專利名稱：從蜘蛛毒液中分離的新型肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述的主題涉及用作有效和選擇性離子通道阻斷劑的分離的蜘蛛毒液肽， 以及用于治療神經(jīng)性疼痛的組合物和方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)動作電位的生成和傳遞，電壓依賴性鈉(NavI)通道和在某些情況下的低電壓激活鈣(Cap)通道是這樣的膜蛋白，其存在于所有可興奮細胞中，包括神經(jīng)元。抑制NavI 通道導(dǎo)致神經(jīng)元不能產(chǎn)生動作電位，因此不能編碼和傳輸信息。神經(jīng)性疼痛是涉及外周神經(jīng)過度興奮和中樞神經(jīng)敏感化的復(fù)合神經(jīng)元過程。外周神經(jīng)過度興奮可能是由于受損的背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元的異位自發(fā)放電(ectopic spontaneous firing)，其傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ并感知為疼痛。通過特異性抑制外周中受損的感覺疼痛的神經(jīng)元中的NavI (或Cap)通道來處理該現(xiàn)象可有效減少或消除神經(jīng)性疼痛。這可以通過局部應(yīng)用非特異性Nav阻斷劑(阻滯劑)(如局部麻醉劑)或通過全身應(yīng)用特異性識別DRG神經(jīng)元膜中NavI通道的NavI阻斷劑來實現(xiàn)。增加該特異性的一種通用方法是通過避開CNS (在CNS中大多數(shù)NavI同工型(亞型，isoforms)對神經(jīng)元活動至關(guān)重要)。另一種方法是找到其表達受限于過度興奮的DRG神經(jīng)元的NavI同工型的選擇性阻滯劑(Devor，2006 ；Cummins等人，2007)。關(guān)于NavI阻斷劑特異性的主要問題之一是避免心臟阻滯活性。河豚毒素(TTX)敏感型NavL 3通道通常在胚胎期在CNS和外周神經(jīng)系統(tǒng)(PNS)中表達，并且其表達隨著成熟而大幅下調(diào)。然而，報導(dǎo)了神經(jīng)元損傷后該通道表達的上調(diào)。這些觀察數(shù)據(jù)表明特異性靶向NavL 3同工型可專門阻斷受損的過度興奮DRG神經(jīng)元(Devor， 2006 ；Cummins 等人，2007)。TTX耐受型NavL 8通道幾乎專門在PNS中表達，并顯示可介導(dǎo)大多數(shù)有據(jù)可依的DRG神經(jīng)元動作電位的抗TTX成分。最近，已經(jīng)發(fā)表了一篇論文，強調(diào)了在疼痛控制中 NavL 8 通道作為靶的重要性(Jarvis，M. F.等人，2007 ;Zi_ermann，K.等人，2007)。通過靶向在外周中特異性表達的蛋白來治療疼痛的重要性在ASICl通道的情況中得到強調(diào)，所述ASICl通道在脊髓中表達，并且在大鼠神經(jīng)性疼痛模型中它們的抑制可誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛(痛覺缺失)。然而，由于全身性給予肽不能穿過血腦屏障而到達其靶蛋白，因此應(yīng)直接給予肽調(diào)節(jié)子(Mazzuca，Μ.等人 2007，Nat. Neurosci. 10,943)。在整個說明書中引用了各種科學(xué)出版物和專利或已公布的專利申請。將所有這些出版物公開的全部內(nèi)容以引用方式并入本說明書，以便更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的狀態(tài)。在該部分或本申請的任意其它部分中引用或指出的參考文獻不應(yīng)解釋為承認該參考文獻可用作本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
提供了從蜘蛛毒液中分離的肽。還提供了所分離的合成性蜘蛛毒液肽。合適的蜘蛛可包括狼蛛種。在一個實施方式中，根據(jù)本文描述的主題，純化或分離肽可以包括氨基酸序列或由氨基酸序列組成，所述氨基酸序列具有2至50個連續(xù)氨基酸，10至50個連續(xù)氨基酸，20 至50個連續(xù)氨基酸，25至45個連續(xù)氨基酸，29至40個連續(xù)氨基酸，29至35個連續(xù)氨基酸，至少四和至多35個連續(xù)氨基酸。在另一個實施方式中，根據(jù)本文描述的主題，純化或分離肽具有在3000至5000道爾頓，3250至4750道爾頓，3500至4500道爾頓，3550至4300道爾頓，或3600至4250道爾頓的范圍內(nèi)的分子量。在一個實施方式中，本文所描述的肽可顯示離子通道抑制活性。離子通道可以為鈉離子通道或鈣離子通道。在又一個實施方式中，本文所描述的主題提供了純化或分離肽，其包括包括SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID NO :5，或 SEQ ID NO :6 中任一序列的序列、包括由 SEQ ID NO :1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO 5，或SEQ ID NO :6中任一序列組成的序列，或包括屬于SEQ ID NO :1,SEQ ID N0:2，SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO 6中任一序列的序列；或包括通過以下方式獲得的序列⑴通過不同的氨基酸殘基置換SEQ ID N0:1,SEQ ID N0:2，SEQ ID NO :3， SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO :6中任一個的一個或多個氨基酸殘基，(ii)SEQ ID NO :1, SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID NO :5，或 SEQ ID NO :6 的任一個中缺失一個或多個氨基酸殘基，和/或(iii)在SEQ ID NO :1,SEQ ID NO :2,SEQ ID NO: 3，SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5，或SEQ ID NO :6的任一個中添加一個或多個氨基酸殘基，或肽的鹽或化學(xué)衍生物。對于缺失、置換或添加的一個或多個，可以是指1至10，1至8，1至 6，1至4，1至2，或1個。在一個實施方式中，保持離子通道阻斷活性。根據(jù)本文所描述的主題，純化或分離肽可以包括一個或多個氨基酸序列或由一個或多個氨基酸序列組成，所述一個或多個氨基酸序列包括，例如DDCLGMFSS⑶PDNDKCCEGRKC NKDKffCKYVL(SEQ ID NO 1), YCQEFLWTCDEERKCC⑶MVCRLWCKKRL(SEQ ID NO 2), ACLGFGEKC NPSNDKCCKSSSLVCSQKHKWCKYGW(SEQ ID NO 3), ACKGLFVTCTPGKDECCPNHVCSSKHKWCKYKI(SEQ ID NO 4),DCLGFMRKCIPDNDKCCRPNLVCSRTHKWCKYVF(SEQ ID NO 5)和 DCLGWFKGCDPDNDKCCE GYKCNRRDKffCKYKLff (SEQ ID NO :6)。可替換地，肽可以包括由 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2， SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式或者由 SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID NO :5 或 SEQ ID NO :6所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式組成。特別地，肽可以包括由SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式或者由SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 5所表示的氨基酸序列的 C端酰胺化形式組成。當(dāng)肽包括由SEQ ID NO :6所表示的氨基酸序列或者由SEQ ID NO 6 所表示的氨基酸序列組成時，蜘蛛毒液可以為Red Morph Grammostola(RMG)毒液并且不是 Brown Morph Grammostola(BMG)0在另一個實施方式中，本文所描述的主題提供了具有20至40個連續(xù)氨基酸的純化或分離肽，所述連續(xù)氨基酸包括序列DCLGXiX2X3X4CX5PDNDKCC(SEQ ID NO 7)；其中&為 M或F成為M或F成為R或S式為K或S ；并且&為D或I，并且肽顯示離子通道抑制活性。離子通道可以為鈉離子通道或鈣離子通道。肽可純化自蜘蛛毒液或可分離自合成性蜘蛛毒液肽。在一個實施方式中，本文所描述的主題提供了具有20至40個連續(xù)氨基酸的純化或分離肽，所述連續(xù)氨基酸包括序列ACX6GX7X8X9XiciCX11PX12X13DX14CC(SEQ ID N0:8)，其中 &為K或L ;X7為L或F成為G或F ;X9為E或V ；X10為K或T ；X11為N或T ；X12為S或G ； X13為N或K ；且為K或E，并且肽顯示離子通道抑制活性。離子通道可以為鈉離子通道或鈣離子通道。肽可純化自蜘蛛毒液或可分離自合成性蜘蛛毒液肽。在另外的實施方式中，本文所描述的主題提供了具有20至40個連續(xù)氨基酸的純化或分離肽，所述連續(xù)氨基酸包括序列x15vcsx16x17hkwcky(seq id no :9)；其中X15為L或 H ；X16為Q、S或R ；且X17為K或T，并且肽顯示離子通道抑制活性。離子通道可以為鈉離子通道或鈣離子通道。肽可純化自蜘蛛毒液或可分離自合成性蜘蛛毒液肽。在又一個實施方式中，根據(jù)本文所描述的主題，提供了可以包括或由本文所描述的肽或其鹽中的任一種或多種組成的離子通道抑制劑。離子通道可以為鈉離子通道或鈣離子通道。根據(jù)本文所描述的主題，提供了可以包括或由以下物質(zhì)組成的藥物組合物包括， 屬于或由 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，和/或SEQ ID NO 9中任一個所表示的一個或多個氨基酸序列組成的肽；以及藥用載體或稀釋劑。在一個實施方式中，載體可為水性載體。在一個實施方式中，肽可以包括或由 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4， SEQ ID NO 5, SEQ ID N0:6，SEQ ID N0:7，SEQ ID N0:8，和 / 或 SEQ ID NO :9 中任一個所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式所表示的一個或多個氨基酸序列組成。在一個實施方式中，肽可以包括或由SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2， SEQ ID NO :4或SEQ ID N0:5所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式所表示的一個或多個氨基酸序列組成。當(dāng)肽包括或由SEQ ID NO :6所表示的氨基酸序列組成時，蜘蛛毒液可以為Red Morph Grammostola(RMG)毒液并且不是 Brown Morph Grammostola(BMG)0在一個實施方式中，根據(jù)本文所描述的主題，提供了治療受試者體內(nèi)疼痛的方法， 所述方法包括或由以下組成給予需要其的受試者治療有效量的肽，所述肽包括，屬于，或由 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6， SEQ ID NO 7, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 9中任一個所表示的一個或多個氨基酸序列，和/ 或其藥用鹽組成。在一個實施方式中，肽可以包括或由SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2,SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，禾口 / 或 SEQ ID NO 9中任一個所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式所表示的一個或多個氨基酸序列組成。在另一個實施方式中，肽可以包括或由SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2,SEQ ID NO :4或 SEQ ID NO :5所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式所表示的一個或多個氨基酸序列組成。在另外的實施方式中，治療有效量可以包括鎮(zhèn)痛或抗炎有效量。當(dāng)肽包括或由SEQ ID NO :6所表示的氨基酸序列組成時，蜘蛛毒液可以為Red Morph Grammostola(RMG)毒液并且不是 Brown Morph Grammostola(BMG)0在另一個實施方式中，根據(jù)本文所描述的主題，提供了治療受試者體內(nèi)疼痛的方法，所述方法包括或由給予需要其的受試者治療有效量的包括或由以下肽以及藥用載體或稀釋劑組成的藥物組合物組成，所述肽包括，屬于，或由SEQ ID N0:1,SEQ ID NO :2,SEQ ID NO 3, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，SEQ ID NO 9中任一個所表示的一個或多個氨基酸序列，和/或其藥用鹽組成。在一個實施方式中，肽可以包括或由 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO 6, SEQ ID NO :7，SEQ ID NO :8，和/或SEQ ID NO 9中任一個所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式所表示的一個或多個氨基酸序列組成。在另一個實施方式中，肽可以包括或由SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :2，SEQ ID NO :4或SEQ ID NO 5所表示的氨基酸序列的 C端酰胺化形式所表示的一個或多個氨基酸序列組成。在另外的實施方式中，治療有效量可以包括鎮(zhèn)痛或抗炎有效量。當(dāng)肽包括或由SEQ ID NO :6所表示的氨基酸序列組成時，蜘蛛毒液可以為 Red Morph Grammostola(RMG)毒液而不是 Brown Morph Grammostola(BMG)0在另外的實施方式中，本文所描述的主題提供了用于抑制受試者體內(nèi)離子通道活性的方法，其包括給予受試者治療有效量的本文所描述的藥物組合物，其中對離子通道活性進行抑制而不損害心臟功能。還提供了阻斷受試者體內(nèi)Nav通道的方法。所述方法可以包括或由給予需要其的受試者治療有效量的肽或包括或由肽以及藥用載體或稀釋劑組成的藥物組合物組成，所述月太包括，屬于，或由 SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:2，SEQ ID N0:3，SEQ ID N0:4，SEQ ID NO :5， SEQ ID NO :6, SEQ ID NO :7, SEQ ID NO :8，SEQ ID NO :9 中任一個所表示的一個或多個氨基酸序列，和/或其藥用鹽組成。在一個實施方式中，肽可以包括或由SEQ ID N0:1,SEQ ID NO2,SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO 8，和/或SEQ ID NO :9中任一個所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式所表示的一個或多個氨基酸序列組成。在另一個實施方式中，肽可以包括或由SEQ ID NO 1, SEQ ID N0:2，SEQ ID NO :4或SEQ ID NO :5所表示的氨基酸序列的C端酰胺化形式所表示的一個或多個氨基酸序列組成。在另外的實施方式中，治療有效量可以包括鎮(zhèn)痛或抗炎有效量。當(dāng)肽包括或由SEQ ID NO 6所表示的氨基酸序列組成時，蜘蛛毒液可以為ItedMorph Grammosto la (RMG) 毒液而不是 Brown Morph Grammostola(BMG)0根據(jù)本文所描述的主題，提供了用于局部、注射、直腸、鼻內(nèi)、肺、口腔、非腸道或腸道給予受試者的藥物組合物?？赏ㄟ^吸入或輸注給予藥物組合物。藥物組合物可以包括藥物制劑(劑量劑型)，其包括但不限于注射劑、水溶液、液體、乳劑、凝膠、洗劑、乳膏劑、軟膏劑、片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、以及栓劑。在又一個實施方式中，藥物組合物可以包括用于口服、腸道外或腸道給藥的液體制劑(液體劑型)。液體制劑可包括水性制劑。通過本文所述的任意方法治療的疼痛可以為任何已知類型的疼痛，包括外周性疼痛。例如，待治療的疼痛可以為一種或多種疼痛，其被描述為神經(jīng)源性疼痛、神經(jīng)性疼痛、癌癥疼痛、術(shù)后疼痛、口腔或牙齒疼痛、來自所提及的三叉神經(jīng)痛的疼痛、來自皰疹后神經(jīng)痛的疼痛、或由于反射交感性營養(yǎng)不良引起的疼痛和/或與炎性病癥相關(guān)的疼痛。疼痛可以表征為例如，傷害性疼痛、非傷害性疼痛、軀體痛、內(nèi)臟痛、神經(jīng)痛。疼痛可以是刺激應(yīng)答熱、冷、振動、拉伸以及由受損細胞所釋放的化學(xué)刺激物的受體的結(jié)果。此外，疼痛可以是由神經(jīng)細胞功能障礙所產(chǎn)生的疼痛的結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明的主題，疼痛可以是與組織如皮膚、肌肉、關(guān)節(jié)、骨骼和韌帶相關(guān)的疼痛-通常稱為肌肉-骨骼痛。疼痛也可以是與主體腔的內(nèi)臟器官相關(guān)的疼痛。在這方面，疼痛可以與胸部(心臟和肺)，腹部(肝、腎、 脾和腸)，和/或盆腔(膀胱、子宮和卵巢)相關(guān)。此外，根據(jù)本發(fā)明主題所描述的疼痛可以為與神經(jīng)系統(tǒng)自身相關(guān)的疼痛，例如與挾捏神經(jīng)或壓迫神經(jīng)有關(guān)的疼痛。疼痛可源于外周神經(jīng)系統(tǒng)，即組織和脊髓之間的神經(jīng)，或源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，即脊髓和大腦之間的神經(jīng)。疼痛可與例如由多發(fā)性硬化、中風(fēng)、腦出血和/或缺氧、神經(jīng)壓力、壓迫神經(jīng)、神經(jīng)炎癥、椎間盤破損或滑脫和/或神經(jīng)感染如帶狀皰疹或其它病毒感染引起的神經(jīng)退變相關(guān)。根據(jù)本文所描述的主題，炎性病癥可以與一種或多種病癥相關(guān)，所述病癥選自由急性疼痛，偏頭痛，頭痛，周期性偏頭痛，外傷性神經(jīng)損傷，神經(jīng)壓迫，神經(jīng)卡壓，皰疹后神經(jīng)痛，三叉神經(jīng)痛，糖尿病性神經(jīng)病變，慢性下腰痛，幻肢痛，慢性盆腔疼痛，神經(jīng)瘤疼痛，復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合癥，慢性關(guān)節(jié)炎疼痛，以及與癌癥、化療、HIV和HIV治療誘導(dǎo)的神經(jīng)病變、腸易激綜合癥和有關(guān)疾病和克羅恩病相關(guān)的疼痛組成的組。此外，提供了用于從蜘蛛毒液中分離肽的方法，所述肽包括或由SEQ ID N0:1,SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，SEQ ID N0:8，和/或SEQ ID NO :9中任一個所表示的一個或多個氨基酸序列組成，所述方法可包括離心凍干的粗蜘蛛毒液以獲得離心毒液，過濾離心毒液以獲得過濾毒液，將過濾毒液加載在凝膠過濾柱上，并洗脫該柱以獲得含有所述分離肽的部分(餾分，fraction)，可使用陽離子交換和/或HPLC色譜進一步純化所述分離肽。當(dāng)肽包括或由SEQ ID NO :6所表示的氨基酸序列組成時，蜘蛛毒液可以為Red Morph Grammostola(RMG)毒液而不是Brown Morph Grammostola(BMG)。此外，提供了用于從蜘蛛毒液中分離肽的方法，所述肽包括或由SEQ ID N0:1,SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO :7，SEQ ID N0:8，和/或SEQ ID NO :9中任一個所表示的一個或多個氨基酸序列組成。當(dāng)肽包括或由 SEQ ID NO :6所表示的氨基酸序列組成時，蜘蛛毒液可以為Red Morph Grammostola(RMG) 毒液而不是Brown Morph Grammostola (BMG)。所述方法可以包括離心凍干的粗蜘蛛毒液以獲得離心毒液，過濾離心毒液以獲得過濾毒液，將過濾毒液加載到凝膠過濾柱上，并且洗脫該柱以獲得含有分離肽的部分，可使用陽離子交換和/或HPLC色譜進一步純化所述分離肽。在又一個實施方式中，提供了用于再折疊(refolding)肽的方法，其中所述方法包括或由以下組成收集濃度為1.1 mM至M mM的粗肽；在例如0. IM Tris緩沖液或2M NH4OAC緩沖液中溶解粗肽；使用例如20mMDTT還原肽；例如在含有還原和/或氧化的半胱氨酸或谷胱甘肽系統(tǒng)的氧化還原混合物中，在PH為7至9. 5范圍內(nèi)的緩沖水溶液中并且在 10-27. 5 μ M的最終肽濃度下折疊肽；以及例如在半制備性C18柱上純化折疊肽。合適的緩沖液可以包括，例如，醋酸銨緩沖液、碳酸氫銨緩沖液、和0. IMTris-HCl緩沖液。


圖IA為來自Pterinochilus spp. hambara毒液(Psp)的肽A的色譜純化的示圖。圖IB為來自Pterinochilus spp. Usambara毒液(Psp)的肽A的色譜純化的另一示圖。圖2A為來自Psp毒液的肽B的色譜純化的示圖。
圖2B為來自Psp毒液的肽B的色譜純化的另一示圖。圖2C為來自Psp毒液的肽B的色譜純化的另一示圖。圖3A為來自金屬藍蜘蛛(泰國金屬藍，Haplopelma lividum)毒液(Hv)的肽C的色譜純化的示圖。圖;3B為來自金屬藍蜘蛛毒液(Hv)的肽C的色譜純化的另一示圖。圖3C為來自金屬藍蜘蛛毒液(Hv)的肽C的色譜純化的另一示圖。圖4A為來自Hv的肽D的色譜純化的示圖。圖4B為來自Hv的肽D的色譜純化的另一示圖。圖4C為來自Hv的肽D的色譜純化的另一示圖。圖5A為來自RedMorph Grammostola (RMG)毒液的肽E的色譜純化的示圖。圖5B為來自RedMorph Grammostola (RMG)毒液的肽E的色譜純化的另一示圖。圖5C為來自RedMorph Grammostola (RMG)毒液的肽E的色譜純化的另一示圖。圖5D為來自RedMorph Grammostola (RMG)毒液的肽E的色譜純化的又一示圖。圖6A為來自RMG毒液的肽F的色譜純化的示圖。圖6B為來自RMG毒液的肽F的色譜純化的另一示圖。圖6C為來自RMG毒液的肽F的色譜純化的另一示圖。圖7A為在灌流(bath perfusion) 2 μ M純肽A之前和期間rNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡(電壓斜升，voltage ramp)刺激的示圖。圖7B為在(灌流3. 4 μ M純肽Α)之前和期間hNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖7C為在灌流2 μ M純肽A之前和期間rNavl. 8通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖7D為在灌流5. 25 μ M純肽A之前和期間，以及在灌流確定的hERG阻斷劑過程中，hKvll. l(hERG)通道響應(yīng)于電壓階梯(電壓階躍)刺激的示圖。圖7E為劑量反應(yīng)曲線的示圖，其總結(jié)了圖7A-7D所示的針對每個通道的至少3個實驗。圖7F為在急性分離的大鼠DRG神經(jīng)元中電壓響應(yīng)于電流刺激的示圖。圖7G為總結(jié)了在圖7F所描述的條件下進行的幾個實驗的條形圖。圖7H為在小鼠胚胎干細胞衍生的心肌細胞(mES-CM)中所記錄的膜電壓的持續(xù)跡線的示圖。動作電位自發(fā)且規(guī)則地發(fā)出，并且它們的頻率和幅度在以下表中繪制。圖71為總結(jié)了其中3. 75 μ M肽A禾Π 3 μ M TTX的作用影響AP頻率的幾個實驗的條形圖的示圖。圖8Α為在灌流0. 5 μ M純肽B之前和期間rNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖8B為在灌流0. 5 μ M純肽B之前和期間hNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖8C為在灌流0. 7 μ M純肽B之前和期間rNavl. 8通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖8D為在灌流1. 5μΜ純肽B之前和期間，以及在灌流確定的hERG阻斷劑過程中， hKvll. l(hERG)通道響應(yīng)于電壓階梯刺激的示圖。
圖8E為總結(jié)了圖8A-8D所示的針對每個通道的至少3個實驗的劑量應(yīng)答曲線的示圖。圖8F為在急性分離的大鼠DRG神經(jīng)元中電壓響應(yīng)于電流刺激的示圖。圖8G為總結(jié)了在圖8F所描述的條件下進行的幾個實驗的條形圖。圖8H為在小鼠胚胎干細胞衍生的心肌細胞(mES-CM)中所記錄的膜電壓的持續(xù)跡線的示圖。圖81為總結(jié)了其中9μ M肽B和3μ M TTX的作用影響AP頻率的幾個實驗的條形圖。圖9Α為在灌流1. 25 μΜ(Ην3920)純肽C之前和期間rNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖9B為在灌流2. 4 μ Μ(Ην3920)純肽C之前和期間hNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖9C為在灌流3. 6 μ Μ(Ην3920)純肽C之前和期間rNavl. 8通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖9D為在灌流4 μ M純肽C之前和期間，以及在灌流確定的hERG阻斷劑過程中， hKvll. l(hERG)通道響應(yīng)于電壓階梯刺激的示圖。圖9E為劑量反應(yīng)(劑量應(yīng)答)曲線的示圖，其總結(jié)了圖9A-9D所示的針對每個通道的至少3個實驗。表3中給出了表觀IC5Q。圖9F為在急性分離的大鼠DRG神經(jīng)元中電壓響應(yīng)于電流刺激的疊加跡線的示圖。圖9G為總結(jié)了如在圖9F所描述的條件下進行的幾個實驗的條形圖。圖9H為在小鼠胚胎干細胞衍生的心肌細胞(mES-CM)中所記錄的膜電壓的持續(xù)跡線的示圖。圖91為總結(jié)了其中5μ M肽C和3μ M TTX的作用影響AP頻率的幾個實驗的條形圖。圖IOA為在灌流0. 15 μ M純肽D之前和期間rNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖IOB為在灌流0. 5 μ M純肽D之前和期間hNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖IOC為在灌流0. 48 μ M純肽D之前和期間rNavl. 8通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖IOD為在灌流1 μ M純肽D之前和期間，以及在灌流確定的hERG阻斷劑過程中， hKvll. l(hERG)通道響應(yīng)于電壓階梯刺激的示圖。圖IOE為劑量反應(yīng)曲線的示圖，其總結(jié)了圖10A-10D所示的針對每個通道的至少 3個實驗。圖IOF為在急性分離的大鼠DRG神經(jīng)元中電壓響應(yīng)于電流刺激的疊加跡線的示圖。圖IOG為總結(jié)了與在圖IOF所描述的條件下一樣的幾個實驗的條形圖。圖IOH為在小鼠胚胎干細胞衍生的心肌細胞(mES-CM)中所記錄的膜電壓的持續(xù)跡線的示圖。
圖101為總結(jié)了其中0. 75 μ M肽D禾Π 3 μ M TTX的作用影響AP頻率的幾個實驗的條形圖。圖IlA為在灌流0. 3 μ M純肽E之前和期間rNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖IlB為在灌流0. 93 μ M純肽E之前和期間hNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖IlC為在灌流0. 93 μ M純肽E之前和期間rNavl. 8通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖1 ID為在灌流0. 93 μ M純肽E之前和期間，以及在灌流確定的hERG阻斷劑過程中，hKvll. l(hERG)通道響應(yīng)于電壓階梯刺激的示圖。圖IlE為劑量反應(yīng)曲線的示圖，其總結(jié)了圖11A-11D所示的針對每個通道的至少 3個實驗。圖IlF為在急性分離的大鼠DRG神經(jīng)元中電壓響應(yīng)于電流刺激的疊加跡線的示圖。圖IlG為總結(jié)了與在圖IlF所描述的條件下一樣的幾個實驗的條形圖。圖IlH為在小鼠胚胎干細胞衍生的心肌細胞(mES-CM)中所記錄的膜電壓的持續(xù)跡線的示圖。圖IlI為總結(jié)了其中0.83μΜ肽E和3μΜ TTX的作用影響AP頻率的幾個實驗的條形圖。圖12Α為在灌流0. 1 μ M純肽F之前和期間rNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖12B為在灌流0. 52 μ M純肽F之前和期間hNavl. 3通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖12C為在灌流0. 5 μ M純肽F之前和期間rNavl. 8通道響應(yīng)于電壓斜坡刺激的示圖。圖12D為在灌流0. 92 μ M純肽F之前和期間，以及在灌流確定的hERG阻斷劑過程中，hKvll. l(hERG)通道響應(yīng)于電壓階梯刺激的示圖。圖12E為劑量反應(yīng)曲線，其總結(jié)了圖12A-12D所示的針對每個通道的至少3個實驗。圖12F為在急性分離的大鼠DRG神經(jīng)元中電壓響應(yīng)于電流刺激的疊加跡線的示圖。圖12G為總結(jié)了如在圖12F所描述的條件下的幾個實驗的條形圖。圖12H為在小鼠胚胎干細胞衍生的心肌細胞(mES-CM)中所記錄的膜電壓的持續(xù)跡線(continuous trace)的示圖。圖121為總結(jié)了其中ΙμΜ肽F和3μΜ TTX的作用影響AP頻率的幾個實驗的條形圖。圖13為天然肽Α(三角形)、使用20mM 二硫蘇糖醇(DTT)還原1小時的合成性肽 A(正方形)和折疊的合成肽A(圓形)的分析性反相HPLC色譜的示圖。圖14為天然肽B (三角形)、使用20mM DTT還原1. 5小時的合成性肽B (正方形)和折疊的合成肽B(圓形)的分析性反相HPLC色譜的示圖。圖15為天然肽C(三角形)、使用20mM DTT還原1小時的合成性肽C(正方形)和折疊的合成肽C(圓形)的分析性反相HPLC色譜的示圖。圖16為天然肽D (三角形)、使用20mM DTT還原1小時的合成性肽D (正方形)和折疊的合成肽D(圓形)的分析性反相HPLC色譜的示圖。圖17為天然肽E (三角形)、使用20mM DTT還原1小時的合成性肽E (正方形)和折疊的合成肽E(圓形)的分析性反相HPLC色譜的示圖。圖1 8為天然肽F(三角形)、使用20mM DTT還原1小時的合成性肽F(正方形) 和折疊的合成肽F(圓形)的分析性反相HPLC色譜的示圖。圖19A-F為天然和合成肽阻滯活性比較的示圖，所述阻滯活性表示為rNavl. 3通道電流的抑制％對肽A-F的肽濃度(劑量應(yīng)答)。圖20為在結(jié)扎同側(cè)和對側(cè)的后爪前后的縮足閾值的示圖。圖21為在急性和慢性給予測試化合物后的1小時和3小時時間點同側(cè)縮足閾值的示圖。圖22為在急性和慢性給予測試化合物后的1小時和3小時時間點處對側(cè)縮足閾值的示圖。
具體實施例方式I.定義以下定義用于提供對說明書和權(quán)利要求書的清楚和一致的理解，包括該術(shù)語提供的范圍。如本文所使用的，術(shù)語“給予”、“給藥”等術(shù)語是指在健全的醫(yī)療實踐中以能夠提供療效的方式將組合物遞送至受試者的任意方法。本發(fā)明主題的一個方面提供了將本主題的治療有效量的組合物口服給予需要其的患者。本文所描述的蜘蛛毒液肽可用于治療疼痛或誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛。如本文所使用的，術(shù)語“治療”也包括預(yù)防具有發(fā)展這樣的疼痛傾向的患者或受試者的疼痛，以及當(dāng)疼痛被確定時改善或消除已發(fā)展的疼痛或減輕這樣的疼痛的特有癥狀。如本文所使用的，術(shù)語“疼痛”是指所有類型的疼痛。特別地，該術(shù)語是指慢性疼痛，如神經(jīng)性疼痛，和術(shù)后疼痛，慢性下腰痛，叢集性頭痛，皰疹神經(jīng)痛，幻肢痛，中樞性疼痛，牙痛，阿片耐藥性疼痛，內(nèi)臟痛，手術(shù)疼痛，骨損傷疼痛，產(chǎn)程和分娩過程中的疼痛，由燒傷引起的疼痛，包括曬傷，產(chǎn)后疼痛，偏頭痛，心絞痛，和泌尿生殖道相關(guān)的疼痛(包括膀胱炎)。此外，神經(jīng)性疼痛可起因于多種單獨的病因。神經(jīng)性疼痛的發(fā)生可由眼科手術(shù)、牙科修復(fù)(根管)、燒傷、反射交感性營養(yǎng)不良、皰疹后神經(jīng)痛、糖尿病性神經(jīng)病變、關(guān)節(jié)炎等引起。該術(shù)語也指由于反射交感性營養(yǎng)不良和傷害性疼痛或傷害感受引起的疼痛。此外，術(shù)語“疼痛”是指與炎性病癥相關(guān)的疼痛，包括但不限于與以下相關(guān)的疼痛關(guān)節(jié)炎；自身免疫性疾病包括例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)或狼瘡；慢性前列腺炎；慢性炎癥；超敏；炎性腸道疾病；再灌注損傷；血管炎；移植排斥；盆腔炎性疾?。荒I小球腎炎；哮喘；炎性肌?。幌到y(tǒng)性硬化癥；皮肌炎；多肌炎；包涵體肌炎；Chediak-Higashi綜合征；和慢性肉芽腫疾病?？筛鶕?jù)傳統(tǒng)藥物復(fù)配技術(shù)來制備含有本發(fā)明的化合物或其藥用鹽或溶劑化物作為活性成分的藥物組合物。參見，例如Remington' s Pharmaceutical Sciences，18版 (1990, Mack Publishing Co.，Easton, Pa.)。如本文所使用的，術(shù)語“賦形劑”或“佐劑”是指藥物組合物中不是藥物物質(zhì)的任何成分。如本文所使用的，術(shù)語“藥品”、“藥物劑型”、“最終劑型”等是指給予需要治療的患者的一種或多種藥物物質(zhì)和一種或多種賦形劑的組合(即藥物組合物)，并且可以為溶液、 水溶液、乳劑、混懸劑、片劑、膠囊劑、貼劑、栓劑、乳膏劑、凝膠劑、洗劑等的形式。 如本文所使用的，術(shù)語“受試者”或“個體”或“動物”或“患者”或“哺乳動物”是指需要診斷、預(yù)后或治療的任意受試者，尤其是哺乳動物受試者，例如人類。如本文所使用是，術(shù)語疾病、障礙或病癥的“治療”或“處理”包括減輕其至少一種癥狀，降低其嚴重程度，或延緩，防止或抑制其進展。治療不需要指疾病、障礙或病癥完全治愈。為了有效治療，本文所述的有用組合物僅需要降低疾病、障礙或病癥的嚴重程度，降低與其相關(guān)的癥狀的嚴重程度，提高患者或受試者的生活質(zhì)量，或延緩，防止或抑制疾病、障礙或病癥的發(fā)作。如本文所使用的，術(shù)語“藥用的(藥學(xué)上可接受的)”載體是指無毒，惰性固體， 半固體液體填充劑，稀釋劑，包封材料，任意類型的配方助劑，或簡單的無菌水性介質(zhì)，如鹽水?？沙洚?dāng)藥用載體的材料的一些實例為糖，如乳糖，葡萄糖和果糖，淀粉如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉，纖維素及其衍生物如羧甲基纖維素鈉，乙基纖維素和醋酸纖維素；粉末狀黃蓍膠；麥芽，明膠，滑石粉；賦形劑如可可脂和栓劑蠟；油如花生油，棉籽油，紅花油，芝麻油， 橄欖油，玉米油和豆油；二醇類，如聚乙二醇，多元醇如甘油，山梨醇，甘露醇和聚乙烯乙二醇；酯類如油酸乙酯和月桂酸乙酯，瓊脂；緩沖劑如氫氧化鎂和氫氧化鋁；褐藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇和磷酸鹽緩沖溶液，以及其它用于藥物制劑的無毒的相容性物質(zhì)。優(yōu)選以治療有效量給予活性劑。如本文所使用的，術(shù)語“安全和有效的量”是指成分的量足以產(chǎn)生期望的治療反應(yīng)而無過分的不利副作用(如毒性、刺激性或過敏性反應(yīng))， 當(dāng)以本文所描述的方式使用時具有合理的益處/風(fēng)險比例。如本文所使用的短語“治療有效量”是指可有效產(chǎn)生期望的治療反應(yīng)的本文所描述的活性劑的量。例如，“治療有效量”可以為足夠量的活性劑以適用于任何醫(yī)學(xué)治療的合理的益處/風(fēng)險比例來治療或減輕疼痛或誘導(dǎo)鎮(zhèn)痛。實際給予的量和給予的速率和時程將取決于待治療病癥的性質(zhì)和嚴重程度。 治療的處方，例如劑量、時間等的確定在普通從業(yè)人員或?qū)＜业穆氊?zé)內(nèi)，并通常需考慮待治療的障礙、個體患者的狀況、遞送的部位、給予方法和從業(yè)人員已知的其它因素。技術(shù)和方案的實 列可以在 Remington' s Pharmaceutical Sciences 中找至lj。如本文所使用的，術(shù)語“肽”是指由兩個或多個氨基酸通過共價鍵結(jié)合而構(gòu)成的化合物，所述共價鍵是通過從一個氨基酸的氨基基團和下一個氨基酸的羧基中消除H2O分子而形成的。對于本發(fā)明來說，術(shù)語“分離的”表明將生物材料(核酸或蛋白)從其初始環(huán)境 (其天然存在的環(huán)境)中移出。例如，以天然狀態(tài)存在于植物或動物中的肽是未分離的，然而，從其天然存在的相鄰氨基酸中分離的相同肽則認為是“分離的”。術(shù)語“純化的”并不要求材料以顯示絕對純度的形式存在并排除其它化合物的存在。相反，它是一個相對的定義。在將起始原料或天然材料純化至少一個數(shù)量級，優(yōu)選2或 3個并且優(yōu)選4或5個數(shù)量級后，肽為“純化的”狀態(tài)。如本文所使用的，術(shù)語“基本純的”描述了已經(jīng)與其天然污染物分離的肽或其它材料。通常，當(dāng)至少約60至75%的樣品顯示單一的肽骨架時，單體肽是基本純的。輕微變體或化學(xué)修飾通常共享相同的肽序列。通?；炯兊碾膶ǔ^約85至90 %的肽樣品，特別是將超過95%的純度，超過97%的純度，或?qū)⒊^約99%的純度。通常在聚丙烯酰胺凝膠上測定純度，其中通過染色測定同質(zhì)性。可替換地，對于特定用途，高分辨率將是必要的， 并且使用HPLC或用于純化的類似手段。對于大多數(shù)用途，可使用簡單的色譜柱或聚丙烯酰胺凝膠測定純度。術(shù)語“基本沒有天然相關(guān)的宿主細胞成分”描述了與在其天然宿主細胞狀態(tài)下伴隨其的天然污染物分離的肽或其它材料。因此，化學(xué)合成或在與天然產(chǎn)生肽的宿主細胞不同的細胞系統(tǒng)中合成的肽沒有其天然相關(guān)的宿主細胞成分。術(shù)語“同源性”是指兩個多核苷酸或兩個肽部分之間的百分比同一性?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的技術(shù)來測定一個部分和另一個部分的序列之間的一致性。例如，可通過比對序列信息和使用現(xiàn)有的計算機程序直接比較兩個肽分子之間的序列信息來測定同源性。如本文所使用的，在其所有語法形式和拼寫變化中，術(shù)語“同源的”是指具有“共同的進化起源”的蛋白之間的關(guān)系，包括來自超家族的蛋白(例如免疫球蛋白超家族)和來自不同物種的同源蛋白(例如，肌球蛋白輕鏈等)(Reeck等人，1987，Cell 50:667)。這樣的蛋白(及其編碼基因)具有序列同源性，如通過其高度的序列相似性所反映的。然而，在通常使用和實時應(yīng)用中，當(dāng)使用副詞如“高度”修飾術(shù)語“同源的”時，可指序列相似性而不是共同的進化起源。因此，所有語法形式的術(shù)語“序列相似性”均是指可能具有或不具有共同進化起源的蛋白的核酸或氨基酸序列之間的同一性或一致性的程度(參見Reeck等人，1987，Cell 50 667)。在一個具體實施方式
中，當(dāng)氨基酸的至少約50% (優(yōu)選至少約75%，并且最優(yōu)選至少約90或95% )與規(guī)定的序列長度匹配時，兩個氨基酸序列為“基本同源的”或“基本相似的”。可使用已知技術(shù)，通過比較序列來識別基本同源的序列。術(shù)語“與……相對應(yīng)”在本文中用來指相似或同源的序列，無論其確切位置與進行相似性或同源性測量的分子相同或不同。核酸或氨基酸序列比對可以包括空位(spaces)。 因此，術(shù)語“與……相對應(yīng)”是指序列相似性，而不是氨基酸殘基或核苷酸堿基的編號。術(shù)語“蜘蛛”是指捕鳥蛛科的任意狼蛛，捕鳥蛛科分為若干亞科，其中包含超過100 個屬和900個種。捕鳥蛛亞科包括Acanthopelminae,小型陸棲新世界狼蛛亞科。該亞科僅有一個屬，Acanthopelma， 禾口兩個禾中，A. beccarri 禾口 A. Rufescens ；Aviculariinae為熱帶樹棲新世界狼蛛亞科。屬包括Avicularia，Ephebopus, Iridopelma, Pachistopelma 禾口 Tapinauchenius ；Eumenophorinae 力丨曰 It ·各良蟲朱1 禾斗。M @ 舌 Anoploscelus, Batesiella, Citharischius, Encyocrates, Eumenophorus, Hysterocrates, Loxomphalia, Loxoptygu, Mascaraneus, Monocentopus, Myostola,禾口 Phoneyusa。 Proshapalopus WWiii 1 : 科中；Harpactirinae為來自非洲的舊世界狼蛛亞科。屬包括Augac印halus， Brachionopus, Ceratogyrus, Eucratoscelus，Harpactira, Idiothele，Pterinochilus，禾口 Trichognathella ；Ischnocolinae亞科包括來自全世界的蜘蛛。屬包括Catumiri，Chaetopelma， Cratorrhagus, Guyruita，Hemiercus，Heterothele，Holothele，Ischnocolus，Nesiergus， Oligoxystre, PlesiophrictusJfI Sickius ；Ornithoctoninae亞科的地老虎(earth tigers)形成了一個舊世界狼蛛群體。 屬包括 Citharognathus, Cyriopagopus, Haplopelma, Lampropelma, Ornithoctonus,禾口 PhormingochiIus ；Poecilotheriinae為來自印度和斯里蘭卡的樹蜘蛛。該亞科僅包含 Poecilotheria 屬；Selenocosmiinae是主要由來自東亞和澳大利亞的狼蛛組成的亞科。屬包括 Baccallbrapo, Chilobrachys, Chilocosmia, Coremiocnemis, Haplocosmia, Lyrognathus, Orphnaecus, Phlogiellus, Phlogius, Psalmopoeus, Selenobrachys, Selenocosmia, Selenopelma, Selenotholus, Selenotypus, Tapinauchenius，ffl Yamia ；Selenogyrinae為來自印度和非洲的狼蛛亞科。屬包括Anrmndaliella， EuphrictusJfI Selenogyrus ；Stromatopelminae為來自非洲西部的樹棲狼蛛。屬包括Encyocratella, HeteroscodraJfI Stromatopelma ；Theraphosinae 為新世界陸棲狼蛛。屬包括 Acanthoscurria，Aenigmarachne， Ami，Aphonopelma，bonnetina, brachypelma，Chromatopelma，Citharacanthus, Clavopelma,Crassicrus,Cubanana,Cyclosternum,Cyriocosmus,Cyrtopholis,Euathlus, Eupalaestrus， Grammostola， Hapalopus， Hapalotremus， Hemirrhagus， Homoeomma, Kochiana， Lasiodora， Lasiodorides， Magulla, Maraca， Megaphobema， Melloleitaoina， Metriopelma， Neostenotarsus， Nesipelma， Nhandu, Ozopactus, Pamphobeteus， Paraphysa，Phormictopus，Plesiopelma，Proshapalopus,Pseudhapalopus,Reversopelma, Schismatothele， Schizopelma， Sericopelma， Sphaerobothria, Stichoplastoris， Theraphosa，Thrixopelma，Tmesiphantes，Vitalius，禾口 Xenesthis ；Thrigmopoeinae 為￡口度狼蛛。屬包括 Haploclastus 禾口 Thrigmopoeus ；合適的種包括但不限于Harpactirinae亞科，Pterinochilus屬的狼蛛，包括坦桑尼亞葉尾(Pterinochilus alluaudi)，烏桑巴拉星團巴布蜘蛛(Pterinochilus chordates)，坦桑尼亞侏儒(Pterinochilus leetzi)，坦桑尼亞灰星巴布(多多馬巴布，Pterinochilus lugardi)，禮巴布(Pterinochilus murinus)(艮口 Pterinochilus spp. Usambara(Psp)), Pterinochilus simoni，禾口 Pterinochilus vorax。 其它合適的種包括但不限于Ornithoctoninae亞科，Haplopelma屬的狼蛛，包括泰國斑馬腳 (Haplopelma albostriatum)，Haplopelma doriae，海南捕鳥蟲朱(Haplopelma hainanum)， 金屬藍蜘蛛，越南老虎尾(Haplopelma longipes)，泰國黑捕鳥(Haplopelma minax)，泰國紅腳(Haplopelma robustum)，馬來西亞捕鳥蛛(Haplopelma salangense)，虎紋捕鳥蛛(Haplopelma schmidti)，和越南地老虎(Haplopelma vonwirthi)。其它合適的種包括但不限于Theraphosinae亞科，grammostola屬的狼蛛，包括巴西紅尾(Grammastola actaeon),巴西灰煙霧(Grammastola alticeps), Grammastola andreleetzi,巴西黑絲絨(Grammastola pulchripes)，阿根廷攻瑰(Grammastola burzaquensis)，巴西巨人金直間(Grammastola chalcothrix), Grammastola doeringi,阿根廷長翅(Grammastola fossor),阿根廷紅翅(Grammastola gossei),阿根廷褐紅(Grammastola grossa),巴西巨人紅尾(Grammastola iheringi)，阿根廷棕?zé)熿F(Grammastola inermis)，阿根廷侏儒(Grammastola mendozae)，彭巴斯茶紅(Grammastola mollicoma),巴西巨人猛 (Grammastola monticola)，智利紅攻瑰(Grammastola porteri)、巴西黑(Grammastola pulchra)，智禾Ij火攻瑰(Grammastola rosea)，智禾Ij大虎斑(Grammastola schulzei)，南美狼妹(Grammastola spatulata)，禾口阿根廷褐黃(Grammastola vachoni)。關(guān)于智利火玫瑰(Grammostola rosea)的分類，應(yīng)理解，智利火玫瑰(Grammostola rosea)可分為例如棕色變種或紅色變種。智利火玫瑰的紅色變種也稱作Wirixotrichus auratus 和智利粉爆紋(Paraphysa scrofa)，并可稱為 RedMorph Grammostola (RMG)。智利火玫瑰的棕色變種也稱作智利紅玫瑰(Grammostola poteri)和南美狼蛛(Grammostola spatulata),并可稱為 Brown Morph Grammostola(RMG)0 此夕卜，Grammostola 的至少兩個其它種或變種，一個來自康塞普西翁(Conc印ion)，而一個來自智利北部。特別合適的狼蛛種包括但不限于Pterinochilus spp. Usambara(Psp)，金屬藍蜘蛛(Hv)禾口 RedMorph Grammostola(RMG)0除非另有說明，否則應(yīng)理解，本文所列舉的任意濃度范圍、百分比范圍、或比率范圍包括所述范圍內(nèi)的任意濃度、百分比或比率的整數(shù)及其分數(shù)，如整數(shù)的十分之一和百分之一。除非另有說明，否則應(yīng)理解，本文所列舉的與任意物理性質(zhì)如聚合物亞單元、尺寸或厚度有關(guān)的任意數(shù)值范圍包括所列舉范圍內(nèi)的任意整數(shù)。應(yīng)理解，如以上和本文別處所使用的術(shù)語“一個”和“一種”是指“一個或多個(一種或多種)”所列舉的成分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員清楚的是，除非另有具體規(guī)定，否則單數(shù)形式的使用包括復(fù)數(shù)形式。因此，術(shù)語“一個”、“一種”和“至少一個”在該申請中可交替使用。在整個本申請中，各實施方式的描述使用“包括”的語言；然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解到，在某些具體實例中，可以可替換地使用語言“基本由……組成”或“由……組成”來描述實施方式。除非另有說明，否則為了更好的理解本發(fā)明的教導(dǎo)并絕不限制教導(dǎo)的范圍，應(yīng)理解所有表達數(shù)量、百分比或比例的數(shù)值，以及在說明書和權(quán)利要求書中使用的其它數(shù)值在所有情況下由術(shù)語“約”進行修飾。因此，除非有相反規(guī)定，否則在以下說明書和所附權(quán)利要求中闡述的數(shù)值參數(shù)為近似值，其根據(jù)期待獲得的所需性能而可以不同。最低程度低，至少應(yīng)依據(jù)所報導(dǎo)的有效數(shù)字并通過應(yīng)用常規(guī)舍入技術(shù)對每個數(shù)值參數(shù)進行解釋。如本文所使用的其它術(shù)語通過本領(lǐng)域的熟知的含義來定義。II.分離蜘蛛毒液肽的方法本文所描述的分離的蜘蛛毒液肽可分離自粗蜘蛛毒液。特別地，用于純化粗毒液以獲得本文所述的分離肽的方法可以包括或由以下步驟組成離心粗蜘蛛毒液以獲得離心毒液；過濾離心毒液以獲得過濾毒液；將過濾毒液加載到凝膠過濾柱上；和洗脫該柱以獲得含有所述分離肽的部分，可使用陽離子交換和/或HPLC色譜進一步純化所述分離肽。粗毒液可以為一種或多種新鮮毒液、冷凍保存的毒液或凍干的粗毒液?？梢栽诶缂s10，000至約16，000 rpm或約13，000 rpm下例如約2至約15分鐘或約7分鐘，將粗毒液例如凍干的毒液溶于緩沖液中，例如PH為約6. 0的100 mM AmAc (緩沖液A)。可選地通過例如膜過濾器進一步過濾上清液，例如0. 22 μ m過濾器。此后，將上清液或濾液加載到預(yù)沖洗的凝膠過濾柱，例如Superdex-30上?？墒褂眉s2倍柱體積(cv)的緩沖液A預(yù)洗該柱，然后注射樣品。運行參數(shù)可以包括例如使用2 cv的緩沖液A以0.8 ml/min洗脫樣品， 7 ml/部分。隨后可吸取部分并可選地通過膜過濾器再次過濾，例如0.22 μ m過濾器。此后，可選地使用反相HPLC并通過分級梯度洗脫而進一步純化所得的樣品，所述梯度洗脫包括溶劑例如在0. TFA中的5% ACN(A)，和流動相例如在0. 1 TFA中的60% ACN(B)。步驟可以為 3 cv 的 0-30% B，10 cv 的 30-55% B，0. 5 ml/部分和 2 cv 的 55-100% B。本文所描述的肽在第二步中洗脫。運行參數(shù)可以為在0.1% TFA中的緩沖液5%-60% CAN。三級梯度0%-30%-55%-100%，0. 5 ml/部分，1 ml/min。III.合成蜘蛛毒液肽的方法可以通過化學(xué)合成制備或可以使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)本文所描述的肽。為了通過化學(xué)合成來制備本發(fā)明的肽，可以使用公開的已知方法，例如可通過使用疊氮化物、酰基氯、酸酐、復(fù)合酸酐、DCC、活化酯、伍德沃德試劑K、羰基咪唑、去氧化、DCC/HONB、BOP試劑的方法來獲得本發(fā)明的肽(參見例如Bozanszky，M和Μ. A. Ondetti，Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York(1966) ；Schroeder 禾口 Luebke, The Peptide, Academic Press, New York(1965) ；F.Μ. Finn 禾口 K.Hofinann, The Proteins Vol. 2, H. Nenrath, R. L. Hill ed. , Academic Press Inc. , New York(1976) ；Nobuo Izumiya 等人， Peptide Gosei no Kiso to Jikken(Basics and experiments of peptide synthesis), Maruzen Co. (1985) ；Haruaki Yajima 禾口 Shunpei Sakakibara 等人’ Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experiment) 1, Japanese Biochemical Society ed. , Tokyo Kagaku Dojin Co. (1977) ；Toshiya Kimura, Zoku Seikagaku Jikken Koza(Sequel to Biochemical Experiment) 2, Japanese Biochemical Society ed. , Tokyo Kagaku Dojin Co. (1987))。此外，可使用自動肽合成儀(例如PE Applied Bio Systems Co.)通過化學(xué)合成來制備本文所描述的肽。諸如在Bulaj G.等人Q006) Biochemistry 45,7404中描述的方法也可用于合成本文所描述的肽和再折疊程序中。此外，在反應(yīng)完成后，可通過已公開的已知純化方法對本文所描述的肽進行純化和分離。例如，可通過溶劑提取、蒸餾、柱色譜、液相色譜、重結(jié)晶等的組合對本發(fā)明的肽進行純化和分離。當(dāng)通過上述方法獲得的本文所述的肽為游離形式時，可使用公開的已知方法將其轉(zhuǎn)換為鹽形式，并且另一方面，當(dāng)獲得的肽為鹽形式時，可使用公開的已知方法將其轉(zhuǎn)換為游離形式。此外，大腸桿菌中的重組表達系統(tǒng)可用于將本文所述的肽表達為具有特定酶切位點的融合蛋白(TRX或GST)，例如腸激酶或TEV。接著，破壞并離心細菌，并且所產(chǎn)生的漿液包含融合蛋白。然后可將融合蛋白加載到特定親和柱，例如M2+或谷胱甘肽柱上以進行洗脫。在洗脫之后，使純化的融合蛋白經(jīng)受特定的酶切反應(yīng)。然后，通過HPLC或離子交換色譜將肽從所產(chǎn)生的混合物中純化出來。IV.其它生物學(xué)方法本文描述了涉及傳統(tǒng)和分析化學(xué)、分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)技術(shù)的方法。這樣的技術(shù)通常在本領(lǐng)域中是已知的，并且在方法學(xué)論著如Classics in Total Synthesis, Targets,Strategies,Methods,K. C. Nicolaou and E. J. Sorensen,VCH,New York,1996 ；The Logic of Chemical Synthesis, E. J. Coney and Xue-Min Cheng, Wiley&Sons, NY,1989 ; 禾口 NMR of Proteins and Nucleic Acids，Wuthrich，K. ，Wiley&Sons，New York，1986 中詳細描述。分子生物學(xué)和細胞生物學(xué)方法描述在論著如Molecular Cloning =A Laboratory Manual, 3rd ed.，vol. 1-3, ed. Sambrook 等人，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y·,2001; 禾口 Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel 等人，Greene Publishing and ffiley-Interscience, New York, 1992 (定期更新)中。V.包括蜘蛛毒液肽的藥物組合物制劑可通過腸道外、局部或直腸給予本文所描述的藥物組合物。當(dāng)然，它們通過適合于每種給予途徑的形式給予。例如，它們通過注射、吸入、軟膏、栓劑等給予。通過注射、輸注或吸入給予；通過洗劑或軟膏局部給予；并且通過栓劑直腸給予。如本文所使用的短語“腸道外給予”和“非腸道給予”是指除腸道和局部給予以外的給予模式，通常通過注射，并且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心臟內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內(nèi)和胸骨內(nèi)注射以及輸注。如本文所使用的短語“全身給予”、“系統(tǒng)給予”、“外周給予”是指除了直接給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外，化合物、藥物或其它物質(zhì)的給予，以使其進入患者身體，因此經(jīng)受代謝和其它類似過程，例如皮下給予。一般配制程序的詳情和另外賦形劑的信息可以在Remington :The Science and Practice of Pharmacy, 20th 版中找到?？梢詫行Я康谋疚乃龅碾牡慕M合物給予需要治療的受試者。可以通過腸道外、靜脈內(nèi)、局部、口服、頰、鼻、直腸、皮下、肌內(nèi)或腹膜內(nèi)給予組合物。在一個實施方式中，可將組合物注射入例如腦脊液中。可配制治療的組合物以與給予途徑相一致。組合物可配制成片劑、膠囊劑、溶液、 粉末、吸入劑、洗劑、酊劑、錠劑、栓劑或透皮貼劑。參見，例如Journal of Pharmaceutical Sciences, (1963),52:918 et seq。用于腸道外、皮內(nèi)或皮下給予的溶液可以包括例如無菌稀釋劑如水、鹽水、甘油、 不揮發(fā)性油、聚乙二醇、丙二醇、或其它合成溶劑；抗菌劑如苯甲醇或尼泊金甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑；緩沖劑如乙酸鹽或磷酸鹽。溶液可儲存在安瓿、一次性注射器、或塑料或玻璃瓶中。用于注射或靜脈內(nèi)給予的制劑(劑型)可以包括載體，其為溶劑或分散介質(zhì)。合適的載體包括水、生理鹽水、抑菌水、Cremophor EL (BASF, Parsippany, NJ)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、乙醇、多元醇(例如，甘油、乙二醇、丙二醇等)，以及它們的混合物。這些組合物必須是無菌的并且是流體以便于注射?？墒褂猛繉尤缏蚜字虮砻婊钚詣┍３至鲃有?。通過包括抗菌劑和抗真菌劑可防止微生物污染，如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、 和硫柳汞。糖和多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉，可用于維持組合物的等滲性。通過溶液的過濾滅菌可確保無菌性?？商鎿Q地，可以使用分別過濾滅菌的成分來生產(chǎn)溶液。過濾滅菌的成分可以被真空干燥或凍干以制備無菌粉末。在注射之前可使用無菌載體溶液再水化這樣的粉末?？诜M合物包括例如片劑；膠囊劑；錠劑；混懸劑；和溶液?？墒褂枚栊韵♂寗┗蚴秤幂d體來制備組合物?？赏ㄟ^將合適的稀釋劑與肽或其制劑組合并用該混合物填充膠囊來配制膠囊劑。常見的稀釋劑為淀粉如粉狀纖維素，或糖如蔗糖、果糖或甘露醇?？梢越柚跀D壓或借助于其它已知方法，通過濕法或干法制粒來制備片劑。除了期望的肽/化合物之外，用于片劑的組合物可以包括例如粘合劑如微晶纖維素，或明膠；賦形劑如淀粉；糖 (例如，乳糖、果糖、葡萄糖、甲基纖維素、乙基纖維素)；樹膠(例如黃蓍膠、阿拉伯樹膠)； 崩解劑(例如褐藻酸、Primogel、或玉米淀粉)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂或Merotes)；助流劑(例如，膠狀二氧化硅)；甜味劑(例如，蔗糖或糖精)；芳香劑(例如，薄荷、水楊酸甲酯、或橙味劑)；或具有類似性質(zhì)的任何化合物?？缮锝到獾木酆衔锶缇?D，L-丙交酯-共-乙醇酸交酯或聚乙醇酸交酯可用作基質(zhì)以延緩組合物的釋放(參見例如美國專利號 5，417，986,4, 675，381、和 4，450，150)。對于通過吸入的給予，可以將化合物從包含合適的推進劑例如氣體的加壓容器分配器中以例如氣溶膠噴霧的形式或通過其它已知的方法來遞送。例如，也可透粘膜給予，例如使用鼻噴劑或栓劑，或通過透皮方式給予，例如使用藥膏、軟膏齊 、凝膠劑或乳膏齊 ?？梢允褂冒ɡ缒懼}和夫西地酸衍生物的制劑進行這樣的給予模式。給予的模式本文所述的肽可通過例如推注、持續(xù)輸注來給予，以便延長與硬膜外區(qū)域的接觸， 或通過其它已知方法給予。肽可以輸注任意時間量?？梢岳缭谥委熖弁吹臉?biāo)準臨床協(xié)議的框架內(nèi)，根據(jù)特定受試者的需要調(diào)整劑量和給予時間。也可以通過鞘內(nèi)途徑來遞送肽，并進入血流中。此外，可以使用可植入或可固定于身體的泵以受控的速率來遞送本文所述的肽?？商鎿Q地，可以通過本領(lǐng)域已知的儲庫或緩釋制劑來實現(xiàn)延長的給予。劑量必須確定用于治療的合適的劑量。抑制劑的有效量為改善受試者脊髓性肌萎縮癥狀所需的量或劑量。治療個體受試者所需的量或劑量的確定對于本領(lǐng)域技術(shù)人員(例如醫(yī)生、藥劑師或研究者)來說是慣常的。還可以確定肽和/或肽制劑的毒性和治療效能。常規(guī)方案可用于確定非人類動物的LD5tl (使50%的群體致死的劑量)和ED5tl (對50%的群體治療有效的劑量)。治療指數(shù)測量為LD5Q/ED5Q的比率。合適的比率包括例如，大于約2、5、10、50、或100的比率?？梢源_定具有高治療指數(shù)的化合物、制劑和給予方法，這是由于這樣的治療在提供高效能的劑量下具有較小的毒性。如果可提供方法以將化合物遞送至受疾病侵襲的組織同時使未受疾病侵襲的組織例如內(nèi)皮組織的損傷最小化，則可以使用具有毒性或不期望的副作用的化合物。在配制用于人類的劑量范圍時，可以通過對實驗動物進行的研究而估計肽制劑的有效劑量，例如如下所述。例如，在細胞培養(yǎng)測定中的治療有效量包括例如約0. InMUnM, 10ηΜ、100ηΜ、1μΜ、或10 μ M的肽，以及其間的范圍?？梢栽趧游镏信渲苿┝恳员闶挂种苿┑难h(huán)血漿濃度落入該范圍中。示例性的劑量可產(chǎn)生超過如在細胞培養(yǎng)測定中所確定的 IC5tl的血漿濃度(S卩，可達到癥狀的半數(shù)最大抑制的測試化合物的濃度)?？赏ㄟ^例如獲取血液樣本，并且通過使用基于抗體的特異性ELISA分析或使用高效液相色譜或質(zhì)譜分析樣本來確定循環(huán)血漿濃度。可替換地，可以根據(jù)如下所述的動物模型中的試驗來估計劑量。當(dāng)大鼠接受劑量為至少約1 μ g/kg至10mg/kg或更多的肽或藥物組合物時，可觀察到癥狀的減輕。例如， 劑量可以為 10μ g/kg、20y g/kg、40y g/kg、80y g/kg、120y g/kg、180y g/kg、240y g/kg、 300 μ g/kg、或 360 μ g/kg、lmg/kg、ang/kg、5mg/kg、7mg/kg 或 10mg/Kg。動物和人類劑量間的相互關(guān)系(基于每平方米體表的毫克數(shù))由例如Freireich等人，Cancer Chemother. R印.1966，50，219來描述?？梢酝ㄟ^患者的高度和重量來粗略估計體表面積。參見，例如 Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537。估計用于治療人類患者的有效劑量為大約至少3 μ g/kg、30 μ g/kg、120 μ g/kg、180 μ g/kg、240 μ g/kg、 300μ g/kg、或500μ g/kg?？梢砸砸欢l率或持續(xù)給予肽以便維持有效減少受試者疼痛的局部濃度。取決于給予的方法，合適的劑量可以從例如約1 μ gkg—1天―1至約IOmg kg—1天―1變化。當(dāng)患者在被醫(yī)生、藥劑師或研究者照管時，可對用于該患者的劑量進行優(yōu)化。例如，最初可給予相對低劑量的所述肽。可以如下所述監(jiān)測患者的癥狀和疼痛的感覺。可增加劑量直到獲得合適的反應(yīng)。此外，用于任意特定受試者的具體劑量水平會隨著受試者的年齡、體重、一般健康狀況、性別、以及受試者的飲食、給予時間、給予途徑、排泄速率、和組合提供的其他藥物而變化。實施例方法粗毒液的凝膠過濾Pterinochilus spp. Usambara,金屬藍_蛛禾口 Red Morph Grammostola 卿蛛毒液購自Spiderpharm，AZ, USA。將100 mg來自SpiderPharm的凍干粗毒液(每批也由 Nanodrop測定了蛋白含量)溶于2. 5 ml的緩沖液A(IOOmM AmAc pH 6.0)中，以13000 rpm離心7分鐘，通過0. 22 μ m醋酸纖維素膜過濾器過濾，然后使用AKTA prime系統(tǒng)(GE HealthCare, Amersham)將其加載在填充到 XK 柱洸/70(代號56876900 ；GE HealthCare) 中的Superdex-30制備性凝膠過濾介質(zhì)(GE HealthCare)中。使用2柱體積(cv)的緩沖液A預(yù)沖洗該柱，并使用進樣環(huán)管注射樣品。運行參數(shù)用2cv的緩沖液A = 100 mMAmAc pH 6. 0以0. 8 ml/min洗脫樣品，7ml/部分。其它餼譜程序在圖1-6的圖例中詳細地描述了陽離子交換和HPLC程序。質(zhì)譜分析MALDI-T0F M. S. (Applied Biosystems, Voyager Biospectrometry-DE, Sequenom)，使用芥子酸基質(zhì)根據(jù)制造商協(xié)議進行制備。肽測序
隨后對純化的肽進行測序，其包括 天然肽的Edman測序，由德國的Proteome Factory和/或瑞士的Atheris進行。 天然肽的MS-MS分析，由德國的ftOteome Factory和/或瑞士的Atheris進行?！ぬ烊浑牡拿噶呀夂推蔚腍PLC分離?！て蔚腅dman測序，由德國的Proteome Factory和/或瑞士的Atheris進行。·天然肽的氨基酸分析，在美國加州大學(xué)戴維斯分校進行?！我煌凰氐腖C-MS分析，由德國的Proteome Factory和/或瑞士的Atheris 進行。細胞培養(yǎng)大鼠DRG神經(jīng)元從3周齡Charles River大鼠中收集來自背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物。DRG通過在膠原酶/分散酶中的酶消化來制備，在胰蛋白酶中分離并通過拋光的巴斯德吸管破碎成單一細胞混懸液。使用percole梯度純化細胞以濃縮用于神經(jīng)元的培養(yǎng)物。隨后將它們接種在matrigel 包被的蓋玻片上的M孔組織培養(yǎng)板上，并且在37°C下在50 ng/ml NGF和10 mM AraC存在下在F-12培養(yǎng)基，10%胎牛血清(FCS)中培養(yǎng)。然后，制備M小時-4天后，所培養(yǎng)的DRG可用于電生理學(xué)。衍生自心肌細胞的小鼠ES細胞根據(jù)制造商的說明書，使用衍生自轉(zhuǎn)基因修飾的小鼠胚胎干細胞的可隨時使用的Cor. At 心肌細胞，其代表原代樣細胞，并顯示原代心肌細胞的典型特征和性質(zhì)。對細胞進行簡單解凍并分別附著于(IxlO4細胞)在含有嘌呤霉素的Cor.At 培養(yǎng)基中的0. 明膠或0. 明膠/纖維連接蛋白包被的蓋玻片48 h，然后將培養(yǎng)基更換為Cor.At 培養(yǎng)基。1周內(nèi)的4天后細胞可用于電生理學(xué)。如所描述的使rNavl. 3通道在HEK-293細胞中表達(Cummins，Τ. R.，等人，2001)如所描述的，通過使用傳統(tǒng)的瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染使rNavl. 8通道在ND7-23細胞中表達(Zhou, X.，等人，2003 John, V. H.，等人，2004 Jarvis, M. F.，等人，2007 ；Zimmermann, K.，等人，2007)。爪蟾卵母細胞中的hNav1.3。合成RNA并注入爪蟾卵母細胞中(每個卵母細胞中約10 ng)，并且在三天后使用雙電極電壓鉗方法記錄內(nèi)部電流(Dascal 1987)。如所描述的，使hKvll. 1 (hERG)在HEK-293細胞中表達(Zhou等人，1998)。電生理學(xué)方案膜片鉗方法(Hamil等人.1981)用于跟蹤和記錄來自幾種細胞類型的離子電流或膜電壓。這些包括過表達重組通道的異源表達系統(tǒng)以及天然或模型細胞。表1給出了用于跟蹤活性的溶液和電壓方案。在所有膜片鉗記錄中，采樣速率為10-50 kHz(間隔 20-100 μ S)。膜片鉗的配置包括放大器和數(shù)字化儀(Axopatch 200B,DIGDATA 1322A_Axon instruments)、顯微鏡(Nikon ECLIPSE 100)和顯微操作器(MP-225-SUTTER INSTRUMENT Co.)。使用硼硅酸鹽玻璃管(SUTTER INSTRUMENT Co.)拉制吸管。始終使用對照細胞外溶液灌注細胞，并使用 ValveLink 16 (Automate Scientific Inc.)和蠕動泵(Iismatec)灌注系統(tǒng)進行更換含有試劑的溶液。除了 TTX、rBeKM-l來自Alomone (以色列)以外，所有化學(xué)品均來自Sigma。使用 ND 96 槽液、Geneclamp 禾口 Digidata 1320 (Axon instruments)禾口手動(基于重力)灌注系統(tǒng)記錄爪蟾卵母細胞中的電流。
表權(quán)利要求
1.一種分離肽，包括選自由 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、以及它們的C端酰胺化形式組成的組中的氨基酸序列。
2.一種分離肽，由以下氨基酸序列組成所述氨基酸序列選自由 SEQ ID N0:1、SEQ ID NO :2、SEQ ID N0:3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、以及它們的C端酰胺化形式組成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離肽，其中，所述氨基酸序列由選自由SEQID N0:1的 C端酰胺化形式、SEQ ID NO :2的C端酰胺化形式、SEQ ID NO 4的C端酰胺化形式和SEQ ID NO 5的C端酰胺化形式組成的組中的序列表示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離肽，用于治療疼痛。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離肽，用于治療神經(jīng)源性疼痛和/或神經(jīng)性疼痛。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離肽，用于治療癌癥疼痛、術(shù)后疼痛、口腔或牙齒疼痛、 來自所提及的三叉神經(jīng)痛的疼痛、來自皰疹后神經(jīng)痛的疼痛、或由于反射交感性營養(yǎng)不良引起的疼痛。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離肽，用于治療與炎性病癥相關(guān)的疼痛。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離肽，用于治療與一種或多種病癥相關(guān)的疼痛，所述病癥選自由急性疼痛，偏頭痛，頭痛，周期性偏頭痛，外傷性神經(jīng)損傷，神經(jīng)壓迫，神經(jīng)卡壓，皰疹后神經(jīng)痛，三叉神經(jīng)痛，糖尿病性神經(jīng)病變，慢性下腰痛，幻肢痛，慢性盆腔疼痛，神經(jīng)瘤疼痛，復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合癥，慢性關(guān)節(jié)炎疼痛，以及與癌癥、化療、HIV和HIV治療誘導(dǎo)的神經(jīng)病、腸易激綜合癥和相關(guān)障礙和克羅恩病有關(guān)的疼痛組成的組。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離肽在治療疼痛中的應(yīng)用。
10.一種藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的分離肽；以及藥用載體或稀釋劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的藥物組合物，其中，所述分離肽表示為選自由SEQID NO 1的C端酰胺化形式、SEQ ID NO :2的C端酰胺化形式、SEQ ID NO 4的C端酰胺化形式和 SEQ ID NO 5的C端酰胺化形式組成的組中的肽。
12.根據(jù)權(quán)利要求10至11中任一項所述的藥物組合物，用于治療疼痛。
13.根據(jù)權(quán)利要求10至11中任一項所述的藥物組合物在治療疼痛中的應(yīng)用。
14.根據(jù)權(quán)利要求10至11中任一項所述的藥物組合物，用于治療神經(jīng)源性疼痛和/或神經(jīng)性疼痛。
15.根據(jù)權(quán)利要求10至11中任一項所述的藥物組合物，用于治療癌癥疼痛、術(shù)后疼痛、 口腔或牙齒疼痛、來自所提及的三叉神經(jīng)痛的疼痛、來自皰疹后神經(jīng)痛的疼痛、或由于反射交感性營養(yǎng)不良引起的疼痛。
16.根據(jù)權(quán)利要求10至11中任一項所述的藥物組合物，用于治療與炎性病癥相關(guān)的疼痛。
17.根據(jù)權(quán)利要求10至11中任一項所述的藥物組合物，用于治療與一種或多種病癥相關(guān)的疼痛，所述疾病選自由急性疼痛，偏頭痛，頭痛，周期性偏頭痛，外傷性神經(jīng)損傷，神經(jīng)壓迫，神經(jīng)卡壓，皰疹后神經(jīng)痛，三叉神經(jīng)痛，糖尿病性神經(jīng)病，慢性下腰痛，幻肢痛，慢性盆腔疼痛，神經(jīng)瘤疼痛，復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合癥，慢性關(guān)節(jié)炎疼痛，以及與癌癥、化療、HIV和HIV 治療誘導(dǎo)的神經(jīng)病變、腸易激綜合癥和有關(guān)障礙和克羅恩病相關(guān)的疼痛組成的組。
18.一種治療疼痛的方法，包括給予需要這樣的治療的受試者有效鎮(zhèn)痛量的根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項所述的分離肽或包括由SEQ ID NO :6表示的氨基酸序列的分離肽。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述疼痛為神經(jīng)源性疼痛和/或神經(jīng)性疼痛。
20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述疼痛為癌癥疼痛、術(shù)后疼痛、口腔或牙齒疼痛、來自所提及的三叉神經(jīng)痛的疼痛、來自皰疹后神經(jīng)痛的疼痛、或由于反射交感性營養(yǎng)不良引起的疼痛。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述疼痛與炎性病癥相關(guān)。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述疼痛與一種或多種病癥相關(guān)，所述病癥選自由急性疼痛，偏頭痛，頭痛，周期性偏頭痛，外傷性神經(jīng)損傷，神經(jīng)壓迫，神經(jīng)卡壓，皰疹后神經(jīng)痛，三叉神經(jīng)痛，糖尿病性神經(jīng)病，慢性下腰痛，幻肢痛，慢性盆腔疼痛，神經(jīng)瘤疼痛，復(fù)雜區(qū)域疼痛綜合癥，慢性關(guān)節(jié)炎疼痛，以及與癌癥、化療、HIV和HIV治療誘導(dǎo)的神經(jīng)病、腸易激綜合癥和有關(guān)障礙和克羅恩病相關(guān)的疼痛組成的組。
23.一種治療受試者體內(nèi)疼痛的方法，包括給予需要其的受試者治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求10至11中任一項所述的藥物組合物。
24.一種用于分離根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肽的方法，包括離心粗蜘蛛毒液以獲得離心毒液；過濾所述離心毒液以獲得過濾毒液；將所述過濾毒液加載在凝膠過濾柱上；以及洗脫所述柱以獲得包含分離肽的部分。
25.—種編碼根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的分離肽的核酸序列。
26.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項所述的分離肽，其中，所述肽分離自蜘蛛毒液。
27.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項所述的分離肽，其中，所述肽是分離的合成肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的分離肽，其中，所述蜘蛛為一種狼蛛。
29.一種具有20至40個連續(xù)氨基酸的分離肽，包括序列Dclgx1X2X3X4Qc5PDNDkcc (seq id no 7)其中&為M或F A2為M或F 為R或S A4為K或S ；而&為D或I，并且所述肽呈現(xiàn)離子通道抑制活性。
30.一種具有20至40個連續(xù)氨基酸的分離肽，包括序列ACX6GX7X8X9XioCXiiPXi2Xi3DXi4CC(SEQ ID NO 8)；其中&為K或L ;X7為L或F 為G或F ;X9為E或V ；X10為K或T ；X11為N或T ；X12 為S或G ；X13為N或K ；而Xw為K或E，并且所述肽呈現(xiàn)離子通道抑制活性。
31.一種具有20至40個連續(xù)氨基酸的分離肽，包括序列X15VCSX16X17HKffCKY (SEQ ID NO 9)其中X15為L或H ；X16為Q、S或R ；而X17為K或T，并且所述肽呈現(xiàn)離子通道抑制活性。
32.一種阻斷Niiv通道的方法，包括給予需要其的受試者治療有效量的分離肽，所述分離肽由選自由SEQ ID NO=USEQ IDNO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、以及它們的 C 端酰胺化形式組成的組中的氨基酸序列表示。
33.一種用于分離來自Red Morph Grammostola(RMG)毒液的由包括SEQ ID NO :6的序列表示的肽的方法，所述方法包括離心粗RMG毒液以獲得離心毒液； 過濾所述離心毒液以獲得過濾毒液； 將所述過濾毒液加載在凝膠過濾柱上；以及洗脫所述柱以獲得含有分離肽的部分。
34.一種用于對根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的肽進行再折疊的方法，包括 收集粗肽以生產(chǎn)收集肽；溶解所述收集肽以生產(chǎn)溶解肽； 還原所述溶解肽以生產(chǎn)還原肽；在包含還原和/或氧化的半胱氨酸或谷胱甘肽的氧化還原混合物中折疊所述還原肽以生產(chǎn)折疊肽；以及純化所述折疊肽以生產(chǎn)再折疊肽。
35.一種用于阻斷Nav通道的組合物，所述組合物包括由選自由SEQ ID NO=U SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、以及它們的 C 端酰胺化形式組成的組中的氨基酸序列表示的分離肽。
全文摘要
本發(fā)明描述的主題涉及用作有效和選擇性離子通道阻斷劑的分離的蜘蛛毒液肽，以及組合物和用于治療疼痛的方法。
文檔編號A61K38/00GK102573884SQ201080041208
公開日2012年7月11日 申請日期2010年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月15日
發(fā)明者埃拉·科爾貝, 尼西姆·巴扎約, 羅尼特·西姆哈·切爾基, 耶爾·蘭古特, 阿隆·梅厄 申請人:阿洛莫恩臨床有限公司