專利名稱：特異用于胞外基質(zhì)蛋白的氨基酸序列rgd的人源化抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
貫穿本申請，此處引入幾個參考。將這些參考的公開以其全部引入此處以作本申請的參考。本發(fā)明涉及免疫特異性識別胞外基質(zhì)蛋白的氨基酸序列RGD(Arg-Gly-Asp)的人源化抗體，并涉及其用于各種疾病或紊亂包括癌癥、炎性疾病、自身免疫病、傳染病和骨疾病等的治療和診斷的用途。
2.
背景技術(shù)：
細(xì)胞黏附在多細(xì)胞生物的生命維持中發(fā)揮著重要的作用。多細(xì)胞生物的細(xì)胞黏附 分為細(xì)胞-胞外基質(zhì)(下文中縮寫為“ECM”)黏附與細(xì)胞-細(xì)胞黏附，已闡明整聯(lián)蛋白介導(dǎo)細(xì)胞-ECM黏附，鈣黏著蛋白、密蛋白和柄蛋白等介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞黏附?？缒ゐじ降鞍?，如整聯(lián)蛋白構(gòu)成細(xì)胞-ECM黏附。據(jù)報(bào)道，整聯(lián)蛋白形成a鏈與3鏈的異二聚體。目前已鑒定并證實(shí)至少18種a鏈、8種P鏈以及24種a ^異二聚體。已知各類型的整聯(lián)蛋白識別特異配體。包括整聯(lián)蛋白的跨膜黏附蛋白除細(xì)胞黏附以外還涉及細(xì)胞內(nèi)信號由ECM向細(xì)胞的傳導(dǎo)，以及增殖、運(yùn)動和分化的調(diào)節(jié)(F. G. Giancotti等人，Science,285，1028-1032，1999)。已知許多蛋白質(zhì)為ECM蛋白，其分為膠原蛋白類(如I-XIX型)、非膠原糖蛋白類(如骨橋蛋白(osteopontin, 0PN)、玻連蛋白、纖連蛋白、血管性血友病因子(vonWillebrand Factor)、層粘連蛋白、生腱蛋白、纖維蛋白原、血小板反應(yīng)蛋白)，彈性蛋白類及蛋白聚糖類。這些ECM蛋白與相應(yīng)的整聯(lián)蛋白結(jié)合并激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組構(gòu)、移動、增殖和分化等。ECM蛋白結(jié)合的整聯(lián)蛋白通過傳遞取決于ECM蛋白類型的特異信號來調(diào)控這些信號激活通路。似乎RGD (精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸)序列通常在許多ECM蛋白的細(xì)胞黏附區(qū)域觀察到，并且通過結(jié)合至整聯(lián)蛋白而顯示各種功能。已期望ECM蛋白的RGD序列可為藥物靶標(biāo)，已提供多種小分子化合物及人工肽。某些類型的整聯(lián)蛋白如a 33 I整聯(lián)蛋白、a 53 I整聯(lián)蛋白、a 83 I整聯(lián)蛋白、a V ^ I整聯(lián)蛋白、a 3整聯(lián)蛋白、a 5整聯(lián)蛋白、a 6整聯(lián)蛋白、a 8整聯(lián)蛋白已知與R⑶序列結(jié)合。已揭示a 50 I整聯(lián)蛋白與其特異性配體纖連蛋白之間的相互作用來研究整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，據(jù)報(bào)道a 50 I整聯(lián)蛋白不僅調(diào)控細(xì)胞黏附與細(xì)胞移動，還調(diào)控細(xì)胞分化及細(xì)胞死亡(S.M. Frisch等人Curr. Opin. Cell Biol.，9，701-706，1997)。還已表明a 5 P I整聯(lián)蛋白在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，并涉及癌癥的惡化。各整聯(lián)蛋白介導(dǎo)的信號因結(jié)合的ECM蛋白而不同。例如，由生長因子的刺激活化了纖連蛋白結(jié)合的內(nèi)皮細(xì)胞的生長，但抑制層粘連蛋白-I結(jié)合的內(nèi)皮細(xì)胞的生長。此外，由層粘連蛋白-10/11至a 30 I整聯(lián)蛋白所傳遞的信號不同于由纖連蛋白至a 50 I整聯(lián)蛋白所傳遞的信號，并顯著增強(qiáng)癌細(xì)胞的移動(J. Gu等人，J. Biol. Chem.，276，27090-27097，2001)，并顯著避免7由血液饑餓而導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡(J. Gu等人，J. Biol. Chem.，277，19922-19928，2002)。已在破骨細(xì)胞和新生血管中觀察到結(jié)合α V整聯(lián)蛋白的RGD序列的高度表達(dá)，RGD序列和α ν整聯(lián)蛋白的抑制已期望作為用于骨質(zhì)疏松癥及癌癥的治療藥物的靶標(biāo)。已表明α 5β I整聯(lián)蛋白在腫瘤細(xì)胞中高度表達(dá)，并涉及癌癥的惡化。從這些發(fā)現(xiàn)中，已開發(fā)出抗α5β1整聯(lián)蛋白抗體(伏洛昔單抗)、抗α 4整聯(lián)蛋白抗體(那他珠單抗(Natalizumab))、抗α νβ 3整聯(lián)蛋白抗體(維他辛(Vitaxin))作為抑制整聯(lián)蛋白與ECM蛋白之間相互作用的拮抗性抗整聯(lián)蛋白抗體藥物。同時，已知某些ECM蛋白如膠原蛋白、骨橋蛋白(OPN)、玻連蛋白、纖連蛋白、血管性血友病因子、層粘連蛋白、生腱蛋白、纖維蛋白原和血小板反應(yīng)蛋白包括R⑶序列。此外，已知某些病毒和某些細(xì)菌擁有RGD序列來黏附細(xì)胞。OPN為具有對骨中大量含有的鈣的結(jié)合性的酸性糖蛋白。據(jù)報(bào)道，OPN在細(xì)胞黏附、細(xì)胞遷移、腫瘤形成、免疫應(yīng)答以及補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞溶解中起重要作用。OPN敲除小鼠和抗OPN中和抗體的結(jié)果表明，OPN涉及肝炎、自身免疫病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及癌轉(zhuǎn)移。因此，期望ECM蛋白與細(xì)胞結(jié)合的抑制劑可用于骨質(zhì)疏松癥或癌癥的治療。因此，除上述靶向整聯(lián)蛋白的拮抗性藥物以外，已開發(fā)作為整聯(lián)蛋白的結(jié)合配偶體(binding partner)的革巴向ECM蛋白的拮抗性藥物。
3.

發(fā)明內(nèi)容
盡管已開發(fā)出藥物如抑制R⑶序列介導(dǎo)的與整聯(lián)蛋白相互作用的小分子、針對OPN的抗體以及針對整聯(lián)蛋白的抗體，但并未有關(guān)于特異性識別RGD序列的抗體的報(bào)道。由于RGD序列為ECM蛋白中的保守序列之一，特異性識別RGD序列的抗體期望具有對人類和治療模型動物二者的作用，因而被認(rèn)為是非常有用的用于治療劑開發(fā)的活性成分。因此，已存在對特異性識別RGD序列的抗體的需要。以前，本發(fā)明人分離鼠單克隆抗體，其免疫特異性識別RGD序列并由雜交瘤克隆33E10和35B6產(chǎn)生(保藏登錄號分別為FERM BP-10440和FERM BP-10441)。此處，雜交瘤克隆的名稱可互換地用作由該克隆產(chǎn)生的單克隆抗體的名稱。所有這些鼠抗RGD抗體為IgGl同種型。觀察到這些單克隆抗體通過結(jié)合ECM蛋白如骨橋蛋白的RGD序列來干擾ECM和細(xì)胞之間由RGD序列介導(dǎo)的結(jié)合。因此，這些抗RGD抗體期望顯示對RGD序列相關(guān)疾病如癌癥，例如癌細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)移，并對炎性疾病，例如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、傳染病、肝炎、支氣管哮喘、纖維樣變、糖尿病、動脈硬化、多發(fā)性硬化癥、肉芽瘤、炎性腸道疾病(潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)、自身免疫病和骨質(zhì)疏松癥等的治療或診斷效果。然而，由于這些單克隆抗體為鼠來源，由于其在人類中的免疫原性所造成的可能的不利影響已妨礙了其對人類診斷或治療用途的直接應(yīng)用。為了減少免疫原性，本發(fā)明人已制備了具有相應(yīng)于原鼠抗RGD抗體所顯示的那些生物學(xué)活性的人源化抗體，所述人源化抗體源自原鼠抗RGD抗體。因此，本發(fā)明提供人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其免疫特異性識別RGD序列，所述抗體包括部分源自非人源和部分源自人源的抗原結(jié)合區(qū)域。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包括源自非人源(供體)如33E10和35B6單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(下文中縮寫為“CDR”)，以及源自人源(受體)的框架區(qū)(下文中縮寫為“FR”)。所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可抑制RGD序列及其配體間的結(jié)合。在本發(fā)明的一方面，所述免疫特異性識別RGD序列的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包括(i)重鏈(下文中縮寫為“H-鏈”)，其包括至少一個源自人類H-鏈的可變區(qū)(下文中縮寫為“V區(qū)”)的H-鏈FR(下文中縮寫為“FRH” )，和至少一個源自免疫特異性識別RGD序列的非人源抗體的⑶RH至少之一的H-鏈⑶R(下文中縮寫為“⑶RH”)；或(ii)輕鏈(下文中縮寫為“L-鏈”)，其包括至少一個源自人類L-鏈的V區(qū)的L-鏈FR(下文中縮寫為“FRL” )，和至少一個源自免疫特異性識別RGD序列的非人源抗體的CDRL至少之一的L-鏈CDR(下文中縮寫為“CDRL”)；或上述⑴和(ii) 二者。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包括(i)包括VH的H-鏈，所述VH包括SEQ ID NO :92、94或96的氨基酸序列；或(ii)包括VL的L-鏈，所述VL包括SEQ IDN0:98或100的氨基酸序列；或(iii)上述⑴和(ii) 二者。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段包括由SEQ ID N0:91、92或93的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，和所述VL包括由SEQ ID NO :97或99的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。在本發(fā)明的優(yōu)選方面，所述VH包括由SEQ ID NO :91、92或93的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，和所述VL包括由SEQ IDNO 97或99的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。 在本發(fā)明的另一方面，所述VH包括SEQ ID NO 94的氨基酸序列，和所述VL包括SEQ ID NO :100的氨基酸序列。在本發(fā)明的另一方面，所述H-鏈包括SEQ ID NO :25或27的氨基酸序列，和所述L-鏈包括SEQ ID NO :29或31的氨基酸序列。在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，所述H-鏈包括SEQ ID NO :25的氨基酸序列，和所述L-鏈包括SEQ ID NO 31的氨基酸序列。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種載體，例如表達(dá)載體，其包括編碼本發(fā)明的免疫特異性識別RGD序列的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的H-鏈或L-鏈或二者的核苷酸序列。在此載體中，本發(fā)明的核苷酸序列能夠可操作地連接至一種或多種調(diào)控元件。本發(fā)明的核苷酸序列可包括編碼非人源供體抗體(由其衍生CDR)的信號肽、或者異源信號肽的核苷酸序列。此外，本發(fā)明提供包括本發(fā)明的核酸分子的宿主細(xì)胞，其含有包括本發(fā)明的核酸分子的載體。在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供分離的宿主細(xì)胞，其包括編碼本發(fā)明的人源化H-鏈的第一核酸分子和編碼本發(fā)明的人源化L-鏈的第二核酸分子，所述第一和第二核酸分子各自以表達(dá)本發(fā)明的生物學(xué)功能的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段這樣的方式可操作地連接至調(diào)控元件。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于制備本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括在表達(dá)所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞；和收集所產(chǎn)生的人源化抗體。本發(fā)明進(jìn)一步提供包括本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段至少之一的組合物。此外，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療與RGD蛋白相關(guān)的紊亂或疾病的藥物學(xué)組合物，其包括本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段至少之一，以及藥物學(xué)可接受載體。所述組合物的二者之一可進(jìn)一步包括可疊加地或協(xié)同地改善紊亂或疾病的另一活性化合物。所述活性化合物包括，但不限于抗炎化合物和化學(xué)療法化合物等。所述活性化合物還包括小分子化合物和抗體或其抗原結(jié)合片段，如人α4整聯(lián)蛋白特異性抗體或人α9整聯(lián)蛋白特異性抗體。
在另一方面，本發(fā)明提供一種用于預(yù)防或治療與RGD蛋白相關(guān)或涉及RGD蛋白的紊亂或疾病的方法，所述方法包括將預(yù)防或治療有效量的本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段至少之一向需要其的受試者給藥。對于此類用途，本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可與增強(qiáng)人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的生物學(xué)效應(yīng)的治療部分相結(jié)合。此類治療部分的實(shí)例包括另一抗體、抑制細(xì)胞生長或殺細(xì)胞的細(xì)胞毒素、放射線元素和/或包括抗炎劑和抗生素等的另一治療劑。在另一方面，本發(fā)明提供一種用于在受試者中診斷與RGD蛋白相關(guān)或涉及RGD蛋白的紊亂或疾病的方法，所述方法包括將診斷有效量的本發(fā)明的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段向待檢測的受試者給藥。對于此類診斷用途，本發(fā)明的人源化抗體可用檢測性標(biāo)簽如放射性元素標(biāo)記。3. I 定義如本文所使用的，術(shù)語“抗體”是指能夠免疫特異性結(jié)合期望的抗原或期望的序列如RGD序列的抗體分子，其包含作為整體的抗體分子或可包含包括抗體的抗原結(jié)合片段的 抗體的片段。本文所使用的術(shù)語“抗原結(jié)合片段”是指保持免疫特異性結(jié)合目的多肽、蛋白質(zhì)或序列(特別是RGD序列)的能力的抗體的任一片段，其包括單鏈抗體、Fab片段、F(ab' )2片段、二硫鍵連接的Fvs和包含特異性結(jié)合目的多肽、蛋白質(zhì)或序列的VL和/或VH或者CDR的片段。因此，此類人源化抗體的抗原結(jié)合片段可包括或可不包括部分或全長人恒定區(qū)。用于獲得上述抗體片段的各種方法在本領(lǐng)域是眾所周知的。本文所使用的術(shù)語“免疫特異性識別”是指抗體或其抗原結(jié)合片段特異性結(jié)合目的多肽、蛋白質(zhì)或序列，特別是人RGD序列的能力。此類抗體不非特異性結(jié)合其他多肽或蛋白質(zhì)。然而，免疫特異性結(jié)合目的多肽或蛋白質(zhì)(例如，RGD蛋白質(zhì))的抗體或其抗原結(jié)合片段可與其他抗原交叉反應(yīng)。例如，本發(fā)明的免疫特異性識別人RGD蛋白質(zhì)的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段可與鼠源RGD蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)。優(yōu)選地，免疫特異性識別RGD蛋白質(zhì)的抗體或其抗原結(jié)合片段不與其他抗原交叉反應(yīng)。本文所使用的術(shù)語“源自人源”或“源自非人源”是指其氨基酸序列分別源自人抗體或非人抗體的相應(yīng)部分的抗體部分。本文所使用的術(shù)語“受體序列”是指來自人抗體VH或VL的FR的核苷酸序列或氨基酸序列，其用作來自通常為非人抗體的供體抗體的CDR的受體。
4.


為了說明本發(fā)明，圖I至27反應(yīng)了目前優(yōu)選的形式；然而，應(yīng)理解，本發(fā)明不受限于圖I至27所示的精確形式，其中圖I示出鼠33E10VH cDNA的核苷酸序列，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。雙下劃線為成熟VH的N-末端氨基酸殘基(E)。下劃線為根據(jù) Kabat 等人(Sequences of Proteins of Immunological Interests,第五版，NIH Publication No. 91-3242, U. S. Departmentof Health and Human Services,1991)所定義的⑶R序列。圖2示出鼠33E10VL cDNA的核苷酸序列，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。雙下劃線為成熟VL的N-末端氨基酸殘基(D)。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。圖3示出設(shè)計(jì)的33E10VH基因的核苷酸序列(33E10VH基因側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線))，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。雙下劃線為成熟VH的N-末端氨基酸殘基(E)。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。內(nèi)含子序列為斜體。圖4示出設(shè)計(jì)的33E10VL基因的核苷酸序列(33E10VL基因側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線))，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。雙下劃線為成熟VL的N-末端氨基酸殘基(D)。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。內(nèi)含子序列為斜體。圖5示出嵌合和人源化的33E10抗體的表達(dá)載體(統(tǒng)稱為“表達(dá)載體”)的示意性結(jié)構(gòu)。從頂部的SalI位點(diǎn)順時針開始,質(zhì)粒包含重鏈轉(zhuǎn)錄單元,其以人巨細(xì)胞病毒(CMV)主要介導(dǎo)早期啟動子和增強(qiáng)子(CMV啟動子)開始來起始抗體重鏈基因的轉(zhuǎn)錄。CMV啟動子 之后為VH外顯子、包含人γ-l重鏈恒定區(qū)(包括具有間隔內(nèi)含子的CH1、鉸鏈、CH2和CH3外顯子)的基因組序列以及CH3外顯子之后的聚腺苷酸化位點(diǎn)。在重鏈基因序列后，輕鏈轉(zhuǎn)錄單元以CMV啟動子開始，隨后為VL外顯子和包含人K鏈恒定區(qū)外顯子(CL)的基因組序列(在其之前具有內(nèi)含子部分)，CL外顯子后為聚腺苷酸化位點(diǎn)。然后輕鏈基因接著這SV40早期啟動子(SV40啟動子)、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶基因(gpt)和包含SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)(SV40 poly(A)位點(diǎn))的片段。最后，質(zhì)粒包含pUC19質(zhì)粒的部分，其包括細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(PUC ori)和β-內(nèi)酰胺酶基因內(nèi)酰胺酶)。相關(guān)的限制性酶切位點(diǎn)的位置示于該圖。圖6 示出 33Ε10 VH、人源化 33Ε10 (Hu33E10) VH和人受體U03400 (GenBank登錄號)的氨基酸序列的比對。氨基酸殘基以單字母編碼示出。序列上方的數(shù)字表示根據(jù)Kabat等人(1991)的位置。下劃線為由Kabat等人定義的CDR序列(Sequences ofProteins ofImmunological Interests,第五版，NIH Publication No. 91-3242, U. S. Department ofHealth and Human Services, 1991)。雙下劃線殘基預(yù)計(jì)與⑶R接觸，鼠殘基以人源化的形式保持在這些位置。在該圖中省略U03400中的⑶R殘基。圖7 示出 33E10 VL、人源化 33E10 (Hu33E10) VL和人受體X72452 (Genbank登錄號)的氨基酸序列的比對。氨基酸殘基以單字母編碼示出。序列上方的數(shù)字表示根據(jù)Kabat等人(1991)的位置。下劃線為由Kabat等人定義的⑶R序列(1991)。在該圖中省略X72452中的⑶R殘基。圖8示出用于構(gòu)成Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸。圖9示出用于構(gòu)成Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸。圖10示出用于構(gòu)成Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸。箭頭表示各核苷酸的位置和方向(5'至3')。氨基酸殘基以單一字母編碼示出。圖11示出用于構(gòu)成Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸。箭頭表示各核苷酸的位置和方向(5'至3')。氨基酸殘基以單一字母編碼示出。圖12示出Hu33E10 VHl基因的核苷酸序列(該基因側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線))，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。雙下劃線為成熟VH的N-末端氨基酸殘基(E)。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。內(nèi)含子序列為斜體。圖13示出Hu33E10 VLl基因的核苷酸序列(該基因側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線))，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。雙下劃線為成熟VL的N-末端氨基酸殘基(D)。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。內(nèi)含子序列為斜體。圖14示出Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列(該基因側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線))，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。雙下劃線為在信號肽編碼區(qū)域中消除剪接供體位點(diǎn)的沉默突變。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。雙下劃線為成熟VL的N-末端氨基酸殘基(D)。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。內(nèi)含子序列為斜體。圖15A&15B示出嵌合和人源化的33E10 IgGl/k抗體與h0PN5_BSA的結(jié)合的 ELISA分析。在以IOOii g/ml下開始并連續(xù)2倍稀釋的各種濃度下試驗(yàn)純化的Ch33E10、Hu33E10-VHl/VL6、Hu33E10-VH5/VL6 和 Hu33E10_VH7/VL6 (圖 15A)以及 Ch33E10 和Hu33E10-VH7. 8/VL6 (圖15B)對于h0PN5_B SA的結(jié)合。重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)兩次。圖16示出Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列(該基因側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線))，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。下劃線的為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。內(nèi)含子序列為斜體。雙下劃線氨基酸殘基表示與VHl的差異。圖17示出Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列(該基因側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線))，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。內(nèi)含子序列為斜體。雙下劃線氨基酸殘基表示與VHl的差異。圖18示出Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列(該基因側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)(下劃線))，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。內(nèi)含子序列為斜體。雙下劃線氨基酸殘基表示與VHl的差異。圖19 示出 33E10 VL、Hu33E10 VLv2 和人受體 M29467 (GenBank 登錄號)的比對。氨基酸殘基以單字母編碼示出。序列上方的數(shù)字表示根據(jù)Kabat等人(1991)的位置。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。雙下劃線殘基預(yù)計(jì)與CDR接觸，在人源化形式中鼠殘基保持在這些位置。在該圖中省略M29467中的⑶R殘基。圖20示出Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列(該基因側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn)(下劃線))，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。信號肽序列為斜體。雙下劃線為成熟VL的N-末端氨基酸殘基(D)。下劃線為根據(jù)Kabat等人(1991)所定義的CDR序列。內(nèi)含子為斜體。圖 21&21B 示出 Ch33E10 和 Hu33E10_VH7/VLv2 IgGl/ k 抗體與 h0PN5_BSA 的結(jié)合的ELISA分析。在以200 ii g/ml (圖21A)或在100 u g/ml下(圖21B)開始并連續(xù)2倍稀釋的各種濃度下試驗(yàn)純化的Ch33E10和Hu33E10-VH7/VLv2抗體對于h0PN5_BSA的結(jié)合。示出重復(fù)兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖21A&21B)。
圖22示出用于Hu33E10重鏈和輕鏈cDNA的PCR擴(kuò)增和測序的寡核苷酸序列。圖23示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_6中表達(dá)的VH7和Y -I重鏈恒定區(qū)的
編碼區(qū)的核苷酸序列，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。終止密碼子用“ ”表示。圖24示出NS0-Hu33E10-5中表達(dá)的VH7. 8和Y -I重鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。終止密碼子用“ · ”表示。圖25示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_5中表達(dá)的VL6和κ輕鏈恒定區(qū)的編
碼區(qū)的核苷酸序列，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。終 止密碼子用“ ”表示。圖26示出NS0-Hu33E10-6中表達(dá)的VLv2和κ輕鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列，其與推導(dǎo)出的氨基酸序列一起示出。氨基酸殘基以單字母編碼示出。終止密碼子用“·”表不。圖27示出人源化抗OPN抗體抑制MDA-MB-435S對h0PN5_BSA的黏附。在各種濃度的抗體、人 IgG, Ch33E10、EJ3-1-1 (Hu33E10-VH7. 8/VL6)、R3-1 (Hu33E10-VH7/VL6)、SP2-1 (Hu33E10-VH7/VLv2)和 m33E10 的存在下，使 MDA-MB-435S (4X 104 細(xì)胞 / 孔)粘附到用h0PN5-BSA(2mg/ml)預(yù)涂布的96孔板。數(shù)據(jù)以三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值呈現(xiàn)。
5.
具體實(shí)施例方式5. I針對RGD序列的抗體的制備可通過本領(lǐng)域已知的任何適合的方法產(chǎn)生免疫特異性識別RGD序列的抗體。本發(fā)明中包括細(xì)胞黏附“RGD”序列的RGD蛋白或肽(下文中縮寫為“RGD-肽”)可為(I)源自表達(dá)RGD蛋白的人ECM或源自存在這些ECM的所有組織，(2)通過轉(zhuǎn)染細(xì)菌、酵母、細(xì)胞系如動物細(xì)胞等使編碼RGD蛋白或RGD肽的DNA(優(yōu)選cDNA)表達(dá)而所獲得的重組蛋白或肽，或者⑶合成蛋白或肽。本發(fā)明中用作抗原的RGD肽將能夠通過免疫生產(chǎn)針對RGD序列的抗體。RGD肽包括RGD肽氨基酸序列CVDVPNGRGDSLAYGLR(SEQ ID NO 71),其為鼠源ECM蛋白的細(xì)胞黏附序列。RGD蛋白或RGD肽包括例如0ΡΝ、玻連蛋白、纖連蛋白、血管性血友病因子、膠原蛋白、層粘連蛋白、生腱蛋白、纖維蛋白原和血小板反應(yīng)蛋白及包括其片段的RGD。只要蛋白或肽包括RGD序列，可將人工或自然變異如氨基酸的取代、缺失、修飾和添加應(yīng)用于所述蛋白質(zhì)或所述肽。變異的蛋白質(zhì)或肽可包括取代、缺失、修飾、添加或插入多個氨基酸、優(yōu)選I至10個氨基酸，并更優(yōu)選I至幾個(如I至5個)氨基酸的氨基酸序列。此處，RGD肽包括至少約5個氨基酸，優(yōu)選約5至50個氨基酸，更優(yōu)選約10至20個氨基酸。本發(fā)明中作為抗原的RGD蛋白或RGD肽可通過使用本領(lǐng)域公知的方法來生產(chǎn)，如化學(xué)合成法、細(xì)胞培養(yǎng)法、基因重組法及其適當(dāng)?shù)男拚＠?，RGD肽可通過適當(dāng)?shù)赜玫鞍酌噶呀釫CM蛋白來獲得。RGD蛋白或RGD肽可源于哺乳動物如小鼠(murine)、大鼠、兔、豬、牛、猴和人。任何本領(lǐng)域公知的方法可用于制備能夠用于制備抗RGD抗體的RGD蛋白或RGD 肽。用于生產(chǎn)變體多肽的方法的實(shí)例包括合成寡核苷酸位點(diǎn)定向誘變(帶缺口的雙鏈體法(gapped duplex method))、涉及通過用亞硝酸鹽或亞硫酸鹽處理而隨機(jī)引入點(diǎn)突變的點(diǎn)突變法、涉及用Bal31酶或其他酶制備缺失突變的方法、盒式突變(cassettemutagenesis)、接頭分區(qū)法(linker scanning method)、錯誤插入法(missincorporation method)、錯配引物法和DNA片斷合成法等。RGD肽可結(jié)合其他生物大分子如甲狀腺球蛋白、鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KeyholeLimpet Haemocyanin, KLH)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或牛球蛋白，優(yōu)選甲狀腺球蛋白。將RGD蛋白結(jié)合到生物大分子的方法可通過使用偶聯(lián)劑如具有活性酯基和馬來酰亞胺基團(tuán)的結(jié)合劑(活性酯基結(jié)合蛋白質(zhì)或肽的氨基，馬來酰亞胺基團(tuán)結(jié)合蛋白質(zhì)或肽的巰基；S. yoshirake 等人，Eur. J. Biochem.，101,395-399,1979)、通過使用混合酐法(B. F. Erlanger 等人，J. Biol. Chem.，234，1090-1094，1954)，或通過使用活性酯法(A.E. Karu 等人，J. Agric. Food Chem.，42，301-309，1994)來實(shí)現(xiàn)。用于將 RGD 肽與生物大分子結(jié)合的方法優(yōu)選通過使用偶聯(lián)劑來實(shí)現(xiàn)。
作為抗原，還可使用過表達(dá)RGD蛋白或RGD肽的細(xì)胞本身。過表達(dá)RGD蛋白或RGD肽的細(xì)胞可通過本領(lǐng)域公知的重組DNA技術(shù)來制備。使用適當(dāng)?shù)娜缟纤鲋苽涞目乖赏ㄟ^各種本領(lǐng)域公知的各種方法制備特異性針對RGD序列的抗體。對于RGD序列的多克隆抗體可通過各種本領(lǐng)域公知的方法生產(chǎn)。例如，可將感興趣的抗原向各種宿主動物包括，但不限于兔、小鼠、大鼠等給藥，以誘導(dǎo)包含特異性針對抗原的多克隆抗體的抗血清的產(chǎn)生?？墒褂酶鞣N佐劑來增加依賴于宿主物種的免疫應(yīng)答，其包括但不限于，弗氏(完全和不完全)佐劑、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronicpolyols)、聚陰離子、肽、油乳劑、鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白、二硝基酹和可能有用的用于人的佐劑如BCG(卡介苗(BacilleCalmette-Guerin))和短小棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)。此類佐劑也為本領(lǐng)域所公知的。單克隆抗體可通過使用本領(lǐng)域公知的各種各樣的技術(shù)來制備，所述技術(shù)包括使用雜交瘤、重組和曬菌體展示技術(shù)(phagedisplay technologies)或其組合。例如，單克隆抗體可通過使用雜交瘤技術(shù)來生產(chǎn),所述雜交瘤技術(shù)包括本領(lǐng)域已知的以及在例如Harlow等人，Antibodies A Laboratory Manual, (Cold SpringHarbor Laboratory Press,第二版 1988) ;Hammerling 等人在Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,pp. 563-681 (Elsevier,N. Y，1981)(將其二者的全部內(nèi)容引入以作參考)中所教導(dǎo)的那些。本文所使用的術(shù)語“單克隆抗體”不限定于通過雜交瘤技術(shù)所生產(chǎn)的抗體。術(shù)語“單克隆抗體”是指源于單一克隆的抗體，并包括任何真核、原核或噬菌體克隆，但不限定于生產(chǎn)其的方法。使用雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)和篩選特異性抗體的方法是常規(guī)的并且是本領(lǐng)域公知的。在非限制性實(shí)例中，可用感興趣的抗原或表達(dá)此類抗原的細(xì)胞免疫小鼠。一旦檢測到免疫應(yīng)答，例如在小鼠血清中檢測到對抗原特異的抗體，獲取小鼠脾臟并分離脾細(xì)胞。然后通過公知技術(shù)將脾細(xì)胞與任意適當(dāng)?shù)墓撬枇黾?xì)胞(如，P3U1、P3X63-Ag8、P3X63_Ag8_Ul、P3NSl-Ag4、SP2/0-Agl4、P3X63-Ag8-653等)融合。通過有限稀釋法篩選并克隆雜交瘤。然后通過本領(lǐng)域針對分泌能夠結(jié)合抗原的抗體的細(xì)胞的已知方法來分析雜交瘤克隆。可通過腹腔內(nèi)用陽性雜交瘤克隆接種小鼠來產(chǎn)生通常包含高水平抗體的腹水液(ascitesfluid)。識別特異性抗原表位Gpitope)的抗體片段可通過已知的技術(shù)產(chǎn)生。例如，可通過使用酶如木瓜蛋白酶(生產(chǎn)Fab片段)或胃蛋白酶(生產(chǎn)F(ab' )2片段)使免疫球蛋白分子的蛋白水解裂解來生產(chǎn)Fab和F(ab' )2片段。F(ab' )2片段包含完整的L-鏈和H-鏈的V區(qū)、CHl區(qū)和鉸鏈區(qū)。本發(fā)明的抗體或其抗原結(jié)合片段可通過本領(lǐng)域用于抗體合成的任何已知方法，特別是通過化學(xué)合成或優(yōu)選通過重組表達(dá)技術(shù)來生產(chǎn)。編碼抗體的核苷酸序列可從本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的任何信息(即，從Genbank、文獻(xiàn)或通過常規(guī)克隆和序列分析)來獲得。如果無法獲得包含編碼特定抗體或其抗原表位結(jié)合片段的核酸的克隆，但已知抗體分子或其抗原表位結(jié)合片段的序列，則可化學(xué)合成編碼免疫球蛋白的核酸，或編碼免疫球蛋白的核酸從適當(dāng)來源(例如，抗體cDNA文庫、或由核酸，優(yōu)選從任何表達(dá)抗體的組織或細(xì)胞(如，為表達(dá)抗體而篩選的雜交瘤細(xì)胞)中分離的polyA+RNA所產(chǎn)生的cDNA文庫)通過以下來獲得使用可與序列的5'末端雜交的合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增或通過使用特異性針對特定基因序列的寡核苷酸探針進(jìn)行克隆來鑒定例如來自編碼抗體的cDNA文庫的cDNA克隆。然后可使用任何本領(lǐng)域公知的方法將由PCR所產(chǎn)生的擴(kuò)增核酸克隆到可復(fù)制的克隆載體中。 5. 2重組抗體的制備對于核苷酸序列的操作，可通過使用本領(lǐng)域公知的方法來操作抗體的核苷酸序列，例如，重組DNA技術(shù)、位點(diǎn)定向誘變和PCR等(參見，例如Sambrook等人，如前所述；和Ausubel 等人，eds. , 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John ffiley&Sons,NY,中所描述的技術(shù)，將二者的全部內(nèi)容引入以作參考)?？贵w可在抗原表位結(jié)合結(jié)構(gòu)域或在任一部分引入突變?nèi)绨被岬娜〈⑷笔Ш?或插入，從而增強(qiáng)或減少生物學(xué)活性。包含編碼抗體的核苷酸序列的表達(dá)載體可用于抗體或其抗原結(jié)合片段的重組表達(dá)。用于生產(chǎn)抗體或其抗原結(jié)合片段的、包括編碼抗體分子、抗體的H-鏈和/或L-鏈或其部分的核苷酸序列的載體，可使用上一節(jié)所討論的本領(lǐng)域公知的技術(shù)通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法可用來構(gòu)建包含抗體或其抗原結(jié)合片段的編碼序列以及適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)控信號的表達(dá)載體。這些方法包括，例如，體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)遺傳重組。編碼VH、VL、VH和VL 二者、VH和/或VL的抗原結(jié)合片段或抗體的一個或多個CDR的核苷酸序列可克隆到用于表達(dá)的該載體中。此類序列可與編碼信號肽的多核苷酸融合，所述信號肽對于原抗體可以是內(nèi)源的或異源的。然后可將由此制備的表達(dá)載體導(dǎo)入適當(dāng)?shù)挠糜诳贵w表達(dá)的宿主細(xì)胞中。因此,本發(fā)明包括宿主細(xì)胞,其包含編碼免疫特異性識別RGD序列的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的多核苷酸?？捎帽景l(fā)明的兩個表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，其中第一載體編碼H-鏈衍生的多肽，而第二載體編碼L-鏈衍生的多肽。兩個載體可包含使H-鏈和L-鏈多肽能夠同等表達(dá)的相同的選擇性標(biāo)記，或確保保持兩個質(zhì)粒的不同的選擇性標(biāo)記?？蛇x地，可使用編碼并能夠表達(dá)H-鏈和L-鏈多肽二者的單一載體。H-鏈和L-鏈的編碼序列可包括cDNA或基因組DNA。在本發(fā)明的另一方面，還可使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示法產(chǎn)生抗體。在噬菌體展示法中，在攜帶編碼它們的多核苷酸序列的噬菌體顆粒表面展示功能性抗體結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明的特定方面，可利用此類曬菌體展示抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如從庫(repertoire)或組合的抗體文庫(如，人或小鼠)中表達(dá)的Fab和Fv或二硫鍵穩(wěn)定的Fv?？捎每乖?，例如，使用標(biāo)記抗原或與固體表面或微珠結(jié)合或捕獲的抗原，篩選或鑒定表達(dá)與感興趣的抗原結(jié)合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的噬菌體。用于這些方法的噬菌體典型地為包括fd和M13的絲狀噬菌體?？乖Y(jié)合結(jié)構(gòu)域作為重組融合蛋白而表達(dá)成噬菌體基因III或基因VIII蛋白。本發(fā)明的可用于產(chǎn)生免疫球蛋白或其片段的噬菌體展示法的實(shí)例包括在如下公開的那些Brinkman 等人,J. TmmunoI Methods, 182 :41-50,1995 ；Ames 等人,J. TmmunoI Methods,184 177-186,1995 ；Kettleborough 等人，Eur. J. TmmunoI. ,24 :952-958,1994 ；Persic 等人，Gene, 187 :9-18,1997 ;Burton 等人，Advances in Immunology, 57 191-280,1994 ；PCT申請 PCT/GB91/01134 號、PCT 公開 W090/02809、W0 91/10737,WO 92/01047,WO 92/18619、W093/11236, WO 95/15982、WO 95/20401 號；以及美國專利 5，698，426、5，223，409、5，403，484,5, 580, 717,5, 427, 908,5, 750, 753,5, 821，047,5, 571, 698,5, 427, 908、5，516，637,5, 780，225,5, 658，727,5, 733，743 和 5，969，108 號；將它們各自的全部內(nèi)容引入以作參考。如上述參考文獻(xiàn)所述，在噬菌體篩選后，可分離來自噬菌體的編碼抗體的區(qū)域并用于產(chǎn)生整個抗體，包括人抗體，或任何其他期望的片段，并在任何期望的宿主包括例如，如下詳細(xì)描述的哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母和細(xì)菌中表達(dá)。例如，還可利用 本領(lǐng)域已知的方法采用重組生產(chǎn)Fab、Fab'和F(ab' )2片段的技術(shù)，如以下所公開的那些PCT 公開 W092/22324 ；MulIinax 等人，BioTechniques, 12 (6) =864-869,1992 ;和 Sawai等人，AJRI,34 :26-34,1995 ;和 Better 等人，Science, 240 :1041-1043，1988 (將它們各自的全部內(nèi)容引入以作參考)?？捎糜谏a(chǎn)單鏈Fv和抗體的技術(shù)的實(shí)例包括以下所描述的那些美國專利 4, 946, 778 和 5, 258, 498 號；Huston 等人，Methods inEnzymology,203 :46-88,1991 ；Shu 等人，PNAS，90 :7995-7999,1993 ；和 Skerra 等人，Science,240 1038-1040，1988。一旦通過上述任何方法生產(chǎn)本發(fā)明的抗體分子，然后其可通過用于純化免疫球蛋白分子的本領(lǐng)域任何已知的方法來純化，例如，通過層析(如，離子交換，親和力、特別是通過在蛋白A或蛋白G純化后對特定抗原的親和力，以及分級柱層析(sizing columnchromatography))、離心、差別性溶解或通過任何其他用于蛋白質(zhì)純化的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。此外，本發(fā)明的抗體或其片段可融合到本文所述的或在本領(lǐng)域其他方面已知的異源多肽序列以促進(jìn)純化。對于某些用途，包括在人類體內(nèi)的抗體用途和體外檢測分析，其可優(yōu)選使用嵌合的、人源化的或人抗體。以下在5. 3節(jié)中詳細(xì)討論嵌合抗體和人源化抗體。與其他化合物或異源多肽融合或結(jié)合的抗體可在體外免疫試驗(yàn)、純化方法(如親和層析)以及體內(nèi)治療或診斷用途中使用。參見，例如，PCT公開號WO 93/21232 ；EP439，095 ；Naramura 等人，Immunol. Lett. ,39 :91-99,1994 ;美國專利 5，474，981 ；Gillies等人，PNAS，89 :1428-1432,1992 ;和 Fell 等人，J. Immunol, 146 :2446-2452,1991，在此將其全部內(nèi)容引入以作參考。例如，可使用已知方法或商購可得的試劑盒以各種方式標(biāo)記抗體(如，生物素標(biāo)記、FITC標(biāo)記、APC標(biāo)記)。作為另一實(shí)例，抗體可與在體內(nèi)增強(qiáng)抗體的生物學(xué)效應(yīng)的治療部分結(jié)合。此類治療部分的實(shí)例包括另一抗體、作為細(xì)胞生長抑制劑或殺細(xì)胞的細(xì)胞毒素、放射性元素和/或包括消炎劑和抗生素等的其他治療劑。在本發(fā)明中，人源化抗RGD抗體可與另一抗體結(jié)合形成雙特異抗體。作為另一實(shí)例，本發(fā)明的人源化抗體對于體內(nèi)診斷用途，可用可檢測標(biāo)簽如放射性元素標(biāo)記。5. 3嵌合和人源化抗體嵌合抗體為其中抗體的不同部分源于不同動物物種的分子，如具有源于鼠源單克隆抗體的V區(qū)和源于人源免疫球蛋白的恒定區(qū)的抗體。用于生產(chǎn)嵌合抗體的方法為本領(lǐng)域已知的。參見，例如，Morrison, Science, 229 :1202,1985 ;0i 等人，BioTechniques,4 214 1986 ;Gillies 等人，J. Immunol. Methods, 125 :191-202,1989 ;美國專利 5,807,715、4，816，567和4，816，397號，在此將其全部內(nèi)容引入以作參考。人源化抗體為結(jié)合期望抗原并包括V區(qū)的分子，該V區(qū)包含一個或多個源自非人物種的CDR和一個或多個源于人免疫球蛋白分子的FR。用于人源化非人抗體的典型方法已在各種文獻(xiàn)中記載，例如以下所述的那些Queen等人，1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 :10029-10033 和美國專利 5，585,089 和 5,693，762 號；Riechmann 等人，Nature, 33 2 323，1988 ;和Tsurushita等人，Methods 36 :69_83，2005，將所有這些的全部內(nèi)容引入此處以作參考。例如，Tsurushita等人的文獻(xiàn)(2005,如前所述；下文為“Tsurushita”)提供了基于由Queen等人(1989，如前所述)最初開發(fā)的抗體人源化方法的用于鼠單克隆抗體的人源化的實(shí)用和指導(dǎo)性的方法。以下簡要總結(jié)Tsurushita公開的通用方法。5. 3. I制備人源化抗體的通用方法_4] 克隆并測序鼠V基因各種方法可用于克隆編碼目的鼠單克隆抗體的VH和VL的cDNA。例如，使用SMARTRACE cDNA 擴(kuò)增試劑盒(Amplification Kit) (BD Biosciences, CA)或 GeneRacer 試劑盒的5' RACE (快速擴(kuò)增cDNA末端)法是常用的。用于5' RACE的基因特異引物可基于目的單克隆抗體的H-鏈和L-鏈的同種型來制備，以便其可迅速結(jié)合VH和VL的下游。因此，5' RACE引物可設(shè)計(jì)為特異性針對鼠中的各亞型，如Yl、Y2a、Y2b或γ3?？蛇x地，可基于亞型間的一致或高度同源區(qū)域設(shè)計(jì)用于所有亞型的通用引物。在Tsurushita中，公開了下列5' RACE引物作為實(shí)例(i)5/ -GCCAGTGGATAGACTGATGG-(SEQ ID NO :82)(用于克隆鼠 Y 1，Y 2a，Y 2b和Y 3H-鏈)(ii)5/ -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-(SEQ ID NO :83)(用于克隆鼠 κ L-鏈)。例如，使用Zero Blunt T0P0 PCR克隆試劑盒(Invitrogen)，可將PCR擴(kuò)增的V區(qū)基因片段直接克隆到質(zhì)粒載體中，并測定它們的DNA序列。所獲得的序列應(yīng)通過，例如，通過使用，例如Model241蛋白質(zhì)測序儀(Hewlett-Packard, CA)的N末端氨基酸測序測定的目的單克隆抗體的氨基酸序列，來比較所獲得序列所編碼的氨基酸序列來證實(shí)。典型地，例如，通過Edman降解檢測目的抗體的N末端處至少15至20個氨基酸殘基，充分證實(shí)所克隆的DNA序列的可靠性。Tsurushita警示，當(dāng)谷氨酸(其為小鼠中最常見的兩種N末端氨基酸之一)為N末端氨基酸時,其可能已被轉(zhuǎn)換成焦谷酰胺(pyroglutamine)并阻斷N末端的測序。在該情況下，必須使N末端去阻斷以獲得序列。V區(qū)的三維樽型基于VH和VL的序列，首先通過例如由R. Levy等人(1989Biochemistry 28:7168-7175)和 B. Zilber 等人(1990，Biochemistry29 :10032-10041)所描述的方法，鑒定潛在的對保持CDR構(gòu)象結(jié)構(gòu)重要的目的抗體的框架殘基。典型地，將各VH和VL分成14個結(jié)構(gòu)上有意義的片段，其為包括免疫球蛋白超家族的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的P折疊股(Pstrand)和環(huán)狀結(jié)構(gòu)。在PDB數(shù)據(jù)庫中，將來自目的抗體的各片段的氨基酸序列與已知結(jié)構(gòu)的抗體的相應(yīng)片段比對(參見 H. MBerman 等人，2000，Nucleic Acids Res. 28 :235-342)。通過多重序列比對，篩選與各目的片段具有最高序列同源性的相應(yīng)片段，并構(gòu)建V區(qū)的三維模型。為了優(yōu)化結(jié)構(gòu)，使模型進(jìn)行多循環(huán)共軛(conjugate)梯度能量最小化(例如，使用ENCAD,或如以下所述Press 等人，1990,在"NumericalRecipes, Cambridge UniversityPress, Cambridge ；AMBER, Weiner 等人，1981，J. Comp. Chem. 2 :287-303 ；3D-JIG-SAff,可在 BioMolecularModelling 或由 Cancer Research UK 運(yùn)行的"BMM "網(wǎng)站上獲得；或 SWISS-MODEL(可在由 Swiss Institute ofBioinformatics, Geneva 運(yùn)行的 ExPASyProteomics Server 網(wǎng)站上獲得))。人框架的詵擇在構(gòu)建V區(qū)結(jié)構(gòu)模型的同時，分別由鼠VH和VL的cDNA克隆推導(dǎo)出的氨基酸序列與如 Kabat 數(shù)據(jù)庫(參見 Johnson 等人，2000, Nucleic Acids Res. 28 :214-218)和 GenBank 70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少約90 %或至少約95 %同一性的人FR，可使用例如 Smith-Waterman算法(Gusfield, 1997, in" Algorithms on Strings,Trees,andSequences " , Cambridge University Press, Cambridge),或 BLAST (Karlin 等人，1990,Proc. Natl. Acad. Sci. USA87 :2264-2268)等檢索。這些人序列可基于cDNA類或蛋白質(zhì)來源的序列；然而，種系的使用通常是優(yōu)選的，這是因?yàn)槠湓谙赾DNA類或蛋白質(zhì)來源的序列中與體細(xì)胞超突變相關(guān)的潛在的免疫原性中是有用的。可選地，如Queen等人(1989，如前所述)所述，也可鑒定共有框架序列的使用并除去從cDNA類或蛋白質(zhì)來源的序列獲得的框架中的此類超突變殘基。在將種系VH片段用作受體框架的情況下，應(yīng)當(dāng)使用在染色體14，而不是15和16上編碼的VH片段，因?yàn)橹挥腥旧w14上的那些才產(chǎn)生功能性VH。人源化V區(qū)的設(shè)計(jì)根據(jù)Queen等人(1989，如前所述)，必須鑒定在⑶R的約4至6人內(nèi)的框架氨基酸，
這是因?yàn)檫@些殘基被認(rèn)為是潛在的支持正確的⑶R結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵框架殘基?？墒褂糜?jì)算機(jī)程序如可從由美國國家科學(xué)基金會(National Science Foundation,NSF)支持的MolecularVisualization Freeware網(wǎng)站獲得RASMOL實(shí)現(xiàn)此方法,該軟件從原子坐標(biāo)或通過計(jì)算機(jī)模型的人工檢驗(yàn)來計(jì)算原子間距。如果在關(guān)鍵框架位置的氨基酸在鼠供體和人受體序列間不同，則通常將鼠供體的那些來替換人殘基。然而，如果此類殘基對支持CDR結(jié)構(gòu)具有最小貢獻(xiàn)，則典型地使用相應(yīng)的人殘基。此外，如果所選擇的人受體包含“非典型”氨基酸(其以小于V區(qū)序列約10至20%發(fā)生)，則它們可為親和突變期間體細(xì)胞超突變的結(jié)果，并應(yīng)當(dāng)用供體殘基替換以避免人類中潛在的免疫原性。此外，為了設(shè)計(jì)人源化V區(qū)，其他因素，如潛在的N-連接的糖基化信號的殘基需要仔細(xì)考慮(參見Tsurushita詳情)。人源化抗體可包含來自人K或X L-鏈的人恒定區(qū)或其一部分，和/或人抗體的Y 1> Y 2> y 3> Y 4> U > a I、a 2、8或e H-鏈,或其突變體,取決于對于治療用途所需要或待消除的效應(yīng)物功能。例如，包含突變的恒定區(qū)的Fe部分可融合到本發(fā)明的嵌合或人源化抗體的V區(qū)，以便減少抗體與Fe受體的結(jié)合和/或減少其固定補(bǔ)體的能力(參見，例如Winter 等人，GB 2，209, 757B ；Morrison 等人，WO 89/07142，Morgan 等人，WO 94/29351)?？贵w分子的此類操作可通過如5. 2節(jié)所述的重組DNA技術(shù)來進(jìn)行。優(yōu)選地所得嵌合或人源化抗體具有與非人供體抗體相同的特異性和具有與非人供體抗體的親和力類似的或至少約1/3、至少約1/2或至少約2/3的親和力。在另一方面，所得嵌合或人源化抗體具有至少約I X IO7M'優(yōu)選至少約IXlO8M'并最優(yōu)選至少約IXlO9M-1的親和力常數(shù)。除了上述通用方法，可使用本領(lǐng)域已知的各種技術(shù)來人源化抗體，包括，例如⑶R移植(EP 239，400 ；PCT 公開 WO 91/09967 ;美國專利 5，225，539 ;5，530，101 和 5，585，089號)、飾面(veneer)或表面重塑(resurfacing) (EP 592, 106 ；EP 519, 596 ；Padlan,Molecular Immunology, 28 (4/5) :489-498,1991 ;Studnicka 等人，Protein Engineering,7(6) :805-814,1994 ;Roguska 等人，ProcNatl. Acad. Sci. USA，91 :969-973,1994)以及鏈改組(美國專利5，565，332號)，將其全部內(nèi)容在此引入以作參考。5. 3. 2對于制備人源化抗體作為藥物的額外考慮 為了提供人源化抗體作為藥物，因此需要制備有效且一致的生產(chǎn)系統(tǒng)。例如，通過插入H-鏈和L-鏈序列來制備用于人源化抗體的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，可獲得用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的高生產(chǎn)率細(xì)胞系作為主細(xì)胞庫(MCB)的種子細(xì)胞，其用作工作細(xì)胞庫(WCB)的穩(wěn)定和半永久性的來源。然后可通過培養(yǎng)來自WCB的工作細(xì)胞并收集培養(yǎng)基來制備人源化抗體。含有適當(dāng)調(diào)控基因的各種表達(dá)載體可用于制備此類生產(chǎn)細(xì)胞系。作為宿主細(xì)胞，可使用通常用于表達(dá)哺乳動物蛋白質(zhì)的那些來表達(dá)人源化抗體。此類宿主細(xì)胞包括，但不限于，中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、SP2/0-Agl4. 19細(xì)胞和NSO細(xì)胞等。人源化抗體的生產(chǎn)率可通過選擇表達(dá)載體和宿主細(xì)胞的最佳組合來最大化。此外，應(yīng)探究培養(yǎng)基的組合物以便從各種無血清培養(yǎng)基和補(bǔ)充劑選擇適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)，從而可優(yōu)化通過宿主細(xì)胞的人源化抗體的表達(dá)?；谟行院徒K產(chǎn)量，可使用本領(lǐng)域公知的各種方法從培養(yǎng)上清液中純化通過宿主細(xì)胞生產(chǎn)的人源化抗體，所述方法包括親和層析、離子交換層析和疏水相互作用層析等。5. 4藥物學(xué)組合物和治療用涂本發(fā)明提供包括上述免疫特異性識別RGD序列的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物學(xué)組合物。包括本發(fā)明的人源化抗體作為活性成分的藥物學(xué)組合物可用作用于預(yù)防和/或治療與RGD蛋白相關(guān)的紊亂或疾病的試劑，所述紊亂或疾病包括，但不限于，癌癥如癌細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)移，和炎性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維樣變、糖尿病、動脈硬化、多發(fā)性硬化癥、肉芽瘤、炎性腸道疾病(潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)和自身免疫病等。包括本發(fā)明的人源化抗體的藥物學(xué)組合物還可用來治療器官移植后的慢性排斥反應(yīng)和自身免疫病如系統(tǒng)性自身免疫病、全身性紅斑狼瘡、葡萄膜炎、白塞病、多發(fā)性肌炎、增生性腎小球腎炎和結(jié)節(jié)病等。包括本發(fā)明的人源化抗體的用于預(yù)防或治療上述紊亂或疾病的預(yù)防和/或治療劑具有低毒性，并可直接通過在適當(dāng)?shù)娜軇┲谢旌隙鳛橐后w制劑，或以適當(dāng)劑型作為藥物學(xué)組合物口服或腸外給藥到人類。用于上述給藥的藥物學(xué)組合物包含前述抗體或其鹽以及藥物學(xué)可接受載體、稀釋劑或賦形劑。以適用于口服或腸外給藥的劑型提供此類組合物。劑量可取決于待給藥的受試者的年齡和體型、目的疾病、病癥和給藥途徑等而變化。當(dāng)抗體用于預(yù)防和/或治療，例如成人患者中的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎時，通常以單劑量約0.01至約20mg/kg體重、優(yōu)選約0. I至約10mg/kg體重、并更優(yōu)選約0. I至約5mg/kg體重,大約I至5次每天，優(yōu)選大約I至3次每天，將本發(fā)明的抗體靜脈注射給藥是有利的。在其他腸外給藥和口服給藥中，抗體可以相應(yīng)于上述所給出劑量的劑量給藥。當(dāng)病癥特別惡劣時，劑量可根據(jù)病癥而增加。已知各種輸送系統(tǒng)并可用于給藥本發(fā)明的藥物學(xué)組合物，例如在脂質(zhì)體中包封、微粒、微囊體、能夠表達(dá)突變病毒的重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用(參見，例如Wu和Wu，1987，J. Biol. Chem. 262 :44294432)。引入方法包括但不限于真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外和口途徑?；衔锟赏ㄟ^任何常規(guī)途徑，例如通過輸液或劑團(tuán)注射(bolus injection)、通過由上皮細(xì)胞或皮膚黏膜內(nèi)膜(lining)(例如，口腔黏膜、直腸和腸粘膜等)給藥，并可與其他生物學(xué)活性試劑一起給藥。給藥可為全身或局部。還可采用肺部給藥，例如通過吸入器或噴霧器的使用，并與粉霧劑(aerosolizing agent) 一起制劑。 在本發(fā)明的一方面，可期望將本發(fā)明的藥物學(xué)組合物局部給藥至需要治療的區(qū)域；這可通過例如并非限制的以下方式實(shí)現(xiàn)例如，通過注射、借助導(dǎo)管、借助栓劑、借助鼻噴霧或借助植入體，連同手術(shù)后的傷口敷藥一起的在手術(shù)期間的局部輸液、局部施用等，所述植入體為多孔、非多孔或包括膜，如娃橡膠膜(sialastic membrane)的凝膠狀材料或纖維。在本發(fā)明的一個方面，可能通過在感染組織的位點(diǎn)(或前述位點(diǎn))處進(jìn)行直接注射來給藥。在本發(fā)明的另一方面，藥物學(xué)組合物可在囊泡，特別是脂質(zhì)體中輸送(Langer，1990, Science 249 :1527-1533 ;Treat 等人，inLiposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer, Lopez Berestein and Fidler(eds. ), Liss, New York,pp. 353-365 (1989) ；Lopez-Berestein,同上，pp. 317-327 ；一般參見同上)。在本發(fā)明的另一方面，藥物學(xué)組合物可在控釋系統(tǒng)中輸送。在本發(fā)明的一方面，可使用泵(參見 Langer,如前所述，Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 201 ；Buchwald 等人，1980, Surgery 88 :507 ；和 Saudek 等人，1989, N. Engl. J. Med. 321 574)。在本發(fā)明的另一方面，可使用聚合材料(參見MedicalApplications ofControlled Release, Langer and Wise(eds. ), CRCPres. , Boca Raton, Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability, Drug Product Design and Performance, SmolenandBall(eds. ), Wiley, New York(1984) ；Ranger 和 Peppas, J. MacromoI. Sci. Rev. MacromoI.Chem. 23 :61 (1983);還參見 Levy 等人，1985，Science 228 :190 ；During 等人，1989，Ann.Neurvl. 25 :351 ；Howard 等人，1989, J. Neurosurg. 71 :105)。仍在本發(fā)明的另一方面，控釋系統(tǒng)可置于組合物的目標(biāo)附近，因此僅需要全身劑量的一部分(參見，如Goodson，inMedicalApplications of Controlled Release,如前所述，第 2 卷，pp. 115-138 (1984))。在Langer的綜述(Science 249:1527-1533(1990))中討論了其他控釋系統(tǒng)。用于口服給藥的組合物的實(shí)例包括固體或液體劑型，特別是，片劑(包括糖衣丸和涂膜片劑)、丸劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑(包括軟膠囊)、糖漿、乳劑、懸浮劑等。此類組合物通過公知方法制造，并包含常規(guī)用于藥物學(xué)制劑領(lǐng)域的載體、稀釋劑或賦形劑。用于片劑的載體或賦形劑的實(shí)例為乳糖、淀粉、蔗糖和硬脂酸鎂等?？勺⑸渲苿┛砂ㄓ糜陟o脈、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)注射、點(diǎn)滴輸液等的劑型。這些可注射制劑可通過公知方法制備。例如可注射制劑可通過以下制備在常規(guī)用于注射的無菌水介質(zhì)或油介質(zhì)中溶解、懸浮或乳化上述抗體或其鹽。作為用于注射的水介質(zhì)，例如，有生理鹽水、包含葡萄糖和其他助劑的等滲溶液等，其可與適當(dāng)?shù)脑鋈軇┤绱?例如，乙醇)、多元醇(例如，丙二醇、聚乙二醇)、非離子表面活性劑(例如，聚山梨酸酯80、HC0-50 (氫化蓖麻油的聚氧化乙烯(50mol)加合物))等組合使用。作為油介質(zhì)，采用例如芝麻油、大豆油等，其可與增溶劑如苯甲酸芐酯、苯甲醇等組合使用。由此制備的注射劑優(yōu)選填入適當(dāng)?shù)陌碴持?。用于直腸給藥的栓劑可通過共混前述抗體或其鹽以及常規(guī)用于栓劑的基質(zhì)來制備。有利地，將上述口服或腸外使用的藥物學(xué)組合物以適合于符合活性成分劑量的單位劑量來制備成劑型。以單位劑量的此類劑型包括，例如片劑、丸劑、膠囊劑、注射劑(安瓿)、栓劑等。前述抗體的含量在單位劑量中通常為每劑型約5至500mg ;特別是以注射劑 的形式，優(yōu)選以約5至IOOmg并以約10至250mg其他劑型包含前述抗體。上述各組合物可進(jìn)一步包含其他活性組分，除非制劑與上述抗體引起任何不利反應(yīng)。本發(fā)明還涉及細(xì)胞和/或組織重建的抑制劑和/或促進(jìn)劑，其包括RGD序列結(jié)合功能分子(例如，整聯(lián)蛋白等)作為活性成分；并涉及抑制和/或促進(jìn)細(xì)胞和/或組織重建的方法，其包括使表達(dá)RGD蛋白的細(xì)胞和/或組織(例如，腫瘤細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、平滑肌等)與RGD蛋白結(jié)合功能分子接觸。在此治療劑中活性成分的劑量、給藥方法、藥物學(xué)制劑等可適當(dāng)?shù)赜申P(guān)于包括本發(fā)明的人源化抗體的藥物的前述描述來確定。如上所述，本發(fā)明進(jìn)一步提供用于預(yù)防或治療與RGD蛋白相關(guān)或涉及RGD蛋白的紊亂或疾病的方法，所述方法包括將至少一種有效量的本發(fā)明的人源化抗體給藥到需要其的受試者。5. 5診斷用涂包括本發(fā)明的人源化抗體的藥物學(xué)組合物可用作癌癥如癌細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)移，和炎性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維樣變、糖尿病、癌癥轉(zhuǎn)移、動脈硬化、多發(fā)性硬化癥、肉芽瘤等的診斷劑，或作為器官移植后的慢性排斥反應(yīng)、自身免疫病如系統(tǒng)性自身免疫病、全身性紅斑狼瘡、葡萄膜炎、白塞病、多發(fā)性肌炎、增生性腎小球腎炎和結(jié)節(jié)病等的診斷劑。本發(fā)明的人源化抗體能夠特異性識別RGD序列，因而可用于定量試驗(yàn)液體中的RGD蛋白，特別是用于通過夾心免疫測定、競爭性測定、免疫測量法(immunometry)、池度法等的定量,或免疫染色等。在將這些免疫學(xué)方法應(yīng)用到本發(fā)明的測定方法中時，無需闡明任何特別的條件、步驟等。通過向常規(guī)條件和步驟添加本領(lǐng)域普通技術(shù)考慮來充分構(gòu)建測定系統(tǒng)。對于這些常用技術(shù)方法的細(xì)節(jié)，可參考綜述或課本等。如上所述，RGD蛋白可通過使用本發(fā)明的抗體而高靈敏度地定量。通過在體內(nèi)應(yīng)用用于定量RGD蛋白的方法，本發(fā)明的人源化抗體特別用于診斷各種與RGD蛋白相關(guān)的疾病。例如，在檢測RGD蛋白的表達(dá)水平增加或降低的情況下，可診斷目前極可能患RGD蛋白相關(guān)疾病，例如癌癥或炎性疾病，或者診斷未來極可能患這些疾病。因此，本發(fā)明還提供用于在受試者中診斷與RGD蛋白相關(guān)或涉及RGD蛋白的紊亂或疾病的方法，所述方法包括將有效量的本發(fā)明的人源化抗體的至少之一或二者向需要其的受試者給藥。此類體內(nèi)診斷的所需劑量可小于治療用途所需的那些，并可由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)常規(guī)步驟確定。本發(fā)明的人源化抗體還可用于具體檢測存在于試樣(例如，體液的試驗(yàn)液、組織等)中的RGD蛋白。人源化抗體還可用于制備純化RGD蛋白用抗體柱，用于檢測純化時包含于各組分的RGD蛋白或用于分析RGD蛋白在待試驗(yàn)細(xì)胞中的行為。本發(fā)明的序列表中的序列鑒定號表示以下序列。[SEQ ID NO:I]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRHl氨基酸序列。[SEQ ID NO:2]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRH2氨基酸序列。
[SEQ ID NO:3]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRH3氨基酸序列。[SEQ ID NO 4]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRLl氨基酸序列。[SEQ ID NO:5]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRL2氨基酸序列。[SEQ ID NO 6]其示出鼠33E10和人33E10共有的CDRL3氨基酸序列。[SEQ ID NO:7]其示出Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列，其包括編碼信號肽的序列和內(nèi)含子序列，側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)。[SEQ ID NO 8]其示出包括信號肽的由Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 9]其示出Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列，其包括編碼信號肽的序列和內(nèi)含子序列，側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)。[SEQ ID NO: 10]其示出包括信號肽的由Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO: 11]其示出Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列，其包括編碼信號肽的序列和內(nèi)含子序列，側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)。[SEQ ID NO: 12]其示出包括信號肽的由Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO: 13]其示出Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列，其包括編碼信號肽的序列和內(nèi)含子序列，側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn)。[SEQ ID NO: 14]其示出包括信號肽的由Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO: 15]其示出Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列，其包括編碼信號肽的序列和內(nèi)含子序列，側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn)。[SEQ ID NO: 16]其示出包括信號肽的由Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO: 17]其示出用于Hu33E10的重鏈和輕鏈cDNA的PCR擴(kuò)增和測序的寡核苷酸[CMV2]。[SEQ ID NO: 18]其示出用于Hu33E10的重鏈和輕鏈cDNA的PCR擴(kuò)增和測序的寡核苷酸[JNT026]。[SEQ ID NO: 19]
其示出用于Hu33E10的重鏈和輕鏈cDNA的PCR擴(kuò)增和測序的寡核苷酸[JNT080]。[SEQ ID NO:20]其示出用于HU33E10的重鏈和輕鏈cDNA的PCR擴(kuò)增和測序的寡核苷酸[JNT082]。[SEQ ID NO 21]其示出用于Hu33E10的重鏈和輕鏈cDNA的PCR擴(kuò)增和測序的寡核苷酸[JNT084]。[SEQ ID NO 22]其示出用于HU33E10的重鏈和輕鏈cDNA的PCR擴(kuò)增和測序的寡核苷酸[JNT097]。[SEQ ID NO 23]其示出用于HU33E10的重鏈和輕鏈cDNA的PCR擴(kuò)增和測序的寡核苷酸[JNT098]。[SEQ ID NO:24]其示出NS 0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_6中表達(dá)的VH7和Y -I重鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列。[SEQ ID NO 25]其示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_6中表達(dá)的VH7和Y -I重鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO:26]其示出NS0-HU33E10-5中表達(dá)的VH7. 8和Y -I重鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列。[SEQ ID NO 27]其示出NS0-HU33E10-5中表達(dá)的VH7. 8和Y -I重鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO:28]其示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_5中表達(dá)的VL6和κ輕鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列。[SEQ ID NO:29]其示出NS0-Hu33E10-4和NS0-Hu33E10_5中表達(dá)的VL6和κ輕鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO:30]其示出NS0-HU33E10-6中表達(dá)的VLv2和κ輕鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列。[SEQ ID NO:31]其示出NS0-HU33E10-6中表達(dá)的VLv2和κ輕鏈恒定區(qū)的編碼區(qū)的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 32]其示出33E10 VL的氨基酸序列。[SEQ ID NO:33]其示出Hu33E10 VLv2的氨基酸序列。[SEQ ID NO:34]其示出鼠33E10 VH cDNA的核苷酸序列。[SEQ ID NO 35]其示出由鼠33E10 VH cDNA的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO:36]其示出鼠33E10 VL cDNA的核苷酸序列。[SEQ ID NO 37]其示出由鼠33E10 VL cDNA的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO:38]其示出所設(shè)計(jì)的33E10 VH基因的核苷酸序列，其包括編碼信號肽的序列和內(nèi)含子序列，側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)。[SEQ ID NO 39]其示出包括信號肽的由設(shè)計(jì)的33E10 VH基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 40]其示出所設(shè)計(jì)的33E10 VL基因的核苷酸序列，其包括編碼信號肽的序列和內(nèi)含子序列，側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn)。[SEQ ID NO 41] 其示出包括信號肽的由設(shè)計(jì)的33E10 VL基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 42]其示出33E10 VH的氨基酸序列。[SEQ ID NO 43]其示出人源化33E10(Hu33E10)VHl的氨基酸序列。[SEQ ID NO 44]其示出33E10 VL的氨基酸序列。[SEQ ID NO 45]其示出人源化33E10(Hu33E10)VLl的氨基酸序列。[SEQ ID NO 46]其示出用于構(gòu)建HU33E10VH1基因的寡核苷酸[JNJ220]。[SEQ ID NO 47]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ206]。[SEQ ID NO 48]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ207]。[SEQ ID NO 49]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ208]。
[SEQ ID NO :50]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ209]。[SEQ ID NO 51]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ210]。[SEQ ID NO 52]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ211]。[SEQ ID NO 53]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ212]。
[SEQ ID NO 54]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ213]。[SEQ ID NO 55]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ214]。[SEQ ID NO 56]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ215]。[SEQ ID NO 57]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ216]。[SEQ ID NO 58]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ217]。[SEQ ID NO 59]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ218]。[SEQ ID NO 60]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ219]。[SEQ ID NO 61]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VHl基因的寡核苷酸[JNJ221]。[SEQ ID NO 62]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ116]。[SEQ ID NO 63]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ193]。[SEQ ID NO 64]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ194]。[SEQ ID NO 65]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ195]。[SEQ ID NO 66]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ196]。[SEQ ID NO 67]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ197]。[SEQ ID NO 68]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ198]。[SEQ ID NO 69]
其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ199]。[SEQ ID NO 70]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ200]。[SEQ ID NO 71]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ201]。[SEQ ID NO 72]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ202]。[SEQ ID NO 73] 其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ203]。[SEQ ID NO 74]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ204]。[SEQ ID NO 75]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ205]。[SEQ ID NO 76]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ101]。[SEQ ID NO 77]其示出用于構(gòu)建Hu33E10 VLl基因的寡核苷酸[JNJ117]。[SEQ ID NO 78]其示出Hu33E10 VHl基因的核苷酸序列，其包括編碼信號肽的序列和內(nèi)含子序列，側(cè)翼為SpeI和HindIII位點(diǎn)。[SEQ ID NO 79]其示出包括信號肽的由Hu33E10 VHl基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 80]其示出Hu33E10 VLl基因的核苷酸序列，其包括編碼信號肽的序列和內(nèi)含子序列，側(cè)翼為NheI和EcoRI位點(diǎn)。[SEQ ID NO 81]其示出包括信號肽的由Hu33E10 VLl基因的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 82]其示出5' RACE引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 83]其示出5' RACE引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 84]其示出GeneRacerS'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 85]其示出33E10VH3'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 86]其示出33E10VL3'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 87]其示出33E10VH5'引物的核苷酸序列。
[SEQ ID NO :88]其示出33E10VH3'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO :89]其示出33E10VL5'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 90]其示出33E10VL3'引物的核苷酸序列。[SEQ ID NO 91]其示出Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列。 [SEQ ID NO 92]其示出由Hu33E10 VH5基因的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 93]其示出Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列。[SEQ ID NO 94]其示出由Hu33E10 VH7基因的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 95]其示出Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列。[SEQ ID NO 96]其示出由Hu33E10 VH7. 8基因的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 97]其示出Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列。[SEQ ID NO 98]其示出由Hu33E10 VL6基因的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。[SEQ ID NO 99]其示出Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列。[SEQ ID NO :100]其示出由Hu33E10 VLv2基因的核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。6.實(shí)施例以下實(shí)施例說明免疫特異性識別RGD序列的單克隆抗體的制備、單克隆抗體V區(qū)的測序、表位作圖及抗體和此類抗體的嵌合和人源化的其他特征，以及所得嵌合和人源化抗體的特征。這些實(shí)施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。6. I鼠33E10可變區(qū)基因的克隆和測序在7. 5%的CO2培養(yǎng)箱中，37°C下使鼠33E10雜交瘤細(xì)胞在包含10%胎牛血清(FBS ；HyClone, Logan, UT)的 TIL 培養(yǎng)基 I (Immunology-Biological Laboratories, Gunma,Japan)中生長。根據(jù)供應(yīng)商的方法，使用TRIzol試劑(Invitrogen, Carlsbad, CA)從大約3X IO6個雜交瘤細(xì)胞中提取總RNA。使用GeneRacerKit(Invitrogen)根據(jù)供應(yīng)商的方法合成Oligo dT引導(dǎo)的cDNA。使用分別與鼠Y-I和κ鏈恒定區(qū)退火的3'引物，以及GeneRacer Kit 中提供的 GeneRacer 5'引物(5' -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' (SEQID NO :84)),通過用 Phusion DNA 聚合酶(New England Biolabs, Beverly, MA)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增33E10重鏈和輕鏈的可變區(qū)cDNA。對于重鏈可變區(qū)(VH)的PCR擴(kuò)增，3'引物具有序列5' -GCCAGTGGATAGACAGATGG-3' (SEQ ID NO :85)。對于輕鏈可變區(qū)(VL)的 PCR 擴(kuò)增，3'引物具有序列 5' -GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3 ' (SEQ ID NO :86)。將擴(kuò)增的VH和VL cDNA克隆到pCR4Blunt_T0P0載體(Invitrogen)中用于序列測定。在Tocore (Menlo Park, CA)下進(jìn)行可變區(qū)的DNA測序。測序多個重鏈和輕鏈克隆,鑒定與典型鼠重鏈和輕鏈可變區(qū)具有同源性的單一序列。與推導(dǎo)的33E10 VH和VL氨基酸序列一起分別將33E10 VH和VL的共有cDNA序列示于圖I和2。6.2嵌合33已10 IgGl/k抗體的構(gòu)建使用33E10 VH cDNA做為模板，5' -GGGACTAGTACCACCATGAAGTTGTGGCTGAACTGGATT-3' (SEQ ID NO :87) (SpeI 位點(diǎn)加下劃線)作為 5'引物和 5' -GGGAAGCTTGAAGTTAGGACTCACCTGCAGAGACAGTGACCAGAGTCCC-3' (SEQ ID NO 88) (HindIII 位點(diǎn)加下劃線)作為 3'引物(圖3)，通過PCR產(chǎn)生編碼33E10 VH的基因作為包括剪接供體信號以及適當(dāng)?shù)膫?cè)翼限制性酶切位點(diǎn)的外顯子。同樣地，使用33E10 VLcDNA作為模板，5' -GGGGCTAGCACCACCATG AAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG-3' (SEQ ID NO :89) (NheI 位點(diǎn)加下劃線)作為 5'引物和 5' -GGGGAATTCTTTGGATTCTACTTACGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCCTCC~3/ (SEQ ID NO :90) (EcoRI 位點(diǎn)加下劃線)作為3'引物(圖4)，通過PCR產(chǎn)生編碼33E10 VL的基因作為包括剪接供體信號和適當(dāng)?shù)貍?cè)翼限制性酶切位點(diǎn)的外顯子。33E10 VH和VL外顯子的剪接供體信號分別源自鼠種系的 JH3 和 J K I 序列(Kabat 等人，Sequences ofProteins of ImmunologicalInterests,第五版,NIH Publication No. 91-3242,U. S. Department of Health and HumanServices, 1991) 使用 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiangen, Valencia, CA)來凝膠純化PCR擴(kuò)增片段，用SpeI和HindIII (對于VH)或者NheI和EcoRI (對于VL)消化，并克隆到載有人Y-I和K恒定區(qū)的哺乳動物表達(dá)載體中，用來生產(chǎn)嵌合33E10 IgGl/K抗體。所得表達(dá)載體pCh33E10的示意性結(jié)構(gòu)示于圖5。6. 3人源化33E10 VH和VL基因的產(chǎn)生如Queen 等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 :10029-10033，1989)所概述的那樣進(jìn)行33E10可變區(qū)的人源化。首先，在計(jì)算機(jī)程序的輔助下構(gòu)建33E10可變區(qū)的三維分子模型。接下來，基于針對人源可變區(qū)序列的同源性檢索，選擇與33E10VH具有高度同源性的U03400 (Genbank登錄號)的人VH氨基酸序列作為受體從而提供人源化33E10VH的框架。同樣地，選擇X72452 (GenBank登錄號)的人VL氨基酸序列作為33E10 VL人源化的受體。在三維模型顯示出與互補(bǔ)決定區(qū)(⑶Rs)顯著接觸的框架位置，來自鼠33E10可變區(qū)的氨基酸殘基被人框架的殘基所替換。其在30和48位進(jìn)行，以產(chǎn)生人源化33E10(Hu33E10)VHl (圖6)。對于輕鏈，無需替換而產(chǎn)生Hu33E10VLl (圖7)。33E10、設(shè)計(jì)的Hu33E10和人受體氨基酸序列的比對，對于VH示于圖6和對于VL示于圖7。將編碼各Hu33E10 VHl和VLl的基因設(shè)計(jì)為包括信號肽、剪接供體信號和用于隨后克隆到哺乳動物表達(dá)載體中的適當(dāng)?shù)南拗菩悦盖形稽c(diǎn)的外顯子。Hu33E10 VHl和VLl外顯子的剪接供體信號分別源自人種系的JH3和Jk I序列(Kabat等人，1991)。通過 SIG-Pred 信號妝預(yù)測軟件(http://bmbpcu36. leeds. ac. uk/prot_analysis/Signal.html)表明鼠33E10 VLl基因的信號肽序列對于精確裂解是次優(yōu)的。因此，在Hu33E10 VLl外顯子中使用通過SIG-Pred軟件預(yù)測被有效且精確地裂解的鼠單克隆抗體35B6 (GeneTechno Science)的VL基因的信號肽。Hu33E10 VHl外顯子的信號肽序列源自相應(yīng)的鼠33E10 VH序列。SIG-Pred軟件表明Hu33E10 VHl基因的信號肽被有效且精確地裂解。如He 等人(J. Immunol. 160 :1029-1035，1998)所概述的，使用 Phusion DNA 聚合酶，通過幾個重疊合成的寡核苷酸引物的延伸和PCR擴(kuò)增來構(gòu)建Hu33E10 VHl和VLl基因。用于構(gòu)建Hu33E10 VHl和VLl基因的寡核苷酸分別列于圖8和9OHU33E10 VHl和VLl基因中的寡核苷酸的位置分別示于圖10和11。使用QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)來凝膠純化PCR擴(kuò)增片段，并克隆到pCR4Blunt-T0P0載體用于序列測定。用SpeI和HindIII (對于VH)或者NheI和EcoRI (對于VL)消化后，Hu33E10VHl和VLl基因亞克隆到用于生產(chǎn)人IgGl/κ形式的哺乳動物表達(dá)載體的相應(yīng)位點(diǎn)。所得表達(dá)載體pHu3E10-l的示意結(jié)構(gòu)示于圖5。所獲得的Hu33E10 VHl和VLl基因的核苷酸序列分別與推導(dǎo)的氨基酸序列一起示于圖12和13。6. 4嵌合和人源化33E10抗體的表達(dá)為了獲得穩(wěn)定生產(chǎn)各嵌合和人源化33E10 IgGl/κ抗體的細(xì)胞系，分別將表達(dá)載體 pCh33E10 和 pHu33E10_l 導(dǎo)入小鼠骨髓瘤細(xì)胞系 NSO (European Collection of Animal Cell Cultures, Salisbury,Wiltshire,UK)的染色體中。在 7· 5% CO2 培養(yǎng)箱中，37°C下使NSO細(xì)胞在包含10% FBS的DME培養(yǎng)基中生長。通過如Bebbington等人(Bio/Technology10 :169-175,1992)所述的電穿孔對NSO細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前，使用FspI使各表達(dá)載體線性化。用10 μ g線性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大約IO7個細(xì)胞，懸浮于包含10% FBS的DME培養(yǎng)基中，并在幾個96孔板中鋪板。24至48小時后，應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基(包含10%FBS、HT培養(yǎng)基補(bǔ)充劑(Sigma, St. Louis,MO)、0· 25mg/ml黃嘌呤和I μ g/ml霉酚酸的DME培養(yǎng)基)。選擇起始后的大約10天,分析培養(yǎng)上清液的抗體產(chǎn)物。通過夾心ELISA測量培養(yǎng)上清液中的由pCh33E10和pHu3E10_l表達(dá)的重組抗體(分別為Ch33E10和Hu3E10-VHl/VLl)的表達(dá)水平。在典型的實(shí)驗(yàn)中，4°C下用100 μ I/孔的1/2，000稀釋的PBS中的羊抗人IgG Fe Y鏈特異性多克隆抗體(SouthernBiotech,Birmingham, AL)鋪ELISA板過夜，用洗滌緩沖液(包含0. 05%吐溫20的PBS)洗漆，并在室溫下用3001 μ /孔的封閉緩沖液(包含2%脫脂牛奶和0. 05%吐溫20的PBS)封閉I小時。用洗滌緩沖液洗滌后，將ELISA緩沖液(包含1%脫脂牛奶和0. 025%吐溫20的PBS)中適當(dāng)稀釋的100 μ I/孔的試樣鋪于ELISA板。將從人骨髓瘤血清中純化的人IgGl/κ抗體(SouthernBiotech)或純化的Ch33E10用作標(biāo)準(zhǔn)。室溫下溫育ELISA板2小時并用洗滌緩沖液洗滌后，使用100 μ I/孔的1/2，000稀釋的HRP結(jié)合的羊抗人κ鏈多克隆抗體(SouthernBiotech)來檢測結(jié)合的抗體。室溫下溫育I小時并用洗滌緩沖液洗滌后,通過添加100 μ I/孔的ABTS底物進(jìn)行顯色，并用100 μ I/孔的2%草酸終止。在405nm下讀取吸光度。使產(chǎn)生高水平Ch33E10的NSO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子之一(NS0_Ch33E102Cll ;也稱作L4-2C11)適應(yīng)于在使用雜交瘤SFM的無血清培養(yǎng)基(Invitrogen)中生長，在滾瓶中增長至密度約106/ml,用6mg/ml超濾大豆水解產(chǎn)物(Irvine Scientific Cat#96857)補(bǔ)給,并進(jìn)一步生長至細(xì)胞活性變成小于50%。離心并過濾后，將培養(yǎng)上清液上樣(load)到蛋白A瓊脂糖凝膠柱(GE Healthcare, Piscataway, NJ)中。在用 0. IM 甘氨酸-HCl (pH 3. 0)洗脫抗體前，用PBS清洗柱。用IM Tris-HCl (pH8)中和后，通過透析將洗脫抗體的緩沖液改為PBS。通過測量280nm下的吸光度來測量抗體濃度(lmg/ml = I. 40D)。
雖然易于獲得表達(dá)Ch33E10的NSO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子，但穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有pHu33E10_l的所有NSO轉(zhuǎn)染子為Hu33E10-VHl/VLl的不良生產(chǎn)者。重鏈和輕鏈mRNA的分析揭示缺失VL編碼區(qū)的異常輕鏈mRNA的存在，這是由于在VLl基因的信號肽編碼區(qū)偶然產(chǎn)生剪接供體位點(diǎn)。為了解決該問題，使用重疊延伸PCR法,通過位點(diǎn)定向誘變(Higuchi,R.,在PCR Technology Principlesand Applications for DNA Amplification. Erlich, H. A. , ed.pp. 61-70,Stockton Press, New York, 1989)來消除在信號肽編碼區(qū)的剪接供體位點(diǎn)。所得突變體Hu33E10 VL基因的序列，VL6，不于圖14。VLl和VL6之間的VL區(qū)氣基酸序列彼此相同。在表達(dá)載體pHu33E10-l中將VL6基因替換VLl以產(chǎn)生pHu33E10_2。通過上述方法獲得用pHu33E10-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的并產(chǎn)生高水平的重組抗體(Hu33E10-VHl/VL6)的NSO細(xì)胞。在用pHu33E10-2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NSO細(xì)胞中未觀察到異常輕鏈mRNA。產(chǎn)生高水平Hu33E10_VHl/VL6 (NS0-Hu33E10-2#2)的NSO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子之一在雜交瘤SFM中適應(yīng)并增長，如上所述將培養(yǎng)上清液用于純化Hu33E10-VHl/VL6。6. 5Hu33E10-VHl/VL6 的表征
通過ELISA檢測 Ch33E10 和 Hu33E10-VHl/VL6 IgGl/k 抗體與 h0PN5_BSA 的結(jié)合。作為抗原，使用與牛血清白蛋白結(jié)合的合成寡肽(Cys-Val-Asp-Thr-Tyr-Asp-Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Val-Val-Tyr-Gly-Leu-Arg-Ser ；由 Gene TechnoScience 提供)(h0PN5_BSA)。在典型的實(shí)驗(yàn)中，在4°C下，用100111/孔0.211 Na2CO3緩沖液(pH9. 4)中的I y g/mlh0PN5-BSA鋪ELISA板過夜，用洗滌緩沖液洗滌，并在室溫下用300 U I/孔封閉緩沖液封閉I小時。用洗滌緩沖液洗滌后，將適當(dāng)溶于ELISA緩沖液中的樣品以IOOiU/孔施加到ELISA板上。4°C下溫育ELISA板過夜并用洗滌緩沖液洗滌后，使用100 U I/孔的1/2，000稀釋的HRP結(jié)合的羊抗人Y鏈多克隆抗體(SouthernBiotech)檢測結(jié)合的抗體。室溫下溫育I小時并用洗滌緩沖液洗滌后，通過添加100 iil/孔的ABTS底物來進(jìn)行顯色，并用100 iil/孔的2%草酸終止。在405nm下讀取吸光度。如圖15A所示，對于與 h0PN5-BSA 的結(jié)合，Hu33E10-VHl/VL6 比 Ch33E10 弱大約 100倍。6. 6Hu33E10 VH5、VH7 和 VH7. 8 的產(chǎn)生和表征為了鑒定人源化VHl和VL6基因哪一個導(dǎo)致HU33E10-VH1/VL6的抗原結(jié)合親和力的減少，產(chǎn)生兩個重組IgGl/K抗體，一個由鼠VH和人源化VL6組成(MoHu33E10)，及另一個由人源化VHl和鼠VL組成(HuMo33E10)。通過分析MoHu33E10和HuMo33E10抗體，發(fā)現(xiàn)Hu33E10-VHl/VL6親和力的減少主要由于VHl基因，部分由于VLl基因(數(shù)據(jù)未示出)?；赩Hl基因的初步突變分析，懷疑73至77位氨基酸對于維持抗原結(jié)合親和力是重要的(數(shù)據(jù)未示出)。選擇由使用重疊延伸PCR法(Higuchi，1989)的位點(diǎn)定向誘變所構(gòu)建的VHl基因的三個突變體(VH5、VH7和VH7. 8)用于進(jìn)一步的分析。與VHl相比，VH5中77位的Ile替換Ser (圖6和16)，VH7中76位的Ser和77位的Ile分別替換Asn和Ser (圖6和17)，VH7. 8中74位的Ser、76位的Ser和77位的Ile分別替換Ala、Asn和Ser (圖 6 和 18)。將用SpeI和HindIII消化的各VH5、VH7和VH7. 8基因替換pHu33E10_2中的VHl以分別構(gòu)建表達(dá)載體pHu33E10-3、pHu33E10_4和pHu33E10_5。如第4節(jié)所述產(chǎn)生用各 pHu33E10-3、pHu33E10-4 和 pHu33E10_5 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的 NSO 細(xì)胞。產(chǎn)生 Hu33E10_VH5/VL6的 NS0-Hu33E10-3#65、產(chǎn)生 Hu33E10-VH7/VL6 的 NS0-Hu33E10_4 3(也稱作 R3-1 5D3)以及產(chǎn)生 Hu33E10-VH7. 8/VL6 的 NS0-Hu33E10_5 1E5 (也稱作 EJ3-3 1E5)適應(yīng)于在雜交瘤SFM中生長并在滾瓶中增長。如第4結(jié)所述，使用蛋白A柱從相應(yīng)的培養(yǎng)上清液中純化Hu33E10-VH5/VL6、Hu33E10_VH7/VL6 和 Hu33E10_VH7. 8/VL6 抗體。如第5 節(jié)所述，通過 ELISA 將 Hu33E10_VH5/VL6、Hu33E10_VH7/VL6 和Hu33E10-VH7. 8/VL6 抗體與 h0PN5_BSA 的結(jié)合同 Ch33E10 的比較。當(dāng)與 Hu33E10_VHl/VL6 相比時，Hu33E10-VH5/VL6與h0PN5_BSA的親和力稍微改進(jìn)，但仍比Ch33E10的親和力弱(圖15A)。Hu33E10-VH7/VL6 與 h0PN5-BSA 的親和力比 Ch33ElO 的親和力弱 3 至 4 倍(圖 15A)。在該實(shí)驗(yàn)中，Hu33E10-VH7. 8/VL6的親和力大約比Ch33E10的親和力低3倍(圖15B)。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，對于同h0PN5-BSA的結(jié)合，Hu33E10-VH7/VL6和Hu33E10_VH7. 8/VL6彼此表現(xiàn)類似。6. 7Hu33E10 VLv2 的產(chǎn)生和表征VLl基因的初步突變分析未能鑒定任何有助于HU33E10-VH1/VL6的結(jié)合親和力減 少的特別的框架氨基酸殘基(數(shù)據(jù)未示出)，即使懷疑VLl基因部分地導(dǎo)致親和力的減少。代替進(jìn)一步表征的VLl基因，基于不同人框架設(shè)計(jì)新的人源化33E10 VL(VLv2)(圖19)。對于VLv2，選擇M29467 (GenBank登錄號)的人氨基酸序列作為受體。在預(yù)測與⑶R顯著相互作用的22和37位，鼠33E10 VL的氨基酸殘基在人源化形式中得到保留。在GenScriptUSA Inc. (Piscataway，NJ)合成側(cè)翼為 Nhe I 和 EcoRI 位點(diǎn)的 Hu33E10 VLv2 基因(圖 20)。VL6和VLv2基因共享相同的信號肽序列和剪接供體信號(圖14和20)。將用NheI和EcoRI消化的Hu33E10 VLv2基因替換pHu33E10_4中的VLl以構(gòu)建新的表達(dá)載體pHu33E10-6。如第4節(jié)所述，產(chǎn)生用pHU33E10_6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NSO細(xì)胞以產(chǎn)生 Hu33E10-VH7/VLv2 IgGl/κ。轉(zhuǎn)染子之一，NS0-Hu33E10_15 (也稱作 SP2-1 1-15)在雜交瘤SFM適應(yīng)并增長，并使用第4節(jié)中所述的步驟從培養(yǎng)上清液中純化Hu33E10-VH7/VLv2抗體。如第5節(jié)所述，通過ELISA分析Hu33E10_VH7/VLv2與h0PN5_BSA的結(jié)合。兩個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)結(jié)果示于圖21。在兩個實(shí)驗(yàn)中，Hu33E10-VH7/VLv2的結(jié)合親和力為Ch33E10的結(jié)合親和力的2倍以內(nèi)。6.8 NSO穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的表征用PCR 支原體檢測裝置(Takara Bio USA, Madison, WT)試驗(yàn)表明，NS0_Ch33E102Cll、NS0-Hu33E10-4 5D3、NS0-Hu33E10_5 1E5 和 NS0-Hu33E10_6 1-15 對于支原體的存在全部為陰性。通過cDNA 測序證實(shí)分別在 NS0-Hu33E10_4 5D3, NS0-Hu33E10_5 1E5 和NS0-Hu33E10-6 1-15 中產(chǎn)生的 Hu33E10_VH7/VL6、Hu33E10_VH7. 8/VL6 和 Hu33E10_VH7/VLv2 IgGl/ κ抗體的重鏈和輕鏈的可靠性。使用TRIzol試劑(Invitrogen)從這些細(xì)胞中提取總RNA，并使用RT-PCR用上標(biāo)III第一鏈合成系統(tǒng)(InvitiOgen)根據(jù)供應(yīng)商的方法合成oligo dT引導(dǎo)的cDNAo使用CMV2和JNT098作為引物(圖22)和PhusionDNA聚合酶通過PCR擴(kuò)增Y -重鏈的編碼區(qū)。將PCR片段凝膠純化并用CMV2、JNT082、JNT097和JNT098作為引物(圖22)進(jìn)行測序。類似地，使用CMV2和JNT026 (圖22)擴(kuò)增κ輕鏈的編碼區(qū)并用CMV2、JNT026、JNT080和JNT084作為引物(圖22)使凝膠純化的DNA片段進(jìn)行測序。所獲得的重鏈和輕鏈編碼區(qū)序列與各NS0-Hu33E10-4 5D3, NS0-Hu33E10-5 1E5和NS0-Hu33E10-6I-15穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的表達(dá)載體中的相應(yīng)序列完全匹配。由Hu33E10VH7和VH7. 8組成的Y -I重鏈的全部編碼區(qū)序列分別示于圖23和24。由Hu33E10 VL6和VLv2組成的K輕鏈的全部編碼區(qū)序列示于圖25和26。此外，通過cDNA測序證實(shí)在NS0-Ch33E10 2C11中產(chǎn)生的Ch33E10 IgGl/k抗體的VH和VL區(qū)的可靠性。如上所述進(jìn)行總RNA的提取和cDNA的合成。使用CMV2和JNT082作為引物和Phusion聚合酶通過PCR擴(kuò)增VH編碼區(qū)。將PCR片段凝膠純化并用CMV2和JNT082作為引物進(jìn)行測序。類似地，使用CMV2和JNT026擴(kuò)增VL編碼區(qū)并用CMV2和JNT026作為引物使凝膠純化的DNA片段進(jìn)行測序。所獲得的VH和VL區(qū)的核苷酸序列與pCh33E10表達(dá)載體中相應(yīng)序列完全匹配(分別為圖3和4)。6. 9 總結(jié)確定Hu33E10-VH7/VLv2 IgGl/k 與 h0PN5_BSA 的親和力為 Ch33E10 IgGl/k 的親和力的3倍以內(nèi)。
6. 10細(xì)胞黏附抑制試驗(yàn)圖27示出人源化抗OPN抗體抑制MDA-MB-435S與h0PN5_BSA的黏附。從美國模式培養(yǎng)物保藏中心(AmericanType Culture Collection, ATCC)獲得 MDA-MB-435S 人乳腺癌細(xì)胞系，并在含10%胎牛血清的DMEM補(bǔ)充劑中培養(yǎng)。37°C下用h0PN5_BSA (2 y g/ml)鋪96孔板I小時，隨后在室溫下用0. 5% BSA處理I小時。將人免疫球蛋白Gl k、Ch33E10、Hu33E10-VH7. 8/VL6 (EJ3-1-1)、Hu33E10-VH7/VL6 (E3-1)、Hu33E10-VH7/VLv2 (SP-2)和鼠33E10抗體溶于0. 25% BSA的DMEM中，并在37°C下在以100 u g/ml開始并連續(xù)2倍稀釋的各種濃度下處理20分鐘。將2X IO4個MDA-MB-435S細(xì)胞添加到各孔。37°C下溫育I小時后，除去培養(yǎng)基并用溫PBS(加熱至37°C)輕輕洗滌兩次。固定黏附細(xì)胞并用溶于20%甲醇的0.5%結(jié)晶紫染色，并用20%乙酸裂解。在590nm下測量吸光度。用不添加抗體的吸光度標(biāo)準(zhǔn)化抑制率。7.保藏2005年10月27日，依照微生物保藏的布達(dá)佩斯條約，將本文所命名的產(chǎn)生鼠抗RGD單克隆抗體的33E10和35B6雜交瘤保藏于位于茨城縣筑波東中央第6 (郵政編碼305-8566)的獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所專利生物保藏中心，相應(yīng)的登陸號分別為FERM BP-10440和FERM BP-10441，將其全部內(nèi)容引入此處以作參考。8產(chǎn)業(yè)上的可利用性本發(fā)明的人源化抗體抑制RGD蛋白的功能從而顯示對癌癥如癌細(xì)胞的生長或轉(zhuǎn)移，以及炎性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、肝炎、支氣管哮喘、纖維樣變、糖尿病、癌轉(zhuǎn)移、動脈硬化、多發(fā)性硬化癥、肉芽瘤、炎性腸道疾病(潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)和自身免疫病等的治療效果。包括本發(fā)明的抗RGD抗體和抗整聯(lián)蛋白抗體的藥物學(xué)組合物對癌癥和炎性疾病發(fā)揮更加改善的治療效果。盡管本文已說明并描述了具體實(shí)施方案，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解各種更改和/或等同實(shí)施在不偏離本發(fā)明的范圍的情況下可替代所示出和描述的具體實(shí)施方案。該申請意于覆蓋任何此處所討論的具體實(shí)施方案的更改或變化。因此，本發(fā)明僅受權(quán)利要求及其等同物的限制。
權(quán)利要求
1.一種免疫特異性識別RGD序列的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其包括 ⑴包括VH的H-鏈，所述VH包括SEQ ID NO :92、94或96的氨基酸序列；或 (ii)包括VL的L-鏈，所述VL包括SEQID NO 98或100的氨基酸序列；或 (iii)上述⑴和(ii)二者。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述VH包括由SEQIDNO :91、93或95的核苷酸序列編碼的氨基酸序列，和所述VL包括由SEQ ID NO :97或99的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述VH包括SEQID NO94的氨基酸序列，和所述VL包括SEQ ID NO :100的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述H-鏈包括SEQIDNO :25或27的氨基酸序列，和所述L-鏈包括SEQ ID NO :29或31的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述H-鏈包括SEQID NO 25的氨基酸序列，和所述L-鏈包括SEQ ID NO 31的氨基酸序列。
6.—種分尚的核酸分子，其包括編碼SEQ ID NO :SEQ IDNO :92、94或96的氨基酸序列的核苷酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列具有SEQID NO :91、93或95的核苷酸序列。
8.一種分離的核酸分子，其包括編碼SEQ ID NO SEQ IDNO :98或100的氨基酸序列的核苷酸序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列具有SEQID N0:97或99的核苷酸序列。
10.一種分離的核酸分子，其包括編碼SEQ ID NO :25或27的氨基酸序列的核苷酸序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列具有SEQID NO 24或26的核苷酸序列。
12.—種分離的核酸分子，其包括編碼SEQ ID NO :29或31的氨基酸序列的核苷酸序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的分尚的核酸分子,其中所述核苷酸序列具有SEQID NO 28或30的核苷酸序列。
14.一種載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求6或8或二者所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地連接至一種或多種調(diào)控元件。
15.一種載體，其包括根據(jù)權(quán)利要求10或12或二者所述的核酸分子，其中所述核酸分子可操作地連接至一種或多種調(diào)控元件。
16.一種分離的宿主細(xì)胞，其包括根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的載體。
17.一種用于制備人源化抗體或其抗原結(jié)合片段的方法，其包括在使所述人源化抗體或其抗原結(jié)合片段表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求16所述的宿主細(xì)胞，和收集被表達(dá)的人源化抗體。
18.一種用于抑制細(xì)胞黏附的組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。
19.一種用于干擾胞外基質(zhì)蛋白與細(xì)胞的結(jié)合的組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段。
20.根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的組合物，其中所述組合物用于治療或診斷與RGD蛋白相關(guān)的紊亂或疾病。
21.一種用于預(yù)防或治療與RGD蛋白相關(guān)的紊亂或疾病的方法，所述方法包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段給藥到需要其的受試者。
22.—種用于檢測試樣中的RGD蛋白的方法，其包括分析試樣中根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段與所述RGD蛋白的結(jié)合。
23.一種用于體內(nèi)診斷與RGD蛋白相關(guān)的紊亂或疾病的方法，所述方法包括將有效量的根據(jù)權(quán)利要求I至5任一項(xiàng)所述的人源化抗體或其抗原結(jié)合片段給藥到待檢測的受試者。
全文摘要
本發(fā)明提供免疫特異性識別RGD序列的人源化抗體。這些抗體中的某些抑制RGD蛋白的生物學(xué)功能，從而顯示對與RGD蛋白相關(guān)的各種紊亂或疾病的治療效果，所述與RGD相關(guān)的紊亂或疾病包括癌癥如癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，以及炎性疾病如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎、肝炎、子宮內(nèi)膜異位癥、支氣管哮喘、纖維樣變、糖尿病、動脈硬化、多發(fā)性硬化癥、肉芽瘤、炎性腸道疾病(潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩氏病)和自身免疫病等。
文檔編號A61K39/395GK102712921SQ20108004235
公開日2012年10月3日 申請日期2010年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月24日
發(fā)明者尚卡·庫馬, 曹仲欣, 鶴下直也 申請人:株式會社遺傳科技