專利名稱：魚呼腸弧病毒免疫原性組合物的制作方法
魚呼腸弧病毒免疫原性組合物
技術領域：
本專利公開內容包含受版權保護的內容。版權所有人不反對任何人對美國專利商標局上公布的本專利文件或本專利內容進行復制，但版權所有人保留任何及所有版權權利。本申請要求2009年10月2日提交的美國臨時專利申請No. 61/248，058、2010年4月16日提交的美國臨時專利申請No. 61/325，047和2010年9月7日提交的美國臨時專利申請No. 61/380，594的權益和優(yōu)先權，這些臨時申請的全部內容據此以引用的方式并入以用于所有目的。
所有出版物、專利申請、專利以及在本文中提到的其它參考文獻的全部內容通過引用的方式并入。本文提及的專利和科學文獻確立了對本領域技術人員而言可用的知識。本文所引用的已公布的專利、申請和其它出版物據此以引用的方式并入，其程度如同具體且單獨地指明各文獻均以引用的方式并入。如果存在不一致的情況，以本公開內容為準。發(fā)明背景魚類正日益成為食品和收入的重要來源；全球年消耗量預計從2010年的I. I億噸上升至2030年的2億噸以上。鑒于野生魚類的捕撈率由于過度捕撈和棲息地喪失而疲軟或下降，全球海水養(yǎng)殖產量正在以每年超過8%的速度增長。然而，水產養(yǎng)殖中傳染性疾病的出現(xiàn)威脅到生產，也可對野生魚類種群造成影響。大西洋鮭魚(Salmo salar L.)是其中最普遍的養(yǎng)殖魚類，其年產量超過一百萬噸。大西洋鮭魚海水養(yǎng)殖一直與傳染性疾病的流行相關，而這些傳染性疾病不僅威脅到當地生產，也對海產養(yǎng)殖圍欄附近的野生魚類或者從圍欄中逃出的魚類造成威脅。心臟和骨骼肌炎癥(HSMI)是一種頻發(fā)的養(yǎng)殖大西洋鮭魚的致命疾病。1999年在挪威的一家養(yǎng)殖場中首次發(fā)現(xiàn)了 HSMI (Kongtorp等，J Fish Dis27，351-358 (2004))，隨后在挪威和英國的其它農場中爆發(fā)HSMI (Ferguson等，J Fish Dis28，119-123(2005))。盡管病理學和疾病傳播研究已指出其傳染基礎，但鑒定致病因子的努力均以失敗告終。HSMI是可傳染的，但此前并未分離出致病因子。HSMI是一種威脅水產養(yǎng)殖的重要疾病。需要適于預防和遏制PRV感染并治療患有HSMI的動物的免疫原性組合物和疫苗。本發(fā)明致力于解決這些需求。發(fā)明概述本發(fā)明涉及魚呼腸孤病毒(PRV)(與鮭魚HSMI相關的新型正呼腸孤病毒樣病毒)、分離的核酸序列及其肽。本發(fā)明還涉及針對來自PRV的抗原的抗體及產生此種抗體的方法。本發(fā)明還涉及誘導動物體內針對PRV的免疫反應的免疫原性組合物。在一方面，本發(fā)明提供了一種PRV免疫原性組合物，其包含PRV核酸。在一個實施方案中，所述PRV核酸為SEQ ID NO :1-10中任何一個的核酸序列。在另一個實施方案中，所述PRV核酸包含SEQ ID NO :1-10中任何一個的至少24個連續(xù)核酸。在又一個實施方案中，所述PRV核酸與SEQ ID NO :1-10中任何一個的核酸序列基本上同一。在又一個實施方案中，所述PRV核酸是具有與SEQ ID NO :1-10至少約85%同一性的SEQ ID NO 1-10中任何一個的變體。在一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :1-10中任何一個具有至少約 90%、約 95. 5%、約 96%、約 96. 5%、約 97%、約 97. 5%、約 98%、約 98. 5%、約 99%、約99. 5%或約99. 9%的同一性。在另一方面，本發(fā)明提供了一種PRV免疫原性組合物，其包含PRV多肽。在一個實施方案中，所述PRV多肽為由SEQ ID NO :1-10中任何一個編碼的多肽。在另一個實施方案中，所述PRV多肽為由包含SEQ ID NO 1-10中任何一個的至少24個連續(xù)核酸的核酸編碼的多肽。在另一個實施方案中，所述PRV多肽為由與SEQ ID NO :1-10中任何一個的核酸序列基本上同一的核酸編碼的多肽。在又一個實施方案中，所述PRV多肽為由核酸編碼的多肽，所述核酸為與SEQ ID NO :1-10具有至少約85%同一性的SEQ ID NO :1_10中任何一個的變體。在又一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :1-10中任何一個具有至少約90%、約 95. 5%、約 96%、約 96. 5%、約 97%、約 97. 5%、約 98%、約 98. 5%、約 99%、約 99. 5%或約99. 9%的同一性。在又一個實施方案中，所述PRV多肽為包含SEQ ID NO :29-40的氨基酸序列的多肽。在又一個實施方案中，所述PRV多肽為包含SEQ ID NO :29-40中任何一個的至少8個連續(xù)氨基酸的多肽。在又一個實施方案中，所述PRV多肽與SEQ ID NO 29-40 中任何一個的氨基酸序列基本上同一。在又一個實施方案中，所述PRV多肽為SEQ ID NO29-40中任何一個的變體且與SEQ ID NO 29-40具有至少約85%的同一性。在又一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :29-40中任何一個具有至少約90%、約95. 5%、約96%、約96. 5%、約 97%、約 97. 5%、約 98%、約 98. 5%、約 99%、約 99. 5%或約 99. 9%的同一性。在另一方面，本發(fā)明提供了一種與PRV或PRV多肽結合并抑制、中和或降低所述PRV或PRV多肽的功能或活性的抗體。在一個實施方案中，所述抗體為多克隆抗體。在另一個實施方案中，所述抗體為單克隆抗體。在又一個實施方案中，所述抗體為硬骨魚抗體。在又一個實施方案中，所述抗體為鮭魚抗體。在又一個實施方案中，所述抗體為IgM抗體。在又一個實施方案中，所述抗體為嵌合抗體。在另一方面，本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，其包含含有PRV多肽的滅活病毒。在又一方面，本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，其包含含有PRV多肽的減毒病毒。在一個實施方案中，本文所述的任何一種免疫原性組合物進一步包含至少一種賦形劑、添加劑或佐劑。在一個實施方案中，本文中所述的任何一種免疫原性組合物進一步包含來自其它病毒的至少一種多肽或其片段。在另一方面，本發(fā)明提供了一種免疫原性組合物，其包含融合多肽，其中所述融合多肽包含PRV多肽、片段或其變體以及來自其它病毒的至少一種多肽或其片段。在一個實施方案中，所述其它病毒選自由以下組成的組嗜睡癥病毒(SDV);鮭魚胰腺病病毒(SPDV);傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV);病毒性出血性敗血病病毒(VHSV);傳染性造血組織壞死病病毒(IHNV);傳染性胰壞死病毒(IPNV);鯉魚春病毒血癥(SVC);斑點叉尾鮰病毒(CCV);殺鮭氣單胞菌；鮭腎桿菌；粘放線菌(Moritella viscosis);耶爾森氏鼠疫桿菌(Yersiniosis);巴斯德桿病菌(Pasteurellosis);鰻弧菌；火神弧菌(Vibrio logei);病?；【?Vibrio ordalii);鮭弧茵；愛德華氏菌(Edwardsiella ictaluri);遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda);柱狀纖維粘細菌(Cytophaga columnari)或鮭魚立克次氏菌(Piscirickettsia salmonis)。在另一方面，本發(fā)明提供了一種誘導動物體內免疫反應的方法，所述方法包括施用本文所述的任何一種PRV免疫原性組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種預防或降低動物體內PRV感染的方法，所述方法包括施用本文所述的任何一種PRV免疫原性組合物。在另一方面，本發(fā)明提供了一種預防或降低動物體內PRV感染的方法，所述方法包括施用本文所述的任何一種動物抗體。在一個實施方案中，本文所述方法中的任何施用為口服施用、浸泡施用或注射施用。
在另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的任何一種免疫原性組合物在生產用于治療動物體內病癥PRV感染的疫苗中的用途。在另一方面，本發(fā)明提供了本文所述的任何一種免疫原性組合物在生產用于預防或降低治療動物體內病癥PRV感染的疫苗中的用途。

圖I :通過焦磷酸測序獲取的魚呼腸孤病毒(PRV)序列。針對PRV串聯(lián)序列(concatenated sequence)對裝配序列數據作圖。由 BLASTN、BLASTX、FASTX 和 FASD 標識的基因組區(qū)分別用紅色、藍色、綠色和橙色示出。 圖2 :呼腸孤病毒RNA依賴性RNA聚合酶的系統(tǒng)發(fā)生分析。使用在MEGA軟件上實施的 ClustalX14 (Tamura等,Mol Biol Evol 24,1596-1599 (2007))比對全長氨基酸序列并使用 T-Coffee (Notredame 等，J Mol Biol 302，205-217 (2000))改進，以合并蛋白質結構數據。使用P距離作為氨基酸取代的模型，由ICTV進行系統(tǒng)系統(tǒng)發(fā)生分析，以分析呼腸孤病毒科(Mertens 等，T. Family Reoviridae. 447-454 (Elsevier Academic Press, 2005)) MEGA用于產生系統(tǒng)樹，通過鄰接(NJ)法進行重構。通過對所述序列進行引導程序重取樣1000次來評估特定樹形拓撲的統(tǒng)計學顯著性。圖3 :歸一化為鮭魚宿主基因的病毒負載對數比的組差異圖示。非參數方法用于測定健康和受HSMI影響的養(yǎng)殖魚中相對病毒負載比較的統(tǒng)計顯著性。盡管如此，仍在計算LI (病毒)/EFlA (管家基因)比率之后對所有樣本進行未歸一化對數比分布的對數變換，以輔助圖示。圖3A示出來自健康養(yǎng)殖魚和患有HSMI的養(yǎng)殖魚的混合心臟和腎臟樣本中調整對數比的比較；*，p < O. 0001 (Mann-Whitney U)。圖3B示出未患有HSMI的養(yǎng)殖魚(健康養(yǎng)殖魚)、HSMI爆發(fā)早期、HSMI爆發(fā)中期和HSMI爆發(fā)高峰過程中的調整對數比的比較；**，P < O. 0005 ; *，P < O. 01 (單獨Mann-Whitney U)。所有四個養(yǎng)殖魚組的調整對數比也顯著不同(P < O. 0001 ；Kruskal-ffallis)。圖4 :用靶向魚呼腸孤病毒的L2片段的鎖核酸(LNA)探針進行原位雜交。在用地高辛(DIG)標記LNA探針進行雜交后接著用蛋白酶K侵入切片。將切片與小鼠單克隆抗辣根過氧化物酶一起培養(yǎng)并用酪胺信號擴增體系進行染色。用梅衣爾蘇木精(Meyer' shematoxylin)溶液對切片進行復染。圖4A示出感染HSMI的魚的心臟(10倍)。圖4B示出感染HSMI的魚的心臟(40倍)。圖4C示出未感染HSMI的魚的心臟(40倍)。圖4D示出感染鮭魚胰腺病病毒的魚的心臟(40倍)。圖5 :水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的λ I ORF的系統(tǒng)發(fā)生分析。用BEAST、BEAUti和示蹤分析軟件包進行片段λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、μ 3、σ 2和σ NS(水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的σ I和σ3具有不同的基因組結構)間的序列差異的貝葉斯定理系統(tǒng)發(fā)生分析。用DayhofT氨基酸取代模型進行10，000, 000代初步分析來選擇最適宜于每一個ORF的時鐘和種群模型。邊緣相似性的分析表明對所有的數據集都選用松散對數正態(tài)分子鐘和常數種群數量模型。最終數據分析包括5，000, 000-30, 000, 000代的MCMC鏈長，其中每1000個形態(tài)進行取樣。彩色框表示不同呼腸孤病毒屬或物種的代表。綠色，水生呼腸孤病毒屬；藍色，物種I (哺乳動物正呼腸孤病毒)；紅色，物種II (鳥類正呼腸孤病毒)；紫色，物種III (納爾遜海灣正呼腸孤病毒);橙色，物種IV(爬行動物正呼腸孤病毒)和淡藍色，物種V (狒狒正呼腸孤病毒)。圖6 :水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的λ 2 ORF的系統(tǒng)發(fā)生分析。用BEAST、BEAUti和示蹤分析軟件包進行片段λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、μ 3、σ 2和σ NS(水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的σ I和σ3具有不同的基因組結構)間的序列差異的貝葉斯定理系統(tǒng)發(fā)生分析。用DayhofT氨基酸取代模型進行10，000, 000代初步分析來選擇出最適宜于每一個ORF的時鐘和種群模型。邊緣相似性的分析表明對所有的數據集都選用松散對數正態(tài)分子鐘和常數種群數量模型。最終數據分析包括5，000, 000-30, 000, 000代的MCMC鏈長，其中每1000個形態(tài)進行取樣。彩色框表示不同呼腸孤病毒屬或物種的代表。綠色，水生呼 腸孤病毒屬；藍色，物種I (哺乳動物正呼腸孤病毒)；紅色，物種II (鳥類正呼腸孤病毒)；紫色，物種III (納爾遜海灣正呼腸孤病毒);橙色，物種IV(爬行動物正呼腸孤病毒)和淡藍色，物種V (狒狒正呼腸孤病毒)。圖7 :水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的λ 3 ORF的系統(tǒng)發(fā)生分析。用BEAST、BEAUti和示蹤分析軟件包進行片段λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、μ 3、σ 2和σ NS(水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的σ I和σ3具有不同的基因組結構)間的序列差異的貝葉斯定理系統(tǒng)發(fā)生分析。用DayhofT氨基酸取代模型進行10，000, 000代初步分析來選擇出最適宜于每一個ORF的時鐘和種群模型。邊緣相似性的一項分析表明對所有的數據集都選用松散對數正態(tài)分子鐘和常數種群數量模型。最終數據分析包括5，000, 000-30, 000, 000代的MCMC鏈長，其中每1000個形態(tài)進行取樣。彩色框表示不同呼腸孤病毒屬或物種的代表。綠色，水生呼腸孤病毒屬；藍色，物種I (哺乳動物正呼腸孤病毒)；紅色，物種II (鳥類正呼腸孤病毒)；紫色，物種III (納爾遜海灣正呼腸孤病毒)；橙色，物種IV(爬行動物正呼腸孤病毒)和淡藍色，物種V (狒狒正呼腸孤病毒)。圖8 :水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒屬的Mu-I ORF的系統(tǒng)發(fā)生分析。用BEAST、BEAUti和示蹤分析軟件包進行片段λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、μ 3、σ 2和σ NS(水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的σ I和σ3具有不同的基因組結構)間的序列差異的貝葉斯定理系統(tǒng)發(fā)生分析。用DayhofT氨基酸取代模型進行10，000, 000代初步分析來選擇出最適宜于每一個ORF的時鐘和種群模型。邊緣相似性的分析表明對所有的數據集都選用松散對數正態(tài)分子鐘和常數種群數量模型。最終數據分析包括5，000, 000-30, 000, 000代的MCMC鏈長，其中每1000個形態(tài)進行取樣。彩色框表示不同呼腸孤病毒屬或物種的代表。綠色，水生呼腸孤病毒屬；藍色，物種I (哺乳動物正呼腸孤病毒)；紅色，物種II (鳥類正呼腸孤病毒)；紫色，物種III (納爾遜海灣正呼腸孤病毒)；橙色，物種IV(爬行動物正呼腸孤病毒)和淡藍色，物種V (狒狒正呼腸孤病毒)。圖9 :水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒屬的Mu-2 ORF的系統(tǒng)發(fā)生分析。用BEAST、BEAUti和示蹤分析軟件包進行片段λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、μ 3、σ 2和σ NS(水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的σ I和σ3具有不同的基因組結構)間的序列差異的貝葉斯定理系統(tǒng)發(fā)生分析。用DayhofT氨基酸取代模型進行10，000, 000代初步分析來選擇出最適宜于每一個ORF的時鐘和種群模型。邊緣相似性的分析表明對所有的數據集都選用松散對數正態(tài)分子鐘和常數種群數量模型。最終數據分析包括5，000, 000-30, 000, 000代的MCMC鏈長，每1000個形態(tài)進行取樣。彩色框表示不同呼腸孤病毒屬或物種的代表。綠色表示水生呼腸孤病毒屬；藍色，物種I (哺乳動物正呼腸孤病毒)；紅色，物種II (鳥類正呼腸孤病毒)；紫色，物種III (納爾遜海灣正呼腸孤病毒);橙色，物種IV(爬行動物正呼腸孤病毒)和淡藍色，物種V (狒狒正呼腸孤病毒)。圖10 :水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒屬的Mu-3 ORF的系統(tǒng)發(fā)生分析。用BEAST、BEAUti和示蹤分析軟件包進行片段λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、μ 3、σ 2和σ NS(水生呼腸孤 病毒和正呼腸孤病毒的σ I和σ3具有不同的基因組結構)間的序列差異的貝葉斯定理系統(tǒng)發(fā)生分析。用DayhofT氨基酸取代模型進行10，000, 000代初步分析來選擇出最適宜于每一個ORF的時鐘和種群模型。邊緣相似性的分析表明對所有的數據集都選用松散對數正態(tài)分子鐘和常數種群數量模型。最終數據分析包括5，000, 000-0, 000, 000代的MCMC鏈長，其中每1000個形態(tài)進行取樣。彩色框表示不同呼腸孤病毒屬或物種的代表。綠色，水生呼腸孤病毒屬；藍色，物種I (哺乳動物正呼腸孤病毒)；紅色，物種II (鳥類正呼腸孤病毒)；紫色，物種III (納爾遜海灣正呼腸孤病毒);橙色，物種IV(爬行動物正呼腸孤病毒)和淡藍色，物種V (狒狒正呼腸孤病毒)。圖11 :水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒屬的σ 2 ORF的系統(tǒng)發(fā)生分析。用BEAST、BEAUti和示蹤分析軟件包進行片段λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、μ 3、σ 2和σ NS(水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的σ I和σ3具有不同的基因組結構)間的序列差異的貝葉斯定理系統(tǒng)發(fā)生分析。用DayhofT氨基酸取代模型進行10，000, 000代初步分析來選擇出最適宜于每一個ORF的時鐘和種群模型。邊緣相似性的分析表明對所有的數據集都選用松散對數正態(tài)分子鐘和常數種群數量模型。最終數據分析包括5，000, 000-30, 000, 000代的MCMC鏈長，其中每1000個形態(tài)進行取樣。彩色框表示不同呼腸孤病毒屬或物種的代表。綠色，水生呼腸孤病毒屬；藍色，物種I (哺乳動物正呼腸孤病毒)；紅色，物種II (鳥類正呼腸孤病毒)；紫色，物種III (納爾遜海灣正呼腸孤病毒)；橙色，物種IV(爬行動物正呼腸孤病毒)和淡藍色，物種V (狒狒正呼腸孤病毒)。圖12 :水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒屬的σ NS ORF的系統(tǒng)發(fā)生分析。用BEAST、BEAUti和示蹤分析軟件包進行片段λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、μ 3、σ 2和σ NS(水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒的σ I和σ3具有不同的基因組結構)間的序列差異的貝葉斯定理系統(tǒng)發(fā)生分析。用DayhofT氨基酸取代模型進行10，000, 000代初步分析來選擇出最適宜于每一個ORF的時鐘和種群模型。邊緣相似性的分析表明對所有的數據集都選用松散對數正態(tài)分子鐘和常數種群數量模型。最終數據分析包括5，000, 000-30, 000, 000代的MCMC鏈長，其中每1000個形態(tài)進行取樣。彩色框表示不同呼腸孤病毒屬或物種的代表。綠色，水生呼腸孤病毒屬；藍色，物種I (哺乳動物正呼腸孤病毒)；紅色，物種II (鳥類正呼腸孤病毒)；紫色，物種III (納爾遜海灣正呼腸孤病毒);橙色，物種IV(爬行動物正呼腸孤病毒)和淡藍色，物種V (狒狒正呼腸孤病毒)。
圖13 :S1的推定ORF具有與FAST蛋白類似的特性。利用TopPred程序(可從 http://mobyle. pasteur fr/cgibin/portal. py form = toppred 獲取)中進行的Kyle-Doolittle算法獲取ARV (紅色)和PRV (藍色)的疏水性圖。序列分析表明PRV包含F(xiàn)AST蛋白質的主要組分疏水區(qū)(HP)、跨膜區(qū)(TM)和堿性區(qū)(BR)。圖14 =PRV感染的病理學可包括肝臟變色、心包積血、脂肪組織充血和脾腫大。圖15 :焦磷酸測序覆蓋度。圖16 :PRV、正呼腸孤病毒和水生呼腸孤病毒的系統(tǒng)發(fā)生分析。圖17 =HSMI診斷，診斷表明HSMI不僅浸潤心外膜而且還引發(fā)了嚴重的心肌炎癥。圖18 :產生針對σ I、σ 3和μ IC的抗體的方法。圖18Α示出外衣殼蛋白σ I、σ 3、λ 2、μ Ic和內衣殼蛋白λ I、σ 2、μ 2和λ 3。圖18Β示出由PCR擴增的σ I、σ 3和μ IC全長片段。圖18C示出擴增的片段可被克隆入表達載體中以產生表達構建體。所述表達可 用于在表達體系中表達抗原(如大腸肝菌)。所述抗原接著可被純化并用于對兔進行免疫。圖19 :肽抗原。圖19Α示出由S4編碼的FAST (融合相關的小跨膜蛋白)。圖19B示出抗原性指數根據氨基酸位置的變化?？乖灾笖翟礁撸贵w就更可能“看到”殘基的那些基團。圖20 :抗血清識別出正如在大腸肝菌組氨酸標簽融合蛋白的免疫印跡中所發(fā)現(xiàn)的μ IC蛋白。泳道11-13是純化蛋白的洗脫液，泳道14-15是被誘導細菌沉淀的稀釋液，泳道16-17是未誘導的細菌沉淀。圖21 :抗血清識別出了正如在大腸肝菌組氨酸標簽融合蛋白和不同的陰性對照物的免疫印跡中所發(fā)現(xiàn)的σ2蛋白。泳道2-4是純化蛋白的洗脫液，泳道5-6是被誘導細菌沉淀的稀釋液，泳道7-泳道8是未誘導的細菌沉淀。圖22:PRV 圖解。發(fā)明詳述除非上下文中另外清楚地指明，否則單數形式“一個”、“一種”和“所述”包括復數個提及物。本文使用的術語“約”指近似、接近、大致或大約。術語“約”與數值范圍連用時，其通過將界限擴展至高于和低于所列數值而修飾此范圍。通常，本文使用的術語“約”是修飾所述數值以20%上下變動的數值。本文使用的“PRV”指的是文中所述的魚呼腸孤病毒的分離菌株。本文使用的術語“動物”指的是脊椎動物，包括但不限于硬骨魚(如鮭魚)本文使用的術語“PRV”多肽包括PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽變體或基本上與PRV多肽同一的肽。本文使用的術語“抗體”指的是與PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽變體或基本上與PRV多肽同一的肽相結合并抑制、中和或降低PRV多肽或PRV活性或功能的抗體。術語抗體尤其不包括與PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽變體或基本上與PRV多肽同一的肽相結合并且不抑制、中和或降低所述肽或所述PRV活性或功能的診斷用抗體。海水養(yǎng)殖，即在海水環(huán)境中進行水產養(yǎng)殖，日益成為人類消費的膳食蛋白的重要來源。HSMI是在魚從淡水轉移至海水圍欄后5-9個月出現(xiàn)(Kongtorp等，J Fish Dis 27，351-358(2004))，但紀錄的最早爆發(fā)的時間是轉移至海水后的14天。受感染的魚食欲不振并表現(xiàn)出游水姿勢反常。剖檢結果通常包括心臟顏色蒼白、肝臟發(fā)黃、腹水、脾腫大以及內臟周圍有瘀斑。病理學的進一步的特征是心包炎、心內膜炎、心肌炎、心肌壞死、肌炎和紅色骨骼肌壞死，死亡率高達 20% (Kongtorp 等,Dis Aquat Organ 59, 217-224 (2004)) 雖然死亡率是可變的(高達20%)，但在受感染的網箱中，發(fā)病率可能極高。HSMI是基于組織病理學作出的診斷。主要的病變發(fā)生在心肌和紅色骨骼肌，其中大面積發(fā)炎和肌細胞的多灶性壞死明顯。可以通過實驗注射來自患HSMI病的魚的組織勻漿或將魚與患有HSMI的魚共居(Kongtorp等，J Fish Dis 27，351-358 (2004))來在首次用于實驗的魚中誘發(fā)疾病。已經觀察到病毒樣顆粒(Watanabe, K.等，Dis Aquat 0rgan70,183-192 (2006));然而，通過利用培養(yǎng)、消減克隆和共有聚合酶鏈式反應來找出傳染原的努力也以失敗告終。在一方面，本發(fā)明表明HSMI與感染有稱為魚呼腸孤病毒(PRV)的新型呼腸孤病毒有關。利用新型頻率分析方法及標準比對方法對通過實驗方法感染的魚的血清和心臟組織進行高通量焦磷酸測序，從而鑒定出PRV。在另一方面，本發(fā)明提供了 PRV核酸序列。在其它方面，本發(fā)明涉及表達構建體(例如質粒和載體)和分離的核酸，所述分離的核酸包含SEQ ID NO 1-10的PRV核酸序列、其片段、互補序列和/或變體。文中所述核酸序列和多肽可用于多種應用，包括但不限于制備抗體和產生免疫原性組合物。例如，在一方面，本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，其包含由SEQ ID NO :1-10中任何一個的PRV核酸序列所編碼的多肽。在另一方面，本發(fā)明涉及一種免疫原性組合物，其包含多肽，所述多肽包含SEQ IDNO 29-40中任何一個的氨基酸序列。在一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV核酸或其片段，所述分離的PRV核酸具有SEQ ID NO :1-10中任何一個的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV核酸或其片段，所述分離的PRV核酸包含連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸具有選自由SEQ ID NO 1-10中任何一個組成的組的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV核酸或其片段，其包含連續(xù)核苷酸，所述核苷酸具有選自由SEQ ID NO :1-10中任何一個的變體組成的組的序列。在一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :1-10或其片段具有至少約85%的同一性。在本發(fā)明上述方面的一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :1-10中任何一個的變體或其片段具有至少約90%,95. 5%、約 96%、約 96. 5%、約 97%、約97. 5%、約 98%、約 98. 5%、約99%、約 99. 5%或約99. 9%的同一性。在一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV核酸或其片段，所述分離的PRV核酸與SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列互補。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV核酸或其片段，其包含連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸與SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列互補。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV核酸或其片段，其包含連續(xù)核苷酸，所述連續(xù)核苷酸與SEQ ID NO :1-10中任何一個中的PRV核酸序列互補。在一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :1-10或其片段具有至少約85%的同一性。在本發(fā)明的上述方面的一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :1-10中任何 一個的變體或其片段具有至少約90%,95. 5%、約96%、約 96. 5%、約 97%、約 97. 5%、約 98%、約 98. 5%、約99%、約 99. 5%或約99. 9%的同一性。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV核酸或其片段，所述分離的PRV核酸具有與SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列基本上同一的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV核酸或其片段，所述分離的PRV核酸具有這樣的序列，其與和SEQ ID NO :1-10中任何一個中的PRV核酸序列互補的序列基本上同 一。本文中所述PRV核酸序列可尤其用于PRV編碼蛋白質或其片段、變體或衍生物的表達、產生針對PRV蛋白質的抗體、產生針對魚呼腸孤病毒的疫苗以及篩選有效針對本文中所述的魚呼腸孤病毒的藥物。
在一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV多肽或其片段，所述分離的PRV多肽由SEQ ID NO 1-10中的任何一個中的PRV核酸序列編碼。在一個實施方案中，所述PRV多肽片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大約8個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大約10個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大約14個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大約16個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大約18個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大約20個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含本文中所述PRV多肽的大約21個或更多個連續(xù)氨基酸的多肽。在又一個實施方案中，所述PRV多肽片段可以是包含約8至約50、約8至約100、約8至約200、約8至約300、約8至約400、約8至約500、約8至約600、約8至約700、約8至約800、約8至約900或更多個PRV多肽的連續(xù)氨基酸的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了一種由核酸編碼的分離的PRV多肽或其片段，所述核酸包含具有選自SEQ ID NO :1-10中任何一個中的PRV核酸序列的序列的連續(xù)核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了一種由核酸編碼的分離PRV多肽，所述核酸包含連續(xù)核苷酸，所述核苷酸具有選自SEQ ID NO :1-10中任何一個中的PRV核酸序列的變體或其片段的序列。在一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :1-10或其片段具有至少約85%的同一性。在本發(fā)明上述方面的一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :1-10中任何一個的變體或其片段具有至少約90%、約95. 5%、約96%、約96. 5%、約97%、約97. 5%、約98%、約98. 5%、約99%、約99. 5%或約99. 9%的同一性。在一方面，本發(fā)明提供了一種由核酸編碼的分離的PRV多肽或其片段，所述核酸與SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列互補。在另一方面，本發(fā)明提供了一種由核酸編碼的分離的PRV多肽或其片段，所述核酸包含SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列的連續(xù)核苷酸。在另一方面，本發(fā)明提供了一種由核酸編碼的分離的PRV多肽或其片段，所述核酸具有與SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列基本上同一的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了一種由核酸編碼的分離的PRV多肽或其片段，所述核酸具有這樣的序列，其與和SEQ ID NO :1-10中任何一個中的PRV核酸序列互補的序列基本上同一。
在一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV多肽或其片段，所述分離的PRV多肽具有SEQ ID NO :29-40中任何一個的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV多肽或其片段，所述分離的PRV多肽包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸具有選自由SEQ ID NO 29-40中任何一個所組成的組的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離PRV多肽或其片段，所述分離PRV多肽包含連續(xù)氨基酸，所述氨基酸具有選自SEQ ID NO :29-40中任何一個的變體的序列。在一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :29-40或其片段具有至少約85%的同一性。在本發(fā)明上述方面的一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :1-10中任何一個的變體或其片段具有至少約 90%、約 95. 5%、約 96%、約 96. 5%、約 97%、約 97. 5%、約 98%、約 98. 5%、約 99%、約99. 5%或約99. 9%的同一性。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離PRV多肽或其片段，所述分離PRV多肽具有與SEQ ID NO :29-40中任何一個中的PRV氨基酸基本上同一的序列。
文中所述PRV多肽和氨基酸序列尤其可用于表達PRV編碼蛋白質或其片段、變體或衍生物的表達以及產生針對魚呼腸孤病毒的疫苗。在一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV多肽或其片段，所述分離的PRV多肽由SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列片段編碼。在一個實施方案中，所述分離的PRV多肽片段可以包含SEQ ID NO 29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的大約8個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO :29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的大約10個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO 29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的大約14個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO:29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的大約16個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO 29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的大約18個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO :29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的大約20個連續(xù)氨基酸的多肽。在又一個實施方案中，所述片段可以是包含SEQ ID NO 29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的大約21個或更多個連續(xù)氨基酸的多肽。在另一個實施方案中，所述分離的PRV多肽片段可以是包含約8至約50、約8至約100、約8至約200、約8至約300、約8至約400、約8至約500、約8至約600、約8至約700、約8至約800、約8至約900或更多個SEQ ID NO :29-40中任何一個的PRV氨基酸序
列的連續(xù)氨基酸的多肽。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV多肽，所述分離的PRV多肽包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸具有選自SEQ ID NO :29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的序列。在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV多肽或其片段，所述分離的PRV多肽包含連續(xù)氨基酸，所述連續(xù)氨基酸具有選自SEQ ID NO :29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的變體的序列。在一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO :29-40中任何一個或其片段具有至少約85%的同一性。在本發(fā)明上述方面的一個實施方案中，所述變體與SEQ ID NO 29-40中任何一個或其片段具有至少約90%、約95. 5%、約96%、約96. 5%、約97%、約97. 5%、約98%、約98. 5%、約99%、約99. 5%或約99. 9%的同一性。
在另一方面，本發(fā)明提供了一種分離的PRV多肽其片段，所述分離PRV多肽與SEQID NO 29-40中任何一個的PRV氨基酸序列的變體基本上同一。在兩個核酸或多肽的情況中的“基本上同一”指的是如使用下列序列比較算法的一種或通過肉眼檢驗，當比較和比對最大一致時，兩個或更多個具有至少98 %、至少99 %或更高核苷酸或氨基酸殘基同一性的序列或子序列。因此，在某些實施方案中，與本文中所述PRV多肽基本上同一的多肽也可以用來產生與本文中所述PRV多肽結合的抗體。在兩個或多個核酸或多肽情況中的“同一性百分比”指的是兩個或更多個序列或子序列包含的相同核苷酸或氨基酸的百分比。使用下列序列比較算法的一種或通過人工比對或肉眼檢驗在比較窗口比較和比對最大相似性時，指定的氨基酸殘基或核苷酸百分比可具有超過指定區(qū)域的指定同一性。一方面，本發(fā)明提供了一種PRV多肽，所述PRV多肽為PRV 多肽變體并與SEQ ID NO 29-40所示的PRV多肽具有至少約90%、約95. 5%、約96%、約96. 5%、約 97%、約 97. 5%、約 98%、約 98. 5%、約 99%、約 99. 5%或約 99. 9%的同一性。應理解，對于此處所述的特定PRV多肽，自然變化可存在于單個PRV菌株之間。這些變化可體現(xiàn)在整體序列中的氨基酸差異或所述序列中氨基酸的缺失、取代、插入、倒位或添加。Neurath 等在"The Proteins " Academic Press New York (1979)中描述了氨基酸取代本質上并不改變生物和免疫活性。此外，在相關15個氨基酸間的氨基酸替換或在進化中頻繁發(fā)生的替換還有 Ser/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、Asp/Asn、Ile/Val (參見 Dayhof,M. D.,Atlas of protein sequence and structure,Nat. Biomed. Res. Found. ,Washington D. C.,1978, vol. 5, suppl. 3)。其它 20 種氨基酸取代包括 Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn,、Ala/Val、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Leu/Ile、Leu/Val 和 Ala/Glu?；诖诵畔?Lipman和Pearson開發(fā)了一種快速靈敏的蛋白質比較(Science, 227,1435-1441,1985)和確定同源蛋白質間功能相似性的方法。只要所產生的蛋白質保持有其免疫反應性，本發(fā)明的示例性實施方案的這些氨基本取代以及具有缺失和/或插入的變化都屬于本發(fā)明的范圍。已知，與參考多肽相比，具有一個或更多個氨基酸序列變化的多肽序列仍可用于產生與所述參考多肽相結合的抗體。因此，在某些實施方案中，PRV多肽及與其有關的抗體和抗體產生方法涵蓋了從具有至少約90%的序列同一性水平的不同病毒分離物中分離出的PRV多肽，同時還代表具有相同免疫原性特性的相同PRV蛋白。所述序列同一性可以通過序列比較算法的分析或通過肉眼檢驗來確定。可以用本領域已知的多種序列比較算法和程序中的任一種評估蛋白質和/或核酸序列同一性(同源性)。對于序列比較，一般是一個序列作為參考序列，測試序列與參考序列相比較。當用序列比較算法時，將測試序列和參考序列輸入電腦，如有必要，指定子序列坐標，并指定序列算法程序參數。可使用默認程序參數，或者指定可選參數。然后基于程序參數，序列比較算法計算測試序列相對于參考序列的序列同一性百分比。對于核酸和蛋白質的序列比較，可以使用BLAST和BLAST 2. 2. 2.或FASTA 3. 0t78版本的算法和下面討論的缺省參數。適用于確定序列同一性和序列相似性的算法的一個實例是FASTA算法，這在Pearson, ff. R.和 Lipman, D. J.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85 :2444,1988 進行了描述。也可參看 W. R. Pearson, Methods EnzymoI. 266 :227-258,1996。對用在 DNA 序列的 FASTA比對中來計算同一性百分比的示例性參數進行了優(yōu)化，BL50矩陣15:-5，k-tuple = 2 ;歸并罰分(joining penalty) = 40,最優(yōu)化參數(optimization) = 28 ;空位罰分-12,空位長度罰分=-2 ;以及寬度=16。適用于確定序列同一性百分比和序列相似性的算法的另一個實例是BLAST和BLAST 2. O 算法，其在 Altschul 等，Nuc. Acids Res. 25 =3389-3402,1977 ;和 Altschul 等，J. Mol. Biol. 215 =403-410,1990中分別進行了描述。用本文中所述的參數，利用BLAST和BLAST 2. O確定本發(fā)明的核酸和蛋白質的序列同一性百分比。執(zhí)行BLAST分析的軟件可以從公開地從美國國家生物技術信息中心獲取(National Center for BiotechnologyInformation) (http://www ncbi. nlm. nih. gov/)。BLAST 算法參數 W、T 和 X 決定了比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用的默認值為單詞長度(W)ll，期望值
(E)10, M= 5, N = -4和兩條鏈的比較。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用的默認值為單詞長度 3，期望值(E)IO 以及 BL0SUM62 打分矩陣(參見 Henikoff & Henikoff, Proc. Natl.Acad. Sci. U. S. A. 89 :10915，1989)比對(B) 50，期望值(E) 10，M = 5, N = -4，以及兩條鏈的比較。
BLAST算法也可以執(zhí)行兩個序列間相似性的統(tǒng)計分析(參見例如Kar I in &Altschul,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 :5873-5787,1993)。BLAST 算法提供的一種相似性方法是最小總和概率(P (N))，它提供概率的指示，通過所述概率的指示兩個核苷酸或氨基酸序列就有機會匹配。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中，最小總和概率小于約O. 2、小于約O. 01以及小于約O. 001，就認為核酸與參考序列相似。另一個可用算法的實例是PILEUP。PILEUP利用漸進雙序列比對從一組相關序列中建立多序列比對，以顯示序列關系和序列同一性百分比。它也描繪出顯示用來建立比對的聚類關系的樹狀圖或系統(tǒng)樹圖。PILEUP使用了 Feng & Doolittle J. Mol. Evol. 35 351-360，1987 的簡化漸進比對法。所用方法與 Higgins & Sharp, CABIOS 5:151-153,1989中所描述的方法相似。所述程序可比對多達300個序列，每個序列最大長度為5000個核苷酸或氨基酸。多重比對程序從兩個最相似序列的雙比對開始，產生一個雙配對序列的聚類。這個聚類然后與下一個最相關序列或聯(lián)配序列聚類進行比對。通過兩單個序列的雙比對的簡單延伸來比對兩個序列聚類。通過一系列的漸進雙比對實現(xiàn)最終比對。通過指定序列比較區(qū)域的特定序列及其氨基酸或核苷酸相配物或指定所述程序參數來運行所述程序。使用PILEUP，利用下列參數來比較參考序列與其它測試序列從而確定序列同一性百分比關系缺省空位權重(3. 00)、缺省空位長度權重(O. 10)和加權端空位?？梢詮腉CG序列分析軟件包如 7. O 版本(Devereaux 等，Nuc. Acids Res. 12 :387-395,1984)獲取 PILEUP。適用于多個DNA和氨基酸序列比對的算法的又一個實例是CLUSTALW程序(Thompson, J. D.等，Nucl. Acids. Res. 22 :4673-4680,1994)。ClustalW 執(zhí)行序列組間多個雙序列比較，并基于同源性將它們裝配到多重比對中?？瘴黄鹗剂P分和空位延長罰分分別為10和0.05。對于氨基酸比對，BLOSUM算法可用作蛋白質權重矩陣(Henikoff和Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 :10915-10919,1992)。在又一方面，本發(fā)明提供了一種計算機可讀介質，所述介質上儲存有(i)選自由以下組成的組的核酸序列SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列、與SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列基本上同一的序列、SEQ ID NO 1-10中任何一個中的PRV核酸序列的序列變體；或(ii)核酸序列編碼的氨基酸序列，所述核酸序列選自由以下組成的組SEQ ID NO :1-10中任何一個中的PRV核酸序列、與SEQ ID N0:l_10中任何一個中的PRV核酸序列基本上同一的序列所編碼的氨基酸序列、SEQ ID NO :1-10中任何一個中的PRV核酸序列的序列變體所編碼的氨基酸序列。本文中所述多肽可用于生成抗體(例如用于免疫接種)。在一方面，本發(fā)明提供了一種抗體，所述抗體與PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽變體或基本上與PRV多肽同一的多肽相結合，其中所述抗體為抑制、中和或降低所述多肽或PRV活性或功能的疫苗抗體。在一些實施方案中，所述抗體為多克隆抗體、單克隆抗體、硬骨魚抗體或嵌合抗體。從硬骨魚純化免疫球蛋白類的方法也在本領域已知。參見,例如,參見Havarstein等，Dev CompImmunol 1988，12(4) :773-85 ;Al_Harbi 等，Bull Eur Ass Fish Pathol 1993,13 :40-4 ；Itami 等，Nippon Suisan Gakkaishi 1988,54(9) :1611-7。在另一方面，本發(fā)明提供了一種PRV免疫原組合物，所述免疫組合物包含RPV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽變體或與PRV多肽基本上同一的多肽。 本文中所用的術語“免疫原性多肽”指的是能夠誘導脊椎動物宿主(如硬骨魚)體內免疫反應的PRV多肽或PRV多肽片段。術語“免疫原性多肽”也指PRV多肽或PRV多肽片段，其可用于利用其它本領域已知的抗體產生技術來產生針對PRV多肽或PRV多肽片段的抗體，所述抗體產生技術包括但不限于雜交瘤細胞、噬菌體展示和核糖體展示技術。在另一方面，本發(fā)明提供了一種PRV疫苗組合物，所述疫苗組合物包含PRV核酸、PRV核酸片段或PRV核酸變體、與PRV核酸基本上同一的核酸、PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽變體或與PRV多肽基本上同一的多肽。當多肽用于生成抗體時，本領域的技術人員將了解不必使用完整多肽來產生可識別全長多肽的抗體。在某些方面，本發(fā)明涉及通過產生與本文中所述多肽的片段相結合的抗體來生成與本文中所述PRV多肽相結合的抗體的方法。因此，在一方面，本發(fā)明涉及用于對抗PRV感染的疫苗，所述疫苗包含蛋白質或PRV多肽的免疫原性片段。本發(fā)明的又一個實施方案涉及在疫苗中使用的本文中所述的PRV蛋白質或其免疫原性片段。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及本文中所述的PRV蛋白質或其免疫原性片段用于生產用于對抗PRV感染的疫苗的用途。在一個實施方案中，本文中所述PRV免疫原性組合物和PRV疫苗能夠改善PRV感染的癥狀和/或減少PRV感染的持續(xù)時間。在另一個實施方案中，所述免疫原性組合物能夠誘導針對PRV感染的保護性免疫。本發(fā)明的所述免疫原性組合物可以有效地針對本文中所公開的PRV，也可以與PRV的多個不同進化枝和菌株交叉反應并有效針對所述進化枝和菌株以及其它呼腸孤病毒。在另一方面，本發(fā)明提供了核酸載體，其包含PRV核酸序列、PRV核酸片段或PRV核酸變體或與PRV核酸基本上同一的核酸。在另一方面，本發(fā)明提供了一種核酸載體，所述核酸載體編碼PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽變體或大體上與PRV多肽完全相同的多肽。載體的非限制性實例包括但不限于逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、慢病毒和泡狀口腔炎病毒載體。在又一方面，本發(fā)明提供了一種宿主生物體，所述宿主生物體包含核酸載體，所述核酸載體編碼PRV多肽、PRV多肽片段或PRV多肽變體或與PRV多肽基本上同一的多肽。在一個實施方案中，所述宿主生物體為原核生物、真核生物或真菌。在另一個實施方案中，所述宿主生物體為硬骨魚(如鮭魚)。在又一方面，本發(fā)明提供了一種誘導動物體內(如鮭魚)免疫反應的方法，所述方法包括對動物施用給所述動物服用PRV核酸、PRV多肽或PRV免疫原性組合物。對動物(如硬骨魚)施用多肽的方法和通過施用免疫原性有效量的免疫原性肽在動物體內產生免疫反應的方法在本領域中是已知的。硬骨魚缺少骨髓或淋巴液且B細胞淋巴液生成發(fā)生在前腎(前腎)和脾臟。對于硬骨魚體內免疫前變化和抗體生成的綜述,請參見Solem和Stenvik, Developmental andComparative Immunology 30(2006)57-76)。哺乳動物的血液循環(huán)中存在幾種免疫球蛋白(如IgG、IgE和IgA等)，而與哺乳動物不同，結構異質IgM四聚體是硬骨魚體內主要的免疫球蛋白(Warr G. W. (1995) !Developmental and Comparative Immunology, 19,1-12 ；Koumansvandiepen 等，(1995)Developmental and Comparative Immunology,19,97-108 ； Kaattari 等，1998. Immunol. Rev. 166 133-142 ；Evans 等，1998. J. Theor. Biol. 195 505-524)。在硬骨魚中也識別出了 IgD、IgZ、IgT和IgH免疫球蛋白(Hordvik等，(1999)Scandinavian Journal of Immunology,50,202-2101 ;Hirono等，(2003)Fish & ShellfishImmunology, 15,63-70 ;Danilova 等，(2000) Immunogenetics, 52,81-91 ;Hansen 等，(1994)Molecular Immunology,31,499-501 ;Savan等，(2005)European Journal of Immunology,35,3320-333)。本文中所述多肽可以PRV免疫原性組合物的形式根據本領域所已知的任一種方法給動物(如硬骨魚)接種疫苗。參見，例如Veseley等，Veterinarni Medicina, 51,2006(5) :296-302 ；Engelbrecht 等，Acta Vet Scand 1997，38 (3) :275-82 ；Ingram 等，JFish Biol 1979，14(3) :249_60。用于疫苗接種的免疫原性組合物也可以包含減毒活疫苗、非活性(滅活)疫苗和亞單位疫苗。在某些實施方案中，可通過以下方式對PRV進行減毒，去除或破壞產物會導致或促成與PRV感染有關的疾病和癥狀的病毒序列，并且使病毒復制所需的那些序列保留完整。用這種方式可以產生在動物體內復制的減毒PRV，并且誘導動物體內免疫反應，但是這種方法并不能誘導通常與PRV感染相關的有害疾病和癥狀。為了生成適宜于用作疫苗的減毒PRV，本領域中的技術人員可以確定哪些PRV序列可以或應該去除或破壞，哪些序列應該保留完整。PRV疫苗也可以包含非活性PRV，如通過化學處理來“滅活”這樣的病毒，從而這病毒就不能夠再在動物體內復制或引發(fā)疾病，然而，仍可以誘導動物(如鮭魚)體內免疫反應。本領域中有很多已知的適宜的病毒滅活方法，并且本領域中的技術人員可以很容易地選擇合適的方法并制備適于用作疫苗的非活性“滅活” PRV。多肽和滅活病毒的純化方法在本領域內是已知的并且可包括例如梯度離心、超速離心法、連續(xù)流超速離心和層析法，諸如離子交換層析法、尺寸排阻層析法和親和層析法中的一種或多種。其它純化方法包括超濾和超細過濾。參見J P Gregersen" Herstellungvon Virussimpfstoffen aus Zellkulturen " Pharmazeutische Biotechnology 中的章節(jié) 4. 2(0. Kayser 和 R H Mueller 編)Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft,Stuttgart, 2000.也參見 O ' Neil 等，"Virus Harvesting and Affinity BasedLiquid Chromatography. A Method for Virus Concentration and Purification ",Biotechnology (1993) 11 :173-177 ;Prior 等，"Process Development for Manufactureof Inactivated HIV-I " , Pharmaceutical Technology(1995)30-52 ；和 Majhdi等，"Isolation and Characterization of a Coronavirus from Elk Calves withdiarrhea" Journal of Clinical Microbiology(1995)35(11) :2937_2942。適用于本發(fā)明使用的純化方法的其它實例包括聚乙二醇或硫酸銨沉淀法(參見 Trepanier 等， "Concentration of human respiratory syncytial virus usingammonium sulfate,polyethylene glycol or hollow fiber ultrafiltration" Journalof Virological Methods (1981)3(4) :201-211 ;Hagen 等， "Optimization ofPoly (ethylene glycol)Precipitation of Hepatitis Virus Used to prepare VAQTA, aHighly Purified Inactivated Vaccine" Biotechnology Progress(1996) 12 :406-412 ;和 Carlsson 等， "Purification of Infectious Pancreatic Necrosis Virus byAnion Exchange Chromatography Increases the Specific Infectivity " Journalof Virological Methods (1994) 47 :27-36)以及超濾和微細過濾(參見 Pay 等，Developments in Biological Standardization (1985) 60 :171-174 ；Tsurumi等， "Structure andfiltration performances of improved cuprammoniumregenerated cellulose hoilow fiber(improved BMM hoilow fiber)for virusremoval" Polymer Journal (1990)22(12) :1085-1100 ;和 Makino 等，"Concentration of live retrovirus with a regenerated cellulose hollow fiber,BMM;/ ,Archives ofVirology (1994) 139(1-2) :87-96.)。多肽和病毒可以用層析法純化，如離子交換層析。層析純化法產生大量含病毒懸浮液。目標病毒產物可通過簡單的吸附/解吸附機制與層析介質相互作用，并且可以在單負載中加工大量樣本。使對吸附劑不具親和力的致污物經過柱。然后可以濃縮的形式洗提病毒物質?？梢允褂玫年庪x子交換樹脂包括DEAE、EMD TMAE。陽離子交換樹脂可包含硫酸改性的表面?？梢杂秒x子交換層析純化病毒，所述離子交換層析包含第一步的強陰離子交換樹脂(如EMD TMAE)和第二步的EMD-S03(陽離子交換樹脂)?？蛇x地，進一步純化可包括金屬結合親合層析步驟(參見如WO 97/06243)。也可以使用諸如Fractogel EMD的樹脂。這種合成甲基丙烯酸樹脂具有共價連接的長線型聚合物鏈，并允許有大量的空間可及配體用于結合生物分子而不會有任何位阻?；谥囊后w親和層析是另一種可以用在本發(fā)明中的純化方法。用于純化方法中的樹脂的一個實例是Matrex Cellufine Sulfate (MCS)。MCS由排阻限為3，000道爾頓(它的孔結構不包括高分子)的硬球形(直徑大約45-105 μ m)纖維素基質組成，纖維素的6位上有低濃度硫酸酯官能度。由于功能配體(硫酸酯)相對高度彌散，它的陽離子電荷密度不足，使得最可溶性蛋白質被吸收到小珠表面。因此在一般病毒池(細胞培養(yǎng)物上清液，如焦精和最臟蛋白質以及核酸和內毒素)中發(fā)現(xiàn)大量的蛋白質從柱上被沖洗掉，實現(xiàn)結合病毒的一定程度的純化。滅活病毒可用梯度離心或密度梯度離心進一步純化。對于工業(yè)規(guī)模操作，可以選用連續(xù)流蔗糖梯度離心。這種方法可以用來純化抗病毒疫苗，并且對于本領域的技術人員是已知的?？捎糜诩兓景l(fā)明病毒的其它純化方法包括使用核酸降解劑、核酸降解酶，如具有脫氧核糖核酸酶(DNase)和核糖核酸酶(RNase)活性的核酸酶或核酸內切酶，諸如來自靈桿菌、帶陰離子官能團或用陰離子官能團(如DEAE或TMAE)進行附加層析法步驟的膜吸附劑。超濾/超細過濾和最終的無菌過濾步驟也可加入到純化方法。本文中所述的純化免疫制劑可基本上消除來自細胞或細胞培養(yǎng)午的污染蛋白質，并可包含少于約1000、500、250、150、100或50 8的細胞核酸/^8病毒抗原和少于約1000、500、250、150、100或50pg的細胞核酸/劑。在一方面，給動物接種疫苗可通過直接將所述PRV多肽、其片段或變體注射到動物體內從而產生免疫原性應答來進行。在某些實施方案中，PRV多肽可以單獨注射或作為包含其它組分(例如賦形劑、添加劑或佐劑的免疫原性PRV組合物進行注射。 為了產生本文中所述的免疫原性制劑，可以例如通過用含有PRV核酸序列的質?；虮磉_載體去轉染培養(yǎng)的細胞或通過用含有PRV核酸序列的重組病毒去感染培養(yǎng)的細胞來將本發(fā)明的PRV核酸序列遞送至培養(yǎng)的細胞中。然后PRV多肽可以在宿主細胞或表達體系中表達并純化。宿主細胞可以是細菌來源的細胞，如大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)和乳桿菌(Lactobacillus)屬，與細菌基質粒組合作為PBR322,或與細菌表達載體結合作為pGEX，或與噬菌體組合。宿主細胞也可是真核來源的細胞，如與酵母特異性載體分子結合的酵母細胞或與載體或重組桿狀病毒結合的高等真核細胞比如昆蟲細胞(Luckow等；Bio-technology 6 :47-55 (1988))、與如Ti質?；d體或植物病毒載體組合的植物細胞(Barton，K.A.等；Cell32 :1033 (1983))、哺乳動物細胞如希拉細胞(Hela cell)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)或貓腎傳代細胞系，也與適當的載體或重組病毒組合?？梢杂皿w外表達系統(tǒng)(如體外轉錄和體外翻譯系統(tǒng))產生本文所述RPV多肽。然后將純化的蛋白質并入適于施用于動物的組合物中。重組蛋白的表達和純化方法和技術在本領域內已眾所周知，而且可以使用任何這類合適的方法。也可以用編碼PRV多肽的DNA直接接種來進行接種。當使用這樣的疫苗時，將核酸施用于動物，并且由核酸編碼的免疫原性多肽在動物體內表達，從而在動物體內產生針對蛋白質或多肽的免疫反應。亞單位疫苗也可以是蛋白質疫苗，其包含病毒蛋白或亞單位本身或那些蛋白質或亞單位的部分?？梢允褂萌魏慰沈寗佣嚯谋磉_的適用質?；虮磉_載體。質粒和表達載體可包含指導核酸轉錄的啟動子。編碼PRV多肽的核酸序列也可以并入合適的重組病毒用于施用于動物。合適的病毒的例子包括但不限于牛痘病毒、逆轉錄酶病毒、腺病毒和腺相關病毒。本領域中的技術人員將能夠選擇合適的質粒、表達載體或重組病毒用于遞送本發(fā)明的PRV核酸序列。用編碼蛋白質的DNA直接接種已經在許多不同的蛋白質中取得了成功(例如在 Donnelly 等· The Immunologist 2:20-26(1993)中所綜述)。也可以使用能夠表達本文中所述多肽的活重組載體進行使用本文中所述的PRV核酸和多肽的接種?；钪亟M載體是微生物或病毒，其中更多的遺傳信息，如編碼PRV多肽或其片段的核酸序列已經被克隆。感染了此類活重組載體的魚不僅會產生針對載體的免疫原的免疫反應而且也會產生針對PRV多肽或PRV多肽片段的免疫反應。適用于本文中所述方法的活重組載體的非限制性實例包括鰻弧菌(Vibrio anguiIlarum) (Singer, J. T等.NewDevelopments in Marine Biotechnology,p. 303-306,Eds. Le Gal and Halvorson，PlenumPress, New York, 1998)和 α 病毒載體(Sondra Schlesinger and Thomas W. DubenskyJr. Alphavirus vectors for gene expression and vaccines. Current opinion inBiotechnology,10 :434439(1999))。
或者，可通過在對第二個動物物種(例如硬骨魚)施用這類抗體(以純化或非純化的形式)之前，由抗體產生細胞系或的體外技術在第一個動物物種(例如兔)中產生PRV抗體來進行被動接種。當第二種動物已經感染了 PRV，可用使用這種被動接種。在有些情況下，當第二種動物體內的感染不能或已經沒有足夠時間對感染建立免疫反應時，被動接種是有效的。許多用于對硬骨魚接種的分方法在本領域是已知的。例如，可以通過注射、浸泡、浸潰或通過口服施用來進行用本文中所述的PRV核酸和多肽的接種?？筛鶕藴式臃N實踐優(yōu)化施用方案。對于硬骨魚的口服接種，可以將本文中所述的PRV核酸、多肽或免疫原性組合物混入飼料、涂在飼料上或以膠囊的形式施用。在某些實施方案中，進行疫苗接種的方式是在給動物(如鮭魚)喂食前，在PRV疫苗懸浮液中培養(yǎng)鹵蟲無節(jié)幼體(Artemia nauplii)、燒 足(copepod)或輪蟲(rotifer)等活飼料,這樣攝取活飼料就會造成PRV疫苗在經受疫苗接種的動物的消化道內積累。本領域的技術人員將理解這些施用方法可能會使抗原分解或變性，因此熟練的技術人員要確保接種方法適用于所選抗原。在口服接種的情況下，疫苗也可以與一種或多種載體混合。適于口服接種的載體包括可代謝和不可代謝物質。也可通過浸泡方案進行骨魚的疫苗接種。魚類中的表皮和鰓上皮細胞具有通過吸附抗原而有助于識別病原體的黏膜表面。順序吸附引起抗體產生細胞活化而成為免疫反應的一部分。因此在一個實施方案中，用本文中所述的多肽給魚類接種可以通過將魚浸泡在含有PRV疫苗組合物的水中來進行。可使用至少兩種浸泡接種方式與本文中所述的多肽結合。在浸潰接種中，魚被短時間(如約30秒)浸泡在包含濃縮疫苗溶液的水中(如I份疫苗，9份水)。在浸浴接種中，浸泡在含有低濃度疫苗的水中的時間更長一些(如幾小時)。本領域的技術人員會很容易地確定在浸泡方案中足以誘導免疫反應的PRV疫苗的稀釋濃度和浸泡持續(xù)的時間。用本文中所述的PRV核酸和多肽對硬骨魚接種的另一種方法是通過注射接種。在注射接種中，疫苗被注射入魚的腹腔。盡管本領域的技術人員能夠輕易地確定合適的注射點，但鮭魚中的一般針插入部位是在腹部的中線，即腹鰭底部前一個腹鰭長的位置。在某些實施方案中，PRV核酸、多肽或免疫原性組合物可以在增強和/或延長免疫反應的油乳劑或其它佐劑或添加劑中遞送到魚的體腔中。除了腹腔內注射接種之外，注射接種還可以通過肌肉內注射來進行。本領域中的技術人員將了解操作不當和針插入不當可引起魚的死亡，并且因此在接種過程中可以使用淺麻醉來降低對動物的應力和機械損傷。熟練的技術人員也會了解具有恰當長度和厚度的針頭對確保恰當接種是很重要的，還同時避免由于感染、驗證或組織損傷所造成的繼發(fā)并發(fā)癥。也可以使用合適的推進劑如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適氣體，從加壓包或噴霧器以氣霧劑的形式遞送本文中所述PRV核酸、多肽或免疫原性組合物。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可以通過裝設閥門來遞送計量的量來確定。也可配制含有所述化合物和適當的粉末基料(如乳糖或淀粉)的粉末混合物的膠囊和藥盒?？梢匀魏巫阋约ぐl(fā)動物體內免疫反應的免疫有效量來施用本文所述的PRV核酸、多肽或免疫原性組合物。在某些情況中，此量可以是每只動物介于約0.01和約1000微克之間的RPV核酸、多肽或免疫原性組合物。本文中所述術語“免疫有效量”指的是能夠誘導或增強誘導動物體內期望的免疫反應的量。其中，所期望的反應還可包括誘導抗體或細胞介導的免疫反應或兩者都有。所期望的反應也可以是誘導足以改善動物體內PRV感染癥狀、減少PRV感染持續(xù)時間的免疫反應和/或提供針對隨后用PRV的激發(fā)的保護性免疫。免疫有效量可以是誘導針對PRV感染的實際“保護”的量，即預防動物體內由PRV感染所引起的任何癥狀或疾病。免疫有效量也可以是足以延遲與感染有關的癥狀和疾病的爆發(fā)、降低感染程度或感染率、降低由感染引發(fā)的任何疾病或癥狀的嚴重程度并減少受感染動物的病毒負載量的量。本領域中的技術人員可以在沒有進行任何不恰當的實驗的情況下很容易地確定什么是本發(fā)明的組合物的免疫有效量。有效量可以用傳統(tǒng)的手段確定，從低劑量開始然后增加劑量并同時監(jiān)測免疫效果。確定最佳施用量時可以考慮許多因素，包括動物的大小、年齡和一般健康情況、動物體內有無其它藥物、針對其對動物接種的特定PRV的毒性等?？紤]多種動物研究的結果后可選擇實際的劑量。 免疫原性組合物的免疫有效量可以單劑量、分劑量或使用“初免-加強免疫”方案來施用。組合物可以任何合適的途徑施用，包括但不限于口服、浸泡施用、腸胃外施用、真皮內施用、經皮施用、皮下施用、肌肉內施用、靜脈內施用、腹膜內施用、鼻內施用、口服或眼內施用途徑，或者通過途徑的組合。技術人員將能夠根據所選的途徑配制疫苗組合物。除了接種技術外，也可以用本領域已知的任何其它方法產生本文所述的與PRV多肽結合的抗體。示例性的可選的體外抗體生成技術、轉基因動物技術和雜交瘤技術。參見例如Ausubel,等，編，Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,Inc.,NY, N. Y. (1987-2001) ;Sambrook,等，Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ;Harlow 和 Lane, Antibodies, A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) ;Colligan,等，編，Current Protocols in Immunology,John Wiley & Sons, Inc. , NY(1994-2001) ;Colligan 等，Current Protocols in ProteinScience, John Wiley & Sons, NY, N. Y.，(1997-2001)。適于產生PRV結合抗體的體外技術包括但不限于核糖體展示、酵母展示和細菌展示技術。核糖體展示是一種將mRNA翻譯成其同源蛋白同時保持蛋白質與RNA結合的方法。核酸編碼序列由 RT-PCR 回收((Mattheakis, L. C.等· 1994. Proc Natl Acad Sci USA 91，9022)。酵母展示是基于構建膜相關α凝集素酵母粘附受體、agal和aga2的融合蛋白，交配型系統(tǒng)的一部分(Broder,等1997. Nature Biotechnology, 15 :553-7)。細菌展示是基于將革巴標融合到與細胞膜或細胞壁關聯(lián)的輸出細菌蛋白(Chen和Georgiou 2002. BiotechnolBioeng, 79 :496-503)。與雜交瘤技術相比，噬菌體和其它抗體展示方法提供了體外操控針對抗原靶標的選擇的機會并且沒有限制對抗原有宿主效應的可能性，反反之亦然。例如，可以通過從文庫(如噬菌體文庫)中選擇來獲取與PRV多肽結合的抗體?？梢酝ㄟ^插入隨機寡核苷酸文庫或含有目標序列(如來自免疫的動物的B細胞)的多核苷酸文庫來創(chuàng)建噬菌體文庫(Smith, G. P. 1985. Science 228 :1315-1317)。抗體噬菌體文庫含有允許單鏈Fv片段或Fab片段表達的一個噬菌體中的重(H)和輕(L)鏈可變區(qū)對(Hoogenboom,等2000, Immunol Today 21(8)371-10)?？梢圆倏刳噙|菌體文庫的多樣性來增加和/或改變文庫的單克隆抗體的免疫特異性從而產生并隨后識別出另外理想的硬骨魚抗體。例如，重(H)鏈和輕(L)鏈免疫球蛋白分子編碼基因可以隨機混合(攪亂(shuffle))以在裝配的免疫球蛋白分子中創(chuàng)建新的HL對。此外，H鏈和輕鏈編碼基因中的任何一個或兩者都可以在免疫球蛋白多肽可變區(qū)的互補決定區(qū)(CDR)進行誘變處理，接著篩選期望的親和力和中和能力?？贵w文庫也可以通過選擇一個或更多個框架序列并引入源自抗體譜系的⑶R盒或通過設計變異用合成的方法創(chuàng)建(Kretzschmar和von Ruden 2000, CurrentOpinion in Biotechnology, 13 :598-602)。多樣性的位置并不局限于⑶R,但也可以包括可變區(qū)的框架片段或可包括不同于抗體可變區(qū)的片段，如肽。
適用于產生針對本文中所述的PRV多肽或PRV多肽的片段的抗體的其它抗體生成技術包括Geysen等所描述的PEPSCAN技術(專利申請WO 84/03564、專利申請WO86/06487，、美國專利 No. 4，833，092、Proc. Natl. Acad. Sci. 81 :3998-4002 (1984)，J. Imm.Meth. 102,259-274(1987))。與PRV多肽結合的全部抗體的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化可以用于產生與PRV多肽結合的抗體片段。具體而言，F(xiàn)ab片段由抗體分子的單價抗原結合片段組成，并且可以通過用木瓜蛋白酶來消化整個抗體分子來生成，從而產生由完整輕鏈和部分重鏈組成的片段。通過用胃蛋白酶處理整個抗體分子而不發(fā)生隨后還原可以獲得抗體的(Fab' )2片段。通過用硫醇還原劑還原來從(Fab' )2獲得抗體分子的Fab'片段，這產生由完整輕鏈和部分重鏈組成的分子。用這種方式處理每個抗體分子可獲得兩個Fab'片段。通過對選取的分子(已經通過用合成手段或通過編碼多肽的核酸的表達生成)進行化學交聯(lián)或通過重組DNA技術結合多肽的體外表達或細胞表達，然后進行寡聚化反應可以產生抗體。通過重組技術和表達、產生帶不同表位特異性的抗體的雜交瘤的融合、或在單個細胞中表達具有不同表位特異性的多核酸編碼抗體可變鏈同樣可以產生抗體。通過共價或非共價結合，如通過“多聚化域”，可以將抗體直接或間接地結合從而產生多聚體。“多聚化區(qū)”介導非共價蛋白質與蛋白質之間的相互作用。具體實例包括卷曲螺旋(如，亮氨酸拉鏈結構)和α螺旋結構蛋白質序列。通過范德華力、氫鍵結合或電荷-電荷間鍵合介導蛋白質-蛋白質結合的序列也可以用作多聚化域。另外的實例包括堿性螺旋-環(huán)-堿性螺旋區(qū)域和介導核酸結合蛋白(例如，DNA結合轉錄因子，如TAFs)中異源或同源蛋白質-蛋白質間的相互作用的蛋白質序列。多聚化域的一個具體實例是介導四聚體形成的Ρ53殘基319至360。另一個實例是胞外蛋白質TSP4，它是血小板反應蛋白家族的成員，它可以形成五聚體。另外的具體實例有jun、fos和酵母蛋白GCN4的亮氨酸拉鏈?？贵w可通過化學交聯(lián)劑直接彼此連接或通過接頭序列(如，肽序列)連接從而形成多聚體。本文中所述抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體?？贵w也可以是嵌合抗體(即，來自超過一個物種的序列的組合，例如嵌合小鼠-鮭魚免疫球蛋白)。物種特異的抗體避免某些與具有來自其它物種的可變和/或恒定區(qū)的抗體有關的問題。這類來自其它物種的蛋白序列其它形態(tài)種的存在會導致抗體的迅速消除或會導致通過抗體產生抵御抗體的免疫反應。本文中所述抗體可以是分別通過重鏈和輕鏈可變區(qū)(VH和VL)與其它分子(抗原)結合的抗體。本文中所述的抗體包括但不限于IgY、IgY(ΔFe))、IgG、IgD、IgA、IgM、IgE和IgL。抗體可以是完整的免疫球蛋白分子、由二硫鍵連接的兩個全長重鏈與兩個全長輕鏈，以及與帶有或不帶有恒定區(qū)的與抗原表位結合的免疫球蛋白分子的子序列(即片段)，或帶有或不帶有恒定區(qū)的與抗原表位結合的免疫球蛋白分子的子序列(即片段)?？贵w可以包含全長重鏈和輕鏈可變區(qū)、單獨的VH和VL或任何組合。
基本免疫球蛋白(抗體)結構單位可以包含四聚體。每一個四聚體可以由兩對完全相同的多肽鏈組成，每一對具有一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈(約50-70kD)。每條鏈的N端界定約100-110或更多個氨基酸的主要負責抗原識別的可變區(qū)。術語可變輕鏈(Vl)和可變重鏈(VH)分別指的是這些輕鏈和重鏈。本文中所述抗體可以完整的免疫球蛋白的形式或以被各種肽酶消化產生的良好表征、的片段的形式存在。尤其是，胃蛋白酶消化鉸鍵區(qū)二硫鍵以下的抗體以產生F(ab) ' 2(Fab的二聚體)，而F(ab) ' 2本身是由二硫鍵結合到VH-CHl的輕鏈。在溫和的條件下F(ab)' 2可以被還原從而破壞鉸鏈區(qū)中的二硫鍵從而將F(ab)' 2 二聚體轉化成Fab'單體。Fab'單體實質上是帶有部分鏈接區(qū)的Fab (要了解更多的抗體片段術語，參見 Fundamental Immunology, ff. E. Paul, ed.，Raven Press, N. Y. (1993)。雖然 Fab'域是根據完整抗體的消化來定義的，技術人員將了解這樣的Fab'片段可以重新用化學方法或通過利用重組DNA方法合成。Fab'區(qū)可以是來自動物或人來源的抗體或者可以是嵌合的(Morrison 等，Proc Natl. Acad. Sci. USA 81,6851-10855(1984)兩者均以引用的方式并入本文)(Jones 等，Nature 321, 522-525 (1986), and published UK patent applicationNo. 8707252，兩者均以引用的方式并入本文)。本文中所述抗體可包括或源自任何哺乳動物，如但不限于魚、人、小鼠、兔、大鼠、嚙齒類動物、靈長類動物或其任何組合，并包括分離的魚、人、靈長類動物、嚙齒類動物、哺乳動物、嵌合、人源化和/或CDR移植或CDR適應抗體、免疫球蛋白、裂解產物及其其它部分和變體。在一個實施方案中，抗體被純化。本文中所述抗體包括保留有至少部分單體的抗原結合活性的全長抗體、子序列(如，單鏈形式)、二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體或任何其它高分子量寡聚物(higher order oligomer)。多聚體可以包含如本文所述和本領域內已知的全長抗體、子序列、未修飾或修飾抗體的異源或同源組合物。由于多聚體具有多抗原結合位點，因此與單體相比，抗體多聚體對增加抗原親和力是有用的。抗體多聚體也對于產生不同抗體的寡聚物(如二聚體、三聚體、四聚體等)組合從而產生多功能(如，雙重功能、三重功能、四重功能等)抗體的組合物。抗體子序列的具體實例包括，例如Fab、Fab'、(Fab' ) 2、Fv或單鏈抗體(SCA)片段(如scFv)。子序列包括保留全長序列的至少部分功能或活性的部分。例如，即使子序列的親和力可能比全長抗體的結合親和力更高或更低，但抗體序列將保留選擇性地結合抗原的能力。Fv片段是包含表達為兩條鏈的輕鏈VL的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)的片段。締合可以是非共價或共價的，如化學交聯(lián)劑或分子間二硫鍵(Inbar等，(1972) Proc. Natl. AcadSci. USA 69 2659 ；Sandhu (1992)Crit. Rev. Biotech. 12 :437)。也可以使用其它產生抗體子序列方法，例如，分離重鏈形成單價輕-重鏈片段，片段進一步裂解或其它酶技術、化學技術或基因技術，前提是子序列與抗原結合，所述抗原與完整抗體結合。
單鏈抗體("SCA")是基因工程抗體或酶消化抗體，其含有以接頭-Vh定向中或Vh-接頭定向任選地由柔性接頭(如多肽序列)連接的輕鏈\的可變區(qū)和重鏈的可變區(qū)。或者，可通過經兩個半胱氨酸殘基間的二硫鏈連接兩個可變域來產生單鏈Fv片段。例如，Whitlow 等,(1991)在Methods A Companion to Methods in Enzymology 2 97 ；U. S. Pat. No. 4, 946, 778 ；and Pack 等，(1993)Bio/Technology 11 :1271 中描述了產生scFv抗體的方法。本文中所述PRV核酸、多肽和免疫原性組合物可以用來產生抑制、中和或降低多肽或PRV的活性或功能的抗體。在某些方面，本方面涉及用于處理動物(如鮭魚)的方法，所述方法包括對動物施用PRV核酸、多肽和免疫原性組合物，或對動物施用與PRV多肽特異性結合的抗體從而抑制、中和或降低PRV多肽或PRV的活性或功能。 在另一方面，本文中所述的本發(fā)明涉及包含PRV多肽或PRV核酸的PRV免疫原性組合物。在一些實施方案中，PRV免疫原性組合物可進一步包含載體、佐劑、賦形劑等。可通過將活性化合物與本領域已知的免疫原性可接受的載體相結合來容易地配制本文中所述的PRV免疫組合物?？梢允褂靡环N或多種包含有利于將活性化合物加工成可用于誘導免疫反應的制備物的賦形劑或助劑的生理上可接受的載體以傳統(tǒng)的方式配制本文所述的PRV免疫原性組合物。這類載體可用于配制合適的片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿料、懸浮液等。在一個實施方案中，可以通過固體賦形劑獲取免疫原性組合物，研磨所得混合物，如果需要，加入合適的助劑后加工顆粒的混合物從而獲得片劑或糖衣丸的核。本文所述的免疫原性組合物可以其本身已知的方式生產,例如通過傳統(tǒng)的混合、分解、造粒、制糖衣丸、磨細、乳化、裝入膠囊、包埋、凍干工藝。適用的制劑取決于所選的施用途徑。當對動物施用免疫學上有效量的PRV免疫組合物時，組合物可以是無熱原、非腸道可接受的水溶液的形式。制備這樣的非腸道可接受的蛋白質或其它活性組分溶液是在本領域內的技術范圍之內，應注意PH值、等滲性、穩(wěn)定性等。例如，除了本發(fā)明的蛋白質或其它活性組分，本文中所述的PRV免疫原性組合物可以包含本領域內已知的等滲媒介物，如氯化鈉注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化鈉注射液、乳酸鈉林格氏注射液或其它媒介物。本發(fā)明的免疫原性組合物也可以含有本領域內技術人員已知的穩(wěn)定劑、防腐劑、緩沖液、抗氧化劑或其它添加劑。PRV免疫原性組合物可以在水溶液、生理兼容緩沖液如Hanks溶液、林格氏溶液或生理鹽水緩沖液中配制。對于經粘膜施用，制劑中要使用適于穿透屏障的滲透劑。這樣的滲透劑通常為本領域內已知的。當口服施用PRV免疫原性組合物時，本發(fā)明的蛋白質或其它活性組分可以是片齊U、膠囊、粉末、溶液或酏劑的形式。以片劑形式施用時，本發(fā)明的免疫原性組合物可以另外包含固體載體如明膠或佐劑。本文所述的PRV免疫原性組合物可以編碼或包含本文中所述的PRV蛋白質或肽的任何一種，或在動物體內是免疫原性的、或其部分、片段、衍生物或突變體。本領域中的技術人員能很容易地測試出本文中所述的PRV蛋白質和肽的免疫原性，并可選擇合適的蛋白質或肽用于亞單位疫苗。本文中所述的PRV免疫原性組合物包含至少一種PRV氨基酸或多肽，如本文中描述的那些。組合物也可包含一種或多種添加劑，包括但不限于一種或更多種藥學上可接受的載體、緩沖液、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、增溶劑、脂質體或免疫調變劑。合適的免疫調變劑包括但不限于佐劑、細胞因子、編碼細胞因子的多核苷酸和有助于PRV源免疫原性組分的細胞攝取的試劑。本文所述的PRV免疫原性組合物也可包含免疫刺激性物質，也就是所謂的佐劑。廣義的佐劑包括以非特異的方式增強宿主的免疫反應的物質。許多不同的佐劑在本領域是已知的。常用在魚類和貝類養(yǎng)殖業(yè)佐劑的實例有胞壁酰二肽、脂多糖、幾種葡聚糖和聚糖以及Carbopol 聚羧乙烯(一種均聚物)。在綜述文章Jan Raa(Reviews in FisheriesScience 4(3) :229-288(1996))中給出了適用于魚類和貝類疫苗的佐劑的詳細述評。本文所述的PRV免疫原性組合物也可以包含所謂的“媒介物”。媒介物是與蛋白質粘附的未與之共價結合的一種化合物。例如，這樣的媒介物例如為生物微膠囊、微海藻酸鹽、脂質體和大分子物，所有都是本領域已知的。這種媒介物的一個特殊形式(其中抗原部分嵌入到媒介物中)是所謂的ISCOM(EP 109. 942，EP 180. 564，EP 242. 380)。此外，疫苗 可包含一種或更多種合適的表面活性化合物或乳化劑，如Span或Tween。也可以采用某些有機溶劑，如二甲亞砜。本文中所述的PRV免疫原性組合物也可以與穩(wěn)定劑混合，例如以而保護易于降解的蛋白質免受降解，提高疫苗的保質期或提高冷凍干燥效率。有用的穩(wěn)定劑是即SPGA (Bovarnik等；J. Bacteriology 59 :509 (1950))、碳水化合物如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、右旋糖苷或葡萄糖、蛋白質如白蛋白或酪蛋白或其降解產物，以及緩沖劑如堿金屬磷酸鹽。以液體形式施用時，可以加入液體載體如水、石油、動物或植物油如花生油、礦物油、大豆油或芝麻油或合成油。免疫原性組合物的液體形式可進一步包含生理鹽水溶液、葡萄糖或其它糖類溶液、或二醇類如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。當以液體形式施用時，免疫原性組合物包含以重量計約O. 5-90%的本發(fā)明的蛋白質或其它活性組分和約1-50%的本發(fā)明的蛋白質或其它活性組分。本文所述的PRV免疫原性組合物包括由明膠制成的推入配合式膠囊(push-fitcapsule)以及由明膠和增塑劑(如甘油或山梨醇)制成的軟密封膠囊。推入配合式膠囊可以包含活性組分，所述活性組分與填料(如乳糖)、粘結劑(如淀粉)和/或潤滑劑(如滑石或硬脂酸鎂)，以及任選的穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中，活性化合物可在合適的液體如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中溶解或懸浮。此外，可以加入穩(wěn)定劑。本文所述的PRV免疫原性組合物也可以配制為通過注射，如彈丸注射或連續(xù)輸注而用于腸道外施用。注射用制劑可以是單位劑量形式存在，如以安瓿瓶或多劑量容器，并加入防腐劑。組合物可以采用如在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳化液的形式，并可以包含配方劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。本文所述的PRV免疫原性組合物也可以是本發(fā)明的蛋白質或其它活性組分與蛋白質或肽抗原的絡合物的形式。本文所述的PRV免疫原性組合物也可以制成適合腸胃外施用并可包括水溶液，所述水溶液包含可溶于水的形式的PRV核酸或多肽。此外，將活性組分的懸浮液制備成合適的油性注射懸浮液。合適的親脂性溶劑或媒介物包括脂肪油(如芝麻油)或合成脂肪酸酯(如油酸乙酯或甘油三酸酯)或脂質體。水性注射懸浮液可包含提高懸浮液黏性的物質如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，懸浮液也可包含適合的穩(wěn)定劑或提高化合物的溶解性的試劑從而可制備高濃度溶液?；蛘?，在使用之前，活性組分可以是粉末形式，用于與合適的媒介物如無菌無熱原水配制。本文所述的PRV免疫原性組合物也可以是脂質體的形式，其中，除了其它可接受的載體外，在水溶液中，本發(fā)明的蛋白質與兩性試劑(如以聚集的形式如膠束、不溶性單層、液晶或薄層存在的脂質)結合。用于脂質體制劑的適合的脂質包括但不限于單酸甘油酯、雙酸甘油酯、硫脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂角苷、脂汁酸等。制備這樣的脂質體制劑在本領域的技術水平之內，如在例如美國專利中No. 4，235，871 ;4，501,728 ;4，837，028 ;和4，737，323所公開的，所有這些專利以引用的方式并入本文。本文所述的PRV免疫原性組合物也可以配制成通過植入(如皮下或肌肉內)或通過肌肉注射進行施用的長效制劑?？墒褂镁忈屜到y(tǒng)如含有治療劑的固體疏水聚合物的半透 性基質遞送組合物。已確定各種類型的緩釋材料并為本領域技術人員所熟知。緩釋膠囊可根據其化學性質釋放化合物達幾個星期、甚至多達100多天。根據治療劑的化學性質和生物穩(wěn)定性，可采用另外的用于蛋白質或其它活性組分穩(wěn)定的策略。因此，例如，化合物可以與合適的聚合材料或疏水材料(如作為可接受的油品中的乳化劑)或離子交換樹脂配制、或作為少量的可溶性衍生物，例如，作為少量可溶性鹽。與本文所述PRV免疫原性組合物一起使用的載體可以是共溶劑體系，其包含苯甲醇、非極性表面活性劑、水溶性有機聚合物和水相。共溶劑體系可以是VPD共溶劑體系。VPD是3% w/v苯甲醇、8% w/v的非極性表面活性劑、聚山梨酯80和65% w/v的聚乙二醇300的溶液，在無水乙醇中補足到體積。VPD共溶劑體系(VPD :5W)由用5%葡萄糖的水溶液按I I稀釋vro組成。這種共溶劑體系充分溶解疏水化合物，它本身在全身施用后產生的毒性較低。共溶劑體系的比例在不破壞其溶解性和毒性特性的情況下，可以有相當大的變化。共溶劑組分的身份也可以變化例如，可以使用其它低毒非極性表面活性劑代替聚山梨酯80 ;聚乙二醇的部分體積可以不同；其它生物相容性聚合物可以代替聚乙二醇，如聚乙烯吡咯烷酮；以及其它糖類或多糖可取代葡萄糖。免疫原性組合物也可以包含合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這樣的載體或賦形劑的實例包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物如聚乙二醇。本發(fā)明的許多活性組分可以提供為具有免疫原性兼容抗衡離子的鹽。這樣的免疫可接受的堿性加成鹽是那些保留有游離酸的生物有效性和特性的那些鹽，并且那些鹽通過與無機堿或有機堿(如氫氧化鈉、氫氧化鎂、氨水、三烷基胺、二烷基胺、單烷基胺、氨基二元酸、乙酸鈉、苯甲酸鉀、三羧乙基胺等)反應獲得。適于用在本文所述免疫原性組合物中的賦形劑包括填料如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，如玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、黃蓍膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，也可以加入分裂劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽如海藻酸鈉。糖衣丸核有合適的糖衣。為此，可以使用濃縮糖溶液，其任選地含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡泊波凝膠(carbopol gel)、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液以及合適的有機溶劑或溶劑混合物?？梢詫⑷玖匣蛏丶尤氲狡瑒┗蛱且轮杏糜谧R別或表征活性化合物劑量的不同組
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本文所述的免疫原性組合物和疫苗也可以是多價免疫原性組合物，其進一步包含另外多肽或編碼來自其它病毒的另外多肽的核酸序列。本文中所述的免疫原性組合物和疫苗也可以是多價免疫原性組合物，其進一步包含另外多肽片段或編碼來自其它病毒的另外多肽片段的核酸序列。本文中所述的免疫原性組合物和疫苗也可以是多價免疫原性組合物，其進一步包含其它病毒(如，毒性減弱、滅活或以另外方式失活的病毒)或編碼其它病毒(如毒性減弱、滅活或以另外方式失活的病毒)的核酸序列。 本文所述的免疫原性組合物和疫苗也可以包含融合蛋白或編碼融合蛋白的核酸，所述融合蛋白包含PRV多肽或其片段和來自另一病毒的多肽或多肽片段?？梢园ㄔ诿庖咴越M合物中的其它病毒、其它病毒的病毒多肽或其片段的實例包括但不限于嗜睡癥病毒(SDV)或SDV病毒多肽或其片段；鮭魚胰腺病病毒(srov)或SPDV病毒多肽或其片段；傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)或ISAV病毒多肽或其片段；病毒性出血性敗血病病毒(VHSV)或VHSV病毒多肽或其片段；傳染性造血組織壞死病病毒(IHNV)或IHNV病毒多肽或其片段；傳染性胰壞死病毒(IPNV)或IPNV病毒多肽或其片段；鯉春病毒血癥(SVC)或SVC病毒多肽或其片段；斑點叉尾鮰皰疹病毒(CCV)或CCV病毒多肽或其片段；殺鮭氣單胞菌或殺鮭氣單胞菌多肽或其片段；鮭腎桿菌或鮭腎桿菌多肽或其片段；粘放線菌或粘放線菌多肽及其片段；耶爾森氏鼠疫桿菌或耶爾森氏鼠疫桿菌多肽及其片段；巴斯德桿病菌或巴斯德桿病菌多肽或其片段；鰻弧菌或鰻弧菌多肽或其片段；火神弧菌或火神弧菌多肽或其片段；病?；【虿『；【嚯幕蚱淦?；鮭弧茵或鮭弧茵多肽或其片段；愛德華氏菌或愛德華氏菌多肽或其片段；遲鈍愛德華氏菌或遲鈍愛德華氏菌多肽或其片段；柱狀纖維粘細菌或柱狀纖維粘細菌多肽或其片段；鮭魚立克次氏菌或鮭魚立克次氏菌多肽或其片段。例如，美國專利No. 6，471，964中描述了編碼傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV)的結構蛋白質-I的cDNA。ISAV抗原也公開在WO 01/10469中。SPDV公開在WO 99/58639中。鮭魚立克次氏菌抗原公開在W001/68865中。白斑病毒抗原公開在WO 01/09340中。適合用于本文所述免疫原性組合物中的其它病毒多肽和核酸序列描述在Tucker 等(2000) " Assessment of DNA vaccine potential for juvenile Japaneseflounder Paralichthys olivaceus， through theintroduction of reporter genesby particle bombardment and histopathology" Vaccine 19(7-8) :801-809 ;Corbeil等(1999) " Evaluation of the protective immunogenicity of the N，P，M，NV,G proteins of infectious hematopoietic necrosis virus in rainbow troutOncorhynchus mykiss using DNA vaccines" Dis.Aquat. 0rgan39(I) :29-26 ;Nusbaum 等(2002)" Protective immunity induced by DNA vaccination of channel catfish withearly and late transcripts of the channel catfish herpes virus (IHV-I) VetImmunol. Immunopathol 84(3-4) 151-168 ；Clark 等(1992) " Developmentalexpression of surface antigen genes in the parasitic cilate Ichtyophthiriusmultifiliis" Proc. Natl. Acad. Sci. 89 (14) :6363-6367 JfISato 等(2000)" Expressionof YAV proteins and vaccination against viral ascites among cultured juvenileyellowtail" Biosci. Biotechnol. Biochem. 64(7) :1494-1497 中論述。魚病原體抗原的許多核酸和氨基酸是已知的且可通過Genbank數據庫和其它來源很容易獲得。用于疫苗制劑的其它添加劑在本領域是已知的且對本領域的技術人員來說顯而易見。以下實施例對本發(fā)明進行了說明，并提出以幫助理解本發(fā)明，但并不應解釋為以任何方式限制如以下權利要求所限定的本發(fā)明的范圍。
實施例實施例I:PRV片段的分離通過對從感染HSMI的挪威養(yǎng)殖鮭魚獲取的樣本進行高通量測序來獲得與哺乳動物正呼腸孤病毒在氨基酸水平有約50%同源性的200nt片段。來自感染HSMI的鮭魚和正 常鮭魚的肌肉組織的定量PCR測定表明感染HSMI的鮭魚中有更高的病毒負載量。實施例2:養(yǎng)殖鮭魚的心臟和骨骼肌炎癥與感染新型呼腸孤病毒有關對從通過實驗方法誘導的HSMI鮭魚的心臟提取的RNA進行焦磷酸測序(Margulies, M.等，Nature 437，376-380 (2005))，產生 106，073 讀數范圍大小多達 598 個核苷酸(平均=349. 7，SD = 149. 5)。盡管核苷酸水平的數據庫比對分析表明沒有感染的證據，但一個265核苷酸讀數的所預期氨基酸序列與哺乳動物正呼腸孤病毒3 (AF378009)的核心尖狀蛋白λ2有49%的相似?；谶@個序列的實時PCR測定用于測試從自然爆發(fā)(η = 20)或實驗感染(η = 20)的感染HSMI的鮭魚和未感染的對照魚(η = 20)的心臟和血清獲取的RNA提取物中候選病毒的存在。所有的感染HSMI的鮭魚的樣本都包含候選序列。在未感染HSMI的對照鮭魚中未發(fā)現(xiàn)序列。經PCR選取具有最高病毒負載量(3. 0x106個基因組拷貝/μ I)的HSMI血清樣本另外用于焦磷酸測序，產生120，705個讀數。用一套生物信息工具鑒定病毒序列。在分析的第一階段，BLASTN 和 BLASTX (Altschul 等，J Mol Biol 215，403-410 (1990))分別檢測出了 I. 5%和53. 9%的預期病毒基因組，使得能夠鑒定片段LI、L2、L3、Ml、M2和M3 (圖I)。執(zhí)行 FASTX (Pear son 等，Genomics 46,24-36(1997))產生另外的 5. 5% 的基因組并在SI片段中檢測出了基序以及在L2和M3片段中檢測出了另外的序列。序列數據的頻率分析(FASD) (Trifonov等，(提交))(一種基于核苷酸頻率和順序而不是序列比對來分類的程序)檢測出了包含另外11. 8%的最終病毒基因裝配的代表SI、S2、S3和S4片段的新序列(圖I)?？傆嫞蠹s有序列的17個千堿基(基因組的72. 8% )是通過焦磷酸測序獲得的(圖I)。片段間的空位和基因片段的末端是通過PCR克隆完成的。所有序列用根據草圖序列設計的引物通過經典的雙脫氧測序法進行驗證。與呼腸孤病毒家族的成員的基因組結構特點相一致，PRV的基因組包括至少10個RNA片段(基因庫登錄號⑶994013-GU994022)。呼腸孤病毒為包含10-12個片段的帶雙鏈RNA基因組的非包膜二十面體病毒?；谒拗鞣秶⒒蚪M片段數量、G/C含量和抗原關系界定了 12個屬。用所知的呼腸孤病毒的L基因片段序列構建的系統(tǒng)樹說明了 PRV代表從魚類、貝類、爬行動物、鳥類和哺乳動物病毒的水生呼腸孤病毒和正呼腸孤病毒祖先衍生的截然不同的遺傳譜系(圖2)。所有10個PRV基因片段的分析證實了 PRV序列與其它呼腸孤病毒的不同(圖5至12)。所有PRV基因片段都含有在正呼腸孤病毒和水生呼腸孤病毒發(fā)現(xiàn)的 3’ 端核苷酸(UCAUC-3，) (Attoui 等，J Gen Virol83,1941-1951 (2002));但是 5’端核苷酸(5’ -GAUAAA/U)是獨有的。正呼腸孤病毒在SI或S4中都具有多順反子片段。而水生呼腸孤病毒屬C在S7 (正呼腸孤病毒SI同系物)中是多順反子性的，其它水生呼腸孤病毒屬則不是(Attoui等，JGen Virol 83，1941-1951 (2002))。PRV 在 S2 的 5’ 端(71aa，等電點 pi =8. 8,8kDa)中有推定的可讀框(ORF)，并且在SI的5’端(124aa，pi = 4. 8，13kDa)具有推定的0RF。盡管在正呼腸孤病毒和水生呼腸孤病毒中發(fā)現(xiàn)了 PRV的λ I、λ 2、λ 3、μ I、μ 2、μ 3、σ 2和σ NS序列的同系物，但在S2和SI中觀察到的σ I和σ 3序列以及小的推定可讀框似乎與眾不同。后者的結構與融合相關的小跨膜(FAST)呼腸孤病毒蛋白質相似(Shmulevitz等，EMBO J 19,902-912(2000))(圖13)。呼腸孤病毒FAST蛋白質為誘導細胞間融合和合胞體形成的非結構單通膜蛋白質(Shmulevitz等，EMBO J 19，902-912 (2000))。這些數據合在一起提供了有說服力的證據，即PRV是正腸孤病毒屬和呼腸孤病毒屬遠枝的一種新型呼腸孤病毒基因的原型。用靶向基因組片段L1、L2、M3和S4的實時PCR測定來檢驗在養(yǎng)殖鮭魚和野生鮭魚中PRV感染的流行程度。用針對LI的MGB檢測定來量化病毒RNA的水平，其中用Pfaffl的 公式將結果歸一化為延伸因子 IA(EFlA) (Pfaffl 等，Nucleic Acids Res 29，e45(2001))。研究了來自代表3種不同的HSMI爆發(fā)的29個鮭魚的心臟和腎臟樣本(表I)，并研究了來自健康養(yǎng)殖魚的10個樣本。如通過L1/EF1A的基因對數比彡5. 00界定，在已知的29個HSMI樣本中有28個(96. 5% )是陽性，但10個健康鮭魚樣本沒有一個是陽性的(0% )。29個HSMI樣本中只有一個樣本是陰性；這個樣本來自HSMI早期階段在魚死亡開始之前躲在鮭魚網中的魚(圖3)。在有嚴重疾病征兆的魚中，包括異常的游泳行為、食欲不振和全心炎和肌炎的組織炎癥明顯的魚(Kongtorp等，J Fish Dis 29，233-244 (2006))，中值調整后的L1/EF1A基因對數比是10. 36(IQR，0. 94)。L1/EF1A基因對數比不僅與有無HSMI有關，還與采樣時疾病的嚴重程度有關。對數比在健康養(yǎng)殖鮭魚中的值最低(對數比范圍，-O. 23-3. 89 ；n = 10)，在HSMI爆發(fā)的早期階段采集的鮭魚中的比值較高，并且在HSMI爆發(fā)的高峰時獲得的鮭魚樣本中的值最高(范圍，8. 52-11.90 ;n= 10))。為了研究來自不同地理位置的健康野生鮭魚中PRV的流行程度和相對水平，測試了從挪威九條沿海河流中獲取的66個樣本。僅在這些樣本中的16個樣本中檢測到了 PRV(24. 2% )。根據相對對數比為6. 70和7. 58的養(yǎng)殖鮭魚的截斷值，這16個樣本中有2個樣本為陽性；其它14個樣本的L1/EF1A都低于截斷值5. O (范圍，20-4. 57)。在其余的野生鮭魚樣本中均未檢測到PRV 轉錄物(η = 50)。表I病毒負載量數據τη丨魚的I疾病丨爆發(fā)組群Z疾丨如妙|L1/EF1A基因比I L1/EF1A基因病毒陽性/陰性
開不種類狀況病階段m 例(調整后)a比例的對數比b檢測e(tnin=5.00)d
408-1 養(yǎng)殖 HSMI3.3E+088.52+陽性
408-2 養(yǎng)殖 HSMI口11E+1010.06+陽性
408-3養(yǎng)技 HSMI6.4E+099.80+陽性
408-4養(yǎng)殖 HSMII.綱99.26+陽性
408-5養(yǎng)殖 HSMI5.5E+1010.74+陽性
408-6養(yǎng)技 HSMI f7.1E+099.85+陽性
408-7 養(yǎng)殖 HSMI6.9E+1010.84+陽性
408-8養(yǎng)殖 HSMI 養(yǎng)2^=8.0E+1111.90+陽性
____-高峰階段腎臟_____
408-9養(yǎng)技 HSMI f5.2E+1010.71+陽性
408-10 養(yǎng)殖 HSMI4.6E+1010.67+陽性
SK300丨養(yǎng)殖IHSMII養(yǎng)殖HSMI丨心臟/ I 2.8E+1010.45+陽性
權利要求
1.一種PRV免疫原性組合物，其包含PRV核酸。
2.根據權利要求I所述的免疫原性組合物，其中所述PRV核酸為SEQID NO :1-10中任何一個的核酸序列。
3.根據權利要求I所述的免疫原性組合物，其中所述PRV核酸包含SEQID N0:l_10中任何一個的至少24個連續(xù)核酸。
4.根據權利要求I所述的免疫原性組合物，其中所述PRV核酸與SEQID NO :1_10中任何一個的核酸序列基本上同一。
5.根據權利要求I所述的免疫原性組合物，其中所述PRV核酸為與SEQID N0:l_10具有至少約85%同一性的SEQ ID NO 1-10中任何一個的變體。
6.根據權利要求5所述的核酸，其中所述變體與SEQID NO :1-10中任何一個的變體具有至少約 90%、約 95. 5%、約 96%、約 96. 5%、約 97%、約 97. 5%、約 98%、約 98. 5%、約99%、約99. 5%或約99. 9%的同一性。
7.一種PRV免疫原性組合物，其包含PRV多肽。
8.根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述PRV多肽為由SEQID N0:l_10中任何一個編碼的多肽。
9.根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述PRV多肽為由包含SEQID NO1-10中任何一個的至少24個連續(xù)核酸的核酸編碼的多肽。
10.根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述PRV多肽為由與SEQID NO 1-10中任何一個的核酸序列基本上同一的核酸編碼的多肽。
11.根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述PRV多肽為由核酸編碼的多肽，所述核酸為與SEQ ID NO :1-10具有至少約85%同一性的SEQ ID NO : 1_10中任何一個的變體。
12.根據權利要求11所述的多肽，其中所述變體與SEQID NO :1-10中任何一個的變體具有至少約 90%、約 95. 5%、約 96%、約 96. 5%、約 97%、約 97. 5%、約 98%、約 98. 5%,約99%、約99. 5%或約99. 9%的同一性。
13.根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述PRV多肽為包含SEQID NO:29-40的氨基酸序列的多肽。
14.根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述PRV多肽為包含SEQID NO 29-40中任何一個的至少8個連續(xù)氨基酸的多肽。
15.根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述PRV多肽與SEQID NO :29-40中任何一個的氨基酸序列基本上同一。
16.根據權利要求7所述的免疫原性組合物，其中所述PRV多肽為SEQID NO :29-40中任何一個的變體且與SEQ ID NO 29-40中任何一個具有至少約85%的同一性。
17.根據權利要求16所述的多肽，其中所述變體與SEQID NO :29-40中任何一個的變體具有至少約 90%、約 95. 5%、約 96%、約 96. 5%、約 97%、約 97. 5%、約 98%、約 98. 5%,約99%、約99. 5%或約99. 9%的同一性。
18.—種與PRV或PRV多肽結合并抑制、中和或降低所述PRV或PRV多肽的功能或活性的抗體。
19.根據權利要求18所述的抗體，其中所述抗體為多克隆抗體。
20.根據權利要求18所述的抗體，其中所述抗體為單克隆抗體。
21.根據權利要求18所述的抗體，其中所述抗體為硬骨魚抗體。
22.根據權利要求18所述的抗體，其中所述抗體為鮭魚抗體。
23.根據權利要求18所述的抗體，其中所述抗體為IgM抗體。
24.根據權利要求18所述的抗體，其中所述抗體為嵌合抗體。
25.一種免疫原性組合物，其包含含有PRV多肽的滅活病毒。
26.一種免疫原性組合物，其包含含有PRV多肽的減毒病毒。
27.根據權利要求1、7、25或26中任一項所述的免疫原性組合物，其進一步包含至少一種賦形劑、添加劑或佐劑。
28.根據權利要求1、7、25或26中任一項所述的免疫原性組合物，其進一步包含來自其它病毒的至少一種多肽或其片段。
29.一種免疫原性組合物，其包含融合多肽，其中所述融合多肽包含來自其它病毒的PRV多肽及其變體片段和至少一種多肽或其片段。
30.根據權利要求28或29所述的免疫原性組合物，其中所述其它病毒選自由以下組成的組嗜睡癥病毒(SDV);鮭魚胰腺病病毒(srov);傳染性鮭魚貧血病毒(ISAV);病毒性出血性敗血病病毒(VHSV);傳染性造血組織壞死病病毒(IHNV);傳染性胰壞死病毒(IPNV)；鯉春病毒血癥(SVC);鲇魚呼腸孤病毒(CCV);殺鮭氣單胞菌；鮭腎桿菌；粘放線菌；耶爾森氏鼠疫桿菌；巴斯德桿病菌；鰻弧菌；火神弧菌；病?；【货q弧茵；愛德華氏菌；遲鈍愛德華氏菌；柱狀纖維粘細菌或鮭魚立克次氏菌。
31.一種誘導動物體內免疫反應的方法，所述方法包括施用根據權利要求1、7、25或26中任一項所述的PRV免疫原性組合物。
32.一種預防或降低動物體內PRV感染的方法，所述方法包括對所述動物施用根據權利要求1、7、25或26中任一項所述的PRV免疫原性組合物。
33.一種預防或降低動物體內PRV感染的方法，所述方法包括對所述動物施用根據權利要求18所述的抗體。
34.根據權利要求31、32或33中任一項所述的方法，其中所述施用為口服施用、浸泡施用或注射施用。
35.根據權利要求1、7、25或26中任一項所述的免疫原性組合物在生產用于治療動物體內條件性PRV感染的疫苗中的用途。
36.根據權利要求1、7、25或26中任一項所述的免疫原性組合物在生產用于預防或降低動物體內條件性PRV感染的疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫原性組合物以及用于誘導動物體內針對魚呼腸弧病毒(PRV)的免疫反應的方法。在另一方面，本發(fā)明涉及與魚呼腸弧病毒多肽結合的抗體。在又一方面，本發(fā)明涉及用于預防或降低動物體內PRV感染的方法。
文檔編號A61K31/7088GK102647988SQ201080044602
公開日2012年8月22日 申請日期2010年10月4日 優(yōu)先權日2009年10月2日
發(fā)明者E·布龍, G·帕拉西奧斯, R·T·康托普, W·I·利普金 申請人:國家獸醫(yī)學院, 紐約市哥倫比亞大學理事會