本說明書全文中所引用及論述的各個概括以及更具體的參考文獻(xiàn)中所述來實施。參見，例如，Sambrook J.&Russell D. Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 3 版， Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2000) ；Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John&Sons 公司(2002) ;Harlow 及 Lane, Using Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N. Y. (1998);及 Coligan 等人，Short Protocols in Protein Science, Wiley, John&Sons公司(2003)。酶促反應(yīng)及純化技術(shù)是按照制造商說明書、按照本領(lǐng)域習(xí)用方法或如本文所述實施。
本文所用的術(shù)語“輕度認(rèn)知損傷(MCI) ”是指一種記憶及認(rèn)知損傷等級，其通常特征在于臨床癡呆評級(clinical dementia rating) (O)R)為O. 5 (參見,例如Hughes等人， Brit. J. Psychiat. 140 =566-572,1982)，且其另外特征在于記憶損傷，但其他認(rèn)知領(lǐng)域的功能未出現(xiàn)損傷。記憶損傷優(yōu)選使用諸如“段落測試(paragraph test) ”等測試來測量。診斷為輕度認(rèn)知損傷的患者通常呈現(xiàn)受損且延遲的回憶表現(xiàn)。輕度認(rèn)知損傷通常與衰老有關(guān)，且通常發(fā)生于45周歲或更大年齡的患者。本文所用的術(shù)語“癡呆”在其最廣泛意義上是指一種精神病的病狀，如美國精神病學(xué)學(xué)會(American Psychiatric Association) Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，第 4 版，Washington，D. C.，1994( “DSM-IV”)中所定義。DSM-IV 將“癡呆”定義為特征在于包括記憶損傷在內(nèi)的多種認(rèn)知缺陷，且按照推測的病因列出各種癡呆。 DSM-IV闡述通常可接受的用于癡呆及相關(guān)精神損傷的診斷、分級及治療的標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)語“Tau”或“tau蛋白”是指與神經(jīng)細(xì)胞中微管的穩(wěn)定化有關(guān)的tau蛋白及廣泛的tau聚集體(例如，神經(jīng)原纖維纏結(jié))的組份。具體而言，本文所用的術(shù)語“tau蛋白” 涵蓋任何多肽，該多肽包含SEQ ID NO :30的人類tau、或經(jīng)修飾或未經(jīng)修飾的其他人類同種型、或來自任何其他動物的對應(yīng)直向同源物(ortholog)，或者由上述所組成。本文所用的術(shù)語“tau蛋白”進(jìn)一步涵蓋轉(zhuǎn)譯后修飾，包括但不限于對如上文所定義tau蛋白的糖基化、乙?；傲姿峄Ｐg(shù)語“Tau病變”是指tau相關(guān)的病癥或病狀，例如，阿爾茨海默病、進(jìn)行性核上麻痹(PSP)、皮質(zhì)基底節(jié)變性(CBD)、皮克病、與染色體17有關(guān)的額顳癡呆及帕金森病 (FTDP-17)、帕金森病、中風(fēng)、外傷性腦損傷、輕度認(rèn)知損傷及諸如此類。術(shù)語“抗原”與“免疫原”在本文中可互換使用，其是指由MHC分子呈遞的能夠與抗體、B細(xì)胞受體(BCR)或T細(xì)胞受體(TCR)結(jié)合的分子。本文所用的術(shù)語“抗原”及“免疫原”還涵蓋T細(xì)胞表位。另外，抗原能夠被免疫系統(tǒng)識別和/或能夠誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/ 或細(xì)胞免疫應(yīng)答，導(dǎo)致B-淋巴細(xì)胞和/或T-淋巴細(xì)胞激活。然而，至少在某些情形下，這可能需要抗原含有或連接至T輔助細(xì)胞表位并提供抗原一種佐劑?？乖删哂幸换蚨喾N表位(例如，B-表位及T-表位)。上文提及的特異性反應(yīng)意在表明，抗原優(yōu)選與其對應(yīng)的抗體或TCR反應(yīng)(通常以高度選擇性方式)，且不與可能由其他抗原誘發(fā)的大量其他抗體或 TCR反應(yīng)。本文所用的抗原還可以為數(shù)種單一抗原的混合物。術(shù)語“抗原”及“免疫原”均涵蓋(但不限于)多肽。術(shù)語“抗原位點”與術(shù)語“抗原表位”在本文中可互換使用，其是指多肽的可被抗體或T細(xì)胞受體(在MHC分子的情況下)免疫特異性地結(jié)合的連續(xù)或不連續(xù)部分。免疫特異性結(jié)合排除非特異性結(jié)合，但不一定排除交叉反應(yīng)性?？乖稽c通常在該抗原位點所特有的空間構(gòu)象中包含5至10個氨基酸。就氨基酸殘基而言，本文所用的術(shù)語“磷酸化”是指在原本通常存在羥基的殘基側(cè)鏈上存在磷酸酯基團(tuán)。所述磷酸化通常以羥基的氫原子被磷酸酯基團(tuán)(-PO3H2)取代的形式發(fā)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識到，基于局部環(huán)境的PH，此磷酸酯基團(tuán)可以不帶電荷的中性基團(tuán)(-PO3H2)、或帶一個負(fù)電荷(-PO3H-)、或帶兩個負(fù)電荷(-PO/—)的形式存在。通?？杀涣姿峄陌被釟埢ńz氨酸、蘇氨酸及酪氨酸側(cè)鏈。在本發(fā)明全文中，磷酸化的氨基酸殘基以粗體表示并標(biāo)以下劃線。
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如本文所用，以單字母或三字母代碼來表示提及的氨基酸殘基(參見，例如 Lehninger, Biochemistry,第 2 版，Worth Publishers, New York,1975,第 72 頁)。冠詞“一”(a及an)在本文中用以指一個或一個以上(即指至少一個)的該冠詞的語法對象。例如，“一元件”意指一個元件或一個以上的元件。此外，除非上下文另有需要，否則單數(shù)形式應(yīng)包括復(fù)數(shù)，且復(fù)數(shù)形式應(yīng)包括單數(shù)，除非本文另外明確說明。術(shù)語“肽”或“多肽”是指氨基酸的聚合物且不考慮聚合物的長度；因此，蛋白質(zhì)片段、寡肽及蛋白質(zhì)均涵蓋于肽或多肽的定義之內(nèi)。此術(shù)語也未指定或排除多肽的表達(dá)后修飾，例如，術(shù)語多肽明確地涵蓋包括糖基、乙酰基、磷酸酯基團(tuán)、脂質(zhì)基團(tuán)及諸如此類的共價附著的多肽。此定義也包括含有一或多種氨基酸類似物(包括，例如，非天然存在的氨基酸、僅天然存在于不相關(guān)生物系統(tǒng)中的氨基酸、來自哺乳動物系統(tǒng)的經(jīng)修飾氨基酸等) 的多肽、具有經(jīng)取代鍵以及本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他修飾(包括天然存在及非天然存在的)的多肽。本文所用的術(shù)語“tau片段”涵蓋包含本文所定義tau蛋白的至少3、4、5、6、7、8、
9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或 30 個鄰接氨基
酸或由其組成的任何多肽。本文所用的術(shù)語“pSer-396磷酸-tau表位”是指包含氨基酸序列K芑P (即人類 tau序列的Lys-395Ser-396Pro-397)的肽，其中絲氨酸殘基經(jīng)磷酸化，且其中序列編號是基于SEQ ID NO 30所提供的人類tau同種型2。pSer-396磷酸-tau表位的長度通常為約 3個至約25個氨基酸。本文所用的術(shù)語“pThr-231/pSer_235磷酸-tau表位”是指包含氨基酸序列I: PPK S (SEQ ID NO :1)(即人類 tau 序列的 Thr-231Pro-232Pro-233Lys-234Ser-235)的肽， 其中蘇氨酸及絲氨酸殘基各自經(jīng)磷酸化，且其中序列編號是基于SEQ ID N0:30提供的人類 tau同種型2。這些表位的長度通常為約5個至約25個氨基酸。所述pThr-231/pSer_235 磷酸-tau表位也可指該表位的包含磷酸化Thr-231殘基但不包括磷酸化Ser_235殘基或包含磷酸化Ser-235殘基但不包括磷酸化Thr-231表位的形式。該表位的這些形式的長度通常為約3個至約20個氨基酸。本文所用的術(shù)語“pThr-212/pSer_214磷酸-tau表位”是指包含氨基酸序列I: P芑 (即人類tau序列的Thr-212PiO-213Ser-214)的肽，其中蘇氨酸及絲氨酸殘基各自經(jīng)磷酸化，且其中序列編號是基于SEQ ID NO :30提供的人類tau同種型2。pThr-212/pSer_214 磷酸-tau表位的長度通常為約3個至約25個氨基酸。本文所用的術(shù)語“pSer-202/pThr_205磷酸-tau表位”是指包含氨基酸序列S PGT (SEQ ID NO :3)(即人類 tau 序列的 Ser-202Pro-203Gly-204Thr-205)的肽，其中絲氨酸及蘇氨酸殘基各自經(jīng)磷酸化，且其中序列編號是基于SEQ ID NO :30提供的人類tau同種型2。pSer-202/pThr-205磷酸-tau表位的長度通常為約4個至約25個氨基酸。本文所用的術(shù)語“純化”及“分離”為同義詞。例如，就多肽而言，術(shù)語“分離”或 “純化”根據(jù)起源或衍生源是指如下多肽(I)不與在其天然狀態(tài)下伴隨其的天然結(jié)合組份相結(jié)合；(2)基本上不含來自相同物種的其他蛋白質(zhì)；(3)由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)；或
(4)在天然狀態(tài)下不存在。因此，經(jīng)化學(xué)合成或在不同于多肽天然起源的細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽是與其天然結(jié)合組份“分離”的。還可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)通過分離使多肽基本上不含天然結(jié)合組份。當(dāng)至少約60%至75%的試樣呈現(xiàn)單一種類的多肽時，多肽為“基本上純凈”、“基本上均質(zhì)”或“基本上純化”。多肽可以為單體或聚合物?；旧霞儍舻亩嚯耐ǔ？烧嫉鞍踪|(zhì)試樣的約50 %、60 %、70 %、80 %或90 % w/w，更通常約95%，且優(yōu)選地可為99%以上純凈。蛋白質(zhì)純度或均質(zhì)性可由本領(lǐng)域熟知的多種方式來展現(xiàn)，例如進(jìn)行蛋白質(zhì)試樣的聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后在用本領(lǐng)域熟知染色劑染色凝膠后目測單個多肽條帶。出于某些目的，可通過使用HPLC或本領(lǐng)域熟知的其他方式進(jìn)行純化來提供更高的分辨率。本文所用的術(shù)語tau相關(guān)神經(jīng)學(xué)病癥意指tau (尤其tau的高度磷酸化形式)被認(rèn)為起作用的任何疾病或其他病狀。所述病癥、疾病和/或病狀通常與存在神經(jīng)原纖維纏結(jié)(通常涉及tau的高度磷酸化形式)有關(guān)，且包括(但不限于)阿爾茨海默病、MCI、額顳癡呆、皮克病、進(jìn)行性核上麻痹、皮質(zhì)基底節(jié)變性、關(guān)島型帕金森病-癡呆綜合癥及其他tau 病變。本文所用的術(shù)語“抗原性tau肽”涵蓋所有tau衍生多肽，例如來自哺乳動物物種， 例如來自人類，以及其呈現(xiàn)“抗原性tau肽生物活性”的變體、類似物、直向同源物、同源物及衍生物、及其片段。例如，術(shù)語“抗原性tau肽”是指包含選自SEQ ID N0:1至26、31至 76、及105-122的氨基酸序列、由這些氨基酸序列組成或基本上由這些氨基酸序列組成的多肽、以及其呈現(xiàn)基本上相同生物活性的變體、同源物及衍生物。本文所用的術(shù)語“抗原性tau肽生物活性”是指本發(fā)明抗原性tau肽在個體中誘導(dǎo)具有拮抗性質(zhì)的自身tau抗體的能力，所述自身抗體能夠降低高度磷酸化的致病形式的 tau的含量，同時基本上不能夠結(jié)合正常的非高度磷酸化、非致病形式的tau。此外，可對具有抗原性tau肽生物活性的抗原性tau肽進(jìn)行設(shè)計以使施用至患者后tau特異性T細(xì)胞應(yīng)答降低至最低程度。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明了可使用何種技術(shù)來證實特定構(gòu)建體是否在本發(fā)明范圍內(nèi)。這些技術(shù)包括(但不限于)本發(fā)明實施例部分中所述的技術(shù)以及以下技術(shù)?？蓪哂型贫乖詔au肽生物活性的肽進(jìn)行分析以確定該肽的免疫原性(例如，確定由推定肽產(chǎn)生的抗血清是否結(jié)合高度磷酸化形式的tau，而基本上不結(jié)合非高度磷酸化、非致病形式的tau)。此外，可對具有推定抗原性tau肽生物活性的肽進(jìn)行分析以確定該肽是否實質(zhì)上誘導(dǎo)tau特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答。本文所用的術(shù)語“高度磷酸化”或“異常磷酸化”是指每個tau分子含有至少約 7個(即約7個或更多個)磷酸酯基團(tuán)的tau(參見,例如Kopke等人，J. Biol Chem 268 24374-84(1993))。高度磷酸化tau是發(fā)現(xiàn)于AD患者中的神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFT)及成對螺旋纖維(PHF)的主要組份，且高度磷酸化是造成tau的正常生物活性喪失及自聚集的原因。一些tau殘基通常僅在其致病的高度磷酸化形式(例如PHF及NFT)中被發(fā)現(xiàn)為磷酸化。這些殘基包括 Ser-202、Thr-205、Thr-212、Ser-214、Thr-231, Ser-235, Ser-396 和 / 或Ser-404、Tyr-18。因此，在通常不參與tau與微管的結(jié)合的多個位點上、尤其在tau的微管結(jié)合區(qū)域兩側(cè)的脯氨酸富集區(qū)域中發(fā)現(xiàn)的位點上磷酸化且包含PHF及NFT的主要組份的tau蛋白也涵蓋于術(shù)語高度磷酸化tau或異常磷酸化tau的范圍內(nèi)?？乖詔au肽人類tau蛋白是微管相關(guān)蛋白，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元中相對富集，但在其他區(qū)域中并不常見。在腦組織中，作為tau基因的外顯子2、3及10的可變剪接的結(jié)果，tau 以六種不同同種型存在。對于本發(fā)明的所有tau肽，人類tau同種型2 (SEQ ID NO :30)在本文中被用作氨基酸編號的參考。Tau通常與微管蛋白相互作用以穩(wěn)定微管并促進(jìn)微管蛋白組裝成微管，以及提供蛋白質(zhì)的軸突運輸。Tau是由發(fā)育調(diào)控的磷蛋白，在成人腦中在正常狀態(tài)下通常每個分子含有2個至3個磷酸酯基團(tuán)。然而，tau可在多于30個不同殘基處、主要在Ser/Thr-Pro基序處經(jīng)不同激酶短暫磷酸化(Hanger等人，J. Neurochem. 71 2465-2476(1998))。本發(fā)明的抗原性tau肽通常具有較小大小，由此他們模擬了選自整個tau蛋白的區(qū)域，在其中發(fā)現(xiàn)了致病形式的tau中的表位。如先前所述，此類致病形式的tau通常特征在于tau蛋白內(nèi)某些氨基酸處經(jīng)磷酸化。因此，本發(fā)明的抗原性tau肽的長度通常小于100 個氨基酸，例如小于75個氨基酸，例如小于50個氨基酸。本發(fā)明的抗原性tau肽的長度通常為約 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29或約30個氨基酸。序列表中提供的本發(fā)明抗原性tau肽的具體實施例包括長度介于4 個至31個氨基酸范圍內(nèi)的肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)明了，此類抗原肽通常具有游離N端，且可具有羧基化或酰胺化的C端。本發(fā)明的抗原肽包含衍生自高度磷酸化或致病形式的人類tau的一部分的氨基酸序列。具體而言，此類抗原性tau肽通常包含特異性磷酸-tau表位，其在文獻(xiàn)中可參考結(jié)合此類表位的抗體而提及(例如PHF1、TG3、AT8和/或AT100 ;參見，例如Hanger 等人，J. Biol. Chem. 282(32) :23645-23654(2007) ；Pennanen 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 337 :1097-1101 (2005) ；Porzig 等人，Biochem. Biophys. Res. Comm. 358 : 644-649(2007))。本發(fā)明已識別出人類tau蛋白的特異性抗原區(qū)，當(dāng)單獨或彼此組合使用時其可有利地用于引發(fā)針對致病形式的高度磷酸化tau的免疫應(yīng)答。例如，pSer-396磷酸-tau表位通常為包括磷酸化絲氨酸殘基Ser-396惡人類tau片段。此類片段的長度通常為約3個至約 20 個氨基酸(例如 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)，且在 Ser-396的N端及C端側(cè)包括至少一個來自天然人類tau序列的氨基酸。例如，pSer-396 磷酸-tau表位通常包含如SEQ ID NO 30中所示人類tau序列的殘基395、396及397 (即 Lys-395Ser-396Pro_397,其中Ser-396經(jīng)憐酸化)。這些pSer-396表位還可進(jìn)一步包含天然人類序列的磷酸化絲氨酸殘基Ser-404。包含pSer-396磷酸-tau表位的tau肽的實例以 SEQ ID NO :4 及 6-13 提供。此外，例如，pThr-231/pSer_235磷酸-tau表位通常是包括磷酸化蘇氨酸殘基 Thr-231及磷酸化絲氨酸殘基Ser-235 二者的人類tau片段。或者，pThr-231/pSer_235磷酸-tau表位僅包括Thr-231或Ser-235之一。此類表位的長度通常為約3個至約20個氨基酸(例如 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個)，且在 Thr-231 的 N端側(cè)包括至少一個來自天然人類tau序列的氨基酸(即Arg-230)和/或在Ser-235的C 端側(cè)包括至少一個氨基酸(即Pro-236)。包含pThr-231/pSer-235表位的tau肽的實例以 SEQ ID NO 14-19 提供。此外，例如，pThr-212/pSer_214磷酸-tau表位通常為包括磷酸化蘇氨酸殘基 Thr-212及磷酸化絲氨酸殘基Ser-214的人類tau片段。此類表位的長度通常為約3個至約 20 個氨基酸(例如 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個)，且在Thr-212的N端側(cè)包括至少一個來自天然人類tau序列的氨基酸(即Arg-211)及在 Ser-214的C端側(cè)包括至少一個氨基酸(即Leu-215)。包含pThr-212/pSer_214表位的 tau肽的實例以SEQ ID NO :20-24提供。此外，例如，pSer-202/pThr-205磷酸-tau表位通常為包括磷酸化絲氨酸殘基 Ser-202及磷酸化蘇氨酸殘基Thr-205的人類tau片段。此類表位的長度通常為約6個至約 20 個氨基酸(例如 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個)，且在 Ser-202 的N端側(cè)通常包括至少一個來自天然人類tau序列的氨基酸(即Gly-201)及在Thr-205 的C端側(cè)包括至少一個氨基酸(即Pro-206)。包含pSer-202/pThr_205表位的tau肽的實例以SEQ ID NO : 25提供。此外，例如，pTyr-18磷酸-tau表位通常為包括磷酸化酪氨酸殘基Tyr-18的人類 tau片段。此類表位的長度通常為約6個至約20個氨基酸(例如6、7、8、9、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19或20個)，且在Tyr-18的N端側(cè)通常包括至少一個來自天然人類tau 序列的氨基酸(即Thr-17)及在Tyr-18的C端側(cè)包括至少一個氨基酸(即Gly-19)。包含 pTyr-18表位的tau肽的實例以SEQ ID NO :112提供。本發(fā)明的抗原性tau肽還可包括包含上文所述磷酸-tau表位的tau肽,包括少數(shù)氨基酸已經(jīng)取代、添加或缺失但基本上仍保留相同免疫特性的肽。另外，此類衍生的抗原性 tau肽可進(jìn)一步經(jīng)氨基酸修飾,尤其在N端及C端末端，以使抗原性tau肽在構(gòu)象上受局限和/或使抗原性tau肽與免疫原性載體在實施適當(dāng)化學(xué)處理后偶合。本發(fā)明的抗原性tau肽還涵蓋衍生自氨基酸已經(jīng)缺失、插入或取代但其免疫特性基本上未減弱的tau的氨基酸序列的功能活性變體肽，即此類功能變體肽保留實質(zhì)的抗原性tau肽生物活性。通常，此類功能變體肽與任何SEQ ID NO :1至26、31至76及105-122 中所述的氨基酸序列具有氨基酸序列同源性，優(yōu)選高度同源性。在一個方面中，所述功能活性變體肽呈現(xiàn)與選自由SEQ ID NO : I至26、31至76及 105-122 組成的組的氨基酸序列至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%, 97 %、98 %或99 %的一致性。多肽的氨基酸序列一致性可使用諸如Bestfit、FASTA或BLAST等公知的計算機(jī)程序以常規(guī)方式來確定(參見，例如Pearson, Methods Enzymol. 183 :63-98(1990)； Pearson, Methods Mol. Biol. 132 :185-219(2000) ；Altschul 等人，J. Mol. Biol. 215 : 403-410(1990) ；Altschul 等人，Nucelic Acids Res. 25 :3389-3402(1997))。當(dāng)使用 Bestfit或任何其他序列比對程序來確定特定序列是否與參考氨基酸序列(例如)95% — 致時，可設(shè)置參數(shù)以在參考氨基酸序列的全長范圍內(nèi)計算一致性百分比，且容許引入占參考序列中的全部氨基酸殘基高達(dá)5%的同源性空位(gap)。此上文提及的確定多肽間一致性百分比的方法可適用于本文所公開的所有蛋白質(zhì)、其片段或變體。功能活性變體包含天然存在的功能活性變體，例如等位基因變體及種類變體 (species variant);以及可通過例如誘變技術(shù)或通過直接合成來制備的非天然存在的功能活性變體。功能活性變體與SEQ ID NO :I至26及31至76中所示的任一種肽相差約例如I、
2、3、4、5、6、7、8、9或10個氨基酸殘基，但仍保留抗原tau生物活性。當(dāng)此種比較需要進(jìn)行比對時，可針對最大同源性對序列進(jìn)行比對。變化位點可位于肽中的任何地方，只要生物活性與任何SEQ ID NO :1至26、31至76及105-122中所示的肽基本上類似即可。關(guān)于如何實施表型沉默氨基酸取代的指導(dǎo)在Bowie等人，Science, 247 1306-1310 (1990)中有提供，該文獻(xiàn)指出，主要有兩種策略用于研究氨基酸序列對變化的耐受性。第一種策略利用進(jìn)化過程期間自然選擇的氨基酸取代耐受性。通過比較不同物種中的氨基酸序列，可識別在各物種間保守的氨基酸位置。此類保守氨基酸對于蛋白質(zhì)功能可能非常重要。相比之下，自然選擇耐受的取代所處的氨基酸位置表示對于蛋白質(zhì)功能并不重要的位置。因此，可對耐受氨基酸取代的位置進(jìn)行修飾，同時仍保留經(jīng)修飾肽的特定免疫原性活性。第二種策略利用基因工程在克隆基因的特定位置上引入氨基酸變化以識別對于蛋白質(zhì)功能極為重要的區(qū)域。例如，可利用定點誘變或丙氨酸掃描誘變(Cunningham等人， Science, 244 :1081-1085 (1989))。隨后可針對特定抗原tau生物活性對所得變體肽進(jìn)行測試。按照Bowie等人，所述兩種策略揭示蛋白質(zhì)對于氨基酸取代令人驚奇地耐受。作者進(jìn)一步指出在蛋白質(zhì)中的某些氨基酸位置上何種氨基酸變化可能是許可的。例如，最隱匿或最內(nèi)部(在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)中)的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，然而很少表面或外部側(cè)鏈特征通常是保守的。向蛋白質(zhì)的氨基酸中引入突變的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見，例如， Ausubel (編輯)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons 公司(1994) ;Τ· Maniatis, E. F. Fritsch 及 J. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor, N. Y. (1989))。還可使用諸如“QuikChangeTM定點誘變試劑盒” (Stratagene)等市售試劑盒來引入突變。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠通過替代不顯著影響抗原性tau肽的功能的氨基酸來制備該抗原性tau肽的功能活性變體。保守氨基酸取代是可在本發(fā)明肽之一中實施的一種氨基酸取代?！氨Ｊ匕被崛〈睘槠渲幸话被釟埢闪硪痪哂杏兄嗨苹瘜W(xué)特性(例如，電荷或疏水性)的側(cè)鏈R基團(tuán)的氨基酸殘基所取代的取代。通常，保守氨基酸取代不會實質(zhì)改變蛋白質(zhì)的功能特性。在其中兩個或更多個氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情形下， 可上調(diào)百分比序列一致性或相似度以校正取代的保守性質(zhì)。用于進(jìn)行此調(diào)整的方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見例如，Pearson，Methods Mol. Biol. 243 :307-31 (1994))。具有有著相似化學(xué)特性側(cè)鏈的各組氨基酸的實例包括1)脂肪族側(cè)鏈甘氨酸、 丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸；2)脂肪族羥基側(cè)鏈絲氨酸及蘇氨酸；3)含酰胺側(cè)鏈 天冬酰胺及谷氨酰胺；4)芳香族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；5)堿性側(cè)鏈賴氨酸、 精氨酸及組氨酸；6)酸性側(cè)鏈天冬氨酸及谷氨酸；以及7)含硫側(cè)鏈半胱氨酸及甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代基團(tuán)為纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘?，保守替代是Gonnet 等人，Science 256:1443-45(1992)中公開的 PAM250 對數(shù)相似度矩陣中具有正值的任何改變?！爸卸缺Ｊ亍碧娲窃赑AM250對數(shù)相似度矩陣中具有非負(fù)值的任何改變。
功能活性變體肽還可使用雜交技術(shù)進(jìn)行分離。簡言之，使用與編碼目標(biāo)肽、多肽或蛋白質(zhì)(例如SEQ ID N0:1至26、31至76及105-122)的完整或部份核酸序列具有高度同源性的DNA來制備功能活性肽。因此，本發(fā)明的抗原性tau肽還包括與任何SEQ ID NO :I 至26及31至76具同等功能且可由與編碼任何SEQ ID NO :I至26、31至76及105-122的核酸雜交的核酸分子編碼的肽、或其互補(bǔ)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用容易獲得的密碼子列表很容易即可決定編碼本文所公開肽的核酸序列。因此，本文中并未提供此類核酸序列。編碼功能活性變體的肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸的雜交嚴(yán)格性例如為10%甲酰胺、 5XSSPE、1 XDenhart溶液及IX鮭魚精子DNA(低度嚴(yán)格條件)。更優(yōu)選條件為25%甲酰胺、5X SSPE、1 XDenhart溶液及I X鮭魚精子DNA(中度嚴(yán)格條件)，更優(yōu)選的條件為50% 甲酰胺、5XSSPE、lXDenhart溶液及IX鮭魚精子DNA(高度嚴(yán)格條件)。然而，除上述甲酰胺濃度外，數(shù)種因素會影響雜交嚴(yán)格性，且本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)剡x擇此類因素以實現(xiàn)類似的嚴(yán)格性。編碼功能活性變體的核酸分子還可使用編碼目標(biāo)肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸分子 DNA的一部分(例如任何SEQ ID NO :1至26、31至76及105-122中所示的肽)作為探針， 通過基因擴(kuò)增方法(例如PCR)分離。肽/蛋白質(zhì)的制備本發(fā)明多肽可衍生自天然來源及自哺乳動物分離得到，所述哺乳動物(例如)為人類、靈長類動物、貓、狗、馬、小鼠或大鼠。因此，本發(fā)明多肽可使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)自細(xì)胞或組織來源分離得到?；蛘?，多肽可由化學(xué)方式合成或使用重組DNA技術(shù)制備。例如，本發(fā)明多肽(例如 tau片段)可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的固相程序合成?？墒褂谩癟-boc”或“F-moc”程序來適當(dāng)?shù)睾铣伞－h(huán)肽可使用熟知的“F-moc”程序及聚酰胺樹脂在全自動設(shè)備中通過固相方法來合成?；蛘撸绢I(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解手動實施此過程所需要的實驗室程序。固相合成的技術(shù)及程序闡述于Solid Phase Peptide Synthesis A Practical Approach,E. Atherton 及 R. C. Sheppard,由 IRL 在 Oxford University Press 出版(1989)；以及 Methods in Molecular BioIory,第 35 卷妝合成方案(M. ff. Pennington 及 B. M. Dunn 編輯)，第 7 章, 第 91-171 頁，D. Andreau 等人著。或者，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的技術(shù)將編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸引入至可在適宜的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的表達(dá)載體中，隨后分離或純化所表達(dá)的目標(biāo)多肽。本領(lǐng)域可得到各種細(xì)菌、酵母、植物、哺乳動物及昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，且可使用任何所述的表達(dá)系統(tǒng)。任選地，可在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中翻譯編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸。本發(fā)明的抗原性tau肽還可包含由于存在多種基因、選擇性轉(zhuǎn)錄事件、選擇性RNA 剪接事件及選擇性翻譯及翻譯后事件而產(chǎn)生者。多肽可在以下系統(tǒng)中表達(dá)獲得的翻譯后修飾與在天然細(xì)胞中表達(dá)多肽時所存在的基本上相同的系統(tǒng)，例如培養(yǎng)的細(xì)胞；或?qū)е略谔烊患?xì)胞中表達(dá)時存在的翻譯后修飾(例如糖基化或裂解)改變或刪除的系統(tǒng)。本發(fā)明多肽(例如抗原tau多肽)可以含有其他非tau或非tau衍生氨基酸序列的融合蛋白形式來制備，此類其他非tau或非tau衍生氨基酸序列例如為本文所述的氨基酸接頭或信號序列或免疫原性載體、以及可用于蛋白質(zhì)純化的配體，例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、組氨酸標(biāo)簽及葡萄球菌蛋白質(zhì)A。融合蛋白中可存在不止一種本發(fā)明抗原tau多肽。例如，可將異源多肽融合至本發(fā)明多肽的N端或C端。本發(fā)明多肽還可以包含同源氨基酸序列(即，其他tau或tau衍生序列)的融合多肽形式來制備。受局限的肽本發(fā)明的抗原性tau肽可以是線性的或在構(gòu)象上受局限的。如本文所用，就分子而言，術(shù)語“構(gòu)象上受局限”意指隨時間流逝分子(例如多肽)的三維結(jié)構(gòu)基本上保持一種空間排列。構(gòu)象上受局限的分子可具有改良特性，例如增強(qiáng)的親和性、免疫原性、代謝穩(wěn)定性、膜通透性或溶解性。另外，預(yù)期此類構(gòu)象上受局限的分子會以與天然構(gòu)象類似的構(gòu)象提供抗原tau表位，由此誘導(dǎo)更易識別自身tau分子的抗-tau抗體。構(gòu)象局限方法已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，且包括(但不限于)橋連及環(huán)化?，F(xiàn)有技術(shù)中已知數(shù)種向線性肽或多肽鏈中引入構(gòu)象局限的途徑。例如，使肽中的兩個鄰近氨基酸橋連產(chǎn)生局部構(gòu)象修飾，與規(guī)則肽的彈性相比，其彈性有限。形成此類橋鍵的一些可能方式包括納入內(nèi)酰胺及六氫卩比嗪酮(參見,例如Giannis及Kolter, Angew. Chem. Int. Ed.，32 :1244 (1993))。如本文所用，就肽而言，術(shù)語“環(huán)狀”是指在兩個非毗鄰氨基酸或氨基酸類似物之間包括分子內(nèi)鍵的結(jié)構(gòu)。環(huán)化可通過共價或非共價鍵來實現(xiàn)。分子內(nèi)鍵包括(但不限于) 骨架與骨架、側(cè)鏈與骨架、側(cè)鏈與側(cè)鏈、側(cè)鏈與端基、及端部與端部之間的鍵。環(huán)化方法包括 (但不限于)在非毗鄰氨基酸或氨基酸類似物的側(cè)鏈之間形成二硫鍵；在Lys與Asp/Glu 殘基側(cè)鏈之間形成酰胺鍵；在絲氨酸殘基與Asp/Glu殘基之間形成酯鍵；形成內(nèi)酰胺鍵，例如，在一種氨基酸或其類似物的側(cè)鏈基團(tuán)與氨基末端殘基的N端胺之間；及形成賴氨酸正亮氨酸及二酪氨酸鍵。還可使用碳形式的二硫鍵，例如乙烯基或乙基鍵(J. Peptide Sc. 14 898-902(2008))，以及使用經(jīng)適當(dāng)多取代的親電試劑(例如二 _、三-或四鹵代烷烴)實施烷基化反應(yīng)(PNAS, 105 (40), 15293-15298 (2008) ;ChemBioChem，6 :821-824 (2005))。還可使用經(jīng)各種修飾的脯氨酸類似物來向肽中納入構(gòu)象局限(Zhang等人，J. Med Chem. ,39 2738-2744 (1996) ；Pfeifer 及 Robinson, Chem. Comm.，1977-1978 (1998))?？衫没瘜W(xué)方式使本發(fā)明肽環(huán)化，以產(chǎn)生利用包括但不限于以下鍵環(huán)化的肽內(nèi)酰胺、腙、肟、噻唑啶、硫醚或锍鍵。設(shè)計構(gòu)象受局限肽的另一途徑(闡述于美國專利公開第2004-0176283號中)是將較短的目標(biāo)氨基酸序列附著至模板上以產(chǎn)生環(huán)狀受限肽。此類環(huán)肽不僅通過其模板在結(jié)構(gòu)上保持穩(wěn)定，由此提供可模仿病毒及寄生蟲上的構(gòu)象表位的三維構(gòu)象，而且與線性肽相比其對血清中的蛋白水解降解更具抗性。美國專利公開第2004-0176283號進(jìn)一步揭示構(gòu)象受局限交聯(lián)肽的合成，其通過制備骨架偶合至適當(dāng)定位的氨基酸以穩(wěn)定肽的超二級結(jié)構(gòu)的合成氨基酸來實施。交聯(lián)可通過使經(jīng)正交保護(hù)的(2S，3R)-3-胺基脯氨酸殘基的一級氨基與谷氨酸鹽的適當(dāng)定位的側(cè)鏈羧基進(jìn)行酰胺偶合來實現(xiàn)。已遵循該途徑來制備CS蛋白質(zhì)的構(gòu)象受局限的四肽重復(fù)，其中至少一個脯氨酸由(2S，3R)-3-胺基脯氨酸替代，而且為引入側(cè)鏈羧基，已納入谷氨酸鹽作為丙氨酸的替代。交聯(lián)策略還包括應(yīng)用Grubbs閉環(huán)置換反應(yīng)來形成經(jīng)設(shè)計以模擬α -螺旋構(gòu)象的 “U 型釘(stapled) ” 肽(Angew. Int. Ed. Engl. 37 :3281 (1998) ；JACS122 :5891 (2000))；使用多官能化糖類；使用氨基羧乙基硫色氨酸(tryptathionine)鍵(Chemistry Eu. J. 24 3404-3409(2008));以及利用迭氮化物與炔烴的“點擊(click) ”反應(yīng)，該兩種物質(zhì)可以側(cè)鏈氨基酸殘基納入或位于肽序列的骨架中(Drug Disc. Today 8(24) : 1128-1137 (2003))。 還從文獻(xiàn)中了解到，金屬離子可通過螯合與金屬陽離子配位的特定殘基(例如組氨酸)來穩(wěn)定線性肽的受局限構(gòu)象(Angew. Int. Ed. Engl. 42 :421 (2003))。類似地,可利用使用非天然酸及氨官能團(tuán)或多氨及多酸官能團(tuán)官能化線性肽序列、隨后激活及形成酰胺鍵來實現(xiàn)環(huán)狀結(jié)構(gòu)。根據(jù)一個實施例，通過使抗原性tau肽的兩個非毗鄰氨基酸(例如N端及C端氨基酸)彼此分子內(nèi)共價鍵合來使該抗原性tau肽構(gòu)象受局限。根據(jù)另一實施例，通過使本發(fā)明抗原性tau肽共價結(jié)合至支架分子來使其構(gòu)象受限。根據(jù)又一實施例，抗原性tau簡單受局限，即在一端(C端或N端)或通過不位于任一端的另一氨基酸偶合至支架分子。根據(jù)再一實施例，抗原性tau肽雙重受限，即C端及N端均偶合至支架分子。支架(也稱為“平臺(platform)”)可以是能夠通過共價鍵合來減少抗原性tau肽可呈現(xiàn)的構(gòu)象數(shù)量的任何分子。構(gòu)象受局限支架的實例包括蛋白質(zhì)及肽，例如脂質(zhì)運載蛋白相關(guān)分子，例如含有β -桶的硫氧還蛋白及硫氧還蛋白樣蛋白質(zhì)、核酸酶(例如RNaseA)、 蛋白酶(例如胰蛋白酶)、蛋白酶抑制劑(例如水蛭抑制劑(eglin)C)、抗體或其結(jié)構(gòu)剛性片段、螢光蛋白(例如GFP或YFP)、芋螺毒素(conotoxin)、纖維連接蛋白III型結(jié)構(gòu)域的環(huán)區(qū)域、CTLA-4及病毒樣顆粒(VLP)。其他適宜平臺分子包括碳水化合物，例如瓊脂糖。平臺可為線性分子或例如閉合形成環(huán)的環(huán)形分子。平臺通常與抗原性tau肽異源。與線性肽相比此類連接至平臺的構(gòu)象受限肽據(jù)認(rèn)為對蛋白水解降解更具抗性。根據(jù)一個實施例，支架是如本發(fā)明中所定義的免疫原性載體，例如異源載體蛋白或VLP。在另一實施例中，抗原性tau肽簡單受限至免疫原性載體上。在又一實施例中，抗原性tau肽雙重受限至免疫原性載體上。以此方式，抗原性tau肽形成構(gòu)象受局限的環(huán)結(jié)構(gòu)，已證實其為細(xì)胞內(nèi)識別分子的特別適宜的結(jié)構(gòu)?？蓪Ρ景l(fā)明的抗原性tau肽進(jìn)行修飾以便于偶聯(lián)至平臺上，例如通過在一端或兩端添加末端半胱氨酸和/或通過添加接頭序列，例如雙甘氨酸頭或尾、以賴氨酸殘基封端的接頭、或本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的可實施此功能的任何其他接頭。還可利用生物正交化學(xué)(Bioorthogonal chemistry)(例如上文所述的點擊反應(yīng))將完整的肽序列偶合至載體上，由此避免任何區(qū)域化學(xué)及化學(xué)選擇性問題。已知剛性接頭(例如闡述于Jones等人， (Angew. Chem. Int. Ed. 2002,41 :4241-4244)中的)可引發(fā)改善的免疫應(yīng)答，而且也可使用。 在又一實施例中，使抗原性tau肽附著至多價模板上，其本身偶合至載體上，由此增加抗原密度(見下文)。多價模板可為適當(dāng)官能化的聚合物或寡聚物，例如(但不限于)寡聚谷氨酸鹽或殼寡糖(oligochitosan)。
權(quán)利要求
1.一種免疫原，其包含至少一種連接至免疫原性載體的抗原性tau肽，其中所述抗原性tau肽包含選自以下的磷酸-tau表位pSer_396磷酸-tau表位、pThr-231/pSer_235磷酸-tau 表位、pThr-231 憐酸-tau 表位、pSer-235 憐酸-tau 表位、pThr-212/pSer-214 憐酸-tau 表位、pSer-202/pThr-205 磷酸-tau 表位、和 pTyr 18 磷酸-tau 表位。
2.一種免疫原，其包含至少一種連接至免疫原性載體的抗原性tau肽，其中所述抗原性tau肽包含選自SEQ ID NO :4、6_26、105和108-112的氨基酸序列。
3.權(quán)利要求2的免疫原，其中所述抗原性tau肽通過式(G)nCK表示的接頭共價連接至所述免疫原性載體，其中所述接頭位于所述肽的C端(肽-(G)nC)或N端(C(G)n-肽)， 并且其中 η 是 0、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10。
4.權(quán)利要求3的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含選自SEQID NO 4及6_13的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQID NO 11中所示的氨基酸序列組成。
6.權(quán)利要求3的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含選自SEQID NO :14-19的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQID NO 16中所示的氨基酸序列組成。
8.權(quán)利要求3的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含選自SEQID NO :20-24的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求8的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQID NO 21中所示的氨基酸序列組成。
10.權(quán)利要求3的免疫原，其中所述抗原性tau肽包含選自SEQID NO :105及108-112的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求10的免疫原，其中所述抗原性tau肽由SEQID NO :105中所示的氨基酸序列組成。
12.權(quán)利要求I至11中任一項的免疫原，其中所述免疫原性載體是選自由HBcAgVLP, HBsAg VLP JPQbeta VLP組成的組的病毒樣顆粒。
13.—種組合物，其包含至少兩種權(quán)利要求2的免疫原，其中a)第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO 4及6_13的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO :14-19的氨基酸序列組成。
14.一種組合物，其包含至少兩種權(quán)利要求2的免疫原，其中a)第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO 4及6_13的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO :20-24的氨基酸序列組成。
15.—種組合物，其包含至少兩種權(quán)利要求2的免疫原，其中a)第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO :14-19的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO :20-24的氨基酸序列組成。
16.—種組合物，其包含至少兩種權(quán)利要求2的免疫原，其中a)第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO 4及6_13的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽選自SEQID NO :105及108-112。
17.—種組合物，其包含至少兩種權(quán)利要求2的免疫原，其中a)第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO :14-19的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽選自SEQID NO :105及108-112。
18.—種組合物，其包含至少兩種權(quán)利要求2的免疫原，其中a)第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO :20-24的氨基酸序列組成；且b)第二種免疫原的抗原性tau肽選自SEQID NO :105及108-112。
19.一種組合物，其包含權(quán)利要求2的四種免疫原中的至少三種免疫原，其中a)第一種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO 4及6_13的氨基酸序列組成；b)第二種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO :14-19的氨基酸序列組成；且c)第三種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO :20-24的氨基酸序列組成；d)第四種免疫原的抗原性tau肽由選自SEQID NO :105及108-112的氨基酸序列組成。
20.一種藥物組合物，其包含權(quán)利要求I至12中任一項的免疫原、或權(quán)利要求13至19 中任一項的組合物、及藥物可接受的賦形劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及包含優(yōu)選連接至免疫原性載體的抗原性Tau肽的免疫原和組合物，其用于治療Tau相關(guān)的神經(jīng)學(xué)病癥。本發(fā)明還涉及制備這些免疫原及組合物的方法以及其在醫(yī)藥中的用途。
文檔編號A61K39/00GK102596236SQ201080040148
公開日2012年7月18日 申請日期2010年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月30日
發(fā)明者G·J·史密斯三世, J·X·朱, K·N·威爾斯 申請人:輝瑞疫苗有限責(zé)任公司