專利名稱：長(zhǎng)雙歧桿菌和功能性胃腸病癥的制作方法
長(zhǎng)雙歧桿菌和功能性胃腸病癥本發(fā)明一般地涉及益生菌的領(lǐng)域。具體而言，其涉及長(zhǎng)雙歧桿菌 (Bifidobacterium longum)NCC3001 (ATCC BAA-999)(下文將其稱之為長(zhǎng)雙歧桿菌 ATCC BAA-999)及其在可攝入的組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明中所述的組合物可以用于治療或預(yù)防功能性胃腸(GI)病癥。功能性胃腸病癥(TOIDs)是包括腸易激綜合征(IBS)和功能性消化不良在內(nèi)的一組疾病，它們是具有高發(fā)病率的慢性病，其特征在于腹部不適或疼痛、胃氣脹和在IBS的情況中的改變的大便習(xí)慣(腹瀉和/或便秘)。在普通人群中reiDs的發(fā)病率相對(duì)高，范圍在15% -30%，造成可觀的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。 已經(jīng)認(rèn)為在8個(gè)最工業(yè)化的國(guó)家中每年僅IBS單獨(dú)的直接成本目前在大約410億美元，同時(shí)具有相當(dāng)多的其它間接成本(例如工作缺勤等)。目前對(duì)reiDs的治療表明至多有邊際效應(yīng)，這在歷史上與對(duì)該疾病的發(fā)病機(jī)理知之甚少有關(guān)。IBS的精確的病理生理學(xué)仍有待解釋。最近的研究已經(jīng)描述了 IBS患者中的粘膜炎癥和腸道微生物群落的變化以及與腸道感染有關(guān)的疾病。某些益生菌表現(xiàn)出抗細(xì)菌、抗病毒和抗炎的性質(zhì)和它們能夠恢復(fù)腸道微生物平衡的事實(shí)表明其可以成為針對(duì)IBS的合適的治療劑。迄今為止，已經(jīng)公開了若干關(guān)于不同益生菌在IBS個(gè)體上的作用的研究。這些研究表明益生菌的應(yīng)用可以與IBS癥狀的改善聯(lián)系起來，并且在IBS中并非全部益生菌都具有相等的效力。最近進(jìn)行的若干薈萃分析的結(jié)論是對(duì)其他的益生菌的效力的論述沒有充分的數(shù)據(jù)(Lynne V McFarland 等人，World J Gastroenterol 2008 May 7 ；14(17) :2650-2661 ； Nourieh Hoveyda 等人，BMC Gastroenterology 2009，9:15)。因此，本發(fā)明的目的是改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)并且特別是提供能夠用于治療或預(yù)防功能性胃腸病癥的組合物，所述的組合物包含有效的、容易獲得的、低價(jià)的和能夠安全給藥且沒有不希望的副作用的可選擇的菌株。本發(fā)明人已經(jīng)解決了這種需要。他們驚訝地發(fā)現(xiàn)其能夠通過獨(dú)立權(quán)利要求的主題來實(shí)現(xiàn)該目的。從屬權(quán)利要求進(jìn)一步發(fā)展本發(fā)明的構(gòu)思。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)治療和/或預(yù)防功能性胃腸病癥的效力取決于所用的細(xì)菌的屬、種和菌株。因此，本發(fā)明的1個(gè)實(shí)施方案是用于治療和/或預(yù)防功能性胃腸病癥的組合物，所述的組合物包含長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999和/或其發(fā)酵的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。本發(fā)明也涉及長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999在制備治療和/或預(yù)防功能性胃腸病癥的組合物中的應(yīng)用。長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999是長(zhǎng)雙歧桿菌種的1種菌株，發(fā)現(xiàn)其特別有效地實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。有利的是，長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999可商購(gòu)得到，其已被檢驗(yàn)并且發(fā)現(xiàn)其例如可用于加入到食品中。長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999(BL999)可以從專業(yè)供應(yīng)商購(gòu)買得到，例如從日本的 Morinaga Milk Industry Co. Ltd.，以 BB536 為商標(biāo)。長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999(BL999)可以根據(jù)任意合適的方法進(jìn)行培養(yǎng)。例如，可以將其加入到冷凍干燥或噴霧干燥形式的產(chǎn)品中。術(shù)語“長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999 (BL999) ”是指包括該細(xì)菌、該細(xì)菌的片段和/或
該細(xì)菌發(fā)酵的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。組合物可以是任意的組合物，但優(yōu)選是經(jīng)口、胃腸內(nèi)或直腸給藥的組合物。例如，組合物可以是可食用的組合物。 “可食用的，，是指經(jīng)批準(zhǔn)用于人或動(dòng)物食用的材料。通常，組合物可以選自食品組合物、寵物食品組合物、膳食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)制品、營(yíng)養(yǎng)配方食品、飲料和/或醫(yī)藥組合物。如果本發(fā)明的組合物是食品組合物，其優(yōu)勢(shì)在于該組合物不但能夠在藥房、藥店中銷售，也能夠在正規(guī)的超級(jí)市場(chǎng)中銷售，在該處任何人可以容易地得到組合物。食品組合物的通常討人喜歡的味道進(jìn)一步有助于產(chǎn)品的可接受性。特別是幼兒或?qū)櫸锟赡芨尤菀椎厥秤镁哂型ǔＯ矚g的味道的組合物。適用于本發(fā)明的食品的實(shí)例是酸乳、乳、調(diào)味乳、冰淇淋、即食甜品、用例如乳或水重構(gòu)的粉末、巧克力奶飲料、麥芽飲料、速食食品、用于人的方便菜肴或飲料、或者用于寵物或家畜的代表全部膳食或部分膳食的食品組合物。因此，在1個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物是用于人、寵物或家畜的食品。組合物可以用于動(dòng)物，所述的動(dòng)物選自狗、貓、豬、牛、馬、山羊、綿羊或家禽。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物是用于成年物種、特別是成年人的食品。本發(fā)明的組合物可以進(jìn)一步含有保護(hù)性水膠體(例如樹膠、蛋白質(zhì)、改性淀粉)、 粘合劑、成膜劑、成膠囊劑/材料、壁/殼材料、基質(zhì)化合物、包衣、乳化劑、表面活性劑、增溶劑(油、脂肪、蠟、卵磷脂等)、吸附劑、載體、填充劑、輔助化合物(co-compounds)、分散劑、 潤(rùn)濕劑、加工助劑(溶劑)、助流劑、掩味劑、增重劑、成膠劑、膠凝劑、抗氧化劑和抗微生物劑。組合物也可以含有常規(guī)的藥物添加劑和輔助劑、賦形劑和稀釋劑，非限制性地包括水、 任意來源的明膠、植物膠、木質(zhì)素磺酸鹽、滑石粉、糖、淀粉、阿拉伯膠、植物油、聚亞烷基二醇，矯味劑、防腐齊 、穩(wěn)定齊 、乳化齊 、緩沖劑、潤(rùn)滑齊 、著色齊 、潤(rùn)濕齊 、填充劑等。在全部情況中，根據(jù)其對(duì)接受者的適用性選擇所述的進(jìn)一步的組分。組合物可以是營(yíng)養(yǎng)上完全的配方食品。
根據(jù)本發(fā)明的組合物可以包含蛋白質(zhì)源?？梢允褂萌我夂线m的膳食蛋白質(zhì)，例如動(dòng)物蛋白(例如乳蛋白、肉蛋白和卵蛋白)；植物蛋白(例如大豆蛋白、小麥蛋白、大米蛋白和豌豆蛋白)；游離氨基酸的混合物； 或其混合物。特別優(yōu)選乳蛋白(例如酪蛋白和乳清蛋白)和大豆蛋白。蛋白質(zhì)可以是完整的或者水解的或者完整的和水解的蛋白質(zhì)的混合物?？赡苄枰?yīng)部分水解的蛋白質(zhì)(水解程度在2和20%之間)，例如用于有發(fā)生牛奶過敏癥風(fēng)險(xiǎn)的人個(gè)體和/或動(dòng)物。而且，預(yù)水解的蛋白質(zhì)源通常更容易被受損傷的胃腸道消化和吸收。
如果需要水解的蛋白質(zhì)，水解過程可以根據(jù)需要和本領(lǐng)域已知的技術(shù)進(jìn)行?？赡苄枰?yīng)部分水解的蛋白質(zhì)(水解程度在2和20%之間)。例如，通過在1個(gè)或多個(gè)步驟中酶促水解乳清蛋白成分可以制備乳清蛋白水解產(chǎn)物。如果作為起始原料使用的乳清蛋白成分基本上沒有乳糖，那么發(fā)現(xiàn)在水解過程中蛋白質(zhì)經(jīng)歷更少的賴氨酸阻斷。這能使賴氨酸阻斷的程度從總賴氨酸重量的約15%減少到約 10%重量的賴氨酸；例如約7%重量的賴氨酸，這極大地改善了蛋白質(zhì)源的營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量。組合物也可以含有碳水化合物源和脂肪源。如果組合物包括脂肪源，脂肪源優(yōu)選地提供組合物能量的5% -40% ；例如 20%-30%的能量。使用芥花油(canola oil)、玉米油和高油酸葵花籽油的混合物可以得到合適的脂肪譜?？梢詫⑻妓衔镌醇尤氲浇M合物中。碳水化合物源優(yōu)選地提供組合物的40% -80%的能量?？梢允褂萌我夂线m的碳水化合物，例如蔗糖、乳糖、葡萄糖、果糖、玉米糖漿固形物、麥芽糖糊精及其混合物。如果需要也可以加入膳食纖維。未經(jīng)酶消化的膳食纖維通過小腸并且發(fā)揮天然的填充劑和輕瀉藥的作用。膳食纖維可以是可溶的或不可溶的，并且通常優(yōu)選這兩種類型的混合物。合適的膳食纖維源包括大豆、豌豆、燕麥、果膠、瓜爾膠、部分水解的瓜爾膠、阿拉伯膠、低聚果糖、酸性寡糖、半乳寡聚糖、唾液酸基乳糖和來源于動(dòng)物乳的寡糖。優(yōu)選的纖維混合物是菊粉與較短鏈的低聚果糖的混合物。優(yōu)選地，如果存在纖維，纖維含量為2-40g/l所消耗的組合物， 更優(yōu)選為4-10g/l。組合物也可以含有礦物質(zhì)和微量營(yíng)養(yǎng)素，例如根據(jù)政府部門(例如USRDA)推薦的微量元素和維生素。例如，組合物每日劑量可以含有1種或多種以下范圍的以下微量營(yíng)養(yǎng)素:300-500mg 鈣，50-100mg 鎂，150_250mg 磷，5_20mg 鐵，l_7mg 鋅，0. 1-0. 3mg 銅， 50-200 μ g 碘，5-15 μ g 硒，1000-3000 μ g β -胡蘿卜素，10_80mg 維生素 C，l-2mg 維生素 Bi，0. 5-1. 5mg 維生素 B6，0. 5_2mg 維生素 B2，5_18mg 煙酸，0. 5-2. 0 μ g 維生素 B12， 100-800 μ g葉酸，30-70 μ g生物素，1-5 μ g維生素D，3-10 μ g維生素E0如果需要，可以將1種或多種食品級(jí)乳化劑加入到組合物中；例如二乙酰酒石酸單和二甘油酯、卵磷脂和單和二甘油酯。類似地可以包括合適的鹽和穩(wěn)定劑。組合物可以是口服和/或腸內(nèi)給藥的；例如以用乳或水重構(gòu)的粉末的形式。根據(jù)本發(fā)明的1個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，組合物包含至少另外1種其他的食品級(jí)的微生物?！笆称芳?jí)”微生物是能安全地用于食物中的微生物。食品級(jí)微生物優(yōu)選是食品級(jí)細(xì)菌或食品級(jí)酵母。食品級(jí)細(xì)菌可以選自乳酸菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌或其混合物。能夠使用食品級(jí)酵母，例如釀酒酵母和/或鮑氏酵母菌。食品級(jí)細(xì)菌可以是益生菌?！耙嫔笔侵笇?duì)宿主的健康或幸福有益的微生物細(xì)胞制劑或微生物細(xì)胞成分。 (Salminen S, Ouwehand A. Benno Y.等人，“益生菌它們應(yīng)當(dāng)如何定義(Probiotics :how should they be defined)" Trends Food Sci. Technol. 1999 :10 107-10)。益生菌優(yōu)選地選自乳酸菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌或其混合物。益生菌可以是具有被證實(shí)的益生菌特性的任意的乳酸菌或雙歧桿菌。例如它們也能夠促進(jìn)雙歧性(bifidogenic)腸道微生物叢的發(fā)育。合適的益生菌可以選自雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬、鏈球菌屬和酵母菌屬或其混合物，特別是選自長(zhǎng)雙歧桿菌、乳雙歧桿菌(Bifidobacterium lactis)、嗜酸乳桿菌、鼠李糖 ？Llf lif (Lactobacillus rhamnosus) >MlJzFSS^LIf lif (Lactobacillus paracasei) ^^] 桿菌(LactcAacillus johnsonii)、植物乳桿菌、唾液乳桿菌、屎腸球菌、鮑氏酵母菌和羅伊乳桿菌或其混合物，優(yōu)選地選自約氏乳桿菌(NCC533 ；CNCM 1-1225)、長(zhǎng)雙歧桿菌(NCC490 ； CNCM 1-2170)、長(zhǎng)雙歧桿菌(NCC2705 ;CNCM H618)、乳雙歧桿菌 Q818 ;CNCM 1-3446), 副干酪乳桿菌(NCC2461 ；CNCM 1-2116)、鼠李糖乳桿菌GG(ATCC 53103)、鼠李糖乳桿菌 (NCC4007 ；CGMCC 1. 3724)、屎腸球菌 SF 68 (NCIMB10415)，及其混合物。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，組合物進(jìn)一步含有至少1種益生元。“益生元”是指用于促進(jìn)腸內(nèi)的益生菌生長(zhǎng)的食物物質(zhì)。因此，益生元能夠促進(jìn)腸內(nèi)的某些食品級(jí)細(xì)菌、特別是益生菌的生長(zhǎng)，并且因此能夠增強(qiáng)長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999的作用。而且，某些益生元對(duì)例如消化具有積極作用。優(yōu)選地，益生元可以選自寡糖并且任選地含有果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；膳食纖維；或其混合物。長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999可以以活細(xì)菌和滅活的非復(fù)制的細(xì)菌物種使用?！胺菑?fù)制的”是指通過經(jīng)典平板培養(yǎng)法不能檢測(cè)到存活的細(xì)胞和/或菌落形成單位。這些經(jīng)典平板培養(yǎng)法在微生物學(xué)書籍中總結(jié)概括James Monroe Jay, Martin J. Loessner, David A. Golden. 2005.現(xiàn)代食品微生物學(xué)(Modern food microbiology)，第 7版，Springer Science, New York, N. Y. 790p。通常，沒有存活的細(xì)胞能夠顯示如下在用不同濃度的細(xì)菌制劑(“非復(fù)制的”樣本)接種和在合適的條件(有氧和/或無氧氣氛至少 24小時(shí))下孵育之后，在瓊脂平板上沒有可見的菌落或者在液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基中沒有渾濁。優(yōu)選至少部分的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999在組合物中是存活的并且優(yōu)選地活著到達(dá)腸道。這樣其能夠持續(xù)在腸道中并且通過繁殖可以增大其效果。其也可以通過與共生的細(xì)菌和/或宿主相互作用來發(fā)揮作用。例如，對(duì)于特殊的無菌食品或藥物，可能優(yōu)選長(zhǎng)雙歧桿菌ATCCBAA-999以非復(fù)制的形式存在于組合物中。因此，在本發(fā)明的1個(gè)實(shí)施方案中，至少部分的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999在組合物中是非復(fù)制的。在治療應(yīng)用中，以足以至少部分地治療或阻止疾病的癥狀及其并發(fā)癥的量給予組合物。將足以實(shí)現(xiàn)這一目的的量定義為“治療有效劑量”。用于該目的的有效量將取決于許多本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的因素，例如疾病的嚴(yán)重性和患者的體重和總體狀況。在預(yù)防應(yīng)用中，本發(fā)明的組合物以足以至少部分地降低發(fā)生疾病的風(fēng)險(xiǎn)的量給予易患或有風(fēng)險(xiǎn)罹患特定疾病的患者。將該量定義為“預(yù)防有效劑量”。而且，精確的量取決于許多患者特異性的因素，例如患者的健康狀況和體重。通常，長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999將以治療有效劑量和/或預(yù)防有效劑量給藥。如果長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999以可存活的形式存在，鑒于這些細(xì)菌能夠寄居腸道并且繁殖，因此在理論上其以任意濃度都是有效的。對(duì)于本發(fā)明的組合物，通常優(yōu)選組合物的每日劑量包含IO4-IO12Cfu (菌落形成單位)的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999。長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999的特別合適的每日劑量為IO4-IO11Cfu,更優(yōu)選為 IO4-IO10Cfu0本發(fā)明的組合物也可以包含相對(duì)于每克組合物干重為IO2-IOiciCfiu優(yōu)選IO2-IO9 的菌落形成單位，更優(yōu)選IO2-IO8Cfu的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCCBAA-999。在滅活的和/或非復(fù)制的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999的情況中，通常優(yōu)選本發(fā)明的組合物包含相對(duì)于每克組合物干重為IO2-IOw的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999的非復(fù)制的細(xì)胞。長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999的特別合適的劑量是相對(duì)于每克組合物干重為IO3-IO8的非復(fù)制的細(xì)胞，更優(yōu)選IO5-IO8的非復(fù)制的細(xì)胞。顯然，非復(fù)制的微生物不形成菌落，因此，術(shù)語細(xì)胞理解為非復(fù)制的微生物的量， 其由復(fù)制的細(xì)菌細(xì)胞的指定的量得到。這包括滅活的、非存活的或死亡、或者以片段(例如 DNA或細(xì)胞壁材料)呈現(xiàn)的微生物?？梢砸运疃刃∮?.2、例如在0. 19-0. 05的范圍內(nèi)、優(yōu)選小于0. 15的粉末形式提
供本發(fā)明的組合物。組合物可以是貯存穩(wěn)定的粉末。低水活度提供貯存穩(wěn)定性并且確保益生菌微生物 (例如長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999)甚至在長(zhǎng)時(shí)間存儲(chǔ)之后仍將保持存活。水活度或^是系統(tǒng)中水的能量狀態(tài)的量度。將其定義為在相同溫度下水的蒸氣壓除以純水的蒸氣壓；因此， 純蒸餾水具有恰好是1的水活度。此外或可選的，可以以包囊劑的形式提供益生菌微生物長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的包囊劑具有治療和技術(shù)優(yōu)勢(shì)。包囊增加細(xì)菌的存活，并且因此增加到達(dá)腸道的活細(xì)菌的數(shù)量。而且，逐漸釋放細(xì)菌使得延長(zhǎng)細(xì)菌對(duì)個(gè)體健康的作用。細(xì)菌可以是微囊密封的，例如如FRM43M7 (Societe des Produits Nestle)所述的，將其引入本文作為參考。簡(jiǎn)要地說，細(xì)菌可以經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥并且將其加入凝膠中。本申請(qǐng)發(fā)明人特別驚訝地發(fā)現(xiàn)能夠成功地使用本發(fā)明的組合物來顯著增加海馬區(qū)BDNF表達(dá)。BDNF(腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子)來自多肽生長(zhǎng)因子的獨(dú)特家族的生長(zhǎng)因子。BDNF和其他的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(例如NGF(神經(jīng)生長(zhǎng)因子)、NT-3(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子- 和NT-4(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-4))對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的健康和良好狀態(tài)是必不可少的。該作用可能能解釋所發(fā)現(xiàn)的對(duì)功能性腸病癥的作用。術(shù)語“功能性胃腸病癥”是指一類腸紊亂，其特征在于沒有能夠解釋癥狀的結(jié)構(gòu)或生化病因的慢性腹部不適。功能性胃腸病癥是本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的，并且其例如被記載并定義為具有歸因于中或下胃腸道的癥狀的功能性胃腸病癥，例如Longstreth等人在腸病學(xué) (GASTROENTEROLOGY) 2006 ；130 :1480-1491 中所述。功能性胃腸病癥可以選自腸易激綜合征；功能性消化不良；功能性便秘，功能性腹瀉；功能性腹痛；功能性氣脹，上腹部疼痛綜合征，餐后不適綜合征(Postprandial Distress Syndrome)，或其組合。例如，可以由本發(fā)明的主題治療或預(yù)防的功能性胃腸病癥包含與焦慮相關(guān)的功能性胃腸病癥。焦慮是心理和生理狀態(tài)，其導(dǎo)致通常與不安、恐懼或擔(dān)憂相關(guān)的不愉快的感覺。例如焦慮是正常的應(yīng)激反應(yīng)。其可以幫助人在工作中或在學(xué)校處理困難的情況，但是當(dāng)過度時(shí)導(dǎo)致焦慮障礙，與焦慮相關(guān)的功能性胃腸病癥是其中的一類。不希望受當(dāng)前理論的限制，發(fā)明人認(rèn)為本發(fā)明的組合物起效所遵循的潛在的機(jī)理與雙向的微生物-腸-大腦軸的調(diào)節(jié)有關(guān)，該軸可能顯著地與心理因素相關(guān)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員清楚，在不脫離所公開的本發(fā)明的范圍的情況下，本說明書中所述的任意特征能夠進(jìn)行自由組合。特別地，用于描述本發(fā)明的組合物的全部特征可適用于本發(fā)明的用途，并且反之亦然。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)來自于以下的實(shí)施例和附圖

圖1表示暗盒/亮盒試驗(yàn)的結(jié)果受到鼠鞭蟲(Trichuris muris,Tm)感染的小鼠在亮盒中所花的總時(shí)間、重新進(jìn)入亮盒的潛伏期和步下的潛伏期。Tm-培養(yǎng)基和Tm-長(zhǎng)雙歧桿菌是指分別用新鮮培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)和長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BM-999處理的Tm感染的小鼠；顯示了用鼠李糖乳桿菌(L.rh)菌株處理的Tm組用于比較。圖2表示受到鼠鞭蟲(Tm)感染的小鼠的大腦海馬區(qū)區(qū)域中原位雜交的結(jié)果。 Tm-長(zhǎng)雙歧桿菌是用長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999處理的Tm感染的小鼠；顯示了用鼠李糖乳桿菌菌株處理的Tm小鼠組用于比較。通過自動(dòng)射線照相術(shù)和圖像分析(右上圖)進(jìn)行35S信號(hào)的定量。圖3表示通過在受到鼠鞭蟲(Tm)感染的小鼠中的髓過氧物酶活性分析(左圖) 和單核細(xì)胞浸潤(rùn)(右圖)測(cè)量的結(jié)腸炎癥所獲得的結(jié)果。Tm-培養(yǎng)基和Tm-長(zhǎng)雙歧桿菌是用新鮮培養(yǎng)基(陰性對(duì)照)和長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999處理的Tm感染的小鼠；顯示了用鼠李糖乳桿菌菌株處理的小鼠Tm組用于比較。
實(shí)施例材料和方法細(xì)菌培養(yǎng)條件益生菌(長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999和鼠李糖乳桿菌NCC4007進(jìn)行對(duì)比)在缺氧條件下在Man-Rogosa-Sharpe (MRS，BioMerieux)培養(yǎng)基(雙歧桿菌的含有0.5%半胱氨酸) 中生長(zhǎng)。在37°C、24h之后，通過在600nm測(cè)量光密度估計(jì)細(xì)菌的數(shù)量(10D600 = IO8細(xì)菌 /mL)。細(xì)菌細(xì)胞通過在4°C以5000X g離心15分鐘沉淀，并且進(jìn)一步以IOltVmL的濃度重新混懸在所用培養(yǎng)基中。ImL的等分試樣保持冷凍直至使用。動(dòng)物購(gòu)買鼠齡在6-8周的雄性BALB/c或AKR小鼠(Harlan，加拿大)并在麥克瑪斯特大學(xué)中心動(dòng)物房(McMaster University Central Animal Facility)飼養(yǎng)在常規(guī)的無特定病原體的單元中。全部實(shí)驗(yàn)都經(jīng)麥克瑪斯特大學(xué)動(dòng)物關(guān)懷委員會(huì)(McMaster University Animal Care Committee) itt}§$||。設(shè)計(jì)慢性鼠鞭蟲感染用鼠鞭蟲(300枚卵/小鼠)(n = 26)或用安慰劑(n = 9)管飼雄性AKR小鼠。然后從第30天用鼠李糖乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌或新鮮的MRS管飼被感染的小鼠10天。未被感染的小鼠從第30天至第40天每天用新鮮的MRS管飼。在給予益生菌或安慰劑的最后，小鼠經(jīng)歷暗盒/亮盒和步下試驗(yàn)。然后處死小鼠，獲得組織樣本。將結(jié)腸樣本固定在福爾馬林中用于組織學(xué)分析或者快速冷凍用于MPO測(cè)定。將大腦快速冷凍在液氮中并且貯藏用于原位雜交。行為測(cè)試暗盒/亮盒使用如文獻(xiàn)中所述的暗盒/亮盒分別評(píng)價(jià)小鼠中的焦慮行為。簡(jiǎn)言之，將每一只小鼠置于照亮的亮盒(30x30cm)的中央，亮盒通過開口(10x3cm)連接到較小的暗盒 (30x15cm)。通過數(shù)碼攝像機(jī)記錄在亮盒中的每一只小鼠的運(yùn)動(dòng)行為10分鐘，并且將其儲(chǔ)存在計(jì)算機(jī)中用于離線分析。由設(shè)盲的觀測(cè)者評(píng)價(jià)若干參數(shù)，包括亮盒中所花費(fèi)的總時(shí)間、 重新進(jìn)入亮盒的潛伏期(在第一次進(jìn)入后在暗盒中所花費(fèi)的時(shí)間)和跨界的數(shù)量(從暗盒到亮盒穿過的次數(shù))。步下試驗(yàn)使用如文獻(xiàn)中所述的步下試驗(yàn)評(píng)價(jià)焦慮行為。簡(jiǎn)言之，將每一只小鼠置于位于黑色地板中部的升高的平臺(tái)(直徑7. 5cm，高3cm)的中央。通過秒表測(cè)量從底座步下的潛伏期；試驗(yàn)的最大持續(xù)時(shí)間是5分鐘。組織學(xué)將結(jié)腸樣本固定在10%福爾馬林中，然后用蘇木精-曙紅染色。在光學(xué)顯微鏡下檢查載玻片，從而為急性和慢性炎癥性浸潤(rùn)分級(jí)。髓過氧物酶活性分析為了評(píng)價(jià)急性腸炎癥，在如前所述的冷凍的組織上進(jìn)行髓過氧物酶活性(MPO)分析。MPO活性表示為單位/mg組織，其中將1個(gè)單位的MPO定義為在室溫在1分鐘內(nèi)能夠?qū)?1 μ mol過氧化氫轉(zhuǎn)化為水的酶的量。在CNS中的原位雜交通過在如前所述的冷凍的大腦切片上使用35S-標(biāo)記的RNA探針進(jìn)行原位雜交， 評(píng)價(jià)在海馬區(qū)中的BDNF和在下丘腦(室旁核)中的CRH的水平(Whitfield等人，1990 ； lister等人，2002)。簡(jiǎn)言之，移除大腦并且通過在_60°C浸入2-甲基丁烷中進(jìn)行快速冷凍并且在-70°C貯存。將低溫恒溫切片12-μ m厚的冠狀部分融裱在明膠涂覆的載玻片上，干燥和在_35°C貯存。組織切片用4%甲醛進(jìn)行固定，用在0. IM三乙醇胺-HC1、pH 8. 0中的 0. 25%醋酸酐進(jìn)行乙?；撍陀寐确氯ブ?。使用Riboprobe System(Promega Biotech, Burlington, ON)分別用 a-35S_UTP(比活性> lOOOCi/mmol ；Perkin-Elmer, Boston, ΜΑ) 和Τ3和Τ7聚合酶從線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄反義BDNF核糖核苷酸探針(來自加利福尼亞歐文大學(xué)的Dr. J. Lauterborn和Dr. C. Gall的贈(zèng)送)和反義CRH核糖核苷酸探針(來自辛辛那提大學(xué)的Dr. James Herman的贈(zèng)送)。將放射標(biāo)記的探針稀釋在雜交緩沖液(0. 6MNaCl, IOmM Tris pH 8. 0, ImM EDTA pH 8. 0，10%右旋糖酐硫酸酯，0. 01 %剪切的鮭魚精子DNA， 0.05%總酵母RNA，XI型，0.01%酵母tRNA，IX Denhardt氏溶液)中，并且將其應(yīng)用于大腦切片(大約500，000CPM/切片)。載玻片在濕潤(rùn)的箱中在55°C孵化過夜。為了減少探針的非特異性結(jié)合，載玻片在室溫在20μ g/ml核糖核酸酶溶液中洗滌30分鐘，然后分別在 50°C在2XSSC中、在55°C和60°C在0. 2XSSC中各洗滌1小時(shí)。載玻片進(jìn)行脫水和風(fēng)干用于自動(dòng)射線照相術(shù)。將載玻片和14C塑料標(biāo)準(zhǔn)品置于靠近膠片(BioMax MR ；Eastman Kodak,Rochester, NY)的χ射線盒中5天并顯像(Kodak醫(yī)學(xué)X射線處理器)。大腦切片和標(biāo)準(zhǔn)品的自動(dòng)射線照相的膠片圖像用具有60mm Nikon鏡頭的固態(tài)照像機(jī)使用QCapture軟件 (Qicam ；Quorum Technologies Inc.，Guelph, ON)和具有圖像軟件的基于蘋果電腦的圖像分析系統(tǒng)(http://rSb. info. nih. gov/nih-image)進(jìn)行數(shù)字化。通過在顯示器上描繪結(jié)構(gòu)測(cè)量透過膠片的透光率。對(duì)于BDNF mRNA，使用用于標(biāo)準(zhǔn)品的Rodbard曲線將透光率轉(zhuǎn)化為放射性水平。對(duì)于CRH mRNA，使用密度分割特征測(cè)量透光率和mRNA信號(hào)的面積。然后計(jì)算的DPM與面積相乘從而產(chǎn)生積分密度。直接從捕獲的圖像進(jìn)行圖解。統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以適當(dāng)?shù)钠骄凳繕?biāo)準(zhǔn)差或具有四分位數(shù)的范圍的中值呈現(xiàn)。使用適當(dāng)?shù)碾p向ANOVA檢驗(yàn)或非配對(duì)t檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。將< 0. 05的ρ值視為統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的。結(jié)果慢性感染了寄生蟲鼠鞭蟲的小鼠在2個(gè)行為測(cè)試中表現(xiàn)出焦慮樣行為的增加1) 在暗盒/亮盒試驗(yàn)中，被感染的動(dòng)物表現(xiàn)出在亮盒中所花費(fèi)的時(shí)間的減少和重新進(jìn)入亮盒的潛伏期的增加；幻在步下試驗(yàn)中，感染增加了從底座上步下的潛伏期(圖1)。用長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999處理、但不用鼠李糖乳桿菌NCC4007處理導(dǎo)致焦慮樣行為降低至正常狀態(tài)。對(duì)行為的影響與僅用長(zhǎng)雙歧桿菌使海馬區(qū)中的鼠鞭蟲介導(dǎo)的BDNF水平降低的正?；嚓P(guān)(圖2)。與之相反，用長(zhǎng)雙歧桿菌以及用鼠李糖乳桿菌處理導(dǎo)致以前由鼠鞭蟲感染引起的髓過氧物酶活性和單核浸潤(rùn)的降低(圖幻，這表明行為的正?；遣灰蕾囉诩?xì)菌的抗炎作用。
權(quán)利要求
1.組合物，其包含用于治療和/或預(yù)防功能性胃腸病癥的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCCBAA-999。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中功能性胃腸病癥選自腸易激綜合征；功能性消化不良；功能性便秘，功能性腹瀉；功能性腹痛；功能性氣脹，上腹部疼痛綜合征，餐后不適綜合征，或其組合。
3.根據(jù)之前的權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中功能性胃腸病癥是與焦慮相關(guān)的。
4.根據(jù)之前的權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中組合物選自食品組合物、寵物食品組合物、膳食補(bǔ)充劑、營(yíng)養(yǎng)制品、營(yíng)養(yǎng)配方食品、飲料和/或醫(yī)藥組合物。
5.根據(jù)之前的權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中組合物另外包含至少1種其他類型的食品級(jí)細(xì)菌，其中食品級(jí)細(xì)菌優(yōu)選地選自乳酸菌、雙歧桿菌、丙酸桿菌或其混合物。
6.根據(jù)之前的權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中組合物進(jìn)一步含有至少1種益生元。
7.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中益生元選自寡糖并且任選地含有果糖、半乳糖、甘露糖、大豆和/或菊粉；膳食纖維；或其混合物。
8.根據(jù)之前的權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中至少5%、優(yōu)選至少10%、更優(yōu)選至少 15%的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999在組合物中是活的。
9.根據(jù)之前的權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中至少80%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少 95%的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999在組合物中是非復(fù)制的。
10.根據(jù)之前的權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其中組合物每日劑量包含IO4-IOltl個(gè)細(xì)胞的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項(xiàng)的組合物，其中組合物包含相對(duì)于每g組合物干重為 IO2-IO8個(gè)細(xì)胞的長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999。
12.根據(jù)之前的權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其進(jìn)一步含有蛋白質(zhì)源，所述的蛋白質(zhì)源包含水解的乳清蛋白。
13.粉末形式的根據(jù)之前的權(quán)利要求任一項(xiàng)的組合物，其具有小于0.2的水活度，例如在0. 19-0. 05的范圍，優(yōu)選小于0. 15。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及益生菌的領(lǐng)域。具體而言，其涉及長(zhǎng)雙歧桿菌，例如長(zhǎng)雙歧桿菌ATCC BAA-999，及其在可攝入的組合物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的組合物可以用于治療或預(yù)防功能性胃腸病癥。
文檔編號(hào)A61P1/00GK102573863SQ201080048017
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
發(fā)明者E·韋爾杜德貝爾希克, G·伯根則里德剛達(dá), P·貝爾?？? P·麥克林, S·M·柯林斯 申請(qǐng)人:雀巢產(chǎn)品技術(shù)援助有限公司