專利名稱：植物乳桿菌菌株用作降血膽固醇試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥、微生物學和營養(yǎng)學領(lǐng)域，具體而言涉及植物乳桿菌 (Lactobacillus plantarum)的新型益生菌菌株，其用于降低膽固醇。
背景技術(shù)：
異常的高膽固醇水平(高膽固醇血癥)與心血管疾病有重大的關(guān)聯(lián)，因為其促進動脈中粥樣斑的發(fā)展。潛在的降血膽固醇藥物和食品得到持續(xù)開發(fā)以控制具有異常高水平膽固醇者的血清膽固醇。這些藥物可基于中斷膽汁鹽的腸肝循環(huán)(EHC)。膽汁鹽代謝和膽固醇代謝是緊密相關(guān)的。膽汁鹽為膽固醇的水溶性分泌終產(chǎn)物，對消化道中乳化脂肪至關(guān)重要。其在肝臟中主要以甘氨酸-或?；撬?綴合物形式合成。一天內(nèi)十二指腸中會數(shù)次分泌膽汁鹽 (平均為六次)，其通過空腸進入回腸。在腸運輸中，大多數(shù)膽汁鹽被重吸收，通過門靜脈回到肝臟。一小部分膽汁鹽進入排泄物而損失，此損失部分在肝臟中由內(nèi)源膽固醇進行新的合成。排泄物中損失的膽汁鹽的量增加導(dǎo)致膽固醇新合成的增加，這樣有效減少了內(nèi)源膽固醇儲存。當前使用的一組稱為樹脂的降膽固醇藥物(消膽胺(Cholestyramine)、考來替泊(Colestipol)、考來維侖(Colesevelam))即通過此種作用機制發(fā)揮活性。除了在藥學上或手術(shù)上通過阻斷EHC降低血清膽固醇水平的嘗試之外，也有人提出攝入特定細菌細胞也可能影響膽固醇水平。腸細菌可通過同化來自膳食的外源膽固醇進入細菌膜或通過去綴合膽汁鹽而影響膽固醇水平。在腸運輸中，膽汁鹽經(jīng)歷了大量的細菌轉(zhuǎn)化過程，其中最重要的是膽汁鹽去綴合。在一些腸乳酸細菌(LAB)種屬中存在去綴合(或水解)膽汁鹽的能力，在其他一些屬中也存在。膽汁鹽去綴合時，甘氨酸或?；撬釓姆肿拥念惞檀疾糠轴尫?，形成游離(去綴合)的膽汁鹽。游離膽汁鹽在低PH下更易沉淀。其還比它們的綴合對應(yīng)物能更不易有效地重吸收。因此，去綴合膽汁鹽比結(jié)合膽汁鹽更易分泌入排泄物中。膽汁鹽去綴合通過增加膽汁鹽的分泌而影響EHC，人們認為其對于減少血液膽固醇水平比僅僅滯留外源膽固醇更有效。在數(shù)種攝入胃腸道的LAB種屬中已經(jīng)檢測到膽汁鹽水解酶(BSH)——在EHC過程中負責膽汁鹽去綴合的酶。Tanaka等人(參照“Screening of Lactic Acid Bacteria for Bile Salt Hydrolase Activity", Journal of Dairy Science 1999, vol. 82,p.2530-35) 篩查了超過300株來自雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)和乳桿菌屬(Lactobacillus)以及乳酸乳桿菌(Lactococcus lactis)、腸膜狀明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)和嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)種的LAB。對于273株菌得到的結(jié)果顯示BSH活性在不同種之間分布不均一。根據(jù)此項研究，幾乎所有雙歧桿菌菌株具有BSH活性，而此活性只在選定的乳桿菌菌株中發(fā)現(xiàn)。
植物乳桿菌為革蘭氏陽性耐氧性LAB，通常發(fā)現(xiàn)于發(fā)酵的食物產(chǎn)品以及厭氧性植物物質(zhì)中。其還存在于唾液(它首次分離于此)中。由于其在工業(yè)加工和保質(zhì)期內(nèi)具有良好的存活率，還由于其具有高的酸化形式和良好的感官特性，植物乳桿菌菌株尤其適合于發(fā)酵食物產(chǎn)品的工業(yè)制備。還有一些植物乳桿菌菌株被認為是益生菌。益生菌為當以適當?shù)牧渴┯脮r能賦予宿主健康益處的活的微生物。細菌必須滿足與以下條件相關(guān)的幾方面要求才能稱為益生菌在到達下胃腸道(GIT)并粘附于腸道粘膜時沒有毒性且具有有活力， 等等。大多數(shù)益生細菌屬于LAB組群，然而，一般已知的是益生菌特征和益處即使在相同種的LAB中間都有極大的菌株依賴性。通常將商業(yè)化植物乳桿菌菌株視為益生菌，且有描述其在以益生飲料形式攝入時，降低了血清中的纖維蛋白原和膽固醇水平(參照Bukowska等人， "Decrease in fibrinogen and LDL-cholesterol levels upon supplementation of diet with Lactobacillus ρlantarum in subjects with moderately elevated cholesterol Atherosclerosis 1998，vol. 137，p. 437-38)。然而，這些研究中的 LDL-膽固醇減少很微弱，伴隨HDL-膽固醇的類似微弱減少。沒有發(fā)表過與植物乳桿菌的BSHA 相關(guān)的數(shù)據(jù)。因此，需要提供新型的改良益生菌菌株用作降血膽固醇試劑。發(fā)明概述本發(fā)明提供了新型的改良益生菌菌株用于降低血液膽固醇，并因此可用于預(yù)防和治療心血管紊亂。本發(fā)明者提供了三種分離自人排泄物的新型益生植物乳桿菌菌株。發(fā)現(xiàn)所述菌株具有驚人的高BSH活性。如前文提到的，高的細菌BSH活性與膽固醇減少之間存在有緊密聯(lián)系，這使得本發(fā)明的菌株可用做降血膽固醇試劑。下文的工作實施例表明這些菌株與相關(guān)的商業(yè)可得的植物乳桿菌菌株相比具有顯著更高的BSH活性，所述商業(yè)可得的植物乳桿菌菌株如植物乳桿菌或存在于商業(yè)益生菌混合物VSL#3中的植物乳桿菌株。還顯示本發(fā)明的菌株對減少來自含可溶性膽固醇培養(yǎng)基的培養(yǎng)物膽固醇有效。盡管新型菌株中每種獨自作用時都表現(xiàn)出相對已知菌株的優(yōu)勢，然而當所述三種菌株一同使用時這些優(yōu)勢得以放大，故顯示出協(xié)同行為。本發(fā)明菌株的降膽固醇活性也在體內(nèi)得到證明。下文的實施例表明含有本發(fā)明的益生菌菌株的產(chǎn)品在施用給高膽固醇血癥受試者時，對于減少其中膽固醇尤其有效。因此，本發(fā)明第一個方面涉及包含有效量的至少一種選自植物乳桿菌CECT 7527、 植物乳桿菌CECT 75 和植物乳桿菌CECT 75 的菌株的組合物，其中突變體菌株是通過使用所述保藏菌株作為起始材料獲得的，且其中突變體菌株保留或進一步提高母本菌株的降膽固醇活性。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明涉及包含有效量的至少一種選自植物乳桿菌CECT 7527、植物乳桿菌CECT 75 和植物乳桿菌CECT 75 的菌株或其突變體菌株的組合物。如本文所使用的，術(shù)語“有效量”指的是這樣的量，活性試劑的量足夠高以傳遞所需要的益處，但足夠低以避免產(chǎn)生醫(yī)學評價范圍內(nèi)的嚴重副作用。本發(fā)明的另一個實施方式涉及包含有效量的植物乳桿菌CECT7527、植物乳桿菌 CECT 75 和植物乳桿菌CECT 75 或其突變體菌株的組合物，其中所述突變體菌株是使用保藏菌株作為起始材料獲得的，且其中所述突變體菌株保留或進一步提高了母本菌株的降膽固醇活性。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的組合物包含有效量的植物乳桿菌CECT 7527、植物乳桿菌CECT75^及植物乳桿菌CECT 7529。清楚的是本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過使用保藏菌株作為起始材料，常規(guī)地通過傳統(tǒng)突變或再分離技術(shù)獲得保留有本文描述的相關(guān)特征和優(yōu)勢的進一步的其突變體或衍生物。因此，術(shù)語“其突變體”涉及通過使用保藏菌株作為起始材料獲得的突變體菌株，所述突變體菌株保留或加強了母本菌株的降膽固醇特性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會決定采用合適的方法來確定菌株的降膽固醇活性。測量此活性的可能方法的實例在下文的實施例中顯示。本發(fā)明的菌株的優(yōu)勢在于其尤其可用作益生菌。如上文提到的，益生細菌必須滿足與無毒、活力、粘附性及有益效應(yīng)相關(guān)的幾方面要求。這些益生菌特征甚至在相同種的細菌中都有菌株依賴性。因此，找出在所有益生菌要求上具有更好表現(xiàn)的菌株十分重要。下文的實施例表明本發(fā)明的菌株具有極好的益生菌特征。本發(fā)明的菌株顯示出對于哺乳動物胃腸環(huán)境的條件(酸性環(huán)境，高溶菌酶，膽汁鹽和過氧化氫濃度)具有高度的抗性，因此能夠在通過GIT的過程中存活。所述菌株還對腸上皮有良好的粘著性，這使得其能存留在腸道中并發(fā)揮其益生菌效應(yīng)。與其他商業(yè)菌株相比，本發(fā)明的菌株顯示了對GIT環(huán)境的更好的抗性以及更高的粘著能力。另外，其還顯示出安全性，因為它們沒有毒性效應(yīng)；其不會導(dǎo)致LAB易位的增加，也不會促進宿主哺乳動物中腸細菌的易位。進一步地，本發(fā)明菌株在宿主中具有數(shù)種有益效應(yīng)。除了其降膽固醇活性之外， 由于其拮抗活性，它們有益于腸道微生物群的平衡。術(shù)語“拮抗活性”指的是益生細菌的活性對胃腸非有益細菌的生長的抑制。具有胃腸微生物平衡失調(diào)的病況稱為生態(tài)失調(diào) (disbiosis)，這對人類的健康有多重負面后果。下文會顯示所述菌株相比其他商業(yè)植物乳桿菌株具有更高的抑制病原菌株生長的能力。所述菌株還產(chǎn)生大量的短鏈脂肪酸(SCFA)。由不可消化纖維生產(chǎn)出SCFA是一種有意義的益生能力。此種能力在益生菌中是很需要的，因為所產(chǎn)生的SCFA在宿主中顯示出 /LftWM^^ft (#MWong J. ,"Colonic health fermentation and short chain fatty acids”，J Clin Gastroenterol 2006, vol. 40, p. 235-43) 在 SCFA 中，丙酸和丁酸的產(chǎn)生對于本發(fā)明的內(nèi)容具有更大的意義。所述第一種具有抗炎性效應(yīng)，這在降低系統(tǒng)炎癥上有用。全身炎癥有可能導(dǎo)致動脈粥樣化形成，動脈粥樣化形成是最重要的心血管風險因素之一(參照Naruszewicz M. ,“Potential parapharmaceuticals in the traditional Polish diet，，2005，Journal of Physiology and Pharmacology, vol. 56，suppl 1，p. 69-78)。已知丁酸對結(jié)腸上皮有益，因為其是結(jié)腸細胞主要的能量來源。由于其可在人類宿主中發(fā)揮數(shù)種有益的效應(yīng)，這些益生細菌可用作治療性或預(yù)防性試劑。具體而言，本發(fā)明的菌株有降低血液膽固醇水平的效果。如上文說明的，高膽固醇水平與心血管疾病緊密相關(guān)，因為其促進動脈中粥樣斑的發(fā)展。因此，本發(fā)明的菌株可用于預(yù)防或治療心血管障礙。因此，本發(fā)明另一個方面涉及包含有效量的至少一種本發(fā)明的菌株或其突變體菌株的組合物，用作預(yù)防性和/或治療性試劑。在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的組合物用于預(yù)防或治療動物(包括人)的心血管障礙。在另一個實施方式中，本發(fā)明提供如上文描述的組合物在制備用于預(yù)防和/或治療心血管障礙的藥物中的用途。備選地，其可作為預(yù)防和/或治療動物(包括人)心血管障礙的方法而配制，包括對需要其的所述的動物施用有效量的本發(fā)明的組合物。在另一個實施方式中，將本發(fā)明的組合物用作降血膽固醇試劑。在一個進一步的實施方式中，本發(fā)明提供如上文描述的組合物在制備用于降低膽固醇的藥物中的用途。備選地，其可作為降低動物(包括人)的膽固醇的方法而配制，包括對需要其的所述的動物施用有效量的本發(fā)明的組合物?？蓪⒈景l(fā)明的組合物施用給患有冠脈障礙的患者，也可以施用給健康受試者。在一個特定的實施方式中，接受本發(fā)明組合物的受試者患有高膽固醇血癥。本發(fā)明的益生菌組合物的進一步的優(yōu)勢在于沒有植物留醇呈現(xiàn)出的副作用，已有描述這些留醇與他汀類聯(lián)合使用在留醇高吸收受試者中有不良后果。近期的證據(jù)表明在他汀類單一療法中可見的一些殘余冠心病風險是他汀類的后果，其實際上在留醇(包括植物甾醇)高吸收者患者中增加冠心病風險。留醇高吸收受試者達到人群的約25%，其中大多數(shù)顯示包含腺苷-5，-三磷酸(ATP)結(jié)合盒(ABC)半轉(zhuǎn)運子(half-transporter) ABCG8的多態(tài)性(Goldstein M 等人，"Statins, plant sterol absorption, and increased coronary risk". Journal of Clinical Lipidology，2008，vol. 2，p. 304-305)。進一步地，已經(jīng)有人指出飲食性植物留醇富集與他汀類療法對于升高血液和組織的植物留醇水平有疊加效果， 并且這一點在留醇高吸收者中尤其明顯。本發(fā)明的益生菌組合物沒有這些缺陷，并可與他汀類或任何其他膽固醇藥物聯(lián)合施用給任何人群。因此，在一個特定的實施方式中，將本發(fā)明的組合物施用給留醇高吸收受試者。在另一個具體的實施方式中，本發(fā)明的組合物與他汀類聯(lián)合施用。本發(fā)明的菌株還促進宿主的免疫調(diào)制效應(yīng)，因為其誘導(dǎo)腸粘膜產(chǎn)生改善的細胞因子譜(cytokine pattern) 0所述免疫調(diào)制效應(yīng)對宿主有益，因為其有助于改善疾病抗性及減少過敏風險。已知GIT中生活的革蘭氏陰性細菌在其細胞表面展示有LPS(脂多糖)分子，LPS誘導(dǎo)腸粘膜細胞產(chǎn)生炎性標記物。補充益生菌可改變這種情況，有助于具有更好的生態(tài)健康性或具有針對一些革蘭氏陰性微生物的拮抗特性的革蘭氏陽性細菌在GIT中更多存在(分組為乳酸細菌組群)，因此降低了腸粘膜中存在的LPS。然而，一些益生微生物本身顯示出調(diào)制細胞因子(其為調(diào)節(jié)體內(nèi)炎性及免疫應(yīng)答的信使分子)產(chǎn)生的能力。具體而言，一些益生細菌誘導(dǎo)了腸粘膜中促/抗炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)之間形成更好的平衡形式(而不降低革蘭氏陰性細菌的數(shù)量)。如上文提到的，此種細菌刺激的免疫調(diào)制也具有抗動脈粥樣化效應(yīng)。如下文要闡明的，有發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的菌株本身能促進腸粘膜細胞產(chǎn)生的炎性腫瘤壞死因子-α (TNF-α)水平下降以及抗炎性白介素-IO(IL-IO)水平的增加，從而誘導(dǎo)腸粘膜產(chǎn)生改善的細胞因子譜。此種免疫調(diào)制效應(yīng)通過所述菌株的拮抗特性得以補充，在于減少 GIT中病原性革蘭氏陰性細菌的存在，并降低腸粘膜中LPS的量。包含有效量的至少一種保藏菌株或其突變體的根據(jù)本發(fā)明的組合物可配制成可食用的、藥學的或獸醫(yī)學的產(chǎn)品，其中所述菌株是唯一的活性試劑或與一種或多種其他活性試劑混合和/或與藥學或獸醫(yī)學可接受賦形劑(在其為藥學或獸醫(yī)學產(chǎn)品的情況下) 或合適的添加劑(在其為可食用產(chǎn)品的情況下)相混合。在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，所述產(chǎn)品另外包含一種或多種進一步的活性試劑。優(yōu)選地，添加的活性試劑為其他益生細菌。根據(jù)配方，這些菌株可以以純化細菌、細菌培養(yǎng)物、細菌培養(yǎng)物的部分、已經(jīng)過后處理的細菌培養(yǎng)物的形式，單獨地或連同合適的載體或成分而添加。也可以添加益菌生 (prebiotics)，形成共生組合物。在一個具體的實施方式中，本發(fā)明的組合物另外包含選自低聚果糖和低聚半乳糖的益菌生。在另一個方面，本發(fā)明提供了藥學和/或獸醫(yī)學產(chǎn)品，其包含有效量的含有至少一種保藏菌株或其突變體菌株的組合物，還含有適當量的藥學或獸醫(yī)學可接受賦形劑?；诖朔N考慮，可將所述藥學產(chǎn)品制備成以片劑、丸劑、膠囊、微膠囊、顆粒劑、混懸劑、糖漿、 凍干粉劑、液體制劑等等的形式進行口服施用。出于所述組合物的特定目的，選擇賦形劑及對于用于制劑的最適方法的在藥學技術(shù)領(lǐng)域一般技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)。盡管口服施用是優(yōu)選的方式，也可能采用其他的形式，如注射、直腸給藥或局部施用。如本文所使用的，術(shù)語“藥學可接受的”指的是化合物、材料、組合物和/或劑型， 其在良好的醫(yī)學判斷范圍內(nèi)適合用于與受試者(例如，人)的組織相接觸而無多余毒性、刺激、過敏應(yīng)答或其他問題或并發(fā)癥，并且同時具有合理的利弊比率。每種載體、賦形劑等在與制劑的其他成分相兼容的意義上也必須是“可接受的”。合適的載體、賦形劑等可在標準藥學課本中找到。類似地，術(shù)語“獸醫(yī)學可接受的”指的是適合用于與非人動物的組織接觸。本發(fā)明的菌株還可包含在多種可食用產(chǎn)品中，如乳制品、酸奶、凝乳、乳酪(例如，夸克乳酪、奶油乳酪、加工乳酪、軟和硬乳酪)、發(fā)酵乳、乳品粉末、乳基發(fā)酵產(chǎn)品、冰淇淋、基于谷物的發(fā)酵產(chǎn)品、乳品基粉末、飲品、調(diào)味品和寵物食品。在本文中術(shù)語“可食用產(chǎn)品”是以其最廣泛的意義使用的，其包括可被動物攝取的任何呈現(xiàn)形式的任何類型的產(chǎn)品，但不包括藥學和獸醫(yī)學產(chǎn)品。其他可食用產(chǎn)品的實例為肉制品(例如，肝醬、法蘭克福香腸和沙拉米香腸或肉醬(meat spreads))、及巧克力醬、餡料(例如，松露、奶油)以及起霜制品(frosting)、巧克力、糖果(例如，飴糖(caramel)、軟糖和太妃糖)、烘焙制品(蛋糕、點心)、沙司和湯、果汁及調(diào)咖啡白油(coffee whiteners)。尤其感興趣的可食用產(chǎn)品為膳食補充劑和嬰兒配方食品。在本發(fā)明的意義上，膳食補充劑還包括營養(yǎng)制品 (nutraceutical)——已知其為對人類健康有醫(yī)療作用的食品提取物。用于動物食品的飼料也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明的組合物還可用做其他食物產(chǎn)品的成分。因此，在本發(fā)明的另一個方面，提供了包含本發(fā)明組合物連同適當量的可食用成分的可食用產(chǎn)品。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物為膳食補充劑。所述組合物中每種菌株的菌落形成單位(Cfu)的有效量可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定并要取決于最終的制劑。例如，根據(jù)立法現(xiàn)狀，可食用產(chǎn)品中的一種或多種菌株以大約 105cfu/g-大約1012cfu/g的量存在，優(yōu)選地以大約107cfu/g-大約1012cfu/g的量存在。術(shù)語“菌落形成單位”(“cfu”)定義為瓊脂平板上通過微生物學計數(shù)顯示的細菌細胞數(shù)量。膳食補充劑通常含有量為107-1012cfu/g范圍內(nèi)的益生菌菌株。在一個特定的實施方式中，本發(fā)明的組合物為膳食補充劑，其包括IO9-IO11CfVg,優(yōu)選地為大約IO11CfVg的所述保藏菌株。在另一個實施方式中，所述膳食補充劑包含IO9Cfu的本發(fā)明的一種或多種菌株株。本發(fā)明的組合物的合適施用方案可由本領(lǐng)域技術(shù)人員確立。本發(fā)明的組合物可以一日一次、一周一次、每周數(shù)次或每日數(shù)次進行施用。在另一個實施方式中，每日劑量包含IO9Cfu的本發(fā)明的一種或多種菌株。本發(fā)明的菌株是通過將細菌在合適培養(yǎng)基中并于合適條件下培養(yǎng)而生產(chǎn)的。所述菌株可單獨培養(yǎng)以形成純培養(yǎng)物，或和其他微生物一同作為混合培養(yǎng)物培養(yǎng)，或通過分開培養(yǎng)不同類型細菌然后將其以所需要的比例組合混合。在培養(yǎng)后，回收細胞懸液并如所述進行使用或以所需的方式處理，例如，通過濃縮或凍干，以進一步在制備藥學或可食用產(chǎn)品中采用。有時益生菌制備物要經(jīng)過固定化或封裝加工以改善保質(zhì)期。數(shù)種用于固定化或封裝細菌的技術(shù)在本領(lǐng)域已知(參照Kailasapathy等人，"Microencapsulation of Probiotic Bacteria-Technology and Potential Applications", Curr Issues Intest Microbiol 2002，vol. 3，p.39-48)。如果根據(jù)本發(fā)明的組合物是用作膳食補充劑，其可以以這樣的方式施用——可與合適的可飲用液體(如水、酸奶、乳品或果汁)混合或可與固態(tài)或液態(tài)食品混合。在這種情況下，所述膳食補充劑可以為片劑、丸劑、膠囊、顆粒劑、粉劑、混懸劑、囊劑(sachet)、錠劑、 糖果(sweet)、棒劑(bar)、糖漿和相應(yīng)施用形式，通常為單位劑量形式。優(yōu)選地，本發(fā)明組合物以片劑、膠囊、糖漿或丸劑形式施用，其以制備藥學產(chǎn)品的常規(guī)工藝過程而制備。如下文實施例中顯示的，提供的菌株中每種與商業(yè)可得的植物乳桿菌菌株相比 (如植物乳桿菌或植物乳桿菌VSL#3)，都具有改善的特性。具體而言，由于其驚人的高BSH活性，這三種菌株具有改善的降血膽固醇效應(yīng)。因此，這些菌株中每種都可用于本發(fā)明的組合物中，可以單獨使用或與本發(fā)明其他菌株組合使用。例如，本發(fā)明的組合物可單獨包含有效量的植物乳桿菌菌株CECT 7527或同時包含其與藥學可接受賦形劑、或可食用成分、防腐劑等等。并且，本發(fā)明組合物可包含有效量的植物乳桿菌菌株CECT 7527和植物乳桿菌菌株CECT 75 和/或植物乳桿菌菌株CECT 7529，連同藥學可接受賦形劑、或可食用成分、防腐劑，等等。本發(fā)明一個進一步的方面提供了植物乳桿菌的菌株，其選自植物乳桿菌CECT 7527，植物乳桿菌CECT 7528和植物乳桿菌CECT 7529構(gòu)成的一組，或其突變體菌株，其中突變體菌株是通過使用保藏菌株作為起始材料獲得的，且其中突變體菌株保留或進一步改善了母本菌株的降膽固醇活性。在一個具體的實施方式中，所述菌株選自保藏菌株中的一種。以下章節(jié)描述了本發(fā)明菌株的降血膽固醇的能力，以及其分類學特征和其特異的益生菌特征，包括其對免疫系統(tǒng)的作用。這些實施例不意欲限制本發(fā)明。所得結(jié)果表明本發(fā)明的菌株與商業(yè)植物乳桿菌菌株相比，具有改善的益生菌特征。進一步地，顯示了包含本發(fā)明菌株的組合物比已知的含植物留醇的制劑，具有更好的體內(nèi)降膽固醇活性除非另有規(guī)定，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語都與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同。與本文所描述的方法和材料類似的那些也可在本發(fā)明的實踐中使用。貫穿整個說明書和權(quán)利要求，詞語“包含”及其變體不意欲排除其他技術(shù)特征、添加劑、組分或步驟。本發(fā)明另外的目標、優(yōu)勢及特征會在本領(lǐng)域技術(shù)人員檢查本說明書時對其變得明顯，或者通過對本發(fā)明的實踐得到了解。以下實施例和附圖以示例說明的方式提供，不意欲限制本發(fā)明。進一步地，本發(fā)明涵蓋本文描述的具體和優(yōu)選實施方式的所有可能的組合。
附圖簡述

圖1. Sma-I (A)和 Sfi-I (B)限制性消化 1，植物乳桿菌 299v ；2，F(xiàn)2099 ；3，F(xiàn)3147 ； 4，植物乳桿菌VSL#3 ；5，F(xiàn)3276的基因組DNA產(chǎn)生的脈沖場電泳圖譜。
實施例1.新型菌株的體外降血膽固醇活性本發(fā)明的菌株分離自嬰兒排泄物，并且通過下文描述的方法進行膽汁鹽水解酶 (BSH)活性篩選中就其高性能在其他500種細菌菌株選擇出。所選擇的菌株顯示了明顯的革蘭氏+染色，以及桿菌形態(tài)，而且不形成孢子。菌株根據(jù)的布達佩斯條約保藏于西班牙典型培養(yǎng)物保藏中心(Colecci0n Espafiola de Cultivos Tipo, CECT, Universidad de Valencia, Edificio de investigacion, Campus de Burjassot,46100 Burjassot, Valencia)。發(fā)出了對應(yīng)的存活證明且菌株得到以下的登記號植物乳桿菌CECT 7527 (在本說明書中也稱為F2099)，植物乳桿菌CECT 7528 (在本說明書中也稱為F3147)，以及植物乳桿菌CECT 7529(在本說明書中也稱為F3276)。進入CECT的日期為菌株F3276和F2099 是2009年5月7日，菌株F3147為2009年7月15日。進一步在體外研究所述菌株的降血膽固醇活性并與商業(yè)對照菌株，植物乳桿菌 299v菌株(此處起稱作Lp 299v)及商業(yè)VSL#3培養(yǎng)物中的植物乳桿菌菌株(此處起稱作 Lp VSL#3)進行比較。如上文說明的，已有兩種機制被描述用于降低乳酸細菌引起的膽固醇水平，即，膽汁酸去綴合引起的膽固醇新合成及通過從膳食中同化外源膽固醇。因此，對所有菌株進行BSH活性測定以及培養(yǎng)物的降膽固醇測試。此外，對含有新型菌株不同組合的混合培養(yǎng)物進行測定以確定所述菌株間在BSH及培養(yǎng)物降膽固醇活性方面是否存在協(xié)同效應(yīng)。實驗步驟按 Hyeong-Jun Lim 等人(參照 “ Isolation of cholesterol lowering lactic acid bacteria from human intestine for probiotic use，，，J Vet Sci 2004, vol. 5，p. 391-5)描述的方法進行，有輕微的變動。1·1·膽汁鹽水解酶活性將菌株在MRS肉湯(pH 6. 4)上于30°C，在含5% CO2的氣體條件中培養(yǎng)過夜。孵育后，將培養(yǎng)物標準化至108cfu/ml并制備以下混合培養(yǎng)物F2099+F3147，F(xiàn)2099+F3276, F3147+F3276, F2099+F3147+F3276?；旌吓囵B(yǎng)物含有等量的每種成分菌株且與單一菌株培養(yǎng)物具有相同的總細菌濃度。對單一菌株培養(yǎng)物和混合培養(yǎng)物都進行BSH活性測定。將培養(yǎng)物注入MRS瓊脂平板(補充有4% (w/v)的?；侨パ跄懰徕c鹽(TDCA，Sigma, USA)及 0. 37g/l CaCl2)上的滅菌圓紙片周圍。將平板在無氧條件下于37°C孵育72h，并測量圓片周圍沉淀區(qū)域的直徑。然后通過由抑制區(qū)直徑(IZD)減去圓片直徑(DD)并將此差值除以 2，根據(jù)公式GI = (IZD-DD) /2計算BSH活性(見表1)。表1.膽汁鹽水解酶(BSH)活性
權(quán)利要求
1.組合物，其包含有效量的至少一種選自植物乳桿菌CECT7527、植物乳桿菌CECT 7528及植物乳桿菌CECT 7529的菌株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其包含有效量的菌株植物乳桿菌CECT7527、植物乳桿菌CECT 75 和植物乳桿菌CECT 7529。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任何一項的組合物，用作益生菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任何一項的組合物，用作預(yù)防性和/或治療性試劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，用于預(yù)防和/或治療心血管障礙。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任何一項的組合物，用作降血膽固醇試劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任何一項的組合物，用于與他汀類聯(lián)合使用。
8.根據(jù)權(quán)利要求3-7中任何一項的組合物，用于留醇高吸收受試者。
9.一種藥學和/或獸醫(yī)學產(chǎn)品，其包括有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-2的組合物，以及適當量的藥學或獸醫(yī)學可接受賦形劑。
10.一種可食用產(chǎn)品，其包括有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-2的組合物，以及適當量的其他可食用成分。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的可食用產(chǎn)品，其為膳食補充劑。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的可食用產(chǎn)品，其為營養(yǎng)制品。
13.根據(jù)權(quán)利要求11-12中任何一項的可食用產(chǎn)品，其為片劑、膠囊、糖漿或丸劑的形式。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的可食用產(chǎn)品，其為乳制品或肉制品。
15.植物乳桿菌菌株，其選自植物乳桿菌CECT7527、植物乳桿菌CECT 75 和植物乳桿菌 CECT 7529。
全文摘要
本發(fā)明涉及組合物，其包含有效量的至少一種選自植物乳桿菌CECT 7527、植物乳桿菌CECT 7528及植物乳桿菌CECT 7529的菌株。這些新型菌株具有良好的益生菌特征，并可用于預(yù)防和/或治療心血管障礙。
文檔編號A61K35/74GK102548566SQ201080045298
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月9日
發(fā)明者J·庫內(nèi)卡斯泰拉納 申請人:抗體抗生素股份有限公司