專利名稱：二甲雙胍在癌癥治療和預(yù)防中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對癌癥進(jìn)行化療治療可有效地減小腫瘤塊，但是該疾病經(jīng)常復(fù)發(fā)(relapse)。為解釋這一現(xiàn)象，癌干細(xì)胞假說認(rèn)為，腫瘤內(nèi)含有少量成瘤的、自我更新的癌干細(xì)胞，這些癌干細(xì)胞處于非成瘤癌細(xì)胞群中(1，2)。不同于腫瘤中的大多數(shù)細(xì)胞，癌干細(xì)胞對公知 (well-defined)的化學(xué)療法具有抗性，并且在治療后，癌干細(xì)胞可通過其干細(xì)胞樣行為 (stem cell-like behavior)在腫瘤內(nèi)再生出所有細(xì)胞類型。因此，盡管目前一無所知，但是選擇性地以癌干細(xì)胞作為靶標(biāo)的藥物為癌癥治療提供了很大的希望。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明一方面涉及在有需要的受試者體內(nèi)對癌癥/腫瘤進(jìn)行治療的方法，所述方法包括給予增強(qiáng)量的二甲雙胍和減少量的一種或多種化療劑。在一個實(shí)施方式中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為250mg/天。本發(fā)明另一方面涉及一種組合物，所述組合物包含增強(qiáng)量的二甲雙胍、減少量的一種或多種化療劑以及藥學(xué)上可接受的載體。在一個實(shí)施方式中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為約 25mg、75mg 或 250mgo本發(fā)明另一方面涉及在受試者體內(nèi)預(yù)防癌癥或延緩癌癥復(fù)現(xiàn)(recurrence)的方法，所述方法包括向受試者給予有效量的二甲雙胍。在一個實(shí)施方式中，二甲雙胍的量為約 75mg/ 天。本發(fā)明另一方面涉及一種試劑盒，所述試劑盒包含瓶裝(vial)的二甲雙胍；瓶裝的一種或多種化療劑；以及使用二甲雙胍和化療劑的說明書。


圖IA-圖IB包括了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的圖示，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，二甲雙胍防止了 MCFlOA-ER-Src細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。圖IA 在所示濃度的二甲雙胍下，在1 μ M的4-羥基他莫昔芬 (TAM)存在或不存在時，細(xì)胞生長Mh后的數(shù)目。圖IB 在所示濃度二甲雙胍存在的情況下， 在未處理或經(jīng)TAM處理的細(xì)胞中的乳腺球(mammospheres)、在軟瓊脂中的集落以及病灶的相對數(shù)目。圖2為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的柱狀圖，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，二甲雙胍抑制了乳腺球的生長。用 0. ImM二甲雙胍對來自所示細(xì)胞系的6天齡乳腺球處理4 或不進(jìn)行處理，對乳腺球的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)。圖3A-圖3C包括了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的圖示，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，二甲雙胍選擇性地殺滅癌干細(xì)胞并與多柔比星協(xié)同地發(fā)揮作用。圖3A:在轉(zhuǎn)化后(ΤΑΜ處理36h)的MCF-10A群中的癌細(xì)胞(⑶44低/⑶M高；灰色)和癌干細(xì)胞(⑶44高/⑶M低；黑色)的數(shù)目，用多柔比星、0. ImM 二甲雙胍或兩者的結(jié)合(n = 3)對所述的MCF-10A群進(jìn)行了處理。圖將通過分選(sorting)得到的癌干細(xì)胞(SC)和非干細(xì)胞癌細(xì)胞(NSC)用0. ImM 二甲雙胍處理 0h、24h和48h。圖3C 在注射MCFlOA-ER-Src癌干細(xì)胞后，在所示天數(shù)時裸鼠體內(nèi)的腫瘤體積，所述癌干細(xì)胞在注射前用0. ImM 二甲雙胍處理Ih或不進(jìn)行處理。圖4A-圖4B包括了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的圖示，該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，二甲雙胍和多柔比星組合在裸鼠體內(nèi)起到減小腫瘤塊并延長癥狀緩解(remission)的作用。圖4A:用轉(zhuǎn)化后的 MCFlOA-ER-Src細(xì)胞注射(時間0表示注射時間)的小鼠的腫瘤體積(平均值和95%置信區(qū)間)，所述小鼠未經(jīng)處理、或每5天(3個周期；箭頭表示天數(shù)或注射情況)多柔比星(DoX)、100yg/ml 二甲雙胍(Met)或兩者同時通過腹膜內(nèi)注射對小鼠進(jìn)行處理。圖 4B:由3個處理周期后(第25天)的腫瘤得到的細(xì)胞中的癌干細(xì)胞(CD44高/CDM低)數(shù)目，所述腫瘤用Dox或Dox+Met的組合進(jìn)行處理。
具體實(shí)施例方式癌干細(xì)胞假說認(rèn)為，與腫瘤內(nèi)的大多數(shù)癌細(xì)胞不同，癌干細(xì)胞能抵抗化療藥物并可在腫瘤內(nèi)再生出各種細(xì)胞類型，從而引起疾病的復(fù)發(fā)。因此，選擇性地以癌干細(xì)胞作為靶標(biāo)的藥物為癌癥治療提供了很大的希望(特別是與化療結(jié)合時)。我們在本文中證明在四種遺傳學(xué)上不同的乳腺癌中，低劑量的二甲雙胍(糖尿病的標(biāo)準(zhǔn)藥物)抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化并選擇性地殺滅癌干細(xì)胞。二甲雙胍和公知化療劑多柔比星的組合同時殺滅培養(yǎng)物中的癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞癌細(xì)胞。此外，在異種移植小鼠模型中，這一組合療法比二者中的任一種單一藥物都更有效地減小腫瘤塊并防止復(fù)發(fā)。在用二甲雙胍和多柔比星進(jìn)行組合治療結(jié)束后至少兩個月內(nèi)，小鼠仍然沒有腫瘤。這些結(jié)果提供了支持癌干細(xì)胞假說的進(jìn)一步證據(jù)，并且它們?yōu)閷⒍纂p胍和化療藥物的組合用以改進(jìn)對患有乳腺癌和其他癌癥的患者的治療提供了理論根據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本發(fā)明的各方面基于如下發(fā)現(xiàn)二甲雙胍增強(qiáng)了在治療性療法(例如癌癥治療) 中所使用的化療劑的抗腫瘤作用。因而，使產(chǎn)生治療性抗腫瘤作用所需化療劑的量減少。化療劑的量的減少使得化療劑對受者(recipient)的副作用減弱。因此，本發(fā)明一方面針對提高化療劑的抗腫瘤作用的方法，所述方法包括向有需要的患者給予增強(qiáng)量的二甲雙胍和減少量的化療劑。定義本文所使用的詞組“細(xì)胞毒素劑”意味著用于對異常和不受控的進(jìn)行性細(xì)胞生長進(jìn)行治療的藥劑。細(xì)胞毒素劑優(yōu)選包括例如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、長春新堿、多柔比星、柔紅霉素、苯丁酸氮芥、卡氮芥、長春花堿、氨甲蝶呤和紫杉醇。本文所使用的二甲雙胍的“增強(qiáng)量”這一術(shù)語是足以對化療劑(例如細(xì)胞毒素劑) 或治療(例如放療)的抗腫瘤作用產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)上顯著、可重現(xiàn)的增強(qiáng)作用的量。可通過本領(lǐng)域已知的各種手段測定抗腫瘤作用的增強(qiáng)。例如，可通過產(chǎn)生抗腫瘤作用所需治療或藥劑的給予量發(fā)生統(tǒng)計學(xué)上顯著的減少來確定抗腫瘤作用的增強(qiáng)。例如，通過與在二甲雙胍不存在時接受標(biāo)準(zhǔn)量治療的適當(dāng)對照組進(jìn)行比較來確定這一點(diǎn)。本文所使用的術(shù)語“化療劑”是指用于腫瘤治療的化學(xué)品或藥物。這類藥劑通常為細(xì)胞毒素劑。本文所使用的術(shù)語“放療”是指使用電離輻射來殺滅癌細(xì)胞并使腫瘤縮小。本文所使用的化療劑(例如細(xì)胞毒素劑)或治療的“減少量”這一術(shù)語是指比為治療腫瘤向患有腫瘤的受試者給予的標(biāo)準(zhǔn)量更低、但產(chǎn)生相同或更好的治療結(jié)果的量。 使用減少量的化療劑或腫瘤治療的一個益處是減弱了受者所受到的副作用，同時得到了相同或提高的治療結(jié)果。量的減少可以是在一次或多次個體給予(劑量)時給予的量的減少、給予頻率的降低或這兩種情況的結(jié)合。已向本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了標(biāo)準(zhǔn)劑量和給予計劃方案的指南(例如，在Physicians' Desk Reference，第56版(2002)，出版商Edward R-Barnhart，新澤西(“PDR”)中的記載)。減少量比治療性給予中常用的標(biāo)準(zhǔn)劑量明顯更低(例如，減少至標(biāo)準(zhǔn)劑量的約90<%、80%或70<%)。在某些實(shí)例中，將可從減少至小于標(biāo)準(zhǔn)劑量的75%的劑量給予(例如，在標(biāo)準(zhǔn)劑量的約75%-25%內(nèi)進(jìn)行給予)中獲得治療益處。預(yù)期從減少至標(biāo)準(zhǔn)劑量的約60%、50%或40%的劑量給予中獲得治療益處。在某些實(shí)例中，將從減少至小于標(biāo)準(zhǔn)劑量40%的劑量給予(例如，在標(biāo)準(zhǔn)劑量的約40% -10%內(nèi)進(jìn)行給予)中獲得治療益處。在一個實(shí)施方式中，所述劑量為標(biāo)準(zhǔn)劑量的約30%。在一個實(shí)施方式中，所述劑量為標(biāo)準(zhǔn)劑量的約20%。在一個實(shí)施方式中，所述劑量為標(biāo)準(zhǔn)劑量的約 10%。本文所使用的術(shù)語“抗腫瘤作用，，或“抗癌作用，，是指使腫瘤的生長、生長速率、 尺寸、擴(kuò)散、轉(zhuǎn)移得以減慢；以及預(yù)防個體體內(nèi)腫瘤的發(fā)生和/或復(fù)現(xiàn)。在“對受試者進(jìn)行治療”中的術(shù)語“治療”意味著尤其是出于阻止不期望的生理學(xué)或醫(yī)學(xué)病癥發(fā)展或惡化的目的、或者出于使受試者體內(nèi)的此類病癥得以改善的目的，對該受試者(人或動物)給予醫(yī)療救助。除非另有說明，術(shù)語“治療”不局限于任何具體的時長或任何具體的劑量水平。在本文中，術(shù)語“組合物”或“藥物組合物”可互換使用，并且是指通常包含賦形劑 (例如本領(lǐng)域常規(guī)的、適合于向受試者給予的藥學(xué)上可接受的載體)的組合物或制劑?？蓪⑦@類組合物進(jìn)行具體配制，用以通過數(shù)種途徑(包括但不限于口服給予、眼部給予和鼻部給予等)中的一種或多種途徑進(jìn)行給予?！八帉W(xué)上可接受的載體”意味著與靶向輸送組合物混合和/或向受試者遞送靶向輸送組合物的任何藥學(xué)上可接受的手段。本文所使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”意味著參與將受試藥劑從生物體的一個器官或部分搬運(yùn)或轉(zhuǎn)運(yùn)至生物體的另一器官或部分的藥學(xué)上可接受的材料、組合物或輔料，如液態(tài)或固態(tài)的填充劑、稀釋劑、賦形劑、溶劑或包封材料。從與制劑的其它成分相容的意義上來說，各載體必須是“可接受的”，并且各載體與向受試者(例如人)進(jìn)行的給予是相容的。
本文所使用的“受試者”是指動物，如哺乳動物、鳥類、爬行動物、兩棲動物或魚類。 術(shù)語“哺乳動物”旨在涵蓋單數(shù)和復(fù)數(shù)的“哺乳動物”，并且包括但不限于人類；靈長類動物，如猿、猴、猩猩和黑猩猩；犬科動物，如狗和狼；貓科動物，如貓、獅子和虎；馬科動物，如馬、牛、驢和斑馬；食用動物，如牛、豬和羊；有蹄類動物，如鹿和長頸鹿；嚙齒類動物，如小鼠、兔、大鼠、倉鼠和豚鼠。在本文中，術(shù)語“個體”、“受試者”和“患者”可互換使用，并且是指動物，例如哺乳動物(如人)。本文所使用的術(shù)語“二甲雙胍”是指二甲雙胍或其藥學(xué)上可接受的鹽，例如鹽酸鹽；1999年3月4日提交的美國申請?zhí)?9/262,5 中公開的二甲雙胍O 1)琥珀酸鹽、 二甲雙胍O 1)富馬酸鹽；氫溴酸鹽；對氯苯氧基乙酸鹽或雙羥萘酸鹽(embonate)；以及包括美國專利號3，174，901中所公開的鹽在內(nèi)的其他已知的一元羧酸二甲雙胍鹽和二元羧酸二甲雙胍鹽；所有這些鹽被統(tǒng)稱為二甲雙胍。本文中所使用的二甲雙胍可以是二甲雙胍鹽酸鹽，即，以Glucophage. RTM. (Bristol-Myers Squibb公司的商標(biāo))進(jìn)行銷售。本文所使用的術(shù)語“衍生物”是指具有類似化學(xué)結(jié)構(gòu)和類似功能的化合物。在本申請文件和所附的權(quán)利要求書中，除非上下文另有清楚規(guī)定，否則，單數(shù)形式 “一(a/an)”和“該/所述(the) ”涵蓋復(fù)數(shù)個的所指物。因此舉例來說，提到用于遞送“一種藥物”的組合物包括提到兩種以上藥物的情況。在本發(fā)明的描述和權(quán)利要求中，將根據(jù)下文闡明的定義使用接下來的術(shù)語。本發(fā)明另一方面涉及在受試者腫瘤治療期間使化療劑的副作用減弱的方法，所述方法包括向受試者給予增強(qiáng)量的二甲雙胍和減少量的化療劑，其中，與化療劑的常規(guī)量相比，所給予的化療劑的量引起較弱的副作用。本發(fā)明進(jìn)一步針對腫瘤抑制藥物組合物，所述組合物包含增強(qiáng)量的二甲雙胍和減少量的一種或多種化療劑，其中，化療劑的腫瘤抑制量為使得副作用減弱的量。在本文所述方法的一個實(shí)施方式中，化療劑對癌干細(xì)胞沒有抑制作用。在本文所述方法的另一實(shí)施方式中，化療劑對癌干細(xì)胞具有抑制作用。同時還預(yù)想到癌干細(xì)胞的抑制性化療和非抑制性化療的組合治療。在一個實(shí)施方式中，隨標(biāo)準(zhǔn)化療劑(例如減少量的化療劑)的混合物一起，向腫瘤 (例如癌癥)移除手術(shù)后的患者給予增強(qiáng)量的二甲雙胍。如本文所討論，還希望共同給予二甲雙胍的效果能增強(qiáng)其他形式的抗腫瘤治療 (例如激素治療(如干擾素治療)或放療)。因而可選地，可使用增強(qiáng)量的二甲雙胍并使用減少量的這些其他形式的腫瘤治療及其相應(yīng)的治療劑(減少給予和/或頻率)，來進(jìn)行本文所述的使用化療劑的治療方法。同時還預(yù)想到將增強(qiáng)量的二甲雙胍與一種或多種治療組合使用，和/或與一種或多種本文所述的其他療法組合使用。如本文所討論，進(jìn)一步希望共同給予二甲雙胍的效果能增強(qiáng)其他殺滅腫瘤/癌癥細(xì)胞的藥劑的作用。這包括傳統(tǒng)上并不是化療組成部分的其他藥劑(例如藥物)，如影響細(xì)胞轉(zhuǎn)化的藥物(例如Exendin4、阿斯匹林、美洛昔康、噴哚美辛、塞來考昔、卩比羅昔康、尼美舒利(nimesulfide)、舒林酸、tocilizumab、辛伐他汀、淺藍(lán)菌素、美伐他汀)。通過共同給予二甲雙胍，可在協(xié)同作用/增強(qiáng)作用的分析(例如本文所述的細(xì)胞分析)中對這類藥劑進(jìn)行試驗(yàn)。因而可選地，可使用增強(qiáng)量的二甲雙胍并使用減少量的這些其他的腫瘤/癌癥殺滅劑(減少給予和/或頻率)，進(jìn)行本文所述的使用化療劑的治療方法。這類殺滅腫瘤/ 癌細(xì)胞的藥劑包括但不限于抗體(例如抗HER2)、他莫昔芬和抑制轉(zhuǎn)化的其他化合物。同時還預(yù)想到將增強(qiáng)量的二甲雙胍與一種或多種治療和/或藥劑組合使用，和/或與一種或多種其他療法和/或本文所述的藥劑組合使用。二甲雙胍對給定的化療劑或治療進(jìn)行增強(qiáng)、從而使向受試者給予的量減少的能力在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。例如，當(dāng)與二甲雙胍組合給予時，通過藥劑或治療的效力增高(與一種或多種未給予二甲雙胍的適當(dāng)對照相比)，證明了對化療劑或腫瘤治療的增強(qiáng)作用。可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員判斷治療的效力?？稍诎┌Y和腫瘤的動物模型中對效力進(jìn)行評價，例如對患有癌癥的嚙齒類動物進(jìn)行治療；并且使得腫瘤的至少一種癥狀減緩 (例如腫瘤尺寸減小或者腫瘤生長速率減緩或停止)的任何治療或者是組合物或制劑的給予都表示有效處理。還可以使用癌癥的實(shí)驗(yàn)動物模型(例如野生型小鼠或大鼠，或優(yōu)選植入與下文實(shí)施例所述的腫瘤細(xì)胞類似的腫瘤細(xì)胞)判斷任何給定制劑的效力。當(dāng)使用實(shí)驗(yàn)動物模型時，腫瘤癥狀減輕(例如與未治療的動物對比，在治療后的動物中更早出現(xiàn)腫瘤尺寸的減小或者腫瘤生長速率的減緩或停止)證明了治療的效力?！案纭币馕吨鴾p輕作用(例如腫瘤尺寸的減小)至少早5%發(fā)生，但更優(yōu)選例如早1天、早2天、早3天以上。在下文實(shí)施例部分中詳述的實(shí)驗(yàn)表明，二甲雙胍選擇性地殺滅癌干細(xì)胞，并且這一殺滅作用在癌干細(xì)胞暴露于相對低濃度的二甲雙胍時發(fā)生。因而，本發(fā)明另一方面涉及預(yù)防或者延緩受試者體內(nèi)腫瘤/癌癥發(fā)展的方法，所述方法包括向受試者給予二甲雙胍。例如，這類受試者可能易感于腫瘤發(fā)展(例如遺傳學(xué)原因或者由于暴露于致癌物質(zhì))。 這類遺傳傾向性的實(shí)例包括brcal、brcall、rb或p53基因中的易感突變(predisposing mutations)，但不限于此。在一個實(shí)施方式中，受試者此前接受過化療或放療，并且處于繼發(fā)性癌癥發(fā)展的高風(fēng)險下。一種此類實(shí)例是進(jìn)行過兒童期白血病或淋巴瘤治療的受試者。 在一個實(shí)施方式中，通過本文所述的方法給予二甲雙胍來接觸癌前病變(例如皮膚病變)， 由此預(yù)防所述病變發(fā)展成為癌癥。在另一實(shí)施方式中，在移除此類病變后給予二甲雙胍 (例如與移除部分接觸)。本發(fā)明另一方面涉及在血癌治療中的自體移植之前，用二甲雙胍處理骨髓或外周血骨髓干細(xì)胞樣本，由此減少癌干細(xì)胞。這類處理將降低干細(xì)胞再種植(reseeding)的可能性。在一個實(shí)施方式中，在已經(jīng)進(jìn)行移植后(例如，在移植后數(shù)天、數(shù)周、數(shù)月或一年)，可向接受移植物的受試者給予二甲雙胍。本發(fā)明另一方面涉及為了在受試者體內(nèi)長期預(yù)防癌癥，給予低劑量的二甲雙胍。 在一個實(shí)施方式中，以補(bǔ)充有二甲雙胍的常規(guī)食品或膳食補(bǔ)充劑的形式進(jìn)行給予(例如 經(jīng)配制的動物飼料，如狗糧、貓糧；或者常規(guī)給予家畜的食物)。本發(fā)明還涵蓋了這類膳食補(bǔ)充劑和食物的制劑。本發(fā)明另一方面涉及對二甲雙胍衍生物在癌細(xì)胞殺滅方面使化療劑、腫瘤殺滅劑和其他治療增強(qiáng)的能力進(jìn)行試驗(yàn)的分析。本領(lǐng)域技術(shù)人員可將下文實(shí)施例部分中所述的細(xì)胞分析適用于此類分析。劑量和給予在治療性應(yīng)用中，所使用的化療劑或治療的標(biāo)準(zhǔn)劑量和給予計劃可根據(jù)許多可變因素而變化，例如所給予的細(xì)胞毒素劑或治療的組合；腫瘤類型；接受患者的年齡、體重和臨床病癥；給予途徑；以及給予治療的臨床醫(yī)生或執(zhí)業(yè)醫(yī)師的經(jīng)驗(yàn)和判斷。然而，本發(fā)明使得劑量和/或給予計劃明顯減少，由此使治療的副作用降低。在一個實(shí)施方式中，給予的二甲雙胍的量可為用于治療2型糖尿病的治療性給予中的常用標(biāo)準(zhǔn)劑量(約1500mg/天至約2550mg/天)。在另一實(shí)施方式中，二甲雙胍的治療量(例如，用于增強(qiáng)用化療進(jìn)行的腫瘤治療、或用于預(yù)防腫瘤發(fā)展)比用于治療2型糖尿病的治療性給予中的常用標(biāo)準(zhǔn)劑量明顯更低，例如減少至標(biāo)準(zhǔn)劑量的約90% (或約1350mg/ 天)、標(biāo)準(zhǔn)劑量的80% (或約1200mg天)、或者標(biāo)準(zhǔn)劑量的70% (或約1050mg/天)。在某些實(shí)例中，將從標(biāo)準(zhǔn)劑量減少至低于75%的劑量給予中獲得治療性益處，例如在標(biāo)準(zhǔn)劑量的約75% -25% (或約1125mg/天至約375mg/天)之中進(jìn)行給予。預(yù)期從減少至標(biāo)準(zhǔn)劑量的約60% (或約900mg/天)、標(biāo)準(zhǔn)劑量的50% (或約750mg/天)、或者標(biāo)準(zhǔn)劑量的40% (或約600mg/天)的劑量給予中獲得治療性益處。在某些實(shí)例中，將從標(biāo)準(zhǔn)劑量減少至低于40%的劑量給予中獲得治療性益處，例如在標(biāo)準(zhǔn)劑量的約40% -10% (或約600mg/天至約150mg/天)之中進(jìn)行給予。在一個實(shí)施方式中，所述劑量為標(biāo)準(zhǔn)劑量的約30% (或約 450mg/天)。在一個實(shí)施方式中，所述劑量約為標(biāo)準(zhǔn)劑量的20% (或約300mg/天)。在一個實(shí)施方式中，所述劑量為標(biāo)準(zhǔn)劑量的約10% (或約150mg/天)。進(jìn)行給予使得所給予的藥劑(例如二甲雙胍和化療劑)與腫瘤或腫瘤部位(例如腫瘤移除后)接觸。本領(lǐng)域已知合適的給予途徑。本文所述藥劑可以臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)的任何適當(dāng)方式給予，如在Physicians' Desk Reference，第56版^00 出版商Edward R-Barnhart，新澤西(“PDR”)中所述的方式。例如胃腸外給予、腸內(nèi)給予、局部給予。可通過本技術(shù)領(lǐng)域已知的任何手段給予組合后的藥劑或分別給予各藥劑。此類模式包括口服給予、直腸給予、鼻部給予、局部給予(包括口腔含化和舌下給予)或者胃腸外給予(包括皮下給予、肌內(nèi)給予、靜脈內(nèi)給予和皮內(nèi)給予)。可將二甲雙胍和被增強(qiáng)的藥劑全身給予，或者局部給予至腫瘤部位或腫瘤部位附近(例如，通過向腫瘤中或向含有腫瘤的人體的器官或部分中進(jìn)行注射)。在一個實(shí)施方式中，二甲雙胍和被增強(qiáng)的治療劑(例如化療劑)均給予至中樞神經(jīng)系統(tǒng)?？稍谛g(shù)前或者術(shù)后給予，或者術(shù)前和術(shù)后均進(jìn)行給予。在一個實(shí)施方式中，在手術(shù)和腫瘤移除前，一天三次(例如25mg/劑)給予二甲雙胍，給予1個月。本文所述方法中的二甲雙胍給予(當(dāng)與化療劑一起應(yīng)用時)可進(jìn)行持續(xù)的一段時間(例如6-12個月，或者1年、2年、3年，或者無限期)。在一個實(shí)施方式中，二甲雙胍比化療劑更頻繁地給予。例如，當(dāng)每天給予二甲雙胍(例如250mg/天)時，可以將化療劑(例如多柔比星)以顯著降低的頻率(例如3天/月)給予受試者，而非按處方規(guī)定。通常，劑量和給予計劃應(yīng)該足以使腫瘤的生長減緩、優(yōu)選消退、還優(yōu)選引起腫瘤的完全消退。在某些情況下，可通過腫瘤特異性標(biāo)記物的血中濃度降低來監(jiān)測消退作用。藥劑的有效量是提供了由臨床醫(yī)生或其他有資格的觀察者記錄的、客觀上可確認(rèn)的改進(jìn)的量。 通常參考腫瘤的直徑來測定患者體內(nèi)的腫瘤消退。腫瘤直徑的減小表明了消退。還可通過在停止治療后腫瘤不復(fù)現(xiàn)來表明消退作用。二甲雙胍和化療劑的組合或單獨(dú)的二甲雙胍和化療劑以周期性的間隔進(jìn)行遞送， 該間隔可從一天數(shù)次到每月一次進(jìn)行變動。如上所述，給予藥劑直至已經(jīng)獲得期望的治療結(jié)果。另外，為避免副作用，在每次給予時，并非組合中的所有組分都需要遞送。治療劑通過其作用機(jī)理可將現(xiàn)有可用的細(xì)胞毒素類藥物大致地分為四組烷化劑、抗代謝物、抗生素和各種各樣的其他活性物質(zhì)。為治療患有癌癥的個體而對具體細(xì)胞毒素劑進(jìn)行的選擇受到許多因素的影響，包括癌癥類型、患者年齡和總體健康狀況、以及多藥耐藥性的問題。本發(fā)明的組合物可利用多種細(xì)胞毒素劑，包括但不限于以下藥劑(包括可能的來源)烷化劑，環(huán)磷酰胺(Bristol-Meyers Squibb)、異環(huán)磷酰胺(Bristol-Meyers Squibb)、苯丁酸氮芥(Glaxo Wellcome)和卡氮芥(Bristol-Meyers Squibb)；抗代謝物， 阿糖胞苷(Pharmacia&Upjohn)、6_ 巰基嘌呤(Glaxo flfellcome)、6_ 硫代鳥嘌呤(Glaxo Wellcome)和氨甲蝶呤(Immunex)；抗生素，多柔比星(Pharmac i a&Up john)、柔紅霉素 (NeXstar)和米托蒽醌(Immimex)；以及各種各樣的藥劑，如長春新堿(Lilly)、長春花堿 (Lilly)和紫杉醇(Bristol-Meyers Squibb)。優(yōu)選的細(xì)胞毒素劑包括環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、多柔比星、柔紅霉素、米托蒽醌和長春新堿。最優(yōu)選的細(xì)胞毒素劑為環(huán)磷酰胺和異環(huán)磷酰胺?；焺┦潜绢I(lǐng)域已知的，并且至少包括紫杉烷類、氮芥類、氮丙啶衍生物、烷基磺酸鹽/酯、亞硝基脲、三氮烯；葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物、長春花生物堿、抗生素、酶、鉬配位絡(luò)合物、取代尿素、甲基胼衍生物、腎上腺皮質(zhì)抑制劑或拮抗劑。具體而言，化療劑可以是選自類固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素藥或雄激素的非限制性組中的一種或多種藥劑。更具體而言，化療劑可以是阿扎立平、博來霉素、苔蘚抑素-1、白消安、卡氮芥、苯丁酸氮芥、卡鉬、順鉬、CPT-11、環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷、達(dá)卡巴嗪、放線菌素D、柔紅霉素、地塞米松、己烯雌酚、多柔比星、炔雌醇、依托泊苷、氟尿嘧啶、氟羥甲睪酮、吉西他濱、己酸羥孕酮、 羥基脲、L-天冬酰胺酶、甲酰四氫葉酸、洛莫司汀、氮芥、醋酸甲羥孕酮、醋酸甲地孕酮、馬法蘭、巰嘌呤、氨甲蝶呤、氨甲蝶呤、光輝霉素、絲裂霉素、米托坦、紫杉醇、丁酸苯酯、強(qiáng)的松、 甲基芐胼、司莫司汀、鏈脲菌素、他莫昔芬、紫杉烷、泰素(taxol)、丙酸睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、塞替派、尿嘧啶氮芥、長春花堿或長春新堿。使用化療劑的任何組合也在考慮之列。其他合適的治療劑選自于由放射性同位素、硼附加物(boron addend)、免疫調(diào)節(jié)劑和化療增敏劑(chemosensitizing agent)所組成的組(參見美國專利號4，925，648 和4932，412)。在如下文獻(xiàn)中描述了合適的化療劑REMINGT0N' S PHARMACEUTICAL SCIENCES,第 19 版(Mack Publishing Co. 1995)禾口 Goodman and Gilman ' s The Pharmacological Basis of Therapeutics (Goodman等，Macmillan Publishing Co.編輯， 紐約，1980和2001版)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知其他合適的化療劑，如實(shí)驗(yàn)藥物。本領(lǐng)域周知放射性核素治療的各種方法均可用于治療癌癥和其他病理狀況，例如在Harbert/'Nuclear Medicine Therapy”，紐約，Thieme Medical Publishers，1087，1-340 頁中所述。此夕卜，合適的治療性放射性同位素選自于由α-發(fā)射源、β-發(fā)射源、Y-發(fā)射源、俄歇電子發(fā)射源、 發(fā)射出α-粒子的中子俘獲劑和通過電子俘獲發(fā)生衰變的放射性同位素所組成的組。優(yōu)選地，放射性同位素選自于由 225Ac、198Au、32P、1251、131I、90Y、186Re、188Re、67Cu、177Lu、 213Bi、10B和211At所組成的組。在另一實(shí)施方式中，將不同的同位素用作第一治療劑和第二治療劑，所述不同的同位素由于它們各自的能量發(fā)射情況而在不同的距離有效。當(dāng)在正常的臨床環(huán)境時，可將這類治療劑用于實(shí)現(xiàn)更有效的腫瘤治療，并且對患有多個不同尺寸腫瘤的患者是有用的。幾乎沒有適用于對極小的腫瘤沉積物和單細(xì)胞進(jìn)行治療的同位素。在這些情況下，藥物或毒素可能是更有用的治療劑。因此，在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式中，將同位素與非同位素物質(zhì)(如藥物、毒素和中子俘獲劑)組合使用。已知許多對細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的藥物和毒素，并且可將這些藥物和毒素與本發(fā)明聯(lián)合使用。所述藥物和毒素可在藥物和毒素概要(如Merck Index和Goodman and Gilman等)和上述引用的參考文獻(xiàn)中找到。還可將干擾胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的藥物用于本發(fā)明的方法中；本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這類藥物，包括嘌呤霉素、放線菌酮和核糖核酸酶。放療許多種放療被用于腫瘤治療中。申請人預(yù)想到在腫瘤治療中使用增強(qiáng)量的二甲雙胍使得這類放療中的任何一種或其組合的量減少。對于某些類型的腫瘤，可能會將放射給予沒有腫瘤跡象的區(qū)域。這么做是為了防止腫瘤細(xì)胞在接受輻射的區(qū)域生長。這一技術(shù)被稱作預(yù)防性放療。還可給予放療以幫助減輕癥狀、例如來自于已經(jīng)擴(kuò)散到骨或生物體其他部分的癌癥的疼痛。這種治療被稱為姑息性放療。放射可能來自生物體外部的機(jī)器(外放射)，可能置于生物體內(nèi)部(內(nèi)放射)，或者可能使用作用于生物體全身的未密封放射性物質(zhì)(全身性放療)。待給予的放射類型取決于以下條件癌癥的類型、癌癥的位置、放射將需要進(jìn)入生物體中到什么程度、患者的總體健康狀況和病史、患者是否將進(jìn)行其他類型的癌癥治療以及其他因素。對接受癌癥放療的大多數(shù)人進(jìn)行外放射。一些患者進(jìn)行外放療、內(nèi)放療、全身性放療，上述三者或者相繼進(jìn)行或者同時進(jìn)行。通常對門診患者給予外放療；大多數(shù)患者不需要住院。外放療用于治療大多數(shù)類型的癌癥，包括膀胱癌、腦癌、乳腺癌、宮頸癌、喉癌、肺癌、前列腺癌和陰道癌。另外，當(dāng)癌癥從生物體的原發(fā)部位擴(kuò)散到其他部分時，可使用外放射來減輕疼痛或緩和其它問題。術(shù)中放療(IORT)是在手術(shù)期間給予的外放射的形式。IORT用于治療不能完全移除、或是在鄰近組織中具有高復(fù)現(xiàn)(重現(xiàn))風(fēng)險的局部癌癥。在將所有或大多數(shù)癌癥移除后，在手術(shù)期間直接針對腫瘤部位進(jìn)行一次高能的大劑量放射(用專門的防護(hù)罩對鄰近的健康組織進(jìn)行保護(hù))?；颊咦≡褐翉氖中g(shù)中恢復(fù)?？蓪ORT用于如下癌癥的治療甲狀腺癌和結(jié)腸直腸癌、婦科癌癥、小腸癌和胰腺癌。還在臨床試驗(yàn)(探索研究)中研究治療成年人體內(nèi)某些類型的腦腫瘤和骨盆肉瘤。預(yù)防性頭顱照射(PCI)是在原發(fā)性癌(例如小細(xì)胞肺癌)具有擴(kuò)散到腦的高風(fēng)險時給予腦的外輻射。內(nèi)放療(也稱作近距離治療)使用放置在非常接近于腫瘤或放置在腫瘤內(nèi)的放射作用。通常將放射源密封在被稱作移植物的小型儲器(holder)中。移植物的形式可以是細(xì)線、塑料管(稱作導(dǎo)管)、條帶、膠囊或種子。將移植物直接放入生物體內(nèi)。內(nèi)放射療法可能需要住院。通常以兩種使用密封移植物的方式之一遞送內(nèi)放射。將間質(zhì)內(nèi)放療插入到腫瘤部位或其附近的組織中。間質(zhì)內(nèi)放療用于治療頭頸、前列腺、宮頸、卵巢、乳腺以及肛周和骨盆等區(qū)域的腫瘤。用外放療進(jìn)行乳腺癌治療的一些婦女接受了“加強(qiáng)劑量(booster dose) ”的放射(可使用間質(zhì)內(nèi)放射或外放射)。腔內(nèi)或管腔內(nèi)放療是用施源器(applicator)插入到生物體內(nèi)。腔內(nèi)或管腔內(nèi)放療通常用于治療子宮癌。研究人員還研究了用于包括乳腺癌、支氣管癌、宮頸癌、膽囊癌、口腔癌、直腸癌、氣管癌、子宮癌以及陰道癌在內(nèi)的其他癌癥的內(nèi)放療。全身性放療使用了放射性物質(zhì)，如碘131和鍶89。所述材料可以經(jīng)口服或注射進(jìn)入生物體內(nèi)。有時，將全身性放療用于治療甲狀腺癌和成人的非霍奇金淋巴瘤。腫瘤通過本發(fā)明的方法和組合物治療的腫瘤可以是惡性腫瘤(例如，致癌腫瘤或“癌癥”)或良性腫瘤。所治療的良性腫瘤的實(shí)例包括甲狀腺腺瘤、腎上腺皮質(zhì)腺瘤和垂體腺瘤、良性腦瘤(例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、腦膜瘤)?！鞍┌Y”通常意味著以出現(xiàn)腫瘤作為癥狀的一組疾病。這些腫瘤由非典型(atypical)的細(xì)胞組成，具有自主生長的能力、 不明確的界限、侵入鄰近組織和血管的能力以及通過產(chǎn)生轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行播散(disseminate) 的傾向?？赏ㄟ^本文所述的方法和組合物治療的癌癥的實(shí)例包括膀胱癌、黑色素瘤、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、腎癌(腎細(xì)胞癌)、皮膚癌(非黑色素瘤)、白血病、甲狀腺癌、肺癌、宮頸癌、卵巢癌、睪丸癌，但不限于此?？赏ㄟ^上述方法抑制以下腫瘤的原發(fā)性生長和轉(zhuǎn)移性生長女陰上皮性癌(vulvar epidermoid carcinomas)、宮頸癌、子宮內(nèi)膜腺癌、卵巢腺癌和眼黑素瘤。由于可穿過血腦屏障，根據(jù)本文所述方法，給予二甲雙胍可用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、或者防止癌癥擴(kuò)散至中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本發(fā)明的藥物組合物可以是固體劑型、半固體劑型或液體劑型，例如懸浮液或氣霧劑等。優(yōu)選以適合于單次給予精確劑量的單位劑型給予所述組合物。根據(jù)所需制劑，所述組合物還可包含藥學(xué)上可接受的、無毒的載體或稀釋劑，所述載體或稀釋劑被定義為通常用于配制向動物或人進(jìn)行給予的藥物組合物的輔料。組合物可以緩釋或定時釋放的制劑提供。載體或稀釋劑可包括本領(lǐng)域已知的任何緩釋材料，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯(單獨(dú)使用或與蠟混合)。通過使用聚合物絡(luò)合或吸附二甲雙胍和/或化療劑可獲得控釋制劑。通過選擇適當(dāng)?shù)拇蠓肿?例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯、 甲基纖維素、羧甲基纖維素和硫酸魚精蛋白)并選擇大分子的濃度以及并入方法(以控制釋放)，可實(shí)現(xiàn)受控遞送。還可使用微囊化作用(microencapsulation)。定時釋放的制劑可全天提供即時釋放和脈沖釋放的組合。對稀釋劑進(jìn)行選擇以免影響組合的生物活性。這類稀釋劑的實(shí)例為蒸餾水、生理鹽水、林格氏溶液(Ringer' s solution)、右旋糖溶液以及 Hank' s溶液。此外，制劑的藥物組合物還可包含其他載體、佐劑、乳化劑(如泊洛沙姆) 或者無毒的、非治療性的且無致免疫性的穩(wěn)定劑等。這類稀釋劑或載體的有效量為對獲得藥學(xué)上可接受的制劑(就組分溶解度或生物活性等方面而言)有效的量。本發(fā)明另一方面涉及用上述藥物組合治療癌癥的制劑。在一個實(shí)施方式中，所述制劑包括控釋裝置，在該裝置中的一種或數(shù)種藥物以滯后方式(delayed fashion)釋放。這類制劑可為片劑(或丸劑)形式，口服后在不同的時間間隔釋放不同劑量的藥物。本發(fā)明另一方面涉及用于通過本文所公開的方法(例如腫瘤治療)治療受試者的試劑盒。所述試劑盒以上文中提供的劑量包含一個或多個瓶裝的二甲雙胍和一個或多個瓶裝的化療劑(裝在一起或者處于單獨(dú)的小瓶中)。所述試劑盒可進(jìn)一步組合包含描述其使用的說明書。所述試劑盒可包含二甲雙胍以及一種或多種化療劑的制劑。
對調(diào)節(jié)化療劑的藥劑或由二甲雙胍調(diào)節(jié)的藥劑進(jìn)行篩選的方法本發(fā)明提供了對通過本發(fā)明的方法調(diào)節(jié)化療劑的藥劑(例如二甲雙胍衍生物)進(jìn)行篩選的方法?？蓪⒛[瘤、癌癥和/或癌干細(xì)胞用于分析試驗(yàn)化合物(例如二甲雙胍衍生物)殺滅細(xì)胞的效力。在該方法中，向細(xì)胞給予二甲雙胍衍生物和已知的化療劑，通過測定細(xì)胞的指示參數(shù)(例如細(xì)胞活力)來確定其殺滅細(xì)胞的能力。將細(xì)胞活力與未接受二甲雙胍衍生物的適當(dāng)對照進(jìn)行比較，殺滅作用增強(qiáng)(例如協(xié)同作用)表明二甲雙胍衍生物是調(diào)節(jié)化療劑的藥劑。本發(fā)明還提供了對其腫瘤、癌癥和/或癌干細(xì)胞殺滅能力被二甲雙胍增強(qiáng)的藥劑進(jìn)行篩選的方法。在該方法中，向細(xì)胞給予試驗(yàn)化合物和二甲雙胍(或已認(rèn)定的二甲雙胍衍生物)；通過測定細(xì)胞的指示參數(shù)(例如細(xì)胞活力)來確定其殺滅細(xì)胞的能力。將細(xì)胞活力與未接受試驗(yàn)化合物的適當(dāng)對照進(jìn)行比較，殺滅作用增強(qiáng)(例如協(xié)同作用)表明該試驗(yàn)化合物是被二甲雙胍增強(qiáng)的藥劑。可方便地向培養(yǎng)中的細(xì)胞的培養(yǎng)基中加入溶液形式或易溶形式的試驗(yàn)化合物。在流通系統(tǒng)(flow-through system)中間歇或連續(xù)地加入流動的藥劑，或者向另外的靜態(tài)溶液中單次或增量式地加入化合物的團(tuán)塊(bolus)。在流通系統(tǒng)中使用兩種流體，其中一種是生理中性溶液，另一種是添加有試驗(yàn)化合物的相同溶液。使第一種流體流過細(xì)胞，隨后使第二種流體流過細(xì)胞。在單一溶液的方法中，向圍繞著細(xì)胞的培養(yǎng)基的容量中加入試驗(yàn)化合物的團(tuán)塊。培養(yǎng)基組分的總濃度不應(yīng)該隨著團(tuán)塊的加入而明顯變化，而且在流通法中的兩種溶液之間不應(yīng)明顯變化。在某些實(shí)施方式中，藥劑制劑不包含可顯著影響整個制劑的額外組分(如防腐劑)。因此，在一個實(shí)施方式中，制劑本質(zhì)上由試驗(yàn)藥劑和生理上可接受的載體(例如水、乙醇、DMSO等)組成。然而，如果化合物是無溶劑的液體，制劑可本質(zhì)上由化合物本身組成。用不同的藥劑濃度平行進(jìn)行多次分析，從而獲得對各種濃度的差別反應(yīng)。如本領(lǐng)域所已知，通常使用由1 10(或其他對數(shù)尺度)稀釋產(chǎn)生的濃度范圍來確定藥劑的有效濃度。如果必要，可用第二系列的稀釋來對濃度進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)化。通常，這些濃度之一起到陰性對照的作用，即，處于零濃度、或處于低于藥劑檢測水平的濃度、或者是等于或低于在表現(xiàn)型方面未產(chǎn)生可檢測的變化的藥劑濃度。試驗(yàn)化合物當(dāng)提到篩選分析時，本文和整個申請文件所使用的術(shù)語“試驗(yàn)化合物”或“試驗(yàn)藥劑”意味著任何有機(jī)分子或無機(jī)分子，包括經(jīng)修飾和未修飾的核酸(如反義核酸)、RNAi (如 siRNA或shRNA)、肽、擬肽、受體、配體和抗體。試驗(yàn)化合物可以是可向試驗(yàn)動物給予的任何分子、化合物或其他物質(zhì)。在某些情況下，試驗(yàn)藥劑本質(zhì)上不干擾動物活力。合適的試驗(yàn)化合物可為小分子、生物聚合物(如多肽、多糖和多核苷酸等)。一般以lng/kg至10mg/kg、通常10 μ g/kg至lmg/kg)的劑量向動物給予試驗(yàn)化合物。試驗(yàn)化合物可以被認(rèn)定為治療上有效的化合物、如抗增殖劑，或者被認(rèn)定為用于藥物開發(fā)的先導(dǎo)化合物(lead compound) 0在某些實(shí)施方式中，試驗(yàn)化合物可來自于多種庫，如隨機(jī)或組合的、肽或非肽的庫。本領(lǐng)域已知許多庫，例如化學(xué)合成庫、重組噬菌體展示庫和基于體內(nèi)翻譯的庫?；瘜W(xué)合成庫的實(shí)例記載于如下文獻(xiàn)中Fodor等(Science 251:767-73(1991))、Houghten 等(Nature 354 :84-86 (1991) )、Lam 等(Nature 354:82-84(1991))、 Medynski(Bio/Technology 12 :709-10 (1994)) , Gallop 等(J. Med. Chem.37 1233-51 (1994))、Ohlmeyer 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :10922—26 (1993))、Erb 等(Proc. Natl. Acad. ki. USA 91 :11422- (1994))、Houghten 等(Biotechniques 13: 412-21(1992))、Jayawickreme 等(Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91 :1614-18(1994))、Salmon 等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :11708-12 (1993))、國際專利公開 WO 93/20242 以及 Brenner 禾口 Lerner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :5381-83 (1992))。噬菌體展示庫的實(shí)例記載于如下文獻(xiàn)中Scott和Smith (Science 249 386-90(1990))、Devlin 等(Science 249 :404-06 (1990)) ,Christian 等(J. Mol. Biol. 227 711-18(1992)), Lenstra (J. Immunol. Meth. 152 149-57 (1992)) , Kay 等(Gene 128 59-65(1993))和國際專利公開 WO 94/18318?；隗w內(nèi)翻譯的庫包括但不限于記載于國際專利公開WO 91/05058和 Mattheakis 等(Proc. Natl. Acad. ki. USA 91 :9022-26(1994))中的庫。作為非肽庫的實(shí)例，可采用苯二氮-‘廣庫(參見例如，Bunin等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 4708-12(1994))。還可以使用肽庫(參見例如，Simon 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 9367-71(1992))。Ostresh 等(Proc. Natl. Acad. ki. USA 91:11138-42(1994))記載了可使用的庫的另一實(shí)例，其中，肽中的酰胺官能團(tuán)已被全甲基化，產(chǎn)生化學(xué)轉(zhuǎn)化后的組合庫。用于篩選方法的試驗(yàn)藥劑可選自于下述組化學(xué)品、小分子、化學(xué)個體(chemical entity)、核酸序列、作用(action)；核酸類似物或蛋白或多肽或其片段類似物。在某些實(shí)施方式中，核酸為DNA或RNA，核酸類似物例如可為PNA、pcPNA和LNA。核酸可為單鏈或雙鏈，并可選自于包括下述核酸的組對感興趣的蛋白(proteins of interest)進(jìn)行編碼的核酸、寡聚核苷酸、PNA等。這類核酸序列包括例如但不限于對起到轉(zhuǎn)錄阻遏物作用的蛋白進(jìn)行編碼的核酸序列、反義分子、核酶、小的抑制性核酸序列(例如但不限于RNAi、 shRNAi, siRNA、微小RNAi (mRNAi)、反義寡聚核苷酸等)。蛋白和/或肽藥劑或其片段可為任何感興趣的蛋白，例如但不限于突變蛋白、治療性蛋白、截短蛋白，其中所述蛋白在細(xì)胞中通常不存在或以較低水平表達(dá)。感興趣的蛋白可選自于包括如下蛋白的組突變蛋白、 基因工程蛋白、肽、合成肽、重組蛋白、嵌合蛋白、抗體、人源化蛋白、人源化抗體、嵌合抗體、 經(jīng)修飾的蛋白以及上述蛋白的片段?？蓪⑺巹?yīng)用至介質(zhì)中，使藥劑與細(xì)胞(如內(nèi)胚層來源的細(xì)胞)接觸并誘導(dǎo)其發(fā)揮作用?；蛘撸巹┛梢蕴幱谠摷?xì)胞(例如內(nèi)胚層來源細(xì)胞) 的胞內(nèi)，這是將核酸序列引入該細(xì)胞、并且所述核酸序列的轉(zhuǎn)錄使得在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生核酸和/ 或蛋白藥劑的結(jié)果。藥劑還涵蓋了細(xì)胞(例如內(nèi)胚層來源細(xì)胞)所經(jīng)受的任何作用和/或事件。作為非限制性實(shí)例，所述作用可包括在細(xì)胞中觸發(fā)生理變化的任何作用，例如但不限于熱休克(heat-shock)、電離輻射、冷休克、電脈沖、光照和/或波長暴露、UV暴露、壓力、 拉伸作用、增加和/或減少的氧氣暴露、暴露至活性氧(ROS)、缺血性條件、熒光暴露等。環(huán)境刺激還包括如下定義的固有的環(huán)境刺激。對藥劑的暴露可以是連續(xù)或間斷的。在某些實(shí)施方式中，藥劑為包含已知和未知化合物的感興趣的藥劑，所述化合物涵蓋了可包括有機(jī)金屬分子、無機(jī)分子、遺傳序列等在內(nèi)的許多化學(xué)品種類(主要為有機(jī)分子)。本發(fā)明的重要方面是對候選藥物進(jìn)行評價，包括毒性試驗(yàn)等。候選藥劑還包括有機(jī)分子，所述有機(jī)分子含有為結(jié)構(gòu)相互作用、特別是氫鍵鍵合所必需的官能團(tuán)，并且一般至少
13包含胺、羰基、羥基或羧基，常常包含上述化學(xué)官能團(tuán)中的至少兩個。候選藥劑經(jīng)常包含由一個或多個上述官能團(tuán)取代的環(huán)狀碳或雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳香族結(jié)構(gòu)或多芳香族結(jié)構(gòu)。還在生物分子中發(fā)現(xiàn)了候選藥劑，所述生物分子包括肽、多核苷酸、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶或上述生物分子的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或組合。試驗(yàn)藥劑還包括藥理學(xué)活性藥物、遺傳活性分子等。感興趣的化合物包括例如 化療劑、激素或激素拮抗劑、生長因子或重組生長因子以及上述化合物的片段和變體。適用于本發(fā)明的示例性藥劑為記載于如下文獻(xiàn)中的藥劑“The Pharmacological Basis of Therapeutics，，，Goodman and Gilman，McGraw-Hill，紐約，N. Y. ， (1996)，第九版，如下章節(jié):ffater, Salts and Ions ；Drugs Affecting Renal Function and Electrolyte Metabolism ；Drugs Affecting Gastrointestinal Function ；Chemotherapy of Microbial Diseases ；Chemotherapy of Neoplastic Diseases ；Drugs Acting on Blood-Forming organs ；Hormones and Hormone Antagonists ；Vitamins,Dermatology ；禾口 Toxicology ；以引用的方式將其整體并入本文。還包括毒素、生化戰(zhàn)劑(biological and chemical warfare agents),例如參見 Somani, S. Μ. (Ed. ), "Chemical Warfare Agents，，，Academic Press,紐約，(1992)。藥劑包括上述所有種類的分子，并可進(jìn)一步包括未知內(nèi)容物的樣品。感興趣的是來自于天然來源(如植物)的天然存在化合物的復(fù)合混合物。雖然許多樣品包含溶液形式的化合物，但也可對能溶于合適溶劑中的固體樣品進(jìn)行分析。感興趣的樣品包括環(huán)境樣品，例如地下水、海水、采礦廢料等；生物樣品，例如由作物、組織樣品等制備的裂解物 (Iysate)；制造樣品，例如藥物制備期間的時間進(jìn)程(time course)；以及為分析制備的化合物庫等。感興趣的樣品包括對潛在治療價值進(jìn)行評價的化合物，即藥物候選物。用于篩選的化合物包括二甲雙胍衍生物和候選藥劑(本文中也被稱為試驗(yàn)藥劑或試驗(yàn)化合物)。候選藥劑從多種來源獲得，包括合成化合物庫或天然化合物庫。例如，可利用多種手段隨機(jī)和定向合成包括生物分子在內(nèi)的多種有機(jī)化合物，所述手段包括隨機(jī)化寡聚核苷酸和寡肽的表達(dá)?；蛘?，可得到或容易制得細(xì)菌、真菌、植物和動物的提取物形式的天然化合物庫。另外，容易通過傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生化手段對天然的庫或合成產(chǎn)生的庫以及化合物進(jìn)行修飾，并可用來產(chǎn)生組合的庫。已知可使藥理學(xué)藥劑接受定向或隨機(jī)的化學(xué)修飾(如?；?、烷基化、酯化、酰胺化等)，從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。通常在同時使用不含藥劑的類似細(xì)胞的情況下，在對細(xì)胞(通常為多種腫瘤/癌癥/癌干細(xì)胞)的作用方面對藥劑進(jìn)行篩選。對響應(yīng)該藥劑的參數(shù)變化進(jìn)行測定，并通過與參比培養(yǎng)物(例如存在和不存在該藥劑、用其他藥劑得到的結(jié)果等)相比對結(jié)果進(jìn)行評價。參數(shù)為細(xì)胞活力、細(xì)胞生長和/或腫瘤發(fā)生的可定量部分，期望可在高通量系統(tǒng)中對上述參數(shù)進(jìn)行精確測定。雖然大多數(shù)參數(shù)將提供定量讀數(shù)，但是在某些實(shí)例中，半定量結(jié)果或定性結(jié)果是可接受的。讀數(shù)可包括單次測定值、或可包括平均值、中值或方差等。由多次相同分析特征性地為每個參數(shù)獲得參數(shù)讀數(shù)的范圍。對可變性進(jìn)行預(yù)期，并使用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計方法獲得各組試驗(yàn)參數(shù)的值的范圍，用常用的統(tǒng)計方法提供單一值。在某些實(shí)施方式中，該分析是通過計算機(jī)界面進(jìn)行操作的自動(robotic)高通量系統(tǒng)或計算機(jī)化的分析。待篩選化合物可以是天然存在的分子或合成的分子。待篩選的化合物還可以從天然來源(如海洋微生物、藻類、植物和真菌)獲得。試驗(yàn)化合物也可為礦物質(zhì)或寡聚藥劑(oligo agents) 0或者，試驗(yàn)化合物可從包含有肽或小分子的藥劑組合庫或從工業(yè)(例如，由化學(xué)工業(yè)、醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境工業(yè)、農(nóng)業(yè)工業(yè)、海洋工業(yè)、美容工業(yè)、藥物工業(yè)和生物技術(shù)工業(yè))合成的化合物的現(xiàn)有庫存中獲得。試驗(yàn)化合物可包括例如藥物、治療劑、農(nóng)業(yè)試劑或工業(yè)試劑、環(huán)境污染物、美容化合物、藥物化合物、有機(jī)化合物和無機(jī)化合物、脂類、糖皮質(zhì)激素、抗生素、肽、蛋白質(zhì)、糖、碳水化合物、嵌合分子及上述化合物的組合。對于能以分步方式合成的多種類型化合物而言，可產(chǎn)生組合庫。這類化合物包括 多肽、蛋白質(zhì)、核酸、β -轉(zhuǎn)角模擬物(β -turn mimetics)、多糖、磷脂、激素、前列腺素、類固醇、芳香族化合物、雜環(huán)化合物、苯并二氮雜T、寡聚N-取代甘氨酸和寡聚氨基甲酸酯。在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選的試驗(yàn)化合物為小分子、核酸和經(jīng)修飾的核酸、肽、擬肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、碳水化合物、脂或糖脂。核酸優(yōu)選為DNA或RNA。通過記載在下述文獻(xiàn)中的編碼合成庫(ESL)方法可以構(gòu)建化合物的大組合庫Affymax，WO 95/12608 ；Affymax，WO 93/06121 ；哥倫比亞大學(xué)，WO 94/08051 ； Pharmacopeia, WO 95/35503 ；以及 kripps，WO 95/30642 (為所有目的，以引用的方式將上述各文獻(xiàn)整體并入本文)。通過噬菌體展示法還可以生成肽庫，參見例如Devlin，WO 91/18980。還可以從政府或私人來源獲得待篩選的化合物，所述來源包括例如=ChemBridge 公司(圣地亞哥，CA)的DIVERSet E庫(16，320種化合物)、美國癌癥研究所(NCI)的天然產(chǎn)物庫(Bethesda，MD)、NCI 開放合成化合物保藏中心(Bethesda，MD)、NCI 的 Developmental Therapeutics Program 等。另外，通過傳統(tǒng)的化學(xué)、物理和生化手段可容易地對天然和合成產(chǎn)生的庫以及化合物進(jìn)行修飾。此外，已知的藥理學(xué)藥劑可接受定向或隨機(jī)的化學(xué)修飾，如酰基化、烷基化、
酯化、酰胺化等。為對上述化合物在調(diào)節(jié)肌肉生長相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的能力方面進(jìn)行篩選，應(yīng)將試驗(yàn)化合物給予試驗(yàn)的對象。在一個實(shí)施方式中，試驗(yàn)對象為包含腫瘤、癌癥和/ 或癌干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物。該細(xì)胞可為原代細(xì)胞培養(yǎng)物或來自腫瘤的永生化細(xì)胞系。可通過例如下述方式給予試驗(yàn)化合物將化合物稀釋進(jìn)入維持細(xì)胞的培養(yǎng)基中、 將試驗(yàn)化合物與具有肌肉的動物的食物或飲水混合、向具有肌肉的動物局部給予處于藥學(xué)上可接受的載體中的化合物、使用浸有試驗(yàn)化合物的三維底物(如慢釋顆粒等)并將這類底物包埋入動物體內(nèi)、肌內(nèi)給予化合物、胃腸道外給予化合物。也可將多種其他試劑納入混合物中。這些試劑包括如鹽、緩沖液、中性蛋白(例如白蛋白)、去污劑等，這些試劑可用來促進(jìn)最佳的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)-核酸的結(jié)合作用，和/或減弱非特異性相互作用或背景相互作用等。同時，可使用改進(jìn)分析效率的試劑，如蛋白酶抑制劑、核酸酶抑制劑、抗微生物劑等。還可以存在防腐劑和其他添加劑。例如，可加入抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和非活性氣體(通常參見 Remington' s Pharmaceutical Sciences，第 16 版，Mack, 1980)。 如上所述，通常在體內(nèi)、例如在所培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行篩選分析。除非本文另有定義，與本申請結(jié)合使用的科技術(shù)語應(yīng)具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所共同理解的含義。進(jìn)一步而言，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應(yīng)包含復(fù)數(shù)且復(fù)數(shù)術(shù)語應(yīng)包含單數(shù)。
應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明不限于本文所記載的具體的方法學(xué)、方案和試劑等，并因而可以進(jìn)行變化。本文所使用的術(shù)語僅僅是為了描述具體的實(shí)施方式，而并不打算限定本發(fā)明的范圍，只通過權(quán)利要求書對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定。除在操作實(shí)施例中或是另有指明以外，本文所使用的全部表達(dá)成分的量或反應(yīng)條件的數(shù)值在所有實(shí)例中都應(yīng)被理解為由術(shù)語“大約”修飾。當(dāng)用于描述本發(fā)明時，與百分比結(jié)合的術(shù)語“大約”意味著士 1%。一方面，本發(fā)明涉及本文記載的本發(fā)明所必需的組合物、方法和其各自的組分，并且仍然開放式地包含未明確指出的成分，無論其是否必需(“包含”)。在某些實(shí)施方式中，在組合物、方法或其各自的組分的描述中包含的其他成分限于不會實(shí)質(zhì)上影響本發(fā)明具備新穎性的基礎(chǔ)特征的成分(“本質(zhì)上由……組成”)。同樣地，這也適用于所記載的方法中的步驟以及組合物和其中的組分。在其他實(shí)施方式中，本文所述的發(fā)明、組合物、方法和其各自的組分旨在排除被認(rèn)為未被視為所述組分、組合物或方法所必需成分的任何成分(“由…… 組成”)。為了描述和公開的目的，以引用的方式將所有的專利、專利申請和其它已確定的出版物在此明確地并入本文，例如，所述出版物中描述的方法學(xué)的使用可能與本發(fā)明相關(guān)。 這些出版物僅因?yàn)樗鼈兊墓_早于本發(fā)明的申請日而提供。在這方面的任何內(nèi)容不應(yīng)視為承認(rèn)發(fā)明者沒有權(quán)利借助于先前的發(fā)明或因?yàn)槿魏纹渌蚨鴮⒐_的內(nèi)容提前。所有關(guān)于這些文件的日期的聲明或這些文件的內(nèi)容的表述是基于申請者可得的信息，并且不構(gòu)成任何關(guān)于這些文件的日期或這些文件的內(nèi)容的正確性的承認(rèn)。本發(fā)明可如下述任一編號的段落所定義1.在有需要的受試者體內(nèi)治療腫瘤的方法，所述方法包括給予增強(qiáng)量的二甲雙胍和減少量的一種或多種化療劑。2.段落1所述的方法，其中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為250mg/天。3. 一種組合物，所述組合物包含增強(qiáng)量的二甲雙胍、減少量的一種或多種化療劑以及藥學(xué)上可接受的載體。4.段落3所述的組合物，其中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為約25mg。5.段落3所述的組合物，其中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為約75mg。6.段落3所述的組合物，其中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為約250mg。7. 一種試劑盒，所述試劑盒包含瓶裝的二甲雙胍、瓶裝的一種或多種化療劑以及使用二甲雙胍和化療劑的說明書。8.在受試者體內(nèi)預(yù)防癌癥或延緩癌癥復(fù)現(xiàn)的方法，所述方法包括向所述受試者給予有效量的二甲雙胍。9.段落8所述的方法，其中，二甲雙胍的量為約75mg/天。通過下述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的說明，所述實(shí)施例不應(yīng)被視為對本發(fā)明的進(jìn)一步限定。實(shí)施例實(shí)施例1在此證明，在四種不同遺傳類型的乳腺癌中，二甲雙胍選擇性地殺滅癌干細(xì)胞。二甲雙胍和多柔比星(公知的化療藥物)的組合對培養(yǎng)中的癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞癌細(xì)胞均具
16有殺滅作用，減小腫瘤塊，并且在異種移植小鼠模型中比單獨(dú)使用任一藥物都更有效地延長癥狀緩解。這些觀察結(jié)果構(gòu)成了對癌干細(xì)胞假說的獨(dú)立支持，并且提供了為什么二甲雙胍和化療藥物的組合可以使患有乳腺癌(和可能的其他癌癥)的患者的治療得以改進(jìn)的理論基礎(chǔ)。為檢驗(yàn)二甲雙胍的抗癌性質(zhì)，我們首先使用了由含有ER-Src (v-Src癌蛋白同雌激素受體的配體結(jié)合域形成的融合物)的非轉(zhuǎn)化人乳腺上皮細(xì)胞(MCF-10A)組成的可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化模型。當(dāng)用他莫昔芬對這些細(xì)胞進(jìn)行處理時，這些細(xì)胞在對_3他內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞群包含10%的癌干細(xì)胞，這由CD44標(biāo)記物的表達(dá)和形成乳腺球(在非附著和非分化條件下生成的多細(xì)胞“微瘤”)的能力進(jìn)行定義(18)。此外，我們分析了用不同藥物治療的其他三種乳腺腺癌細(xì)胞系(來自遺傳和表型方面不同的腫瘤)ER-陽性MCF7(13)； HER-陽性SKBR3(14)；三陰性MDA-MB-468 (15)。這些細(xì)胞系也含有能夠形成乳腺球的少量癌干細(xì)胞群。在所有的實(shí)驗(yàn)中，以不影響非轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長的濃度使用二甲雙胍(0. 1或 0.3mM;圖1A)。在先對癌細(xì)胞系進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)(7-9)使用了遠(yuǎn)遠(yuǎn)更高濃度的二甲雙胍(通常為10-30mM)，這種條件對非轉(zhuǎn)化細(xì)胞也是有毒的。在可誘導(dǎo)的MCF-10A模型中，二甲雙胍強(qiáng)有力地抑制了形態(tài)學(xué)上的轉(zhuǎn)化(見于存在或不存在0. ImM 二甲雙胍和/或TAM時細(xì)胞生長3 后的相差圖像(數(shù)據(jù)未示出))、創(chuàng)傷愈合分析中的侵襲性生長(見于存在或不存在0. ImM 二甲雙胍和/或TAM時細(xì)胞生長的創(chuàng)傷愈合/侵入響應(yīng)分析(數(shù)據(jù)未示出))、病灶形成、軟瓊脂中集落的形成和乳腺球的生成(圖1B)。此外，用二甲雙胍對來自所有四種乳腺癌細(xì)胞系的乳腺球進(jìn)行處理，引起乳腺球的數(shù)目在48h內(nèi)顯著降低(細(xì)胞死亡的結(jié)果)(圖2)。由于乳腺球主要由癌干細(xì)胞組成 (18)，后一觀察結(jié)果表明二甲雙胍可以殺滅癌干細(xì)胞。驚人的是，在轉(zhuǎn)化后的MCF-10A或MCF-7細(xì)胞群內(nèi)，二甲雙胍優(yōu)先殺滅癌干細(xì)胞 (CD44高/CDM低)(圖3A)。類似地，當(dāng)將所有四種癌細(xì)胞系進(jìn)行分選時，癌干細(xì)胞對二甲雙胍十分敏感，而標(biāo)準(zhǔn)癌細(xì)胞群實(shí)質(zhì)上仍然不受影響(圖3B)。此外，用二甲雙胍對MCF-10A 癌干細(xì)胞處理僅Ih就阻滯了這些細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力，即使在注射后的當(dāng)月藥物并不存在(圖3C)。二甲雙胍選擇性殺滅癌干細(xì)胞的能力與多柔比星(殺滅癌細(xì)胞而非癌干細(xì)胞的化療劑)形成鮮明對比。正如根據(jù)它們迥異的性質(zhì)所預(yù)料的那樣，共同使用二甲雙胍和多柔比星使混合的轉(zhuǎn)化群中非干細(xì)胞癌細(xì)胞和癌干細(xì)胞得以減少(圖3A)。與細(xì)胞系中的上述結(jié)果一致，對腫瘤(向裸鼠注射MCF-IOA-ER-Src細(xì)胞10天后出現(xiàn)腫瘤)進(jìn)行處理后，即觀察到了二甲雙胍和多柔比星之間的協(xié)同作用。在處理15天(3 個處理周期，每個處理周期5天)后，這一藥物組合幾乎消除了腫瘤，而單用多柔比星僅使得腫瘤體積減小2倍，單用二甲雙胍?guī)缀鯖]有作用(圖4A)。再過10天(第35天)后，用多柔比星治療的小鼠顯示出了腫瘤體積的進(jìn)一步降低。單用二甲雙胍的微弱效果和獨(dú)立報告(8)中更顯著的效果形成了對比，但是這些研究之間在實(shí)驗(yàn)方案方面存在著許多不同。為了確定為什么二甲雙胍和多柔比星的組合比單用多柔比星更有效的基本原理， 我們對在3個處理周期(第25天)后從腫瘤中回收的細(xì)胞群進(jìn)行了檢查。與我們在細(xì)胞系中的結(jié)果一致，用該藥物組合治療的小鼠幾乎不存在癌干細(xì)胞，而在由單用多柔比星治療的小鼠的腫瘤中容易地檢測到癌干細(xì)胞(圖4B)。因此，在傳統(tǒng)化療的背景下，二甲雙胍的治療優(yōu)勢與其殺滅癌干細(xì)胞的能力相聯(lián)系。
關(guān)于人類疾病進(jìn)程的癌干細(xì)胞假說基于癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞癌細(xì)胞差別化的成瘤性質(zhì)和對公知化療的響應(yīng)。對這一模型的預(yù)測(迄今未經(jīng)試驗(yàn))為選擇性抑制癌干細(xì)胞的藥物應(yīng)當(dāng)與化療藥物協(xié)同發(fā)揮作用，從而延緩復(fù)發(fā)。驚人的是，用二甲雙胍和多柔比星的組合治療的小鼠在治療結(jié)束后至少60天內(nèi)仍保持癥狀緩解(圖4A)。相比之下，在單用多柔比星對小鼠治療20天后，腫瘤繼續(xù)開始生長，并且復(fù)發(fā)后的腫瘤生長速率與最初發(fā)病時(即，未進(jìn)行治療)觀察到的速率相當(dāng)。因此，組合治療對延長癥狀緩解具有顯著的效果， 并且事實(shí)上甚至可以治愈這些異種移植生成的腫瘤。除了其潛在的醫(yī)學(xué)意義外，這些觀察結(jié)果還對癌干細(xì)胞假說提供了獨(dú)立且進(jìn)一步的支持。據(jù)我們所知，二甲雙胍選擇性地殺滅癌干細(xì)胞的能力、以及與多柔比星協(xié)同發(fā)揮作用以阻滯癌干細(xì)胞和非干細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞的能力是獨(dú)特的。對于乳腺癌的情況，赫賽汀和他莫昔芬是用于分別表達(dá)HER2和雌激素受體的癌癥類型的藥物，但是某些形式的乳腺癌不具有這些受體，從而能抵抗這些治療。對所有這些類型的乳腺癌，二甲雙胍選擇性地抑制癌干細(xì)胞生長，并由此很可能與化療藥物協(xié)同地發(fā)揮作用。此外，由于二甲雙胍抑制了 MCFlOA-ER-Src細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，表明二甲雙胍具有預(yù)防癌癥發(fā)展的能力(相對于對已經(jīng)出現(xiàn)的癌癥進(jìn)行治療)。事實(shí)上，二甲雙胍抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力可構(gòu)成如下的流行病學(xué)觀察的基礎(chǔ)用二甲雙胍治療的糖尿病患者具有較低的癌癥發(fā)病率(5，6)。作為癌癥預(yù)防手段，優(yōu)選以長期的方式給予二甲雙胍，并且在這點(diǎn)上，對于此處所觀察到的抗癌效果來說，所需要的二甲雙胍濃度大大低于用于糖尿病治療的濃度。最后，二甲雙胍和多柔比星在腫瘤中對不同類型細(xì)胞的選擇性可以解釋在裸鼠體內(nèi)使腫瘤塊減小、并延長癥狀緩解這種驚人的組合效果，并且這種選擇性提供了將二甲雙胍與化療結(jié)合作為乳腺癌或其他癌癥的新治療措施的基本原理。本發(fā)明的方法細(xì)胞系MCFlOA細(xì)胞是來自纖維囊性乳腺組織的乳腺上皮細(xì)胞，所述乳腺組織得自一名無乳腺癌家族史且無發(fā)病跡象的36歲婦女的乳房切除術(shù)(12)。遺傳分析并沒有顯示出HER2/ neu致癌基因的任何擴(kuò)增或H-Ras致癌基因的突變，并且這些細(xì)胞并不表達(dá)雌激素受體。此處的實(shí)驗(yàn)中使用了 MCFlOA衍生物，該衍生物含有v-Src癌蛋白同雌激素受體的配體結(jié)合域形成的完整融合物(integrated fusion)。MCF7細(xì)胞是表達(dá)極高水平雌激素受體的乳腺腺癌細(xì)胞(對于HER2/neu為陰性)，并且不具有強(qiáng)的錨定獨(dú)立(anchorage-ind印endent)性質(zhì)(1 。SKBR3細(xì)胞是過表達(dá)HER2/neU受體的乳腺腺癌細(xì)胞，具有錨定獨(dú)立性質(zhì)，并且在異種移植中形成腫瘤(14)。MDA-MB-468細(xì)胞來自三陰性乳腺癌，該乳腺癌顯示出許多復(fù)現(xiàn)性的基底樣(basal-like)分子異常，包括ER-PR-HER2陰性狀態(tài)、p53缺乏、EGFR過表達(dá)、 PTEN喪失和MEK/ERK途徑的組成性活化(1 。MDA-MB-468細(xì)胞非常具有侵略性，在異種移植實(shí)驗(yàn)中形成了大腫瘤，該腫瘤對采用他莫昔芬或赫賽汀進(jìn)行的治療具有抗性。細(xì)胞培養(yǎng)于37 "C>5 % CO2 下，在 DMEM 培養(yǎng)基 Qnvitrogen)、10 % 胎牛血清(Atlanta Biologicals)和青霉素/鏈霉素(Invitrogen)中，使MCF-7細(xì)胞、SKBR3細(xì)胞和MDA-MB-486 細(xì)胞進(jìn)行生長。如先前所述(16)對MCFlOA ER-Src細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，并用溶于KOH中的IyM 的40Η-他莫昔芬(TAM) (Sigma)誘發(fā)轉(zhuǎn)化。在加入TAM對_3他后出現(xiàn)形態(tài)變化、表型轉(zhuǎn)化和病灶形成，通過相差顯微鏡術(shù)進(jìn)行監(jiān)測。除非另有指明，通常添加溶于水中的二甲雙胍 (Sigma)至 0. ImM。創(chuàng)傷愈合活動力(motility)分析將細(xì)胞以IX IO5/孔接種于6孔培養(yǎng)皿上。使用PlO微量移液管管尖在匯合的細(xì)胞中造成單道刮傷。將細(xì)胞用PBS洗滌三次以去除細(xì)胞碎片，補(bǔ)充分析培養(yǎng)基并進(jìn)行監(jiān)測。 在創(chuàng)傷后oh和1 使用相差顯微鏡術(shù)捕獲圖像。集落形成分析將來自MCFlOA ER-Src的三份5X IO4細(xì)胞的樣品以4 1 (ν/ν)與處于MCF-10A 生長培養(yǎng)基中的2. 0%瓊脂糖混合，從而使瓊脂糖終濃度為0. 4%。將細(xì)胞混合物置于處于生長培養(yǎng)基中的0. 5%瓊脂糖的固化層上。每6-7天向細(xì)胞供給含有0. 4%瓊脂糖的生長培養(yǎng)基。在15天后對集落的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)。乳腺球培養(yǎng)如先前所述(17)，將乳腺球在無血清DMEM/F12培養(yǎng)基中的懸浮液(1000細(xì)胞/ml)中進(jìn)行培養(yǎng)，該培養(yǎng)基補(bǔ)充有 B27(l 50，Invitrogen) ,0. 4 % BSA,20ng/ml EGF(Preprotech)和4μ g/ml胰島素(Sigma)。在這些條件下，在存在或不存在二甲雙胍時， 通過放入轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞群對乳腺球的形成進(jìn)行了試驗(yàn)，通過向6天齡的乳腺球中加入二甲雙胍、并在處理2天和4天后對乳腺球的數(shù)目進(jìn)行計數(shù)來檢查乳腺球的生長。癌干細(xì)胞的分離和分析在單細(xì)胞懸浮液上，對轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞群進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞分選。將細(xì)胞用 CD44 抗體(FITC-綴合)(555478，BD Biosciences)和 CD24 (PE-綴合)(555428，BD Biosciences))抗體進(jìn)行染色。用0. ImM 二甲雙胍處理來自MCFlOA ER-Src細(xì)胞(經(jīng)TAM 處理)和MCF7細(xì)胞、SKBR3細(xì)胞以及MDA-MD-486細(xì)胞的癌干細(xì)胞(⑶44高/⑶對低)和非干細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞(CD44低/CDM高)，在不同的時間點(diǎn)(12h、Mh、48h)對細(xì)胞生長進(jìn)行評價。進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值士SD表示。異種移植中的腫瘤生長和復(fù)發(fā)將5X IO6 的 MCFlOA ER-Src 細(xì)胞注射入 16 只雌性 nu/nu 小鼠(Charles River 實(shí)驗(yàn)室)的右側(cè)腹部，對于所有小鼠均使腫瘤發(fā)展10天，大小為 50mm3。將小鼠隨機(jī)分入4 組中(未治療的組、每5天(3個處理周期)用％ig/kg多柔比星、100μ g/ml 二甲雙胍或其組合通過腹膜內(nèi)注射進(jìn)行治療的組)。在初次注射后的多個時間測定腫瘤體積(平均值和 95%置信區(qū)間)。所有的小鼠實(shí)驗(yàn)均按照學(xué)會動物管理和使用委員會的程序和指南進(jìn)行。將所引參考文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。參考文獻(xiàn)1. Allies LE, Weissman IL, Cancer stem cells in solid tumors, Curr Opin Biotechnol 2007;18:460-6。2.Polyak K, Weinberg RA, Transitions between epithelial and mesenchymal states !acquisition of malignant and stem cells traits, Nat Rev Cancer 2009 ；9 265-73。3. Larsson SC, Mantzoros CS, Wolk A,Diabetes mellitus and risk of breast cancer -.a meta-analysis, International journal of cancer 2007 ； 121 :856_62。4. Hsu IR, Kim SP, Kabir Μ, Bergman RN, Metabolic syndrome,hyperinsulinemia，and cancer，Am J Clin Nutr 2007;86:867-71。5. Evans JM, Donnelly LA, Emslie-Smith AM, Alessi DR, Morris AD, Metformin and reduced risk of cancer in diabetic patients,BMJ Clinical research ed 2005 ； 330 :1304-5o6. Jiralerspong S，Palla SL, Giordano SH 等，Metformin and pathologic complete responses to neoadjuvant chemotherapy in diabetic patients with breast cancer, J Clin Oncol 2009 ；27 :3297_302。7. Alimova IN，Liu B，F(xiàn)an Z，等，Metformin inhibits breast cancer cell growth,colony formation and induces cell cycle arrest in vivo,Cell Cycle 2009 ； 8 :909-15o8. Liu B，F(xiàn)an Z，Edgerton SM 等，Metformin induces unique biological and molecular responses in triple negative breast cancer cells，Cell Cycle 2009 ；8 2031-40。9.Zakikhani M，Dowling R，F(xiàn)antus IG，Sonenberg N，Pollak MiMetformin is an AMP kinase-dependent growth inhibitor for breast cancer cells, Cancer research 2006 ；66 :10269-73o10. Cazzaniga M，Bonanni B，Guerrieri-Gonzaga A，Decensi A，Is it time to test metformin in breast cancer clinical trials ？ Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2009 ；18 :701_5。11. Goodwin PJ, Ligibel JA, Stambolic V，Metformin in breast cancer :Time for action, J Clin Oncol 2009 ；27 :3271_3。12. Soule HD, Maloney TM, Wolman SR 等，Isolation and characterization of a spontaneously immortallized human breast epithelial cell line， MCFlO, Cancer research 1990;50:6075-86。13. Brooks SC, Locke ER, Soule HD, Estrogen receptor in a human cell line (MCF-7)from breast carcinoma，J Biol Chem 1973;248:6251-3。14.Bergman I，Barmada MA, Griffin JA, Slamon DJ, Treatment of meningeal breast cancer xenografts in the rat using an anti-p 185/HER2 antibody, Clin Cancer Res 2001；7 :2050_6。15.Oliveras-Ferraros C， Vazquez-Martin A， Lopez-Bonet E 等，Growth and molecular interactions of the anti-EGFR antibody cetuximab and the DNA crosslinking agent cisplatin in gefitinib-resistant MDA_MB_468 cells :new prospects in the treatment of triple-negative/basal-like breast cancer, Int J Oncol 2008 ；33 :1165_76。16.Debnath J, Muthuswamy SK，Brugge JS，Morphogenesis and oncogenesis of MCF-IOA mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures，Methods 2003 ；30 (3) :256_68017. Dontu G, Abdallah WM, Foley JM In vivo propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells， Genes Dev2003 ；17 :1253-70。 18. Grimshaw MJ, Cooper L, Papazisis K 等，Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenie breast cancer cells, Breast Cancer Res 2008 ；10 :R52。
權(quán)利要求
1.在有需要的受試者體內(nèi)治療腫瘤的方法，所述方法包括給予增強(qiáng)量的二甲雙胍和減少量的一種或多種化療劑。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為250mg/天。
3.一種組合物，所述組合物包含增強(qiáng)量的二甲雙胍、減少量的一種或多種化療劑以及藥學(xué)上可接受的載體。
4.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為約25mg。
5.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為約75mg。
6.如權(quán)利要求3所述的組合物，其中，二甲雙胍的增強(qiáng)量為約250mg。
7.一種試劑盒，所述試劑盒同時包含裝有二甲雙胍的瓶、裝有一種或多種化療劑的瓶以及使用二甲雙胍和化療劑的說明書。
8.在受試者體內(nèi)預(yù)防癌癥或延緩癌癥復(fù)現(xiàn)的方法，所述方法包括向所述受試者給予有效量的二甲雙胍。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中，二甲雙胍的量為約75mg/天。
全文摘要
本文公開了在有需要的受試者體內(nèi)治療腫瘤的方法，所述方法包括給予增強(qiáng)量的二甲雙胍和減少量的一種或多種化療劑。二甲雙胍的增強(qiáng)量的一個實(shí)例為約250mg/天。本文還公開了在受試者體內(nèi)預(yù)防癌癥或延緩癌癥復(fù)現(xiàn)的方法，所述方法包括向所述受試者給予有效量的二甲雙胍。在該方法的一個實(shí)例中，二甲雙胍的量為約75mg/天。本文還公開了一種組合物，所述組合物含有增強(qiáng)量的二甲雙胍、減少量的一種或多種化療劑以及藥學(xué)上可接受的載體。本文還公開了包含有二甲雙胍和一種或多種化療劑的試劑盒。
文檔編號A61K31/33GK102596192SQ201080048060
公開日2012年7月18日 申請日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
發(fā)明者凱文·施特爾, 季米特里斯·伊利奧普洛斯, 希瑟·赫希 申請人:哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會