專利名稱：攜氧的抗湍流的高密度亞微米顆粒的合成的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及包封的載體活性物質(zhì)，例如全氟化碳和多聚血紅蛋白，其用作血液或其它液體中的可移除的人工氧載體和/或治療劑和診斷劑的可移除的載體。
背景技術(shù)：
在現(xiàn)有技術(shù)中，存在寬范圍的意圖受控地將生物活性物質(zhì)遞送到身體內(nèi)的粒狀載體。它們的尺寸從微米變化至亞微米，并且它們的組成范圍為有機物(例如聚合物、脂質(zhì)、 表面活性劑、蛋白質(zhì))至無機物(磷酸I丐、娃酸鹽、CdSe、CdS、ZnSe、金以及其它)。這些粒狀載體中的每種設(shè)計成攜帶化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)，并且隨時間或在特定的位置或在這兩種情況下釋放該反應(yīng)性物質(zhì)。用于用特定組分合成這種粒狀載體的方法范圍為液相自裝配、聚集、沉淀或這些合成方法的組合。單個粒狀載體的尺寸和它們的有效負(fù)荷能力由在合成中使用的材料的量、組分裝配的形態(tài)和組分的特定組成來控制。合成的粒狀載體具有能夠溶解或能夠結(jié)合到意圖被最終遞送的化學(xué)或生物化學(xué)反應(yīng)的物質(zhì)的雙重功能。潛在假定是包封的反應(yīng)性物質(zhì)將最終被釋放，使得它們可進行其預(yù)期功能。粒狀載體自身通常不參與釋放功能，除了在一定程度上它們調(diào)節(jié)它們所攜帶的反應(yīng)性物質(zhì)的釋放時間或位置，并且載體組分必須隨時間分解或保持為不造成任何傷害的非活性和非毒性物質(zhì)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，這些粒狀載體已用于將藥物遞送大身體內(nèi)的特定位置并且用作人造血液產(chǎn)品中的人工氧載體(AOC)。人造血液是被制備成用作替代紅細胞的產(chǎn)品，其將氧氣和二氧化碳輸送到身體內(nèi)。然而，紅細胞的功能是復(fù)雜的，并且人造血液的形成通常僅集中在滿足特定的功能，氣體交換-氧和二氧化碳。相比之下，全血可實現(xiàn)AOC不可復(fù)制的許多不同的功能?？膳c自體血混合的人造血液可在手術(shù)之間支持病人，以及在醫(yī)療保健、血液捐獻和儲存設(shè)施有限，或由于篩選步驟非常昂貴而具有暴露于疾病的高風(fēng)險的新興國家，支持供血服務(wù)。不依賴于交叉配血和血型測定的血液代用品將意味著血液供應(yīng)沒有延遲，且可能意味著病人生與死的區(qū)別。在現(xiàn)有醫(yī)療應(yīng)用中，來自粒狀材料的殘余材料預(yù)期隨時間進行新陳代謝和/或被排泄。然而，通過病人的自然新陳代謝來處理粒狀載體是極其困難的。雖然在美國供血每年增長了約2_3%，然而由于老年人口的增多對血液的需求甚至增加地更快，且對血液的需求超過了其捐贈。開發(fā)改進的AOC的另一動機是盡管對捐贈的血液的篩查顯著進步了，但仍存在對有限貨架期的擔(dān)憂，其在2V _6°C下為42天。盡管對捐贈的血液的篩查和儲存有顯著進步，仍存在對捐贈的儲存血液的供應(yīng)、 成本和安全的擔(dān)憂。當(dāng)對血液進行血液中的危險病原體測試時，當(dāng)前沒有可行的方式來測試新發(fā)疾病，例如Cruetzfeld-Jacob疾病、天花和SARS。根據(jù)2000NIH研究，在全球，每年輸注10-15百萬單元的血液，而沒有測試HIV和其它疾病。這對于具有高HIV感染人口的地區(qū)例如南非尤其如此，在該地區(qū)感染HIV的人口的百分比可高達40 %。最近的報道 (Koch CG, Li L，Sessler DI等人.，(心臟手術(shù)后紅細胞儲存周期及并發(fā)癥)Duration of Red-Cell Storage and Complications after Cardiac Surgery,New Eng. J. ofMed. 2008 ； 358 :1229-1239)詳述了與使用儲存的血液用于心臟直視手術(shù)相關(guān)聯(lián)的疾病影響并且強調(diào)了對發(fā)現(xiàn)用作人造血液的人工氧載體(AOC)的緊迫性，作為對捐贈血液供應(yīng)的可替代物。在現(xiàn)代科學(xué)時代，數(shù)十年的廣泛研究、工業(yè)研究的努力、臨床試驗和花費數(shù)十億美元已導(dǎo)致兩種主要種類的A0C，即乳化的全氟化碳(PFC)和聚血紅蛋白(Hb)。雖然這兩種類型A0C，每種具有一些優(yōu)點，但在美國都還未被批準(zhǔn)用于臨床。一些基于全氟化碳(PFC)的 AOC 是 Oxygent (Alliance Pharmaceutical Corporation, San Diego, CA)、Fluosol-DA-20 (Green Cross,日本)、0xyfluor@(Hemagen, Inc. , St. Louis, MO)、Oxycyte0(Oxygen Biotherapeutics, Inc. International, Costa Mesa, CA)、Pher-02 (Sanguine Corp, Pasadena, CA) (13))和 Liquivent0 (Alliance Pharmaceutical, San Diego, CA)?；谘t蛋白或多聚血紅蛋白的AOC是亞微米尺寸的， 并且基于乳化的全氟化碳AOC是微米或亞微米尺寸的。任一類型在美國都還未被批準(zhǔn)用于臨床?；瘜W(xué)上和生物上惰性的乳化的無菌全氟化碳(PFC)在低溫2_5°C下儲存一年是穩(wěn)定的。此外，PFC制備是相對便宜的并且可在無任何生物材料下制備，排除了經(jīng)由輸血傳播傳染病的可能性。因為它們不溶于水，它們必須與能夠?qū)FC的微小液滴懸浮在血液中的乳化劑組合。在體內(nèi)在乳化劑通過單核細胞/巨噬細胞體系消化后，全氟化碳最終經(jīng)由肺被排除。另外，PFC是生物上惰性的材料，其可溶解比血漿多約五十倍的氧，但溶解比紅細胞少的氧。例如，如果肺中的氧分壓可通過使病人呼入具有約180mmHg的氧分壓的空氣而提高到120mm Hg,由按體積計70%血液和30%全氟化碳組成的混合物每IOOml血液可提供需要的5ml氧。與上面描述的基于全氟化碳(PFC)的AOC的有前途的特征相比，使用這樣的基于 PFC的AOC已導(dǎo)致似流感癥狀、對比正常氧壓力高的氧壓力的需求、諸如乳化劑毒性、氧自由基的形成、AOC在組織內(nèi)長期滯留、對肺組織的傷害、血小板計數(shù)減少的問題，以及與血液中來自循環(huán)的一氧化氮(NO)的損失相關(guān)的問題。NO的損失還是基于血紅蛋白的AOC的問題° 另夕卜，最近的對于 Oxygent (Alliance Pharmaceutical Corporation, San Diego, CA) 的III期臨床試驗已顯示與對照相比在治療病人中風(fēng)事件上的增加，并且因此已經(jīng)終止 Oxygent的臨床試驗,所述Oxygent使用穩(wěn)定的全氟溴辛燒/全氟萘燒蛋黃磷脂乳液并且具有比Fluosol-DA-20 (Green Cross,日本)大4-5倍的攜氧能力。全氟化碳(PFC)比水溶解更多氧，但仍少于正常血液。為了供應(yīng)在循環(huán)中需要量的氧，病人可能需要供氧。高度疏水性的PFC需要乳化劑來穩(wěn)定血液中的液滴。這些乳化劑與存在于血液中的蛋白質(zhì)和乳化劑相互作用，導(dǎo)致不穩(wěn)定性。因為，在循環(huán)中不能接受大量的PFC。小量的PFC從血液中逃逸進入肺，在肺中，PFC蒸發(fā)并且被呼出。大量的PFC和乳化劑可對肺功能具有不利影響。
與在前面段落中描述的基于全氟化碳的AOC相比，基于交聯(lián)的聚合的或包封的血紅蛋白的人工氧載體(AOC)為后來者，但引起了不斷增加的關(guān)注，因為它們運輸氧的特性與紅細胞(在下面稱為RBC)的運輸氧的特性相似。一些基于血紅蛋白的AOC是Hemolink、 Hemosol、Optro 和 Hemospan、Polyheme (Northfield, USA)、和 Hemopure (Biopure Corp., USA)，這些中的一些處于開發(fā)晚期并且在非洲和歐洲已通過III期臨床試驗。然而，存在潛在的動物傳播疾病，血紅蛋白從動物中獲得并且被純化，但高生產(chǎn)成本已減慢了發(fā)展。諸如由于肝臟內(nèi)的局部酶消化產(chǎn)生的鐵超載的其它副作用是否將與基于這些血紅蛋白的AOC 一樣出現(xiàn)仍是未知的。聚合血紅蛋白(pHb)使用與紅細胞(RBC)的結(jié)合機理更相似的結(jié)合機理來結(jié)合O2 和CO2，但在循環(huán)中留下的更小量的未聚合Hb可變得非常有毒。作為人工氧載體(A0C)，大量的Pffi需要注入到人體內(nèi)。過早分解可增大毒性風(fēng)險，并且如此大量會使身體的自然除去過程負(fù)擔(dān)加重。聚合Hb仍是昂貴的。其中動物來源的Hb冒著轉(zhuǎn)移基于朊病毒的疾病的風(fēng)險。重組Hb是有前景的方法。該方法需要高質(zhì)量的分離和純化步驟，這會增加成本。雖然基于聚合血紅蛋白(Hb) 和全氟化碳(PFC)的AOC產(chǎn)品將大量的氧運輸?shù)郊毎徒M織，它們的副作用，例如一氧化氮相關(guān)的血管收縮、中風(fēng)、心搏停止、似流感癥狀和長期的化學(xué)毒性，已迫使在美國終止了所有臨床試驗。用于降低通過新陳代謝注入到身體內(nèi)的相對大量的AOC的毒性的所有付出的努力已失敗。對于安全的人造血液產(chǎn)品的期望的特征列表很長且包括肺中充足的氧吸入和運輸?shù)浇M織，相應(yīng)地從組織釋放氧和除去二氧化碳；廣泛的適用性(即不需要交叉配血或相容性測試)；無副作用；對整個生物體無毒性；合理的循環(huán)時間；非毒性且可排泄而不造成傷害；不從血液中排除一氧化氮(NO);無免疫原性；易于殺菌以確保無病原體，例如病毒； 無對普通血液組分的干擾；在室溫下是穩(wěn)定的且大量制造是便宜的；長的貨架期和在實施時的即時全容量氧輸送。因此，考慮到意圖受控地將生物上活性物質(zhì)運輸?shù)缴眢w內(nèi)的人造血液產(chǎn)品和粒狀載體遇到的許多問題，在本領(lǐng)域存在對具有以下特性的改進的人工氧載體(AOC)和粒狀載體的需求(a)不會意外破碎并且不允許意外釋放以未經(jīng)調(diào)節(jié)的量存在于身體內(nèi)的可能有毒的活性藥用物質(zhì)，(b)提供充足的肺的氧吸入和運輸?shù)浇M織并且從組織相應(yīng)地除去二氧化碳，(C)對身體無毒，(d)不從血液中排除一氧化氮，(e)制造便宜，(f)在室溫和低溫下是穩(wěn)定的，(g)長的貨架期，(h)無副作用，(i)不干擾普通血液組分，(j)具有廣泛的適用性， 即不需要交叉配血或相容性測試；(k)化學(xué)上或生物上是惰性的，使得它們無生物材料，排除了經(jīng)由輸血傳播傳染病的可能性，(I)基于全氟化碳的A0C，其不具有現(xiàn)有技術(shù)先前遇到的問題，和(m)不必測試疾病。發(fā)明概述在前面段落中描述的現(xiàn)有技術(shù)中存在的需求通過本發(fā)明得以滿足。為滿足上面列出的現(xiàn)有技術(shù)的需求，本發(fā)明的獨特的特征是(1)粒狀人工氧載體(A0C)，其由以下性質(zhì)的有機組分和無機組分的獨特組合制成有機組分和無機組分的理化性質(zhì)允許用作A0C， 同時使用密度梯度的連續(xù)流動離心分離可從全血中回收，(2) A0C，其合成可通過間歇法或連續(xù)方法來進行，和(3)基于密度梯度分離的專用離心轉(zhuǎn)子，以完成從血液或其它生物流體中除去的任務(wù)。另外，只要其醫(yī)學(xué)目的實現(xiàn)便從病人系統(tǒng)中移除A0C，以便減輕已缺乏抵抗力的病人的生理應(yīng)力。粒狀人工氧載體被設(shè)計成在閉合回路流體循環(huán)體系中連續(xù)地循環(huán)，不經(jīng)受湍流破碎、化學(xué)分解或碎片的積累，并且不釋放其有效負(fù)荷，但能夠進行小的離子和氣體的交換， 并且粒狀人工氧載體可在所期望的任何時間使用采用密度梯度離心分離的連續(xù)流動分離被回收，而不會遭受破壞，或?qū)赡芤汛嬖谟诹鲃恿黧w中的其它材料造成破壞，密度梯度離心分離可通過磁場、親和過濾或其它方法加以補充。本發(fā)明的其它應(yīng)用包括從循環(huán)血液中除去和濃縮轉(zhuǎn)移性癌細胞，回收低復(fù)制(low copy)哺乳動物細胞、細菌細胞或病毒細胞和組織和器官成像。根據(jù)應(yīng)用，依據(jù)這些材料的尺寸和組成這些材料的特定設(shè)計需求可變化，但對于它們?nèi)康墓餐c是先前概述的性質(zhì)，和使用在前面段落中列出的方法從循環(huán)流體中連續(xù)回收的定制能力。
在本發(fā)明的AOC中使用的微粒的其它特征包括(I)由足夠大以保持循環(huán)的尺寸制成的微粒(即大于50nm和小于2um),⑵設(shè)計成在瑞流條件下抵抗機械破碎的微粒，(3) 設(shè)計成避免粘附到血球和血蛋白的微粒，(4)不會不利地影響現(xiàn)有的血液組分的生理功能的微粒，(5)抵抗吞噬作用的顆粒，(6)具有低毒性的微粒，(7)避免血管堵塞的顆粒，和(8) 能夠攜帶藥物、光學(xué)示蹤物、X射線示蹤物、射線照相示蹤物或MRI成像示蹤物和移動化學(xué)傳感器的微?！，F(xiàn)有的人工氧載體(AOC)產(chǎn)品可能滿足作為AOC在體內(nèi)使用時上面列出的標(biāo)準(zhǔn)中的一個或多個，但它們未被設(shè)計具有如本發(fā)明可實現(xiàn)的使用離心分離從血流中可連續(xù)回收的能力。為幫助實現(xiàn)AOC的上述目的，本發(fā)明涉及合成這樣的載體顆粒被設(shè)計成在閉合回路流體循環(huán)體系(例如人體的血流中)中連續(xù)循環(huán)，不經(jīng)受湍流破碎、化學(xué)分解、碎片的積累，不釋放其有效負(fù)荷，但能夠進行小的離子和氣體的交換，并且可在任何所期望的時間被回收。為從血樣中除去載體顆粒，可使用以下連續(xù)流動分離方法中的一種或多種(a)離心分離，(b)磁場，和/或(C)親和過濾，而不會遭受破壞，或?qū)赡芤汛嬖谟诹鲃恿黧w中的其它材料造成破壞。設(shè)想的是，在AOC已執(zhí)行它們的功能之后但在同時發(fā)生的AOC降解和副作用形成之前，盡可能快地從血流中除去AOC。在本發(fā)明的兩個實施方式中，合成了可移除的人工氧載體(AOC)，其具有單殼和雙殼以產(chǎn)生微米或亞微米尺寸的微粒/顆粒，微粒/顆粒包封氣體吸收物質(zhì)，例如全氟化碳 (PFC)或多聚血紅蛋白(PolyHB，聚HB)。簡要而言，用于制備基于包覆的PFC的載體顆粒的合成方法需要(a)形成穩(wěn)定的、抗湍流的PFC乳液，(b)逐層合成多聚血紅蛋白，和(c)形成一個或兩個殼，以保護載體顆粒。這些顆粒還可用作血液或其它液體中的治療劑或診斷劑的載體。使用間歇或連續(xù)流動合成方法實現(xiàn)包封。殼有助于抵抗在湍流條件下的機械破碎，避免粘附到血球，它們不會不利地影響現(xiàn)有的血液組分的正常的生理功能，它們抵抗吞噬作用，具有低毒性，且它們避免血管堵塞。新殼阻止將PFC釋放到AOC內(nèi)，但允許氣體和小的離子在血液和包封的PFC之間交換。存在兩種方法來制備用于單殼AOC的穩(wěn)定的、抗湍流的可回收的PFC納米乳。第一種方法使用幾種表面活性劑、油介體和其它添加劑的復(fù)合混合物，或使用專門設(shè)計的氟化的烷基末端磷脂酰膽堿型表面活性劑。第二種方法使用基于離子型碳氫化合物的表面活性劑(例如磷脂酸)以穩(wěn)定納米乳并且是優(yōu)選的方法，其將在下面更詳細描述。為了滿足對于在上面描述的本發(fā)明的AOC顆粒在它們的使用期間從血液中可回收性的標(biāo)準(zhǔn)，粒狀材料必須是填充有高密度全氟化碳液體的亞微米尺寸(50nm-700nm)的空心顆粒。這些顆粒被一個或兩個剛性的增強殼環(huán)繞。這些微粒殼的外表面包覆有含有暴露官能團(C00H、NH2、SH等)的分子，這些暴露官能團對于交聯(lián)多于一種的顆?；虻鞍踪|(zhì)狀抗體、細胞受體靶標(biāo)、多聚血紅蛋白、血紅蛋白等是便利的。更具體地，作為合成作為AOC的這種亞微米尺寸的單殼包覆的PFC顆粒，在室溫下用I，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)或具有比紅細胞更高密度的等效脂質(zhì)乳化全氟化碳，例如全氟溴辛烷或全氟萘烷。在詳述中描述了除了 DOPA外的乳化劑。使用擠出機在20-90C范圍內(nèi)的溫度通過擠出膜數(shù)次擠出全氟化碳和乳化劑。然后用磷酸鈣的5-20nm 厚的殼包覆通過擠出過程產(chǎn)生的亞微米結(jié)構(gòu)，并且與稍微過量的羧乙基膦酸(CEPA)混合， 羧乙基膦酸羧化顆粒表面，終止顆粒在生理PH下的進一步生長并且抑制顆粒在生理pH下的自聚集。離心濃縮材料，并且用磷酸鹽緩沖液透析最終產(chǎn)物并且通過熱壓處理進行滅菌， 而對包覆的顆粒無任何破壞。
用于制備單殼包覆的乳化顆粒的可變的方式是供給良好混合的流中的磷酸鹽緩沖的全氟化碳(PFC)或血紅蛋白(HB)乳液通過含有適當(dāng)pH的固定濃度的無菌氯化鈣溶液的反應(yīng)器。當(dāng)在反應(yīng)器中，混合物中的鈣和磷酸鹽圍繞乳化顆粒成核形成增強層，且懸浮液將進入旋籃式反應(yīng)器或終縮聚反應(yīng)器中，在反應(yīng)器中，添加少量的CEPA 18(足以覆蓋在此體積中可得到的顆粒的表面積)，并且濃縮所得到的混合物并且收集。本發(fā)明的單殼包覆的乳化顆粒(AOC)具有比血液中的其它組分例如紅細胞、白細胞和血漿更高的密度。因此，可利用離心力來從其它血液組分中分離顆粒，但使用密度梯度，而不是如現(xiàn)有技術(shù)中的沉降速率。在現(xiàn)有技術(shù)中，紅細胞是在離心力場中移動最遠的顆粒，但根據(jù)本發(fā)明，新的AOC是在離心力場中移動最遠的顆粒。由于AOC為離心力場中移動最遠的顆粒，可將它們與所有其它血液組分分離。本發(fā)明的用作人工氧載體的單殼包覆的PFC顆粒通常被添加到人的血液中并且它們與血流一起循環(huán)，從而以與血液相似的方式來交換氧和二氧化碳。本發(fā)明的第二實施方式是雙核氧載體(DCOC),其被合成為具有雙殼，以產(chǎn)生包封活性物質(zhì)(例如全氟化碳(PFC)和多聚血紅蛋白(PolyHb，聚Hb))的微米或亞微米尺寸的微粒。簡要而言，用于制備基于包覆的PFC的氧載體的合成方法需要(a)形成穩(wěn)定的、抗湍流的PFC乳液(b)逐層合成多聚血紅蛋白，和(C)形成用于保護載體顆粒的殼。更具體地，將DOPA與PFC混合并且擠出通過選定直徑的多孔膜，以形成具有亞微米尺寸的小顆粒的PFC乳液。將所得到的乳液懸浮在磷酸鹽緩沖液中，并且緩慢添加CaCl2 溶液，以在乳化顆粒上形成用于穩(wěn)定它們的DCPD薄層。接著，用羧乙基膦酸(CEPA)羧化第一殼的DCPD表面，以產(chǎn)生阻止乳化顆粒的聚集/生長的層。第二殼的厚度可通過DCPD殼形成的持續(xù)時間來控制。然后通過透析或離心膜過濾除去未反應(yīng)的試劑。最后的乳化顆粒的密度大于血液的密度并且可通過離心分離被分離。DCOC顆粒具有與正常血液的氧解離曲線相似的氧解離曲線并且具有用于交換肺和組織中的氣體的足夠快的滲透性，即它們以與正常血液相似的方式運輸氧和除去二氧化碳。另夕卜，DCOC顆粒足夠強，以經(jīng)得起在血液循環(huán)期間的正常湍流，并且具有兩種不同種類的氧載體，PFC和聚Hb，預(yù)期DCOC的毒性比具有單組分AOC的毒性小。血液中的AOC具有比血液更高的密度并且通過利用較高密度的AOC顆粒的連續(xù)流動密度梯度離心分離與其分離，以實現(xiàn)它們的分離。還可使用親和過濾從血液中分離AOC納米或亞納米尺寸顆粒。
另外，可將順磁性材料添加到每個納米顆粒中的較高密度PFC中，并且磁化率用于回收聚合血紅蛋白。含有順磁性和反磁性材料的流動液體(天然血液組分)在離心分離期間必須暴露于磁場，以使它們偏離具有順磁性材料的顆粒的流動方向，遠離反磁性顆粒， 從而使得可以分離和收集兩種類型的顆粒。


通過結(jié)合附圖閱讀下面的詳述，本發(fā)明將被更好地理解，其中圖I是被優(yōu)化用于所描述的發(fā)明的亞微米尺寸的血液代用品的透射電子顯微鏡圖像；圖2A-C是顯示如何構(gòu)造單殼AOC的橫截面圖；圖3是顯示不同濃度的全氟化碳血液代用品乳液(AOC)和亞微米尺寸血液代用品的估計的的氧含量的曲線，表明每單位重量的攜氧材料等同的攜氧能力；圖4示出在一定時間段內(nèi)本發(fā)明的單殼AOC顆粒在不同類型溶液中的穩(wěn)定性；圖5示出顯示本發(fā)明的單殼AOC顆粒用于不同濃度血紅蛋白的估計的氧合速率的三種曲線；圖6是雙殼雙核氧載體(DCOC)的橫截面圖示，雙殼雙核氧載體包裹PFC乳液核， PFC乳液核包裹有第一殼，在第一殼的外部上是包裹有第二殼的聚HB ；圖7是顯示用于雙核AOC(DCOC)的人的血液、全氟化碳和它們的混合物中的以二氧化碳CO2表示的氧含量對不同氧分壓的曲線；圖8示出表面活化的全氟化碳核和CaP殼穩(wěn)定的人工氧載體的不同構(gòu)型的四種圖示；圖9是顯示用于連續(xù)合成穩(wěn)定的人工氧載體的裝配系統(tǒng)的示意圖。發(fā)明詳述現(xiàn)有技術(shù)的未包覆的納米乳顆粒13具有許多缺點，例如非常易碎并且它們不期望地允許意外釋放活性藥用物質(zhì)，該活性藥用物質(zhì)在身體中以未經(jīng)調(diào)節(jié)的劑量存在，可能是有毒的。本發(fā)明的包覆的AOC納米乳顆粒11不存在這種問題。為滿足對于可暫時替代血液的人工氧載體(AOC)的標(biāo)準(zhǔn)，且滿足對于AOC 11從血液的可回收性的標(biāo)準(zhǔn)，本文描述的AOC是根據(jù)本發(fā)明的具有殼12的微粒。AOC殼12必須是圍繞高密度全氟化碳(PFC)乳化納米顆粒的亞微米尺寸(50-1000nm)的空心顆粒。增強殼12是剛性的并且由脂質(zhì)和無機材料(例如磷酸鈣、硅酸鹽)或生物相容性有機聚合物的組合組成，該生物相容性有機聚合物為例如但不限于聚己酸內(nèi)酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚環(huán)氧乙烷、脫乙酰殼多糖或軟骨素。AOC納米乳核顆粒11比血液密度大，且可使用特殊的離心，利用該更高的密度從血液中回收它們。圖I示出AOC顆粒11的典型的電子顯微鏡圖片。這些新的AOC顆粒11的殼12被含有暴露官能團(C00H、NH2、SH等)的分子包覆，這些暴露官能團對于交聯(lián)多于一種的顆?；虻鞍踪|(zhì)狀抗體、細胞受體靶標(biāo)、多聚血紅蛋白、血紅蛋白等是便利的。外環(huán)或殼12是透氣的磷酸鈣或聚合物涂層，而內(nèi)部是含有血紅蛋白(HB) 13納米顆粒和/或全氟化碳(PFC) 14 納米顆粒的攜氧中心。
由于基于碳氫化合物 的乳化劑在PFC中的受限的溶解度、還與在高溫下和在消毒期間它們在生物介質(zhì)中的不穩(wěn)定性有關(guān)的事實，在水中制備全氟化碳(PFC) 14納米乳富有挑戰(zhàn)性。為了乳化PFC，使用I，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)或不同鏈長度和結(jié)構(gòu)的類似磷脂酸、卵磷脂或不同鏈長度和結(jié)構(gòu)的磷脂酰膽堿、這些的混合物，以及這些與本領(lǐng)域其他人所用的其它添加劑(包括單鏈表面活性劑、甘油三酯和部分氟化的化合物) 的混合物。為以高收率在水中形成納米乳，有兩種主要的方法(a)使用幾種表面活性劑、油介體和其它添加劑的復(fù)合混合物；或(b)使用專門設(shè)計的氟化的烷基末端磷脂酰膽堿型表面活性劑。第二種增加了成本和復(fù)雜性。另一種方法是使用基于離子型碳氫化合物的表面活性劑，例如磷脂酸。這些乳化劑在過去未被用于制備PFC乳液，但存在一些優(yōu)點。乳化顆粒的高度帶負(fù)電的頭基預(yù)計能提高所形成乳液的曲率，結(jié)果使更小的納米尺寸的乳液至少在溫和條件下具有更高穩(wěn)定性。為了改進乳化過程并且實現(xiàn)每批乳液PFOB含量的增加，卵磷脂替代DOPA或其它乳化劑，作為在0. 334M磷酸鹽緩沖液中的乳化劑。乳化納米顆粒的增加量可為5%至70%， 但已發(fā)現(xiàn)對于AOC形成最佳的增加量為 40vol%。選擇該數(shù)據(jù)，以使AOC形成過程便利和穩(wěn)定?？墒褂酶邼舛鹊牟牧?，但所得到的更高的粘度引入與混合和擠出有關(guān)的問題。另夕卜，卵磷脂比使用DOPA明顯便宜，且結(jié)果是AOC和DCOC產(chǎn)物明顯便宜。發(fā)現(xiàn)在水中最佳的乳液具有含有0. I %至0. 6% PFOB的0. 25%卵磷脂。用于成像、組織氧合和作為治療措施的許多報道的PFC納米乳使用期短，并且當(dāng)需要大量的暴露時間或延長的暴露時間時這會導(dǎo)致產(chǎn)生的全身副作用和細胞副作用更糟。 我們示出納米乳顆粒的負(fù)電荷的磷酸根頭基易于與磷酸鈣的層12礦化，如在圖2A-2C中所示，其在機械性和化學(xué)性方面被更彈性地增強。這些材料可用于這樣的微流體設(shè)備、細菌和哺乳動物細胞培養(yǎng)體系和化學(xué)反應(yīng)器中需要足夠且有效的氧化，但用聚乙二醇、交聯(lián)蛋白質(zhì)和其它聚合物補充的較弱乳化的全氟化碳(PFC)已經(jīng)實現(xiàn)有限的成功。除了液體PFC外， 可制備高度揮發(fā)性的氣態(tài)形式的全氟化碳，并且合成在低溫下進行，以避免全氟化碳蒸發(fā)。合成全氟化碳AOC 11顆粒的優(yōu)選的方法涉及用如上描述的具有比紅細胞 (RBC)中更高密度的1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)或等同的脂質(zhì)(Avanti Lipid)在室溫下乳化全氟化碳例如全氟溴辛烷或全氟萘烷或其它合適的PFC。例如，使用 Thermobarrel LIPEX擠出機(Northern Lipids),數(shù)次擠出IOOml批量的全氟化碳和乳化劑的混合物通過300、400、500、600或700nm孔徑的聚碳酸酯擠出膜(Millipore)，以產(chǎn)生乳化顆粒。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，然后將亞微米尺寸的乳化顆粒11用磷酸鈣的5-20nm厚的殼12包覆，并且與略微過量的羧乙基膦酸(CEPA)混合，羧乙基膦酸羧化顆粒表面，終止顆粒在生理pH下的進一步生長并且抑制顆粒在生理pH下的自聚集。材料被離心濃縮到高于 50vol %,并且通過使用100，000MWC0 Spectrapore透析管(Pierce)用磷酸鹽緩沖液透析最終產(chǎn)物并且通過熱壓處理消毒，而對顆粒無任何破壞。將濃縮的乳化納米顆粒13收集在無菌儲存器中。測量收集的最終的AOC納米顆粒11的克分子滲透壓濃度并且如需要用無菌的PBS調(diào)節(jié)?？墒褂闷渌牧嫌糜谛纬蓺?2，例如硅酸鹽，或生物相容性有機聚合物，例如聚己內(nèi)酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚環(huán)氧乙烷、脫乙酰殼多糖或軟骨素。在一個實施方式變體中，這些材料的合成涉及緩慢地供給所制備的在良好混合的流中的磷酸鹽緩沖的全氟化碳或血紅蛋白乳液通過含有在適當(dāng)pH下的固定濃度的無菌氯化鈣溶液的反應(yīng)器中。在乳液在反應(yīng)器中的停留時間期間，混合物中的鈣和磷酸鹽圍繞乳化顆粒13成核形成增強層或殼12，然后懸浮液將進入旋籃式反應(yīng)器/終縮聚反應(yīng)器中，其中在反應(yīng)器中，添加有少量的CEPA 18 (足以覆蓋在此體積中可得到的顆粒的表面積)，并且濃縮所得到的混合物，并且收集在無菌儲存器中。測量收集的最終AOC的克分子滲透壓濃度并且如需要用無菌的PBS調(diào)節(jié)。反應(yīng)器示出在圖9中并且通過參考圖9被描述CEPA 18是優(yōu)選的，因為一側(cè)匹配存在的CaP涂層并且另一側(cè)被羧化，CEPA對于許多生物醫(yī)學(xué)材料是代表性的并且易于經(jīng)由已知的化學(xué)過程交聯(lián)物質(zhì)。雙官能或三官能的配體可用于替代CEPA，因為這些分子具有設(shè)計成粘著到顆粒的一個或兩個配體并且一個或兩個設(shè)計成突出或最終化學(xué)交聯(lián)到可以是聚合物、蛋白質(zhì)等的一些其它分子。對于非AOC應(yīng)用，它可以是例如用于靶向運輸?shù)目贵w。如果使用硅酸鹽替代CEPA，類似物將是替代磷酸酯基團的硅酸鹽基團。如果聚合物涂層替代CaP用作殼，則基于胺或硫的材料將用于粘著到聚合物殼，但在殼的外部上仍使用羧基，使得表面電荷將是負(fù)的并且使得顆粒穩(wěn)定且疏蛋白。更具體地，單殼AOC 11按如下制備。圖2 (A-C)圖示了納米乳顆粒的礦化以制備單殼AOC顆粒11的過程。納米乳顆粒13優(yōu)選地通過參考圖9在本詳述中任何地方所描述的攪拌過程由全氟溴辛烷(PFOB) 21,1,2- 二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA) 22和水的混合物制備，但還可使用本領(lǐng)域已知的其它方法。制備單殼AOC顆粒11通常需要的原材料從以下來源中獲得首先是(a)試劑級氯化鈣(CaCl2)、(b)磷酸(H3PO4)、(C)氯化鈉(NaCl)和(d)氫氧化鈉(NaOH)，所有這些都從Pittsburg, PA的Fisher Scientific獲得。需要的其它原材料是(a)羧乙基膦酸 (CEPA)、(b)全氟溴辛烷(PFOB)和(c)達爾伯克氏改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)，所有這些都從St. Louis, MO的Sigma-Aldrich獲得。需要的另外的其它原材料是(a) 1,2- 二油?；?sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)和(13)1-棕櫚酰基-2-[12-[7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]十二?；鵠-sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12: ONBD PC)和作為凍干粉末從 Alabaster, AL 的 Avanti Polar Lipids 獲得的類似的脂質(zhì)。然后是從 Salt Lake City, UT的ARUP Laboratories獲得的懸浮紅細胞(RBC)。最后，18MQ去離子水從Millipore， Billerica, MA的超純水過濾系統(tǒng)獲得。制備單殼AOC顆粒11的典型配方是將50 ill的PFOB 21與在水中的5ml 0. 69mM DOPA 22溶液混合。當(dāng)在室溫下在1200RPM下攪拌30分鐘時，產(chǎn)生這樣的混合物納米尺寸的均相乳液，約350nm平均尺寸的范圍，具有相對寬的尺寸分散度。分布和尺寸減小的細化通過使用 IOmlThermobarrel LIPEX 擠出機(Northern Lipids, Vancouver, CA)擠出混合物通過適當(dāng)孔徑(在60至200nm之間)的聚碳酸酯擠出膜(Millipore,Billerica,MA) 而獲得。使用工業(yè)級氮氣在800PSI下驅(qū)動流體通過膜，以獲得 0. 2-1. 0ml/min的流速。 膜孔徑被測試，以確定在每種情況下獲得的納米乳尺寸。在擠出之后在進行后續(xù)的包覆納米乳顆粒的步驟之前，進行懸浮，以靜止約I小時。在試驗中，用在IOOkV下操作的JEOL 100-SX透射電子顯微鏡(JE0L，東京，日本) 對礦化的納米乳樣品成像。將I或2 Ul被振搖的懸浮液放入具有聚醋酸甲基乙烯脂支撐物(Ted Pella, Redding, CA)的鍍碳的300目銅網(wǎng)的中心并且進行空氣干燥。圖像捕獲在膜上并且將顆粒直徑與在標(biāo)刻度的TEM圖像中的顆粒直徑進行比較。見圖I。使用Zetasizer Nano ZEN3600 (Malvern Instruments, Malvern, Worcestershire, UK)獲得2(TC時在20nM的懸浮濃度下制備的產(chǎn)物的平均顆粒流體動力學(xué)直徑、多分散指數(shù)(PDi)和定義為(roi)1/2xioo的多分散指數(shù)百分比。該儀器能夠測量 0.6nm至6微米范圍的顆粒尺寸，并且使用這樣的配置7°角的散射光從樣品池的前部被檢測到。這意味著對于獲得準(zhǔn)確尺寸測量，相比在檢測90度信號的常規(guī)的光散射儀器的情況，樣品的濃度是較不關(guān)鍵的。殼的厚度通過從初始納米乳的平均尺寸分布減去顆粒的平均尺寸分布來確定。在水、DMEM介質(zhì)和PBS介質(zhì)中時的納米乳顆粒的尺寸在圖4中示出。 如在圖2A中示出的，全氟溴辛烷(PFOB)納米顆粒11的外表面具有圍繞納米乳顆粒21的1，2- 二油酰基-sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)的表面。未包覆(未礦化)的納米乳顆粒13具有通過使用磷脂酸產(chǎn)生的PO3-的負(fù)電荷表面，以穩(wěn)定納米乳顆粒。由于納米乳顆粒的合成在堿性條件下進行，納米乳的表面電荷密度是非常高的，具有接近_50mV電動電位。為了在批處理中包覆負(fù)電荷的納米乳顆粒13，將600 ii I納米乳懸浮液與2: OOii I 0. IM磷酸溶液混合，磷酸溶液先前已用0. IM NaOH滴定到pH7。在室溫下在IOOml燒杯中以 400RPM的速度磁力攪拌混合物。接著，添加270 ill的0. IM NaOH,以將該混合物的pH 調(diào)節(jié)到9. 5。使用由在個人計算機上運行的Lab VIEW 6. 0版程序(National Instruments. Austin, TX)控制的兩個Tecan XP-3000注射泵，以30分鐘為間隔，將15至30份IOyl整份的0. IM CaCl2水溶液添加到含有納米乳的反應(yīng)容器中。在最后添加0. IM CaCl2后一小時，添加100 ill的0. IM CEPA溶液(在pH 7. 0下制備)，以包覆顆粒并且阻止磷酸鈣進一步沉積。在該過程中，來自磷酸中的正電荷的鈣離子被吸引到納米乳顆粒13(D0PA)的表面上的負(fù)電荷的PCV，如在圖2B中示出的。鈣離子在納米乳顆粒外周的積聚將局部濃度提高至超過磷酸鈣沉淀的穩(wěn)定點，導(dǎo)致磷酸鈣沉淀到納米乳顆粒上。這產(chǎn)生第一磷酸鈣(CaP) 殼22，如在圖2A中示出的。因為本體乳液中離子濃度低，在納米乳/溶劑界面處沉淀是優(yōu)選的。以這種方式產(chǎn)生的磷酸鈣的主要形式是透鈣磷石。除了 CaP殼22外，可使用其它材料來產(chǎn)生殼，例如脫乙酰殼多糖、軟骨素和碳酸鈣，和/或CaP和這些材料的混合物和/或其它礦物。為了濃縮產(chǎn)生的產(chǎn)物，如在前面的段落中描述的，將25ml礦化的納米乳顆粒放 A 50ml維形離心管(Fisher Scientific, Pittsburg, PA)中并且使用SL250T型轉(zhuǎn)子以 10，000RPM在 Sorval T20Superspeed Centrifuge (ThermoFisher, Pittsburg, PA)中離心 I 小時，并且倒出上層清液。通常得到5ml濃縮產(chǎn)物，產(chǎn)生含有約10% PFOB的懸浮液。使用 100, 000MWC0 Spectrapore 透析管(Pierce, Rockford, IL)用 pH 7. 0 的 0. ImM 憐酸鹽緩沖液透析離心樣品，以除去未反應(yīng)的和未包封的材料。這產(chǎn)生基本的CaP單殼AOC 11，如在圖IB和2C中所示。在最后的步驟中，將CEPA 的涂層18添加到CaP殼12、22上。在最后添加0. IM CaCl2以產(chǎn)生CaP殼后一小時，添加 100 ill的0. IM CEPA溶液(在pH 7. 0下制備)，以用涂層18包覆顆粒并且阻止磷酸鈣進一步沉積。最后的AOC納米顆粒11圖不在圖2C中。在37°C下，在劇烈攪拌、聲波處理和熱壓處理滅菌下，評估未包覆的納米乳顆粒13和礦化的12顆粒11的穩(wěn)定性。對于溫度研究，在室溫和37°C下溫育納米乳和相應(yīng)的礦化的顆粒30天。每隔五天，使用所描述的動態(tài)光散射測定平均尺寸。對于劇烈混合，使用定軌搖床，以將剪切力施加到顆粒，并且每天測量平均顆粒尺寸。對于聲波測試，使用Branson 細胞均質(zhì)機，并且每隔30分鐘測量平均顆粒尺寸。最后，使樣品經(jīng)受在121°C下持續(xù)30分鐘的一個熱壓滅菌周期來處理樣品，并且證實了包覆的顆粒未被破壞。對如上面參考圖I和2A-2C所描述的單層包覆的納米乳顆粒的用途進行了它們用作人工氧載體(AOC)Il的測試。見圖5A-5C。這些圖的斜率被調(diào)節(jié)以適應(yīng)所用的血紅蛋白的濃度，最終的速率估計為4. 8、14. 5、和15. 2sec^0對于RBC，等效常數(shù)是4. Isec'為了得到產(chǎn)生圖5A-5C中的曲線的數(shù)據(jù)，通過用在等滲PBS中制備的0. 5ml乳液和礦化的顆粒溫育在20%血流比各計中的0. 5ml RBC/血衆(zhòng)樣品，在室溫下測試在納米乳顆粒的存在下紅細胞(RB C)的溶血。測量從RBC中釋放的微摩爾和釋放的血紅蛋白的％， 作為從0-8%的納米乳或礦化的納米乳顆粒的體積％的函數(shù)。在所使用的顆粒的每種濃度下，通過假定血紅蛋白的摩爾吸收率在575nm時為55，S^cnT1M'用分光光度計測量在 3，000RPM下離心15分鐘以除去細胞和其它碎片之后混合物的上層清液中的RBC溶血的量。為了確定單層包覆的納米乳顆粒AOC的攜氧能力，測量了水中溶解的氧的量。首先確定了在充足量的氧的存在下在37°C時540nm處的吸光度與葡萄糖濃度的線性依存關(guān)系，然后限制氧的量，在充足量的葡萄糖存在下，估計濃度。實際上，對于氧濃度的校準(zhǔn)，將 200 u I的冷凍葡萄糖分析溶液(鄰苯二茴香胺、葡萄糖氧化酶和過氧化物酶的混合物)倒 A IOml離心管中，用隔膜覆蓋并且使用旋轉(zhuǎn)式真空泵排空5分鐘隨后用氮氣吹掃5分鐘。 重復(fù)排氣和吹掃兩次，并且將離心管保持在37°C水浴中。在37°C下，將每個IOiU的含有 IOOmg葡萄糖/ml的類似脫氧的葡萄糖溶液與0、25、50、75、100和150 的空氣平衡的去離子水混合，并且在37°C下將混合物添加到在上面制備的脫氧葡萄糖分析溶液中并且反應(yīng) 30分鐘。最后，將200 ill 12N H2SO4添加到每個樣品中，以終止反應(yīng)。添加去離子水，以使總體積為I. 41ml并且在540nm處檢測吸光度。繪制吸光度與溶解的氧的濃度的曲線，假定空氣在IATM和37°C，水含有215. 6 u mo I的02。在實驗上測定的包覆的AOC懸浮液中的氧含量為水中的氧含量和全氟化碳中的氧含量的加和。定量地，(等式I)CO2 總=C02PFCVPFC+C02 水 V 水= C02PFCVPFC+C0a (I-Vpfc)其中，CO2總是樣品的總的氧濃度，且CO2prc和CO2 #是在給定的氧分壓和溫度下PFC 和水中的氧的濃度，且類似地，V是PFC和水的體積分?jǐn)?shù)。如果對于每相氧溶解度是已知的， CO2總可根據(jù)PFC的給定的總分?jǐn)?shù)估算。乳化的PFOB的氧含量在37°C和在IATP下具有估計3，640 u mol/1 CSAT的02。通過在10，OOOrpm下離心I小時將未包覆和包覆的顆粒的懸浮液濃縮到10% v/v。使用上面的等式(I)并且使Vprc = 0. 1，空氣平衡的母液中的氧濃度測定為558. OuM0用pH 7. 4的PBS順序稀釋200 U I的產(chǎn)物，以制備從0至250nM范圍的 5種不同濃度的懸浮液。向37°C的200 ill的每個空氣飽和的懸浮液中，添加200 ill先前制備的脫氧葡萄糖分析溶液連同I U I的100mg/ml的葡萄糖溶液。使反應(yīng)在37°C下進行 30分鐘，并且測量540nm處的吸光度，以估算未包覆的和包覆的顆粒中存在的氧的量。見圖 3。
對于適合于作為組織充氧器的這些材料，從血流中攝取氧的速率必須與從組織毛細管中的血液中的卸載氧的速率相當(dāng)。對于紅細胞，氧攝取和釋放速率測定為在最大變化的50%的點處，分別報道為0.4和I. lsec，并且以假一級常數(shù)計算的脫氧常數(shù)為 4. IliO^sec'產(chǎn)物的脫氧速率根據(jù)脫氧血紅蛋白(Hb)溶液攝取氧的速率間接估算， 因為，脫氧血紅蛋白溶液的攝取氧的速率比產(chǎn)物的脫氧速率快得多。使用具有30ms混合時間的Aminco停流進樣儀器進行脫氧Hb的氧攝取測量。用新獲得的血細胞制備Hb溶液并且用鹽水洗滌幾次。離心地收集紅細胞并且用10倍體積的冷去離子水溶解，且通過在 3，000RPM下離心分離20分鐘來除去膜片段。將pH調(diào)節(jié)到7. 0使用而無需純化。Hb的濃度為約0. 5mM。Hb的脫氧通過用氮氣吹掃進行直至585nm處溶液的吸收峰值變得可忽略。 PFOB-納米乳和顆粒的濃度設(shè)為約10VOl%并且將它們的pH值調(diào)節(jié)為7. O。在將Hb與納米乳或顆?？焖倩旌虾?，在25°C觀察到585nm處光譜吸收隨時間的增大。對于每個樣品，記錄了三次連續(xù)停流蹤跡的平均值。在單層殼包覆的AOC的可替代的實施方式中，載體顆粒具有微米或亞微米尺寸的雙核全氟化碳(PFC)和多聚血紅蛋白(PolyHb，聚Hb)，多聚血紅蛋白為聚合的血紅蛋白，雙核全氟化碳和多聚血紅蛋 白使用間歇或連續(xù)流動合成方法使用與制備單層包覆的AOC相同的技術(shù)來制備。這些在本文稱為雙核氧載體(DCOC)。圖6示出雙殼人工氧載體(DCOC) 的橫截面圖并且除了制備單殼AOC所需要的步驟外還需要幾種另外的順序合成步驟。這些另外的步驟是形成穩(wěn)定的PFC乳液，在第一殼中逐層合成多聚血紅蛋白，以及形成最后的殼，以覆蓋聚HB。另外，圖7示出DCOC氧載體作為如先前描述的血液代用品性能是多么好。 除了聚外，還可使用其它Hb單體，轉(zhuǎn)基因Hb和來自?？苿游锖腿祟悂碓吹腍b。DCOC運輸氧并且提取二氧化碳，由于其高密度，可使用連續(xù)流動密度梯度分離從先前關(guān)于單殼AOC已經(jīng)描述的循環(huán)血液中回收?？蓪COC的氧解離曲線制成與正常血液的氧解離曲線相似，因此，不同于基于全氟化碳的氧載體，DCOC不需要病人另外使用氧氣筒。它持續(xù)保持循環(huán)，足以經(jīng)受血壓循環(huán)中的湍流，并且具有用于交換肺和組織中的氣體的足夠快的滲透性。有不同的兩種氧載體-全氟化碳(PFC)和血紅蛋白(HB)，DCOC的毒性比由單組分制備的那些小。將I，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸酯(DOPA)與接近2. Og/ml密度的PFC例如全氟溴辛烷或全氟萘烷混合并且擠出通過選定直徑的多孔膜，以形成具有亞微米尺寸的PFC 乳液。將乳液懸浮在8-9之間的pH值的15mM磷酸鹽緩沖液中并且向懸浮液中緩慢添加 IOOmM CaCl2溶液，以使亞微米尺寸PFC乳液顆粒形成二水合磷酸二鈣(DCPD)，以用于穩(wěn)定它們。接著，用羧乙基膦酸(CEPA)羧化DCOC顆粒的DCPD殼表面，以防止顆粒的自聚集，從而終止DCPD殼在生理pH下的進一步生長，并且抑制顆粒在生理pH下的自聚集。DCPD殼的厚度通過控制DCPD形成的持續(xù)時間和借助于透析或離心膜過濾除去未反應(yīng)的試劑而通常被保持在3-15nm之間。最后的顆粒的密度為約I. 8g/ml，且因此它們可易于通過離心而被濃縮到高達50%體積。初步研究已表明帶殼的PFC顆粒在磷酸鹽緩沖液中是穩(wěn)定的，經(jīng)得起與在血液中所預(yù)期的湍流相同的湍流，并且呈現(xiàn)比在紅細胞(RBC)中所預(yù)期的氧交換速率更快的氧交換速率。具有DCro殼的PFC顆?？捎脽晒鈽?biāo)記物標(biāo)記，用于跟蹤和定量分析。將010 I-棕櫚?；?2-[12-[7-硝基-2-1，3-苯并噁二唑-4-基)氨基]十二?；鵠-Sn-甘油-3-磷酸膽堿(16:0-12:0 NBD PC)與DOPA混合并且用于完成如上描述的PFC乳液的合成。已知 NBD在460nm處激發(fā)且熒光在524nm處有熒光，并且計算存在于懸浮液中的乳液顆粒的數(shù)目，可為每份DCOC構(gòu)建校準(zhǔn)曲線，通過校準(zhǔn)曲線，可估算使用這種乳液構(gòu)建的未知濃度樣品顆粒的量。當(dāng)將乳液與RBC混合時，兩種樣品的激發(fā)和發(fā)射將相互干擾，并且每種樣品的估算的濃度將需要求解吸收光譜和發(fā)射光譜的聯(lián)立方程。為了減小誤差，使用疏水性熒光染料作為標(biāo)記物(其吸收和熒光受RBC的干擾將是最小的)。合成DCOC的下一步 驟是添加第二殼。這通過用DP⑶殼將聚賴氨酸/Hb的層沉積在PFC顆粒上來完成。聚賴氨酸/Hb被逐層地沉積到在本方法的前面步驟中所制備的DCPD 殼的負(fù)電荷的羧化表面上。第一步是用聚賴氨酸的分子層覆蓋在前面段落中描述的DCPD/CEPA包覆的PFC乳液的表面。聚賴氨酸Mb靜電粘附到帶電表面和其它蛋白質(zhì)并且通常作為食品添加劑被美國食品和藥物管理局接受為是安全的。為了牢固的粘附，聚賴氨酸分子的長度應(yīng)是足夠長的，以跨越至少3個或更多個血紅蛋白分子。假定血紅蛋白的直徑是約4nm且單體賴氨酸的長度為約lnm，為了合成聚賴氨酸/Hb,我們將需要至少12_mer的聚賴氨酸。然而,聚賴氨酸分子的長度可增加，以穩(wěn)定Hb。在200nm直徑PFC顆粒的表面上，有足夠的空間結(jié)合多達24，000個Hb分子。如果50%或更高的表面被Hb包覆，且需要至少4個聚賴氨酸分子來壓緊分子，必須將48，000個聚賴氨酸分子結(jié)合到在其上具有第一殼的PFC顆粒的表面。 如果PFC顆粒的濃度是已知的，可估算用于包覆所需要的聚賴氨酸分子的最小數(shù)目。聚賴氨酸(和ffi)的沉積可通過在本方法過程期間使用電動電位測量來監(jiān)測并且用分光法或通過在借助于透析從混合物中除去過量的試劑之后的總碳含量來證實。還可使用除聚賴氨酸外的聚合物，例如聚乙二醇、聚乳酸、聚乙醇酸PHEMA、脫乙酰殼多糖和軟骨素。一旦聚賴氨酸的第一層沉積了，添加含有至少12，000X濃度的PFC顆粒的血紅蛋白(ffi)溶液，作為的第一層用于聚合。然后添加3-4倍濃度的聚賴氨酸。Hb和聚賴氨酸的交替添加將持續(xù)，直至獲得所期望厚度的聚賴氨酸Mb層。所有反應(yīng)將在PH 8下進行， 使得的氧化保持是低的并且在Hb和CEPA之間維持相反的離子電荷。一旦聚賴氨酸/Hb層形成，應(yīng)用第二 DCPD涂層和最后的CEPA涂層，以強化DCOC 顆粒。該最后的層還用于保持內(nèi)部材料完整。所制備的DCOC的詳細橫截面示出在圖6中。圖7示出了，在其殼內(nèi)具有80%聚Hb和20% PFC的單獨的雙核氧載體(DCOC) 的攜氧能力非常接近于全血的攜氧能力，且當(dāng)向血中添加相同的DCOC以組成80%血液和 20% DCOC時，其同樣具有非常接近于全血的攜氧能力。還示出單獨的聚Hb的攜氧能力。更具體地，圖7示出了血液的氧解離曲線、用于合成雙核氧載體(DCOC)的單個組分即聚Hb和OFC的推測的氧解離曲線，以及80%聚Hb和20% PFC及類似地80%血液和 20% DCOC的數(shù)字表示的額外的氧解離曲線。注意到，血液的氧解離曲線和DCOC與血液混合物的氧解離曲線在它們的S形性質(zhì)和氧親和力方面是相似的，這表明兩者可將幾乎相同量的氧從肺運輸?shù)浇M織。換句話說，不同于基于PFC的A0C，病人可能不再需要補充吸氧。 此外，這還有助于降低聚Hb的氧化速率并且抑制其與環(huán)境直接接觸，避免與當(dāng)前開發(fā)的的聚Hb產(chǎn)品相關(guān)的一些問題。圖8不出表面有活性的全氟化碳核21和穩(wěn)定的殼12的人工氧載體AOC的不同配置的四種圖示。在圖8A和圖SB中，單個可回收顆粒的表面活性層24可以是使用各種交聯(lián)劑(例如EDC/SNHS (Pierce))交聯(lián)到CaP層的蛋白質(zhì)(例如抗體)或其它生物化學(xué)活性物質(zhì)例如螯合劑、酶、核酸等?；钚员砻婵梢允桥cA中的密度相同的高密度或與B中的密度相同的低密度?；钚詫舆€可以是聚合物層，例如聚賴氨酸、聚乙二醇或聚乳酸/聚乙醇酸、 pHEMA等(可從Sigma得到)。這些材料中的許多在文獻中已知為用于包覆其它類型的納米顆粒并且提供其它功能。它們可以是對本發(fā)明可回收性特征的補充，但不排除其它技術(shù)。 活性層還可以是交聯(lián)的血紅蛋白和聚電解質(zhì)的層，或由另一種不可回收的納米顆?；蚓哂衅渌再|(zhì)(例如地磁活動性和化學(xué)活性)的材料組成。圖SC和8D闡述了包封可回收顆粒的不同方式，成對或更多的數(shù)目限制。為了產(chǎn)生這些類型的顆粒排列，活性表面應(yīng)具有使用標(biāo)準(zhǔn)的交聯(lián)化學(xué)過程將顆粒交聯(lián)在一起的性質(zhì)。例如，可使用親和素-生物素、抗體-抗原或直接交聯(lián)劑。這些策略還用于文獻中并且通過增大它們的質(zhì)量或合并多種構(gòu)型的可回收顆粒來補充增強本發(fā)明的可能具有不同的檢測能力的可回收顆粒(例如，組合熒光性標(biāo)記的和MRI活性的可回收納米顆粒，或組合不可回收探針納米顆粒與可回收納米顆粒，以同時具有探針特征和可回收性特征，或組合順磁性納米顆?；虿牧吓c具有高密度的可回收顆粒，以一并使用用于回收的密度和磁化率)。可使用用于單層AOC的相同的連續(xù)流動密度梯度分離從循環(huán)血液中回收AOC和 DCOC顆粒。這是由于其高于紅細胞的密度。通常，只要AOC或DCOC的醫(yī)療目的實現(xiàn)便將 AOC或DCOC從病人體系中回收，以減輕已缺乏抵抗力病人的生理應(yīng)力。本發(fā)明新的AOC和DCOC被設(shè)計成被循環(huán)通過身體和通過閉合回路流體循環(huán)體系而不破碎的大致目的。更具體地，AOC和DCOC粒狀人工氧載體被設(shè)計成在閉合回路流體循環(huán)體系中連續(xù)循環(huán)，且不經(jīng)受湍流破碎、化學(xué)分解或碎片積累，并且它們不釋放它們的有效負(fù)荷，但能夠交換小的離子和氣體，并且可使用采用密度梯度離心分離的連續(xù)流動分離在所期望的任何時間被回收，而不不遭受破壞或?qū)σ汛嬖谟诹黧w中的其它材料造成破壞，密度梯度分離可被磁場、親和過濾或其它方法補充。新的AOC和DCOC的其它應(yīng)用包括從循環(huán)血液中除去和濃縮轉(zhuǎn)移性癌細胞，回收低復(fù)制哺乳動物細胞、細菌細胞或病毒細胞和組織和器官成像。根據(jù)應(yīng)用，依據(jù)這些材料的尺寸和組成，這些材料的特定設(shè)計需求可進行變化，但它們?nèi)克灿械氖窍惹案攀龅男再|(zhì)， 和從循環(huán)流體中連續(xù)回收的定制能力。為了從血液中除去AOC和DCOC顆粒，可使用以下連續(xù)流動分離方法中的一種或多種(a)離心分離，(b)磁場，和/或(C)親和過濾，而不遭受破壞或?qū)赡芤汛嬖谟诹鲃恿黧w中的其它材料造成破壞。從血液中除去AOC和DCOC顆粒不是本發(fā)明的部分，且不再另外描述。圖9是示出用于連續(xù)合成穩(wěn)定的人工氧載體(A0C和DC0C)的裝配體系的框圖。在合成中使用的材料的細節(jié)之前已在本發(fā)明的詳述中被詳細描述。本方法的步驟、材料、百分比等先前已被詳細描述，因此在此不再重復(fù)。整個體系包括用于運輸原材料的可控源，并且包括多聚血紅蛋白(Pffi)的儲存器30、水性脂質(zhì)溶液例如全氟化碳(PFC)的儲存器31和制備的氯化鈣(CaCl)溶液的儲存器32。有預(yù)混合器/多擠出機33，儲存器30和31中的材料在計算機控制下可控地進入預(yù)混合器/多擠出機33。預(yù)混合器/多擠出機33產(chǎn)生如先前在本發(fā)明的詳述中描述的納米乳顆粒。納米乳顆粒經(jīng)由穿孔的試劑輸送管被輸送到合成室35，并且，在適當(dāng)?shù)臅r間，還將氯化鈣溶液添加到合成室，以產(chǎn)生圍繞乳化顆粒13的增強層或殼12。在包覆過程期間，用由電機34驅(qū)動的槳36緩慢地攪拌室35內(nèi)的原材料。在適當(dāng)?shù)臅r間，包覆的納米乳顆粒離開合成室35進入旋籃式反應(yīng)器/終縮聚反應(yīng)器37中，在反應(yīng)器中，顆粒被儲存在儲存器38中的CEPA 18包覆。在旋籃式反應(yīng)器37中， 包覆的納米乳顆粒與足夠的CEPA 18 —起被緩慢攪拌，以包覆顆粒的有效表面。如先前描述的，CEPA涂層羧化顆粒表面，終止納米乳顆粒在生理pH下的進一步生長并且抑制納米乳顆粒在生理pH下的自聚集。在離開終縮聚反應(yīng)器37后，顆粒被離心濃縮(未示出)成高于50vol %,并且通過使用100，000MWC0 Spectrapore透析管(Pierce)用磷酸鹽緩沖液透析最終產(chǎn)物并且通過熱壓處理消毒，而對顆粒無任何破壞。將濃縮的乳化納米顆粒13收集在無菌儲存器(未示出)中。測量收集的最終AOC納米顆粒11的克分子滲透壓濃度并且如需要用無菌的PBS調(diào)節(jié)。雖然本文描述了基于鈣的殼，還可使用其它材料形成殼12，例如硅酸鹽或生物相容性有機聚合物，例如聚己酸內(nèi)酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚環(huán)氧乙烷、脫乙酰殼多糖或軟骨素?；谙惹懊枋龅脑?，儲存器31中的脂質(zhì)溶 液中優(yōu)選地可具有卵磷脂。另外，在每種納米顆粒中可將順磁性材料添加到更高密度的PFC中，并且隨后使用磁化率，用于回收聚合血紅蛋白。含有順磁性和反磁性材料的流動液體(天然血液組分)在離心分離期間必須暴露于磁場，以使得它們偏離具有順磁性材料的顆粒流動方向，遠離反磁性顆粒，從而可以分離和收集兩種類型的顆粒。雖然在本文已描述的是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式和一些可替代的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，可在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下作出許多改變。
權(quán)利要求
1.一種用于替代人血液的粒狀人工氧載體，所述粒狀人工氧載體包括 乳化材料的納米顆粒，并且所述材料可以以與血液相似的方式攜帶氧和二氧化碳； 第一殼，其圍繞乳化的納米顆粒形成，所述第一殼穩(wěn)定所述納米顆粒；以及 第一涂層，其圍繞所述乳化的納米顆粒的所述第一殼，所述第一涂層終止所述第一殼的連續(xù)形成； 其中具有第一殼的所述納米顆粒具有比血液中的任意組分更高的密度，并且其中所述第一殼允許所述乳化的納米顆粒在閉合回路循環(huán)體系中的人血液內(nèi)連續(xù)地循環(huán)，而不破碎并且不會將在所述第一殼內(nèi)的所述乳化的材料釋放到血液中。
2.如權(quán)利要求I所述的粒狀人工氧載體，其中所述第一殼由磷酸鈣制成。
3.如權(quán)利要求2所述的粒狀人工氧載體，其中在所述第一殼內(nèi)的所述乳化的納米顆粒為全氟化碳或多聚血紅蛋白。
4.如權(quán)利要求I所述的粒狀人工氧載體，其還包括 材料的新層，其可以以與血液相似的方式在所述第一殼的外部上攜帶氧和二氧化碳； 第二殼，其圍繞所述第一殼的外部上的新層生成，形成圍繞其的第二殼以保護所述材料的新層；以及 第二涂層，其圍繞所述第二殼，所述第二涂層終止所述第二殼的連續(xù)形成。
5.如權(quán)利要求4所述的粒狀人工氧載體，其中所述第二殼由磷酸鈣制成。
6.如權(quán)利要求5所述的粒狀人工氧載體，其中所述材料的新層包括在聚賴氨酸中的多聚血紅蛋白。
7.如權(quán)利要求I所述的粒狀人工氧載體，其中使用卵磷脂乳化在所述第一殼內(nèi)的材料的納米顆粒材料。
8.如權(quán)利要求4所述的粒狀人工氧載體，其中使用卵磷脂乳化在所述第一殼和第一涂層的外部上的所述材料的新層。
9.如權(quán)利要求4所述的粒狀人工氧載體，其中所述粒狀人工氧載體是亞微米尺寸的。
10.制備用于替代人血液的粒狀人工氧載體的方法，所述方法包括以下步驟 乳化可以以與血液相似的方式攜帶氧和二氧化碳的第一材料； 使乳化的材料形成納米顆粒；以及 用第二材料包覆所述納米顆粒，以圍繞所述納米顆粒形成第一殼，所述第一殼可透過氧氣和二氧化碳； 其中具有第一殼的所述納米顆粒具有比血液中的任意組分更高的密度，并且其中所述第一殼允許所述乳化的納米顆粒在閉合回路循環(huán)體系中的人血液中連續(xù)地循環(huán)，而不破碎并且不會將在所述第一殼內(nèi)的所述乳化的材料釋放到血液中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備用于替代人血液的粒狀人工氧載體的方法，還包括用第三材料包覆所述第一殼以終止所述第一殼的生長的步驟。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備用于替代人血液的粒狀人工氧載體的方法，還包括以下步驟 形成可以以與血液相似的方式在所述第一殼和第一材料涂層的外部上攜帶氧和二氧化碳的材料的新層；以及 用第二殼包覆所述材料的新層，以保護所述材料的新層。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備用于替代人血液的粒狀人工氧載體的方法，其中所述材料的新層是可以以與血液相似的方式攜帶氧和二氧化碳的在聚賴氨酸中的多聚血紅蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備用于替代人血液的粒狀人工氧載體的方法，還包括用材料包覆所述第二殼的外部以終止所述第二殼的生長的步驟。
15.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備用于替代人血液的粒狀人工氧載體的方法，其中包覆所述納米顆粒以形成所述第一殼的材料是磷酸鈣。
16.根據(jù)權(quán)利要求10所述的制備用于替代人血液的粒狀人工氧載體的方法，還包括在使所述乳化的材料形成小的顆粒之前，用卵磷脂乳化攜氧第一材料的步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求11所述的制備用于替代人血液的粒狀人工氧載體的方法，且其中用第二材料包覆所述第一殼以終止所述第一殼的生長的步驟包括在適當(dāng)?shù)臅r間下用羧乙基膦酸包覆所述第一殼以終止所述第一殼的生長的步驟。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的制備用于替代人血液的粒狀人工氧載體的方法，還包括在使所述乳化的材料形成小的顆粒之前，用卵磷脂乳化攜氧第一材料的步驟。
19.制備用于攜帶化學(xué)劑例如藥物和成像示蹤劑通過在人體內(nèi)流動的血液的粒狀載體的方法，所述方法包括以下步驟 乳化所述化學(xué)劑； 使乳化的化學(xué)劑形成納米顆粒；以及 用材料包覆所述納米顆粒，以圍繞所述納米顆粒形成第一殼，所述第一殼是可滲透的，以允許所述化學(xué)劑以受控的方式離開所述粒狀載體； 其中具有第一殼的所述納米顆粒是足夠穩(wěn)定的，使得它們允許所述乳化的顆粒在人血液中連續(xù)地循環(huán)，而不破碎且不會將所述第一殼內(nèi)的所述乳化的化學(xué)材料釋放到血液中。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的制備用于攜帶化學(xué)劑通過在人體內(nèi)流動的血液的粒狀載體的方法，還包括以下步驟 形成可以在所述第一殼的外部上攜帶所述化學(xué)劑的材料的新層；以及 用材料包覆所述材料的新層，以圍繞所述材料的新層形成第二殼，從而保護其免于以不受控的方式釋放到血液中。
全文摘要
一種用于身體的人工氧載體(AOC)。第一透氣的第一殼包封攜氧劑。第一殼具有圍繞其的第二攜氧劑，且存在包封第二試劑的第二透氣殼。同心的殼不經(jīng)受湍流破碎，或化學(xué)分解，不釋放試劑。
文檔編號A61K38/16GK102625710SQ201080048249
公開日2012年8月1日 申請日期2010年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月25日
發(fā)明者希羅?！っ芴K卡米, 艾格尼絲·奧斯塔芬 申請人:希羅?！っ芴K卡米, 艾格尼絲·奧斯塔芬