專利名稱：生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌的人工莢膜多糖的方式和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria mentingitidis)的合成和人工莢膜多糖的方式(裝置，means)和方法。本發(fā)明也涉及可通過(guò)本發(fā)明方法獲得的莢膜多糖。還提供了用作藥物，特別用作疫苗和/或診斷劑(diagnostics)的腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖。
背景技術(shù)：
細(xì)菌性腦膜炎仍然是對(duì)全球健康的嚴(yán)重威脅，估計(jì)全世界每年有17萬(wàn)人因此而死亡(WHO，http://www.who.int/nuvi/meningitidis/en/)。盡管可利用強(qiáng)有力的抗微生物藥劑，但病死率仍然很高(10-40% )，而且幸存者經(jīng)常遭受后遺癥，如神經(jīng)殘疾或肢體缺失和耳聾(Van Deuren 等人，Clin Micriobiol Rev 2000 ； 13 (1) 144-166 ;Kaper 等人，Nat Rev Microbiol 2004,2(2) :123-140)。腦膜炎奈瑟氏菌(Nm)是細(xì)菌性腦膜炎的最重要致病物之一，因?yàn)樗哂性诹餍胁ㄖ袀鞑サ臐摿?Kaper等人，Nat Rev Microbiol 2004，2(2) :123-140 ;Rosenstein 等人，N Eng J Med 2001,344(18) :1378-1388) 產(chǎn)生 Nm 物種的疾病的關(guān)鍵毒力決定因素是它們的細(xì)胞外多糖莢膜，該多糖莢膜對(duì)人血清中腦膜炎球菌的生成是至關(guān)重要的(Vogel等人，hfect Immun 1997,65(10) =4022-4029) 基于這些多糖的抗原變異，已鑒定出Nm的至少十二種不同的血清組(血清群，serogroup) (A、B、C、E29、H、I、K、L、W-135、X、Y和Z)，但僅六種(A、B、C、W-135、Y和X)導(dǎo)致幾乎所有的病例；還可參見(jiàn) Handbook of Meningococcal Disease. Frosch, Μ. , Maiden, Μ. C. J. (eds).Weinheim =Wiley-VCH ψ^ Frosch,M. ,V0GEL,U. (2006) "Structure and genetics of themeningococcal capsule.，，。血清組A(NmA)和C(NmC)是撒哈拉沙漠以南的非洲腦膜炎球菌性腦膜炎(meningococcal meningitidis)的主要原因，而血清組B (NmB)和C是工業(yè)化國(guó)家主要的致病菌株。然而，血清組W-135(NmW-135)和Y(NmY)正變得越來(lái)越流行。對(duì)于NmW_135，最明確的證明就是2002年布基納法索的流行病，此流行病感染病例超過(guò)13，000例，死亡人數(shù)超過(guò) 1，400 人(Connolly 等人，Lancet 2004,364(9449) :1974-1983 ；WHO，Epidemicand Pandemic Alert and Response (EPR) 2008)。相比之下，NmY 在美國(guó)得到重視，它在美國(guó)的流行程度已從1989-1991期間的2%增加到1997-2002期間的37% (Pollard等人，JPaediatr Child Health 2001,37(5) :S20_S27)。最近，以前只是零星發(fā)現(xiàn)的血清組X(NmX)在尼日爾出現(xiàn)高發(fā)病率，并暴發(fā)于肯尼亞和烏干達(dá)(Biosier等人，Clin Infect Dis 2007，44(5) :657-663 ；Lewis, WHO Health Action in Crisis 1,62006)。血清組A、B、C.29E, H、I、K、L、W-135、X、Y和Z是本領(lǐng)域眾所周知的，并描述在Frosch, M.，V0GEL, U. (2006)，同前文獻(xiàn)中。所有血清組的莢膜多糖(CPS)都是帶負(fù)電的線性聚合物。血清組B和C包裹在由通過(guò)血清組B中α-2 —8糖苷鍵或血清組C中的α -2 — 9鍵連接的唾液酸(Neu5Ac)部分組成的均聚CPS中(Bhattacharjee等人，J BiolChem 1975,250(5) =1926-1932) 血清組W-135和Y都是雜聚物。它們由血清組W-135中半乳糖 /Neu5Ac 重復(fù)單元[—6) - α -D-Glcp-(1 — 4) _ α -Neu5Ac_ (2 — ]n，或血清組 Y 中葡萄糖 /Neu5Ac 重復(fù)單元[—6) - α -D-Galp-(1 — 4) - α -Neu5Ac_ (2 — ]n 組成(Bhattachar jee等人，Can J Biochem 1976,54(1) :1_8)。NmA 和 NmX 的 CPS 不包含 Neu5Ac 部分，而是分別由N-乙酰基-甘露糖胺1-磷酸[—6)-a-D-ManpNAc-(1 — OPO3 — ]η或N-乙?；?葡糖胺I-磷酸[—6)-a-D-GlcpNAc-(l — OPO3 — ]n重復(fù)單元構(gòu)造而成的(Bundle等人，Carbohydr Res 1973，26(1) :268-270 ;Bundle 等人，J Biol Chem 1974,249(15)4797-4801) ；Bundle 等人，J Biol Chem 1974，249 (7) :2275_2沘1 Jennings 等人，J InfectDis 1977,136 Suppl:S78_S83)。產(chǎn)生Nm的疾病的CPS是吸引人的候選疫苗，且對(duì)于血清組A、C、Y、W-135，可用多糖或多糖結(jié)合物(conjugate)疫苗(Broker 等人，Minerva Med 2007,98 (5) :575-589)。對(duì)于血清組B和X，當(dāng)前無(wú)疫苗可用。僅血清組B的莢膜多糖具有不良免疫原性，因?yàn)樗诮Y(jié)構(gòu)和化學(xué)上與在人中發(fā)現(xiàn)的多糖(多碳水化合物)(PolySia)相同。然而，NmX的大暴發(fā)僅發(fā)生在2006年，因此還未研制出任何疫苗。CPS生物合成中的關(guān)鍵酶是膜相關(guān)性莢膜聚合酶(capsule polymerase)。已為所有六種致病血清組鑒定出候選基因(Frosch等人，Proc Natl Acad Sci USA 1989，86 (5)1669-1673 ;Claus 等人，Mol Gen Genet 1997，257(1) J8-34 ;Tzeng 等人，Infect Immun2003,71 (2) :6712-6720)。然而，我們對(duì)那些重要酶的酶學(xué)或結(jié)構(gòu)功能關(guān)系的了解仍然非常有限。雖然已為使用粗膜(crude membrane)組分作為酶源的NmB和NmC酶報(bào)道了一些數(shù)據(jù) Gteenbergen 等人，J Biol Chem 2003,278(17) :15349-15359)，但最近才可以純化出活躍NmB聚合酶，且只進(jìn)行了初步結(jié)構(gòu)功能分析(Freiberger等人，Mol Microbiol 2007，65(5) :1258-1275)。在最新的研究中，還對(duì)從血清組NmW_135和NmY克隆的莢膜聚合酶進(jìn)行純化和初步表征(Claus等人，Mol Microbiol 2009,71(4) :960-971)。這些蛋白質(zhì)是雙官能(bifunctional)糖基轉(zhuǎn)移酶，其可以單獨(dú)地合成NmW_135和NmY的各個(gè)雜聚CPS。然而，直到現(xiàn)在，用于奈瑟氏菌屬疫苗的多糖生產(chǎn)仍需要腦膜炎奈瑟氏菌的發(fā)酵，以及隨后針對(duì)培養(yǎng)基中多糖的多步純化。這些生產(chǎn)工藝既是成本密集型的(costintensive)，也總是存在被奈瑟氏菌屬毒素、培養(yǎng)基組分或隨后純化操作過(guò)程所需的化學(xué)物污染的風(fēng)險(xiǎn)。而且，所得多糖批次通常是異質(zhì)的(heterogeneous)，很難表征。將在下面描述的體外生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌的合成和人工莢膜多糖的本發(fā)明方法已克服這些技術(shù)問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖(capsular polysaccharides, CPS)的體外方法，所述方法包括以下步驟(a)使至少一種供體(donor)碳水化合物與至少一種純化的莢膜聚合酶(CP)接觸；(b)將所述碳水化合物與所述莢膜聚合酶溫育；和(c)分離產(chǎn)生的莢膜多糖，其中所得莢膜多糖是腦膜炎奈瑟氏菌血清組W_135、Y、A或X特異性莢膜多糖的合成或人工莢膜多糖，或者其中所得莢膜多糖是人工嵌合莢膜多糖，該人工嵌合莢膜多糖包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-i;35、B/Y/W-i;35、C/Y/W-135、B/W-135/Y、C/W-135/Y、X/A 或 A/X 的莢膜多糖或莢膜多糖亞基(subunit)。根據(jù)本發(fā)明，驚人地發(fā)現(xiàn)腦膜炎奈瑟氏菌血清組W_135、Y、A和X的莢膜多糖(CPS)可以通過(guò)合成生產(chǎn)，即體外生產(chǎn)。因此，可以避免以前使用的成本和時(shí)間密集型生產(chǎn)工藝。此外，發(fā)現(xiàn)包含不同腦膜炎奈瑟氏菌血清組的CPS或其亞基的人工嵌合CPS可以通過(guò)本文描述和列舉的體外方法生產(chǎn)?？赏ㄟ^(guò)本文描述的體外方法獲得的嵌合CPS可以包括腦膜炎奈瑟氏菌血清組A、B、C、W-135、X和/或Y的兩個(gè)或更多個(gè)CPS亞基或者含有腦膜炎奈瑟氏菌血清組A、B、C、W-135、X和/或Y的不同CPS的一個(gè)或多個(gè)衍生化(derivatized)結(jié)構(gòu)單元(building blocks)的CPS，或者由它們組成。此種衍生化結(jié)構(gòu)單元的實(shí)例在圖1 5中示出?？赏ㄟ^(guò)本文描述的方法獲得的嵌合CPS可以包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-135、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/W-135/Y、C/W-135/Y、X/A或A/X的CPS或CPS亞基，或者由它們組成。在所述嵌合CPS內(nèi)，CPS亞基的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元可以衍生化，如圖1 5中示例性示出的?？赏ㄟ^(guò)上文陳述的本發(fā)明方法獲得的嵌合CPS可以包含一種或多種各包含CPS亞基的碳水化合物。可通過(guò)本文所述的方法獲得的嵌合CPS的CPS亞基，或包含在這些嵌合CPS中的衍生化結(jié)構(gòu)單元的序列可以是任何順序的?？赏ㄟ^(guò)上文陳述的體外方法獲得的嵌合CPS實(shí)例在圖6中示出?？赏ㄟ^(guò)上文描述的體外方法獲得的嵌合CPS也可以用作藥物，例如用作疫苗。特別地，本文描述的嵌合CPS作為由腦膜炎奈瑟氏菌引起的疾病預(yù)防和治療疫苗，如腦膜炎奈瑟氏菌疫苗是有利的。通過(guò)本文描述的體外方法獲得的嵌合CPS可以用作對(duì)抗不同腦膜炎奈瑟氏菌血清組的疫苗。這些含有不同CPS亞基的嵌合CPS可以用來(lái)對(duì)抗其CPS亞基包含在所述嵌合CPS中的腦膜炎奈瑟氏菌血清組。例如，根據(jù)本發(fā)明，含有腦膜炎奈瑟氏菌血清組A的CPS亞基和腦膜炎奈瑟氏菌血清組X的CPS亞基的嵌合CPS可以用作對(duì)抗腦膜炎奈瑟氏菌血清組A和腦膜炎奈瑟氏菌血清組X的疫苗。本發(fā)明體外方法也可以獲得多聚嵌合CPS。此種嵌合CPS可以包含不同腦膜炎奈瑟氏菌血清組的兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)不同CPS亞基，或者由它們組成。例如，可通過(guò)本文陳述的體外方法獲得的嵌合CPS可以包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組w-135、Y和C的CPS亞基或者由它們組成。而且，此種嵌合CPS以及針對(duì)它的抗體可用于診斷目的。在本文描述和列舉的體外方法的一個(gè)實(shí)施方式中，人工嵌合CPS包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組w-135和Y的CPS。在本文陳述的方法的進(jìn)一步實(shí)施方式中，使該至少一種供體碳水化合物和至少一種莢膜聚合酶(CP)進(jìn)一步與受體碳水化合物接觸。根據(jù)本發(fā)明體外方法，可以在步驟(b)期間進(jìn)一步活化與至少一種純化的莢膜聚合酶(CP)接觸的供體碳水化合物。優(yōu)選地，該活化通過(guò)活化核苷酸如CMP、UDP、TDP或AMP的鍵連(連鍵、連接，linkage)介導(dǎo)。更優(yōu)選地，該活化核苷酸是CMP或UDP。核苷酸鍵連對(duì)碳水化合物的活化可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的數(shù)種活化酶催化?？梢栽诒疚奶峁┑捏w外方法的步驟(a)期間使此種活化酶與該至少一種供體碳水化合物和至少一種CP接觸。例如，在本文陳述的體外方法的步驟(a)期間，使碩大利什曼原蟲(chóng)(Leishmania major)的UDP-糖焦磷酸化酶(USP)(USP-LM)與至少一種供體碳水化合物和至少一種CP接觸。USP-LM催化feil-Ι-磷酸和Glc-I-磷酸分別活化成核苷酸糖UDP-Gal和UDP-Glc。USP-LM的核苷酸序列在SEQ ID NO :9中示出。USP-LM的多肽序列在SEQ ID N0:10中示出。為了活化Neu5Ac，優(yōu)選使用 CMP-NeuNAc 合成酶(CSS) (Ganguli 等人，J Bacteriol (1994)，176(15)4583-4589)。UDP-ManNAc 優(yōu)選從 UDP-GlcNAc 使用酶 UDP-GlcNAc-差向異構(gòu)酶合成。在 SEQID NO=Il中，示出從腦膜炎奈瑟氏菌血清組A克隆的UDP-GlcNAc-差向異構(gòu)酶的核苷酸序列，UDP-GlcNAc-差向異構(gòu)酶的相應(yīng)多肽序列在SEQ ID NO 12中示出。根據(jù)本文陳述的方法，可以使該至少一種供體碳水化合物和莢膜聚合酶(CP)進(jìn)一步與受體碳水化合物接觸。在本文陳述的體外方法的一個(gè)實(shí)施方式中，與至少一種供體碳水化合物接觸的莢膜聚合酶(CP)專用于(specific for)合成腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135的CPS。具體地，與至少一種供體碳水化合物接觸的CP是CP-W-135或其功能衍生物。編碼CP-W-135的核苷酸序列在SEQ ID NO 1中示出。CP-W-135的氨基酸序列在SEQ ID NO 2中示出。CP-ff-135功能衍生物是能夠合成血清組W-135和血清組Y CPS的莢膜多糖(CPS)的酶(Claus等人，Mol Microbiol 2009,71(4) :960-971)。優(yōu)選地，CP-W-135功能衍生物的核苷酸序列與SEQID NO 1具有至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %的序列同一性，且CP-W-135功能衍生物的氨基酸序列與SEQ ID NO :2具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少99%的序列同一性。功能衍生物也可以包含維持生物活性的功能片段。所以，如本文結(jié)合核苷酸序列或多肽使用的術(shù)語(yǔ)“其功能衍生物”是指，與本文定義的核苷酸序列或可被本發(fā)明核酸序列(例如SEQ ID NO 1)編碼的多肽(例如，SEQ ID NO 2所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。該(生物)功能尤其可以通過(guò)Claus等人，Mol Microbiol 2009,71(4) :960-971中描述的方法以及本文提供的本發(fā)明中(的方法)評(píng)估。根據(jù)本發(fā)明，核苷酸或氨基酸序列的同一性水平分別指的是SEQ ID NO 1所示核苷酸序列或SEQ ID NO :2所述多肽序列的整個(gè)長(zhǎng)度(全長(zhǎng))，并且成對(duì)地(pair-wise)評(píng)估，其中每個(gè)空位(空隙，gap)都被記為一個(gè)不匹配。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”與術(shù)語(yǔ)“同源性”等效。例如，術(shù)語(yǔ)同一性和同源性在本文結(jié)合分別與SEQ ID NO :1或2，優(yōu)選在整個(gè)長(zhǎng)度內(nèi)具有至少80%的同一性或同源性的核酸或多肽/氨基酸序列使用。因此，本發(fā)明涉及多肽(為CP-W-135或其片段)在本發(fā)明方法中的應(yīng)用，其中該多肽與SEQ ID NO 2中所示的多肽具有至少80%的同一性/同源性。如果例如通過(guò)例如序列比較進(jìn)行比較的兩個(gè)核酸序列同一性不同，則術(shù)語(yǔ)“同一性”或“同源性”指的是較短序列和與所述較短序列匹配的較長(zhǎng)序列的部分。因此，當(dāng)所比較的序列長(zhǎng)度不相同時(shí)，同一性程度是指與較長(zhǎng)序列中核苷酸殘基相同的較短序列中核苷酸殘基的百分比，或者與較短序列中核苷酸序列相同的較長(zhǎng)序列中核苷酸的百分比。在這種情況下，技術(shù)人員能夠容易地確定與較短序列“匹配”的較長(zhǎng)序列的部分。而且，針對(duì)序列比較(例如，“同一性”或“同源性”值的確定)的這些定義將應(yīng)用于本文描述和公開(kāi)的所有序列。此外，同一性意味著相應(yīng)核苷酸序列或多肽(例如，由此編碼的多肽)之間存在功能和/或結(jié)構(gòu)等效性(等同性，equivalence) 0與本文描述的特定核酸/氨基酸序列具有給定水平的同一性的核酸/氨基酸序列可以代表這些序列的衍生物/變體，所述衍生物/變體優(yōu)選具有相同的生物功能。它們可以是天然存在的變異形式(variations)，例如來(lái)自其它種類(varieties)、物種等的序列，或者突變形式(mutations)，且所述突變形式可以天然形成或者可以通過(guò)預(yù)訂(deliberate)誘變產(chǎn)生。此外，該變異形式可以是合成產(chǎn)生的序列。該等位基因變體可以是天然存在的變體或合成產(chǎn)生的變體或通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。與上述核酸序列的偏離(deviation)可以通過(guò)，例如刪除、替換、添加、插入和/或重組產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“添加”是指在給定序列末端添加至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸，而“插入”是指在給定序列內(nèi)插入至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸。術(shù)語(yǔ)“刪除”是指在給定序列內(nèi)刪除或除去至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“替換”是指替換給定序列內(nèi)至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸殘基。再次，如本文使用的這些定義，加上適當(dāng)?shù)淖兏?，可以適用于本文提供和描述的所有序列。變體多肽，特別是根據(jù)本文描述的本發(fā)明體外方法使用的核酸序列的不同變體編碼的多肽優(yōu)選表現(xiàn)出它們共同具有的特定特性。這些包括，例如，生物活性、分子量、免疫反應(yīng)性、構(gòu)象等，以及物理性質(zhì)，如凝膠電泳遷移行為、色譜行為、沉降系數(shù)、溶解度、光譜特性、穩(wěn)定性、最適pH、最適溫度等。在上面描述的體外方法的進(jìn)一步實(shí)施方式中，該莢膜聚合酶(CP)是CP-W-135或其功能衍生物，且與CP接觸的至少一種供體碳水化合物是CMP-NeU5Ac或其衍生物，且至少一種供體碳水化合物是UDP-Gal或其衍生物。CMP-Neu5Ac和UDP-Gal衍生物的實(shí)例分別在圖ID和IB中示出。在本文陳述的體外方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，CP是CP-W-135或其功能衍生物，且至少一種供體碳水化合物是fel-1-磷酸或其衍生物，且至少一種供體碳水化合物是唾液酸或其衍生物。feil-l-磷酸和唾液酸衍生物的實(shí)例分別在圖4B和4D中示出。優(yōu)選地，根據(jù)本文描述的體外方法，該唾液酸是Neu5Ac。在上文描述的體外方法中，當(dāng)與CP接觸時(shí)，Gal-I-磷酸和唾液酸可以進(jìn)一步與至少一種核苷酸和/或磷酸烯醇丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)及輔助酶(輔酶)接觸。此種核苷酸可以是CMP、CDP、CTP、UMP、UDP和UTP。在本文陳述的體外方法中，供體碳水化合物feil-Ι-磷酸和唾液酸中的至少一種可以在與CP —起溫育期間進(jìn)行活化，從而產(chǎn)生活化的糖核苷酸UDP-Gal和/或CMP-Neu5Ac。根據(jù)上文描述和列舉的體外方法中，CP-W-135或其功能衍生物以及至少一種供體碳水化合物可以進(jìn)一步與受體碳水化合物在接觸步驟期間接觸。所述受體碳水化合物可以是腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135的寡聚或多聚的CPS(W-135CPS)、腦膜炎奈瑟氏菌血清組Y的寡聚或多聚的CPS (Y CPS)、腦膜炎奈瑟氏菌血清組B的寡聚或多聚的CPS (B CPS, α 2，8-連接的唾液酸)，和/或腦膜炎奈瑟氏菌血清組C的寡聚或多聚的CPS(C CPS，α 2，9-連接的唾液酸)。所述受體碳水化合物也可以在它的還原端帶有一個(gè)或多個(gè)另外的官能團(tuán)，如圖5圖例中列舉的。因此，可以合成可通過(guò)本文描述的體外方法獲得的，包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-135、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/W-135/Y或C/W-135/Y的CPS或CPS亞基，或者由它們組成的人工嵌合CPS。例如，在本發(fā)明體外方法中，使CP-W-135與作為供體碳水化合物的CMP-Neu5Ac和UDP-Gal，以及作為受體碳水化合物的α 2，8-連接的唾液酸三聚體(B CPS三聚體)接觸，從而合成包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組B/W-135的CPS亞基或者由它們組成的人工嵌合CPS。在可通過(guò)上文描述的本發(fā)明方法獲得的嵌合CPS當(dāng)中，CPS亞基的一種或多種碳水化合物可以衍生化，并且可以包含例如，另外的官能團(tuán)如氨基、烷基、羥基、羧酸、疊氮化物(azides)、酰胺、乙酰基或鹵素原子；也可參見(jiàn)“Carbohydrate chemistry”卷1_34 monosaccharides, disaccharides, and specific oligosaccharides, 1967-2000 年出版的文獻(xiàn)的綜述，Cambridge (England)，Royal Society of Chemistry?？赏ㄟ^(guò)本文陳述的體外方法獲得的嵌合CPS可以包含一種或多種各包含CPS亞基的碳水化合物。所述嵌合CPS的CPS亞基的序列可以是任何順序的。作為實(shí)例，生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖(CPS)的體外方法包括以下步驟(a)使 CMP_Neu5Ac、UDP-Gal 和水解的 Y CPS 與 CP-W_i;35 接觸；(b)將 CMP_Neu5Ac、UDP-Gal 和水解的 Y CPS 與 CP-W_i;35 —起溫育；禾口(c)分離出由腦膜炎奈瑟氏菌血清組Y/W-135莢膜多糖亞基組成的人工嵌合CPS。技術(shù)人員容易理解，還可以應(yīng)用如本文描述的活化或未活化供體碳水化合物、受體碳水化合物和莢膜聚合酶(CP)的其它組合。此種其它組合和其它修改并沒(méi)有違背本發(fā)明的主旨。例如，本發(fā)明的另一個(gè)示例體外方法涉及包含以下步驟的生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖(CPS)的方法(a)使 Neu5Ac、Gal-I-P, CTP、UTP 和水解的 Y CPS 與 CP-W-135、USP-LM 和 CSS 接觸；(b)將 Neu5Ac、Gal-I-P, CTP、UTP 和水解的 Y CPS 與 CP-W-135、USP-LM 和 CSS —起溫育，其中將Neu5Ac活化成CMP-Neu5Ac且將Glc-I-P活化成UDP-Glc ；和(c)分離出由腦膜炎奈瑟氏菌血清組Y/W-135莢膜多糖亞基組成的人工嵌合CPS。技術(shù)人員容易理解，還可以應(yīng)用如本文描述的活化或未活化供體碳水化合物、受體碳水化合物和莢膜聚合酶(CP)的其它組合。此種其它組合和其它修改并沒(méi)有違背本發(fā)明的主旨。在本文陳述的體外方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，與至少一種供體碳水化合物接觸的莢膜多糖(CP)專用于合成腦膜炎奈瑟氏菌血清組Y的CPS。具體地，與至少一種供體碳水化合物接觸的CP是CP-Y或其功能衍生物。編碼CP-Y的核苷酸序列在SEQ ID NO :3中示出。CP-Y的氨基酸序列在SEQ ID NO :4中示出。CP-Y功能衍生物是能夠合成血清組W-135和血清組 Y CPS 的莢膜多糖的酶(Claus 等人，Mol Microbiol 2009,71(4) :960-971)。優(yōu)選地，CP-Y功能衍生物的核苷酸序列與SEQ ID NO 3具有至少40%，至少80%，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %的序列同一性，且CP-Y功能衍生物的氨基酸序列與SEQ ID NO :4具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少99%的序列同一性。功能衍生物也可以包含維持生物活性的功能片段。因此，如本文結(jié)合核苷酸序列或多肽使用的術(shù)語(yǔ)“其功能衍生物”是指，與可被本發(fā)明核酸序列(例如SEQ ID NO 3)編碼的本文定義的核苷酸序列或多肽(例如，如SEQ ID NO :4中所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。該(生物)功能尤其可以通過(guò)Claus等人，MolMicrobiol 2009,71(4) :960-971中描述的方法以及本文提供的方法評(píng)估。根據(jù)本發(fā)明，核苷酸或氨基酸序列的同一性水平分別指的是SEQ ID N0:3所示核苷酸序列或SEQ ID NO :4所示多肽序列的整個(gè)長(zhǎng)度，并且成對(duì)地評(píng)估，其中每個(gè)空位都被記為一個(gè)不匹配。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”與術(shù)語(yǔ)“同源性”等效。例如，術(shù)語(yǔ)同一性和同源性在本文結(jié)合分別與SEQ ID NO :3或4，優(yōu)選在整個(gè)長(zhǎng)度內(nèi)具有至少80%的同一性或同源性的核酸或多肽/氨基酸序列使用。因此，本發(fā)明涉及多肽(為CP-Y或其片段)在本發(fā)明方法中的應(yīng)用，其中該多肽與SEQ ID NO 4中所示的多肽具有至少80%的同一性/同源性。如果例如通過(guò)例如序列比較進(jìn)行比較的兩個(gè)核酸序列同一性不同，則術(shù)語(yǔ)“同一性”或“同源性”指的是較短序列和與所述較短序列匹配的較長(zhǎng)序列的部分。因此，當(dāng)所比較的序列長(zhǎng)度不相同時(shí)，同一性程度優(yōu)選指與較長(zhǎng)序列中核苷酸殘基相同的較短序列中核苷酸殘基的百分比，或者與較短序列中核苷酸序列相同的較長(zhǎng)序列中核苷酸的百分比。在這種情況下，技術(shù)人員能夠容易地確定與較短序列“匹配”的較長(zhǎng)序列的部分。而且，針對(duì)序列比較(例如，“同一性”或“同源性”值的確定)的這些定義將應(yīng)用于本文描述和公開(kāi)的所有序列。術(shù)語(yǔ)“同一性”和“同源性”在上文中有進(jìn)一步描述，該定義和解釋尤其適用于CP-Y及其功能片段。在本發(fā)明體外方法的具體實(shí)施方式
中，CP是CP-Y或其功能衍生物，且至少一種供體碳水化合物是CMP-Neu5Ac或其衍生物，且至少一種供體碳水化合物是UDP-Glc或其衍生物。CMP-Neu5Ac和UDP-Glc衍生物的實(shí)例分別在圖ID和2B中示出。再次，根據(jù)本發(fā)明的術(shù)語(yǔ)衍生物或功能片段涉及具有生物活性的衍生物或片段。此種“生物”功能可以在如后附實(shí)例中提供的或如Claus (2009)，同前文獻(xiàn)中描述的試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試。在本文陳述的體外方法的進(jìn)一步實(shí)施方式中，莢膜聚合酶(CP)是CP-Y或其功能衍生物，且至少一種供體碳水化合物是Glc-I-磷酸或其衍生物，且至少一種供體碳水化合物是唾液酸或其衍生物。唾液酸衍生物的實(shí)例在圖4D中示出，Glc-I-磷酸衍生物的實(shí)例在圖15中示出。在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述唾液酸是Neu5Ac。根據(jù)本文描述的體外方法，當(dāng)與CP接觸時(shí)，Gal-I-磷酸和唾液酸可以進(jìn)一步與至少一種核苷酸和/或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)及輔助酶接觸。此種核苷酸可以是01^、^ 、0 』1^、皿？和^ 。在本文陳述的體外方法中，供體碳水化合物feii-i-磷酸和唾液酸中的至少一種可以在與CP —起溫育期間進(jìn)行活化，從而產(chǎn)生活化的糖核苷酸UDP-Glc和/或CMP-Neu5Ac。CP-Y或其功能衍生物以及至少一種供體碳水化合物可以進(jìn)一步與受體碳水化合物在本文所述的體外方法的接觸步驟期間接觸。所述受體碳水化合物可以是寡聚或多聚的W-135CPS、寡聚或多聚的Y CPS、寡聚或多聚的B CPS，和/或寡聚或多聚的C CPS。所述受體碳水化合物也可以在它的還原端帶有一個(gè)或多個(gè)另外的官能團(tuán)(見(jiàn)圖例5)。因此，可以合成可通過(guò)本發(fā)明體外方法獲得的，包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組Y Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y,B/ff-135X/ff-135,B/Y/ff-135X/Y/ff-135,B/ff-135/Y 或 C/W-135/Y 的 CPS 或 CPS 亞基或者由它們組成的嵌合CPS。例如，使CP-Y與供體碳水化合物CMP-Neu5Ac和UDP-Gal，以及與作為受體的寡聚W-135CPS接觸，從而合成包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135/Y的CPS亞基或者由它們組成的人工嵌合CPS。在這種情況下，術(shù)語(yǔ)“功能衍生物”也可以包含“功能片段”。在可通過(guò)本文陳述的體外方法獲得的嵌合CPS當(dāng)中，CPS亞基的一種或多種碳水化合物可以衍生化，并且可以包含例如，另外的官能團(tuán)如氨基、烷基、羥基、羧酸、疊氮化物、酰胺、乙酰基或鹵素原子；也可參見(jiàn)例如“Carbohydrate chemistry ‘‘卷l-34Cambridge [England], Royal Society of Chemistry，同前文獻(xiàn)。所述嵌合 CPS 可以包含一種或多種各包含CPS亞基的碳水化合物?？赏ㄟ^(guò)本文面描述的體外方法獲得的嵌合CPS的CPS亞基的序列可以是任何順序的。作為本發(fā)明的實(shí)例，生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖(CPS)的體外方法包括以下步驟(a)使 CMP_Neu5Ac、UDP-Glc 和水解的 W_i;35CPS 與 CP-Y 接觸；(b)將 CMP_Neu5Ac、UDP-Glc 和水解的 W_i;35CPS 與 CP-Y —起溫育；禾口(c)分離出由腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135/Y的莢膜多糖亞基組成的人工嵌合CPS。如上所述，技術(shù)人員容易理解，還可以應(yīng)用如本文描述的活化或未活化供體碳水化合物、受體碳水化合物和莢膜聚合酶(CP)的其它組合。此種其它組合和其它修改并沒(méi)有違背本發(fā)明的主旨。本發(fā)明的另一個(gè)示例體外方法涉及包含以下步驟的生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖(CPS)的方法(a)使 Neu5Ac、Glc-I-P, CTP、UTP 和水解的 W_i;35CPS 與 CP-Y、USP-LM 和 CSS 接觸；(b)將 Neu5Ac、Glc-l-P、CDP、UDP、PEP 和水解的 W_i;35CPS 與 CP_Y、USP_LM 和 CSS與一起溫育，其中將Neu5Ac活化成CMP-Neu5Ac，且將Glc-I-P活化成UDP-Glc ；和(c)分離出由腦膜炎奈瑟氏菌血清組Y/W-135的莢膜多糖亞基組成的人工嵌合CPS。再次，還可以應(yīng)用如本文描述的活化或未活化供體碳水化合物、受體碳水化合物和莢膜聚合酶(CP)的其它組合。此種其它組合和其它修改并沒(méi)有違背本發(fā)明的主旨。本發(fā)明也涉及這樣的體外方法，其中與至少一種供體碳水化合物接觸的莢膜聚合酶(CP)專用于合成腦膜炎奈瑟氏菌血清組X的CPS。具體地，與至少一種供體碳水化合物接觸的CP是CP-X或其功能衍生物。編碼CP-X的核苷酸序列在SEQ ID NO :5中示出。CP-X的氨基酸序列在SEQ ID NO :6中示出。CP-X功能衍生物是能夠合成血清組X的莢膜多糖的酶(Tzeng 等人，Infect Immun 2003,71 (2) :6712-6720)。優(yōu)選地，CP-X 功能衍生物的核苷酸序列與SEQ ID NO: 5具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的序列同一性，且CP-X功能衍生物的氨基酸序列與SEQ ID NO 6具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%，最優(yōu)選至少99的序列同一性。功能衍生物也可以包含維持生物活性的功能片段。所以，如本文結(jié)合核苷酸序列或多肽使用的術(shù)語(yǔ)“其功能衍生物”是指，與本文定義的核苷酸序列或可被本發(fā)明核酸序列(例如SEQ ID NO5)編碼的多肽(例如，如SEQ ID NO :6中所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。再次，功能片段包括在術(shù)語(yǔ)“功能衍生物”中。該(生物)功能尤其可以通過(guò)Tzeng等人，Infect Immun 2003,71 (2) :6712-6720中描述的方法以及本文提供的方法評(píng)估。根據(jù)本發(fā)明，核苷酸或氨基酸序列的同一性水平分別指的是SEQ ID NO :5所示核苷酸序列或SEQ ID NO :6所示多肽序列的整個(gè)長(zhǎng)度，并且成對(duì)地評(píng)估，其中每個(gè)空位都被記為一個(gè)不匹配。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”與術(shù)語(yǔ)“同源性”等效。例如，術(shù)語(yǔ)同一性和同源性在本文結(jié)合分別與SEQ ID NO 5或6，優(yōu)選在整個(gè)長(zhǎng)度內(nèi)具有至少80%的同一性或同源性的核酸或多肽/氨基酸序列使用。因此，本發(fā)明涉及多肽(為CP-X或其片段)在本發(fā)明方法中的應(yīng)用，其中該多肽與SEQ ID NO 6中所示的多肽具有至少80%的同一性/同源性。如果例如通過(guò)例如序列比較進(jìn)行比較的兩個(gè)核酸序列同一性不同，則術(shù)語(yǔ)“同一性”或“同源性”指的是較短序列和與所述較短序列匹配的較長(zhǎng)序列的部分。因此，當(dāng)所比較的序列長(zhǎng)度不相同時(shí)，同一性程度優(yōu)選指與較長(zhǎng)序列中核苷酸殘基相同的較短序列中核苷酸殘基的百分比，或者與較短序列中核苷酸序列相同的較長(zhǎng)序列中核苷酸的百分比。在這種情況下，技術(shù)人員能夠容易地確定與較短序列“匹配”的較長(zhǎng)序列的部分。而且，針對(duì)序列比較(例如，“同一性”或“同源性”值的確定)的這些定義將應(yīng)用于本文描述和公開(kāi)的所有序列。再次，術(shù)語(yǔ)“同一性”和“同源性”在上文中有進(jìn)一步描述，該定義和解釋尤其適用于CP-X及其功能片段。應(yīng)用于本文描述的方式和方法中的CP可以是CP-X或其功能衍生物，且至少一種供體碳水化合物可以是UDP-GlcNAc或其功能衍生物。UDP-GlcNAc衍生物的實(shí)例可以是烷基化或羥基化或者包含另外官能團(tuán)如羧酸、疊氮化物、酰胺、乙酰基或鹵素原子的化合物，如還在圖3B中示出的；還可參見(jiàn)“Carbohydrate chemistry”卷1_34，Cambridge [England], Royal Society of Chemistry,同前文獻(xiàn)。在本發(fā)明體外方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，莢膜聚合酶(CP)可以是CP-X或其功能衍生物，且至少一種供體碳水化合物可以是GlcNAc-1-磷酸或其功能衍生物。GlcNAc-1-磷酸衍生物的實(shí)例在圖16中示出。當(dāng)與CP接觸時(shí)，所述供體碳水化合物GlcNAc-1-磷酸可以進(jìn)一步與至少一種核苷酸和/或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)及輔助酶接觸。所述核苷酸可以是UMP、UDP和UTP。所述供體碳水化合物GlcNAc-1-磷酸可以在與CP —起溫育期間進(jìn)行活化。根據(jù)本文陳述的體外方法，這種活化可以產(chǎn)生活化的糖核苷酸UDP-GlcNAc。一般地，在本發(fā)明的背景下，本文描述的糖衍生物也可以是這些糖的標(biāo)記形式。例如，對(duì)于本文描述的糖衍生物，該糖可以是放射性標(biāo)記的，如[14C]或[3H]。此種標(biāo)記尤其對(duì)本文描述的糖的診斷應(yīng)用和使用有用。此種診斷應(yīng)用和使用將在下面進(jìn)一步描述。根據(jù)本發(fā)明方法，CP-X(或其功能衍生物)以及至少一種供體碳水化合物可以進(jìn)一步與受體碳水化合物在本文描述的體外方法的接觸步驟期間進(jìn)行接觸。所述受體碳水化合物可以是腦膜炎奈瑟氏菌血清組X的寡聚或多聚的CPS(X CPS)、腦膜炎奈瑟氏菌血清組A的寡聚或多聚的CPS (CPS A)，和/或含有末端GIcNAC殘基的碳水化合物結(jié)構(gòu)，如透明質(zhì)酸、肝素、硫酸肝素或蛋白質(zhì)連接的低聚糖。例如，可以合成可通過(guò)本發(fā)明體外方法獲得的，包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組A/X或X/A的CPS或CPS亞基或者由它們組成的嵌合CPS。所述包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組的CPS或CPS亞基或者由它們組成的嵌合CPS，如果用作受體，可以包含含有末端GIcNAC殘基的碳水化合物結(jié)構(gòu)，如透明質(zhì)酸、肝素、硫酸肝素或蛋白質(zhì)連接的低聚糖。在可通過(guò)本發(fā)明體外方法獲得的嵌合CPS當(dāng)中，CPS亞基的一種或多種碳水化合物可以衍生化，并且可以包含，例如，另外的官能團(tuán)如氨基、烷基、羥基、羧酸、疊氮化物、酰胺、乙?；螓u素原子；還可以參見(jiàn)“Carbohydrate chemistry"卷1_；34Cambridge (England), Royal Society of Chemistry，同前文獻(xiàn)。嵌合 CPS 可以包含一種或多種各包含CPS亞基的碳水化合物。嵌合CPS的CPS亞基的序列可以是任何順序的。作為本發(fā)明的實(shí)例，生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖(CPS)的體外方法包括以下步驟
(a)使 UDP-GlcNAc 和水解的 A CPS 與 CP-X 接觸；(b)將UDP-GlcNAc和水解的A CPS與CP-X —起溫育；和(c)分離出由腦膜炎奈瑟氏菌血清組A/X的莢膜多糖亞基組成的人工嵌合CPS。如上所述，還可以應(yīng)用如本文描述的活化或未活化供體碳水化合物、受體碳水化合物和莢膜聚合酶(CP)的其它組合。此種其它組合和其它修改并沒(méi)有違背本發(fā)明的主旨。在本文陳述的體外方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，與至少一種供體碳水化合物接觸的莢膜聚合酶(CP)專用于合成腦膜炎奈瑟氏菌血清組A的CPS。具體地，與至少一種供體碳水化合物接觸的CP是CP-A或其功能衍生物。編碼CP-A的核苷酸序列在SEQ ID NO 7中示出。CP-A的氨基酸序列在SEQ ID NO :8中示出。CP-A功能衍生物是能夠合成血清組A的莢膜多糖的酶(Swartley 等人，J Bacteriol (1998)，180 (6) :1533-1539)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明，CP-A功能衍生物的核苷酸序列與SEQ ID NO: 7具有至少80%，更優(yōu)選至少85%，更優(yōu)選至少90 %，最優(yōu)選至少95 %的序列同一性，且CP-A功能衍生物的氨基酸序列與SEQID NO 8具有至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，最優(yōu)選至少99%的序列同一性。功能衍生物也可以包含維持生物活性的功能片段。所以，如本文結(jié)合核苷酸序列或多肽使用的術(shù)語(yǔ)“其功能衍生物”是指，與本文定義的核苷酸序列或可被本發(fā)明核酸序列(例如SEQ ID NO 7)編碼的多肽(例如，如SEQ ID NO 8中所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。該(生物)功能尤其可以通過(guò)Swartley等人，JBacteriol (1998)，180 (6) :1533-1539中描述的方法以及本文提供的方法評(píng)估。如本文結(jié)合核苷酸序列或多肽使用的術(shù)語(yǔ)“其功能衍生物”是指，與本文定義的核苷酸序列或可被本發(fā)明核酸序列(例如SEQ ID NO 7)編碼的多肽(例如，如SEQ ID NO 8中所示的)具有基本相同的(生物)活性的功能片段。生物活性可以通過(guò)本文提供的和本領(lǐng)域中已知的方法評(píng)估；參見(jiàn)，例如，Swartley (1998)，同前文獻(xiàn)。此種功能衍生物也包含功能片段。根據(jù)本發(fā)明，核苷酸或氨基酸序列的同一性水平分別指的是SEQ ID NO :7所示核苷酸序列或SEQ ID NO :8所示多肽序列的整個(gè)長(zhǎng)度，并且成對(duì)地評(píng)估，其中每個(gè)空位都被記為一個(gè)不匹配。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”與術(shù)語(yǔ)“同源性”等效。例如，術(shù)語(yǔ)同一性和同源性在本文結(jié)合分別與SEQ ID NO 7或8，優(yōu)選在整個(gè)長(zhǎng)度內(nèi)具有至少80%的同一性或同源性的核酸或多肽/氨基酸序列使用。因此，本發(fā)明涉及多肽(為CP-A或其片段)在本發(fā)明方法中的應(yīng)用，其中該多肽與SEQ ID NO 8中所示的多肽具有至少80%的同一性/同源性。如果例如通過(guò)例如序列比較進(jìn)行比較的兩個(gè)核酸序列同一性不同，則術(shù)語(yǔ)“同一性”或“同源性”指的是較短序列和與所述較短序列匹配的較長(zhǎng)序列的部分。因此，當(dāng)所比較的序列長(zhǎng)度不相同時(shí)，同一性程度是指與較長(zhǎng)序列中核苷酸殘基相同的較短序列中核苷酸殘基的百分比，或者與較短序列中核苷酸序列相同的較長(zhǎng)序列中核苷酸的百分比。在這種情況下，技術(shù)人員能夠容易地確定與較短序列“匹配”的較長(zhǎng)序列的部分。而且，針對(duì)序列比較(例如，“同一性”或“同源性”值的確定)的這些定義將應(yīng)用于本文描述和公開(kāi)的所有序列。術(shù)語(yǔ)“同一性”和“同源性”在上文中有進(jìn)一步描述，該定義和解釋尤其適用于CP-A及其功能片段。在本發(fā)明體外方法的一個(gè)實(shí)施方式中，所使用的CP是CP-A或其功能衍生物，且至少一種供體碳水化合物可以是UDP-ManNAc或其衍生物。UDP-ManNAc衍生物的實(shí)例可以是烷基化或羥基化或者包含另外官能團(tuán)如羧酸、疊氮化合物、酰胺、乙?；螓u素原子的化合物，如還在圖17B中示出的；還可參見(jiàn)“Carbohydrate chemistry”卷1-34 monosaccharides, disaccharides, and specific oligosaccharides, 1967-2000 年出版的文獻(xiàn)的綜述，Cambridge (England), Royal Society of Chemistry。在本文描述的體外方法的另一個(gè)實(shí)施方式中，莢膜聚合酶(CP)是CP-A或其功能衍生物，且至少一種供體碳水合物是ManNAc-I-磷酸或其衍生物。ManNAc-I-磷酸和唾液酸衍生物的實(shí)例在圖18中示出。當(dāng)與CP接觸時(shí)，所述供體碳水合物ManNAc-I-磷酸可以與至少一種核苷酸和/或磷酸烯醇丙酮酸(PEP)及輔助酶接觸。所述核苷酸可以是UMP、UDP和UTP。所述供體碳水化合物ManNAc-I-磷酸可以在與CP—起溫育期間進(jìn)行活化。根據(jù)本文陳述的體外方法中，這種活化可以產(chǎn)生活化的糖核苷酸UDP-ManNAc，或其衍生物。CP-A或其功能衍生物以及至少一種供體碳水化合物可以進(jìn)一步與受體碳水化合物在本發(fā)明體外方法的接觸步驟期間接觸。根據(jù)本文陳述的本發(fā)明體外方法，受體碳水化合物可以是腦膜炎奈瑟氏菌血清組X的寡聚或多聚的CPS(X CPQ、腦膜炎奈瑟氏菌血清組A的寡聚或多聚的CPS(CPSA)，和/或包含末端GIcNAC或ManNAc殘基的碳水化合物結(jié)構(gòu)，如透明質(zhì)酸、肝素、硫酸肝素或蛋白質(zhì)連接的低聚糖。例如，可以通過(guò)本文陳述的體外方法合成包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組A/X或X/A的CPS或CPS亞基或者由它們組成的嵌合CPS?？赏ㄟ^(guò)陳述的體外方法獲得的，包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組的CPS或CPS亞基或者由它們組成的嵌合CPS，如果用作受體，可以包含含有末端GIcNAC殘基的碳水化合物結(jié)構(gòu)，如透明質(zhì)酸、肝素、硫酸肝素或蛋白質(zhì)連接的低聚糖。在可通過(guò)本發(fā)明體外方法獲得的嵌合CPS當(dāng)中，CPS亞基的一種或多種碳水合物可以衍生化，并且可以包含，例如，另外的官能團(tuán)，如氨基、烷基、羥基、羧酸、疊氮化物、酰胺、乙酰基或鹵素原子；也可參見(jiàn)”Carbohydrate chemistry” Volumes 1-34Cambridge(England), Royal Society of Chemistry，同前文獻(xiàn)。這些嵌合 CPS 可以包含一種或多種各包含CPS亞基的碳水化合物?？赏ㄟ^(guò)本文描述的體外方法獲得的嵌合CPS的CPS亞基的序列可以是任何順序的。作為本發(fā)明的實(shí)例，生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖(CPS)的體外方法包括以下步驟(a)使 UDP-ManNAc 和水解的 X CPS 與 CP-A 接觸；(b)將UDP-ManNAc和水解的X CPS與CP-A —起溫育；禾口(c)分離出由腦膜炎奈瑟氏菌血清組X/A的莢膜多糖亞基組成的人工嵌合CPS。再次，技術(shù)人員容易理解，還可以應(yīng)用如本文描述的活化或未活化供體碳水化合物、受體碳水化合物和莢膜聚合酶(CP)的其它組合。此種其它組合和其它修改并沒(méi)有違背本發(fā)明的主旨。與供體碳水化合物和CP接觸的受體碳水化合物可以根據(jù)本文描述的體外方法進(jìn)行純化。如果所述受體碳水化合物是腦膜炎奈瑟氏菌的寡聚或多聚的CPS，則可以對(duì)它進(jìn)行水解。與至少一種供體碳水化合物接觸的莢膜聚合酶(CP)可以在陳述的體外方法中進(jìn)行純化。所述CP可以是從腦膜炎奈瑟氏菌裂解液中分離的或通過(guò)重組產(chǎn)生的。
本發(fā)明也涉及可通過(guò)本文描述的體外方法獲得的人工嵌合CPS。此種CPS可以是腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135、Y、A或X的合成或人工嵌合CPS，或者包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-i;35、C/W-i;35、B/Y/W-i;35、C/Y/W-i;35、B/W-135/Y、C/W-135/Y、Χ/Α或Α/Χ的CPS或CPS亞基或由它們組成的人工嵌合CPS?？赏ㄟ^(guò)本發(fā)明體外方法獲得的人工嵌合CPS可以用作疫苗。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，它們用于人主體的疫苗接種(vaccination)。還公開(kāi)了可通過(guò)本發(fā)明體外方法獲得的嵌合CPS在制備疫苗中的應(yīng)用。在本發(fā)明具體實(shí)施方式
中，可通過(guò)本文描述的體外方法獲得的嵌合CPS用作對(duì)抗由腦膜炎奈瑟氏菌血清組A、B、C、W-135、X或Y引起的腦膜炎球菌性腦膜炎的疫苗。可通過(guò)該體外方法獲得的嵌合CPS也可以用于診斷由腦膜炎奈瑟氏菌血清組A、B、C、W-135、X或Y引起的腦膜炎球菌性腦膜炎或與其相關(guān)的疾病?？赏ㄟ^(guò)該體外方法獲得的嵌合CPS也可以用于分析操作程序中。例如，此種嵌合CPS可以用作規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)碳水化合物從而使得與樣本碳水化合物的比較能被分析。本發(fā)明進(jìn)一步涉及結(jié)合到可通過(guò)本文描述的體外方法獲得的人工嵌合CPS上的抗體。優(yōu)選地，這些抗體特異性地結(jié)合到人工嵌合CPS上。本文中的術(shù)語(yǔ)“抗體”在廣義上使用且具體包括完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整的抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)，以及抗體片段，只要它們表現(xiàn)出期望的生物活性即可。也包括人和人化(humanized)抗體以及 CDR 移植抗體(CDR-grafted antibodies)。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“單克隆抗體”是指從基本均質(zhì)性(homogeneous)抗體的群體中獲得的抗體，即，包含除了少量存在的可能的天然發(fā)生的突變之外相同的群體的各種抗體。單克隆抗體具有高度的特異性，針對(duì)單一抗原表位(抗原位點(diǎn)，antigenic site)。此外，與包括針對(duì)不同決定簇(決定子，determinant)(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑相比，每種單克隆抗體均針對(duì)抗原上的單一決定簇。除了它們的特異性之外，單克隆抗體還具有可在不被其它抗體污染的情況下合成的優(yōu)點(diǎn)。修飾詞“單克隆”是指該抗體的特征為它是從基本均質(zhì)性的抗體群體獲得的，而不應(yīng)解讀為該抗體需要通過(guò)任何特定方法生產(chǎn)。例如，根據(jù)本發(fā)明方法使用的單克隆抗體可以通過(guò)雜交瘤方法生產(chǎn)，這種方法首次由Kohler，G.等人，Nature 256 (1975) 495描述，或者可以通過(guò)重組DNA方法制備(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利No. 4，816，567)?！翱贵w片段”包含完整抗體的一部分。在本發(fā)明背景下，抗體特異性地識(shí)別可通過(guò)本文描述的體外方法獲得的CPS或人工嵌合CPS。如本文描述的抗體或其片段也可以用于藥物和醫(yī)療環(huán)境，如疫苗接種/免疫，特別是被動(dòng)(passive)疫苗接種/免疫。本發(fā)明抗體也可以用于治療和/或診斷由腦膜炎奈瑟氏菌血清組A、B、C、W-135、X或Y引起的腦膜炎球菌性腦膜炎。本發(fā)明進(jìn)一步涉及焦磷酸化酶，特別是碩大利什曼原蟲(chóng)(Leishmania major)的 UDP-糖磷酸化酶(USP-LM) (Damerow 等人，J Biol Chem (2010)，285 (2) :878-887)。USP-LM的核苷酸序列在SEQ ID NO :9中示出。USP-LM的多肽序列在SEQ ID N0:10中示出。所述USP-LM可以將己糖-1-磷酸(hexose-1-phosphate)和/或戊糖磷酸(pentose-1-phosphate)活化為核苷酸糖。例如，USP-LM將半乳糖磷酸(Gal-1-P)活化為UDP-半乳糖(UDP-Gal)并將葡萄糖磷酸(Glc-I-P)活化為UDP-葡萄糖(UDP-Glc)。該活化可以是可逆的。USP-LM進(jìn)一步可以作用于并活化多種己糖-1-磷酸以及戊糖-1-磷酸，且因此呈現(xiàn)出寬廣的體外特異性。戊糖-ι-磷酸的實(shí)例有木糖-ι-磷酸、阿拉伯糖-1-磷酸、葡萄糖醛酸-1-磷酸，而且對(duì)GlcNAc-lP具有非常弱的活性。本文也描述了編碼焦磷酸化酶或其片段的核酸分子。此種核酸分子可以是DNA分子、RNA分子、硫代磷酸寡核苷酸(oligonucleotide thiophosphates)、取代(substituted)的核糖寡核苷酸或PNA分子。此外，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”可以指DNA或RNA或其雜合體(hybrids)或其在本領(lǐng)域中已知的任何修飾(參見(jiàn)，例如關(guān)于修飾的US 5525711、US 4711955、US 57擬608或EP 302175)。該多核苷酸序列可以是單鏈或多鏈的、線性或環(huán)形的、天然或合成的，且沒(méi)有任何尺寸限制。例如，該多核苷酸序列可以是基因組DNA、cDNA、mRNA、反義RNA、核酶(ribozymal)或編碼此種RNA或嵌合修復(fù)體(chimeroplasts)的DNA(Gamper,Nucleic Acids Research，2000，28，4332-4339)。所述多核苷酸序列可以是質(zhì)粒形式或者病毒DNA或RNA形式。特別地，本發(fā)明涉及具有SEQ ID NO :9所示核苷酸序列的核酸分子。本發(fā)明也包括包含SEQ ID NO :9所示核酸分子的核酸分子，其中添加、刪除或替換一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)核苷酸。此種核酸分子可以編碼具有焦磷酸化酶活性的多肽。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“活性”特別指多肽或其片段將糖-ι-磷酸活化為核苷酸糖的能力。在本發(fā)明具體實(shí)施方式
中，本文描述的核酸分子編碼可將己糖-1-磷酸和/或戊糖-1-磷酸活化為核苷酸糖，特別將半乳糖-1-磷酸(Gal-I-P)活化為UDP-半乳糖(UDP-Gal)和將葡萄糖-1-磷酸(Glc-I-P)活化為UDP-葡萄糖(UDP-Glc)的多肽。該活化可以是可逆的。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地測(cè)定多肽將糖-ι-磷酸活化為核苷酸糖的活性。由相應(yīng)的糖-1-磷酸和UTP合成UDP-Glc、UDP-Gal或其它UDP-糖的反應(yīng)(正反應(yīng))產(chǎn)生副產(chǎn)物焦磷酸鹽，其可以利用例如Enz-Chek Pyrophosphate Kit(Invitrogen)監(jiān)測(cè)。替換地，按照形成的UTP分析從核苷酸糖和焦磷酸鹽合成的糖-1-磷酸(逆反應(yīng))。在這個(gè)試驗(yàn)中，可利用大腸桿菌CTP合成酶(31)從UTP產(chǎn)生游離的無(wú)機(jī)磷酸鹽，其可以再次利用Enz-ChekPyrophosphate Kit(Invitrogen) 5 Enz-Chek Phosphate Kit (Invitrogen)監(jiān)測(cè)。細(xì)節(jié)在實(shí)施例11中示意性地給出。優(yōu)選地，本發(fā)明描述的核酸分子與SEQ ID NO :9具有至少45 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %，且最優(yōu)選至少99 %的同一性。這種核酸分子優(yōu)選編碼可將己糖-ι-磷酸和/或戊糖-ι-磷酸活化為核苷酸糖，特別將半乳糖-1-磷酸(Gal-l-p)活化為UDP-半乳糖(UDP-Gal)和將葡萄糖-1-磷酸(Glc-I-P)活化為UDP-葡萄糖(UDP-Glc)的多肽。該活化可以是可逆的。本發(fā)明進(jìn)一步涉及與上述核酸分子互補(bǔ)的核酸分子。還包括可以與本文描述的核酸分子雜交的核酸分子。本發(fā)明核酸分子也可以是本文描述的核酸分子的片段。特別地，此種片段是功能片段。此種功能片段的實(shí)例是用作引物的核酸分子。如本文結(jié)合核酸分子/DNA序列使用的術(shù)語(yǔ)“雜交(hybridization)”或“雜交(hybridize)”可以涉及在嚴(yán)格條件或非嚴(yán)格條件下的雜交。如果沒(méi)有進(jìn)一步說(shuō)明，該條件優(yōu)選為非嚴(yán)格條件。所述雜交條件可以根據(jù)例如下面文獻(xiàn)中描述的常規(guī)方案確立Sambrook， Russell" Molecular Cloning，A Laboratory Manual" ，Cold Spring HarborLaboratory, N. Y. (2001) ；Ausubel, “ Current Protocols in Molecular Biology “，Green Publishing Associates andWiley Interscience, N. Y. (1989)，或 Higgins andHames(Eds.) “ Nucleic acid hybridization, a practical approach “ IRL PressOxford, Washington DC, (1985)。條件的設(shè)置完全在技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)且可以根據(jù)本領(lǐng)域中描述的方案確定。因而，對(duì)僅特異性雜交的序列的檢測(cè)通常要求嚴(yán)格的雜交和洗滌條件，如 65°C下 0. Ix SSC,0. 1% SDS0 檢測(cè)同源或不完全互補(bǔ)(exactly complementary)的序列的非嚴(yán)格雜交條件可以設(shè)置為65°C下6xSSC，l% SDS0眾所周知，探針的長(zhǎng)度和待確定核酸的組成構(gòu)成雜交條件的進(jìn)一步參數(shù)。上述條件的改變可以通過(guò)添加和/或替換用于抑制雜交實(shí)驗(yàn)中背景的替換封閉劑(blocking reagent)完成。典型的封閉劑包括Denhardt ‘ s試劑(Denhardt ‘ s reagent)、BL0TT0、肝素、變性鮭魚(yú)精子DNA，和市售的專利配方(proprietary formulations)。由于相容性問(wèn)題，特定封閉劑的添加可能要求修改上述雜交條件。根據(jù)本文描述的本發(fā)明，可以將檢測(cè)同源性或不完全互補(bǔ)的序列的低度嚴(yán)格雜交條件設(shè)置為，例如65°C下6x SSC，1%SDS。眾所周知，探針的長(zhǎng)度和待確定核酸的組成構(gòu)成雜交條件的進(jìn)一步參數(shù)。雜交核酸分子也包含上述分子的片段。此種片段可以代表可用作引物、為如上所述的功能焦磷酸化酶或其功能片段編碼的核酸分子。此外，與前述核酸分子中任一種雜交的核酸分子也包括這些分子的互補(bǔ)片段、衍生物和等位基因變體。另外，雜交復(fù)合體是指依靠互補(bǔ)的G和C堿基以及互補(bǔ)的A和T堿基之間形成氫鍵(連接)的兩個(gè)核酸序列的復(fù)合體；這些氫鍵可以由堿基堆積相互作用(base stacking interactions)加以進(jìn)一步穩(wěn)定。這兩個(gè)互補(bǔ)的核酸序列氫鍵處于反平行構(gòu)型中。雜交復(fù)合體可以在溶液中形成(例如，Cot或Rot分析)，或者可以在存在于溶液中的一個(gè)核酸序列和固定在固體載體(例如，細(xì)胞已固定在其上的膜、過(guò)濾器、芯片、銷釘(Pin)或玻片)上的另一個(gè)核酸序列之間形成。術(shù)語(yǔ)互補(bǔ)的或互補(bǔ)是指多肽在許可的鹽和溫度條件下通過(guò)堿基配對(duì)自然結(jié)合(的特性)。例如，序列“A-G-T”結(jié)合到互補(bǔ)序列“T-C-A”上。兩個(gè)單鏈分子之間的互補(bǔ)可以是其中僅一些核酸結(jié)合的“部分”(互補(bǔ))，或者當(dāng)單鏈分子之間存在總體互補(bǔ)時(shí)，它可以是完全(互補(bǔ))。核酸鏈之間的互補(bǔ)度對(duì)核酸鏈之間的雜交效率和強(qiáng)度具有重要的影響。這在擴(kuò)增反應(yīng)中特別重要，擴(kuò)增反應(yīng)取決于核酸鏈之間的結(jié)合。術(shù)語(yǔ)“雜交序列”優(yōu)選指，與如上面所述的編碼焦磷酸化酶的核酸序列具有至少45 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %，且最優(yōu)選至少99 %的序列同一性的序列。而且，術(shù)語(yǔ)“雜交序列”優(yōu)選指，編碼如本文所述的焦磷酸化酶，與SEQ ID NO=IO具有至少45 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %，最優(yōu)選至少99 %的序列同一性的序列。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含編碼焦磷酸化酶的本發(fā)明核酸分子的載體。本發(fā)明也涉及包含編碼本文所述的焦磷酸化酶的核酸構(gòu)建體的載體。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“載體”特別是指質(zhì)粒、粘粒、病毒、噬菌體以及基因工程中常用的其它載體。在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明載體適合于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如真菌細(xì)胞、微生物細(xì)胞如酵母或原核細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，此種載體適合于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞，例如從而表達(dá)本發(fā)明的焦磷酸化酶。因此，在本發(fā)明一個(gè)方面，所提供的載體是表達(dá)載體。一般地，表達(dá)載體在文獻(xiàn)中有詳盡的描述。一般說(shuō)來(lái)，它們可以不但包含選擇標(biāo)記基因和確保所選宿主中的復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)，而且還包含啟動(dòng)子，且在大多數(shù)情況下包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。啟動(dòng)子和終止信號(hào)之間優(yōu)選存在至少一個(gè)限制位點(diǎn)，或使得期望被表達(dá)的核酸序列/分子能被插入的多接頭(polylinker)。應(yīng)理解，當(dāng)通過(guò)利用現(xiàn)有技術(shù)中已知的、已包含適用于本發(fā)明背景的啟動(dòng)子，例如表達(dá)如本文上面描述的焦磷酸化酶的表達(dá)載體制取本文提供的載體時(shí)，以使得到的載體僅包含一種適用于本發(fā)明背景的啟動(dòng)子的方式將核酸構(gòu)建體插入到那個(gè)載體中。技術(shù)人員知道此種插入如何進(jìn)行。例如，在連接之前從該核酸構(gòu)建體或從該表達(dá)載體中切除啟動(dòng)子。本發(fā)明載體的非限制性實(shí)例為包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體的質(zhì)粒載體pET22b。適合于包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體從而形成本發(fā)明載體的載體的進(jìn)一步實(shí)例在本領(lǐng)域中是已知的且為，例如細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)用的其它載體，如PET系列(Novagen)的載體或者pQE載體(Qiagen)0在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體和/或載體的宿主細(xì)胞。優(yōu)選地，本發(fā)明宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞。作為非限制性實(shí)例，本發(fā)明宿主細(xì)胞可以是大腸桿菌。本文提供的宿主細(xì)胞對(duì)產(chǎn)生本發(fā)明焦磷酸化酶特別有用。一般地，本發(fā)明宿主細(xì)胞可以是包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體或載體的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，或者源自此種細(xì)胞并包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體或載體的細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方式中，該宿主細(xì)胞包含本發(fā)明核酸構(gòu)建體或載體，即，以使得它包含整合到基因組中的本發(fā)明核酸構(gòu)建體的方式利用本發(fā)明核酸構(gòu)建體或載體進(jìn)行基因修飾。例如，本發(fā)明的此種宿主細(xì)胞，以及本發(fā)明的一般宿主細(xì)胞可以是細(xì)菌、酵母或真菌細(xì)胞。在一個(gè)特定方面，本發(fā)明宿主細(xì)胞能夠表達(dá)或表達(dá)如本文定義的和如SEQID NO :10中示例性地描述的焦磷酸化酶。用于產(chǎn)生本發(fā)明宿主細(xì)胞，例如這種特別的宿主細(xì)胞的不同相應(yīng)表達(dá)系統(tǒng)的實(shí)例綜述，例如包含在下面文獻(xiàn)中=Methods inEnzymology 153(1987)，385-516 ;Bitter 等人(Methods in Enzymology 153(1987)，516-544) ；Sawers 等人(Applied Microbiology and Biotechnology 46 (1996),1-9)；BilIman-Jacobe (Current Opinion in Biotechnology 7(1996),500-4) ；Hockney(Trendsin Biotechnology 12 (1994)，456-463)；和 Griffiths 等人(Methods in MolecularBiology 75(1997),427-440)。利用根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或載體對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行的轉(zhuǎn)化或基因工程可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行，如下面文獻(xiàn)中描述的Sambrook and Russell (2001), MolecularCloning :A Laboratory Manual, CSH Press, Cold Spring Harbor, NY, USA ；Methods inYeast Genetics,A Laboratory Course Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1990。本文進(jìn)一步描述了包含SEQ ID NO :10所示氨基酸序列的多肽，其中添加、刪除或替換了一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基。該多肽可以具有焦磷酸化酶功能。優(yōu)選地，該多肽可以將己糖-1-磷酸和/或戊糖-1-磷酸活化為核苷酸糖，特別將半乳糖-1-磷酸(Gal-I-P)活化為UDP-半乳糖(UDP-Gal)和將葡萄糖-1-磷酸(Glc-1-P)活化為UDP-葡萄糖(UDP-Glc)。該活化可以是可逆的。該多肽的氨基酸序列可以與SEQ ID N0:10具有至少45 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %，且最優(yōu)選至少99 %的同一性。優(yōu)選地，該多肽可以將己糖-ι-磷酸和/或戊糖-ι-磷酸活化為核苷酸糖，特別將半乳糖-1-磷酸(Gal-I-P)活化為UDP-半乳糖(UDP-Gal)和將葡萄糖磷酸(Glc-I-P)活化為UDP-葡萄糖(UDP-Glc)。該活化可以是可逆的。還包括本文描述的多肽的功能片段。這些多肽的功能片段表現(xiàn)出焦磷酸化酶功能。優(yōu)選地，這些功能片段可以將己糖-ι-磷酸和/或戊糖-1-磷酸活化為核苷酸糖，特別將半乳糖-1-磷酸(Gal-I-P)活化為UDP-半乳糖(UDP-Gal)和將葡萄糖-1-磷酸(Glc-I-P)活化為UDP-葡萄糖(UDP-Glc)。該活化可以是可逆的。本文描述的核酸分子或其片段以及載體、宿主細(xì)胞和多肽或其片段可以進(jìn)一步用于活化己糖-I-P和/或戊糖-1-P。根據(jù)本發(fā)明，此種應(yīng)用可以是體外應(yīng)用。己糖-I-P的實(shí)例為GlC-I-P或Gal-l-p。戊糖-I-P的實(shí)例為木糖_1_P或阿拉伯糖_1_P。核苷酸或氨基酸序列的同一性水平是指SEQ ID NO :9所示核苷酸序列或SEQ IDNO :10所示多肽序列的整個(gè)長(zhǎng)度，并且成對(duì)地評(píng)估，其中每個(gè)空位都被記為一個(gè)不匹配。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”與術(shù)語(yǔ)“同源性”等效。例如，這個(gè)術(shù)語(yǔ)結(jié)合與另一個(gè)，優(yōu)選整個(gè)核酸序列具有至少45 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %，且最優(yōu)選至少99%的同源性，即序列同一性的核酸序列使用。關(guān)于氨基酸/多肽序列或其片段，這個(gè)術(shù)語(yǔ)在本文結(jié)合與另一個(gè)，優(yōu)選整個(gè)氨基酸/多肽序列具有至少45 %，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少55 %，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97 %，更優(yōu)選至少98 %，且最優(yōu)選至少99%的同源性，即，序列同一性的氨基酸/多肽序列或其片段使用。因此，本發(fā)明涉及與SEQ ID NO: 10所示的多肽具有至少45%，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少陽(yáng)%，更優(yōu)選至少60 %，更優(yōu)選至少65 %，更優(yōu)選至少70 %，更優(yōu)選至少75 %，更優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少85 %，更優(yōu)選至少90 %，更優(yōu)選至少95 %，更優(yōu)選至少96 %，更優(yōu)選至少97%，更優(yōu)選至少98%，且最優(yōu)選至少99%的同一性/同源性的焦磷酸化酶或其片段。同樣，在涉及本文公開(kāi)的焦磷酸化酶(或其功能片段)的這個(gè)實(shí)施方式的背景下，如果例如通過(guò)例如序列比較進(jìn)行比較的兩個(gè)核酸序列同一性不同，則術(shù)語(yǔ)“同一性”或“同源性”指的是較短序列和與所述較短序列匹配的較長(zhǎng)序列的部分。因此，當(dāng)所比較的序列長(zhǎng)度不相同時(shí)，同一性程度是指與較長(zhǎng)序列中核苷酸殘基相同的較短序列中核苷酸殘基的百分比，或者與較短序列中核苷酸序列相同的較長(zhǎng)序列中核苷酸的百分比。在這種情況下，技術(shù)人員能夠容易地確定與較短序列“匹配”的較長(zhǎng)序列的部分。而且，針對(duì)序列比較(例如，“同一性”或“同源性”值的確定)的這些定義將應(yīng)用于本文描述和公開(kāi)的所有序列。同樣，在本文陳述的新焦磷酸化酶背景下，同一性意味著相應(yīng)核苷酸序列或多肽(例如，由此編碼的多肽)之間存在功能和/或結(jié)構(gòu)等效性。與本文描述的特定核酸/氨基酸序列具有給定水平的同一性的核酸/氨基酸序列可以代表這些序列的衍生物/變體，所述衍生物/變體優(yōu)選具有相同的生物功能。它們可以是天然存在的變異形式，例如來(lái)自其它種類、物種等的序列，或者突變形式，且所述突變形式可以天然形成或者可以通過(guò)預(yù)訂誘變產(chǎn)生。此外，該變異形式可以是合成產(chǎn)生的序列。本文公開(kāi)的焦磷酸化酶的等位基因變體可以是天然存在的變體或合成產(chǎn)生的變體或通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生的變體。與上述核酸序列的偏離可以通過(guò)，例如刪除、替換、添加、插入和/或重組產(chǎn)生。術(shù)語(yǔ)“添加”是指在給定序列末端添加至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸，而“插入”是指在給定序列內(nèi)插入至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸。術(shù)語(yǔ)“刪除”是指在給定序列內(nèi)刪除或除去至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸殘基。術(shù)語(yǔ)“替換”是指替換給定序列內(nèi)至少一個(gè)核酸殘基/氨基酸殘基。本文公開(kāi)的焦磷酸化酶的變體多肽，特別是本發(fā)明核酸序列的不同變體編碼的多肽優(yōu)選表現(xiàn)出它們共同具有的特性。這些包括，例如，生物活性、分子量、免疫反應(yīng)性、構(gòu)象等，以及物理性質(zhì)，如凝膠電泳遷移行為、色譜行為、沉降系數(shù)、溶解度、光譜特性、穩(wěn)定性、最適pH、最適溫度等。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“合成的”描述了體外合成的CPS結(jié)構(gòu)，且其中該CPS的結(jié)構(gòu)與在腦膜炎奈瑟氏菌的天然CPS中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)相同。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“人工的”描述了體外合成的且與在腦膜炎奈瑟氏菌的天然CPS中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)不同的CPS結(jié)構(gòu)。例如，人工CPS是這樣的嵌合CPS，其包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組A、B、C、W-135、X和/或Y的兩個(gè)或更多個(gè)CPS亞基或者含有腦膜炎奈瑟氏菌血清組A、B、C、W-135、X和/或Y的不同CPS的一個(gè)或多個(gè)衍生化結(jié)構(gòu)單元的CPS，或者由它們組成。此種衍生化結(jié)構(gòu)單元的實(shí)例在圖1 5中示出。嵌合CPS可以包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-135、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/ff-135/Y、C/W-135/Y、X/A或Α/Χ的CPS或CPS亞基，或者由它們組成。在嵌合CPS內(nèi)，CPS亞基的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元可以衍生化，如圖1 5中示例性示出的。嵌合CPS可以包含一種或多種各包含CPS亞基的碳水化合物。嵌合CPS的CPS亞基的序列可以是任何順序的。嵌合CPS實(shí)例在圖6中示出。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“碳水化合物”包含結(jié)構(gòu)單元如任何形式的糖(saccharides)和糖(sugars)以及添加有數(shù)個(gè)羥基的醛和酮。碳水化合物可以包含經(jīng)由共價(jià)鍵如糖苷連鍵連接的一個(gè)或多個(gè)所述結(jié)構(gòu)單元。碳水化合物可以具有任何長(zhǎng)度，即，它可以是單體、二聚體、三聚體或多聚體。碳水化合物也可以包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元作為經(jīng)由共價(jià)鍵連接到主鏈上的側(cè)鏈。碳水化合物還可以包含一個(gè)或多個(gè)活化糖，如核苷酸糖。核苷酸糖的實(shí)例為 UDP-Glc、UDP-Gal, UDP-GlcNAc, UDP-GlcUA、UDP-Xyl、GDP-Man、GDP-Fuc, CMP_Neu5Ac和 CMP-NeuNAc。如本文使用的術(shù)語(yǔ)“CPS亞基”描述了對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌血清組各種CPS有特異性的一種或多種碳水化合物。在CPS亞基內(nèi)，一種或多種碳水化合物可以衍生化。如果一個(gè)特定CPS亞基中存在兩種或更多種碳水化合物，則它們通過(guò)對(duì)各種腦膜炎奈瑟氏菌血清組的CPS有特異性的連鍵連接。從上面明顯可以看出，本發(fā)明提供了生產(chǎn)合成莢膜多糖，特別是人工嵌合莢膜多糖的方式和方法。因此，本發(fā)明還涉及通過(guò)或可通過(guò)本文提供的方法獲得的嵌合莢膜多糖，特別是腦膜炎奈瑟氏菌的嵌合莢膜多糖。此種嵌合莢膜多糖尤其是，包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-i;35、C/W-i;35、B/Y/W-i;35、C/Y/W-i;35、B/W-135/Y、C/W-135/Y、X/A或A/X的莢膜多糖或莢膜多糖亞基的嵌合莢膜多糖。如本文提供的此種莢膜多糖不僅作為科學(xué)工具有用處，而且在醫(yī)學(xué)環(huán)境中非常有價(jià)值，例如作為藥物組合物。此種藥物組合物可以包含疫苗。因此，本發(fā)明也涉及包含本文描述的嵌合莢膜多糖的藥物組合物。所述莢膜多糖可以是分離的，但也設(shè)想了這些嵌合莢膜多糖結(jié)合其它結(jié)構(gòu)例如多肽等使用。此種多肽，尤其可以用作本文描述的本發(fā)明嵌合莢膜多糖的載體或骨架。已開(kāi)發(fā)將低聚糖共價(jià)連接到蛋白質(zhì)上的許多方法(文獻(xiàn)(Lit) :(a)Vince Pozsgay,Oligosaccharide-protein conjugates as vaccine candidates againstbacteria, Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry, Academic Press,2000，卷 56，153-199 頁(yè)，(b) Jennings, H. J.，R. K. Sood (1994) Synthetic glycoconjugatesas human vaccines ；Lee, Y.C. R. T. Lee(eds) Neoglycoconjugates. Preparation andApplications. San Diego, Academic Press, pp 325-371, (c)Pozsgay, V. ；Kubler-Kielb,J. , Conjugation Methods toward Synthetic Vaccines, Carbohydrate-Based Vaccines,American Chemical Society, July 2,2008,36-70) ； (D) Carl E. Frasch, Preparationof bacterial polysaccharide-protein conjugates Analytical and manufacturingchallenges, Vaccine, In Press, Corrected Proof，網(wǎng)上公布于 2009 年 6 月 24 日，ISSN0264-410X, DOI :10. 1016/j. vaccine. 2009. 06. 013.)。一個(gè)實(shí)例是本文描述的合成或人工CPS分子與蛋白質(zhì)氨基通過(guò)還原胺化共價(jià)偶聯(lián)。因此，本發(fā)明也包括包含如本文描述的嵌合莢膜多糖的復(fù)合物(化合物，compound) 0此種復(fù)合物具有特定的科學(xué)應(yīng)用和醫(yī)學(xué)應(yīng)用。其中的一個(gè)此種應(yīng)用是作為疫苗的應(yīng)用，即，本文提供的復(fù)合物可以用于主體的疫苗接種。此種主體可以是哺乳動(dòng)物，且在特定實(shí)施方式中，可以是人。本文提供的疫苗對(duì)于奈瑟氏菌的疫苗接種特別有用。根據(jù)上面，本發(fā)明也提供了包含本文公開(kāi)的嵌合莢膜多糖的復(fù)合物在制備待給予主體，優(yōu)選給予哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選給予人的疫苗中的應(yīng)用。此種醫(yī)學(xué)應(yīng)用特別涉及關(guān)于疾病的醫(yī)學(xué)應(yīng)用或干預(yù)，如腦膜炎疫苗接種，特別是對(duì)抗由腦膜炎奈瑟氏菌血清組A、B、C、W-135、X或Y引起的腦膜炎球菌性腦膜炎的疫苗接種。然而，如上面提到的和如后附實(shí)例中說(shuō)明的，本發(fā)明也涉及新焦磷酸化酶(Damerow等人，Biol Chem(2010), 285 (2) :878-887)。因此，本發(fā)明也提供了本文定義的焦磷酸化酶在科學(xué)研究、工業(yè)環(huán)境以及醫(yī)學(xué)環(huán)境中的應(yīng)用。因此，本發(fā)明也涉及為本文定義的焦磷酸化酶(或其功能片段)編碼的核酸分子、包含此種核酸分子的載體、包含此種核酸分子或此種載體的宿主細(xì)胞，或本文定義的焦磷酸化酶(或其功能片段)自身在將己糖-ι-磷酸和/或戊糖-ι-磷酸活化為核苷酸糖中的應(yīng)用。所述己糖-ι-磷酸尤其可以選自Glc-IP和(ial-1-P構(gòu)成的組，且所述戊糖-1-磷酸尤其可以選自木糖-I-P和阿拉伯糖-I-P構(gòu)成的組。本文公開(kāi)的焦磷酸化酶的此種應(yīng)用可以是體外應(yīng)用。特別設(shè)想在如本文公開(kāi)的，例如用于生產(chǎn)合成多糖，如嵌合莢膜多糖的(生物)化學(xué)過(guò)程和方法中應(yīng)用如本文描述的焦磷酸化酶。本文描述的焦磷酸化酶也可以用于生產(chǎn)活化的核苷酸糖如UDP-Gal、UDP-Glc、UDP-Xyl、UDP-GalA 或 UDP-Ara。本文提供的組合物可以包含如本文描述的合成和/或嵌合多糖(CPQ。此種組合物，尤其對(duì)醫(yī)學(xué)和診斷目的有用，特別對(duì)藥物和疫苗接種目的有用，即，對(duì)于奈瑟氏菌誘導(dǎo)的疾病治療或診斷檢測(cè)或?qū)惯@些病原體的疫苗接種有用。因此，本發(fā)明也涉及如本文定義的組合物，該組合物是進(jìn)一步包含可選的藥物可接受載體的藥物組合物。本發(fā)明藥物組合物可以包含本發(fā)明CPS。該藥物組合物可以進(jìn)一步包含特異性針對(duì)本發(fā)明這些CPS的抗體，例如針對(duì)本文公開(kāi)的這些合成CPS或者針對(duì)這些CPS產(chǎn)生的本發(fā)明抗體(或其片段或衍生物)。此種CPS以及針對(duì)此種CPS的抗體可以單獨(dú)或結(jié)合用于尤其是疫苗接種方案。因此，包含本發(fā)明CPS或針對(duì)本發(fā)明CPS的抗體的本發(fā)明藥物組合物可以用于制藥目的，如受感染人和動(dòng)物的有效治療和/或用于疫苗接種目的。因此，本發(fā)明涉及包含如本文描述的CPS和/或針對(duì)如本文描述的CPS的抗體或抗體片段，和可選的藥物可接受載體的藥物組合物。在本發(fā)明背景下，本文描述的藥物組合物尤其可以用于治療、預(yù)防和/或診斷奈瑟氏菌誘導(dǎo)的疾病和/或感染。優(yōu)選地，該藥物組合物用作疫苗，如本文在下面將進(jìn)一步描述的。本發(fā)明藥物組合物可以進(jìn)一步包含藥物可接受載體、賦形劑和/或稀釋劑。合適的藥物載體的實(shí)例在本領(lǐng)域中是眾所周知的，且包括磷酸鹽緩沖鹽溶液、水、乳液，如油/水乳液、各種類型的潤(rùn)濕劑、無(wú)菌溶液等。包含此種載體的組合物可以通過(guò)眾所周知的常規(guī)方法調(diào)配。這些藥物組合物可以以合適的劑量給予主體。合適的組合物的給予可以通過(guò)不同方式實(shí)施，如通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、外用、真皮內(nèi)、鼻內(nèi)或支氣管內(nèi)給予。給藥方案將由主治醫(yī)師和臨床因素決定。如醫(yī)學(xué)領(lǐng)域眾所周知的，針對(duì)任何一名患者的劑量取決于許多因素，包括患者體型(Size)、體表面積、年齡、待給予的特定化合物(復(fù)合物)、性別、給予時(shí)間和途徑、一般健康狀況，和并行給予的其它藥物。本發(fā)明藥物組合物，特別在用于疫苗接種目的時(shí)，可按每劑(劑量，dose)約0. Olyg Ig CPS，或每劑約0. 5 μ g 500 μ g，或每劑約1 μ g 300 μ g CPS使用。然而，設(shè)想了低于或高于這個(gè)示例范圍的劑量，尤其在考慮到前述因素時(shí)。合適的組合物的給予可以通過(guò)不同方式實(shí)施，如通過(guò)靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、外用或真皮內(nèi)給予。然而，特別在本發(fā)明的藥物干預(yù)中，奈瑟氏菌感染可能要求給予在感染側(cè)，如腦。可以通過(guò)定期評(píng)估監(jiān)測(cè)進(jìn)展。本發(fā)明組合物可以局部或全身給予。給予一般是腸胃外，例如靜脈內(nèi)給予。本發(fā)明組合物也可以直接給予到靶位，例如通過(guò)基因槍(biolistic)遞送到內(nèi)部或外部靶位或者通過(guò)導(dǎo)管遞送至動(dòng)脈內(nèi)的部位。用于腸胃外給予的制劑包括無(wú)菌水溶液或無(wú)菌非水溶液、懸浮液和乳液。非水溶劑的實(shí)例為，丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和注射用有機(jī)酯如油酸乙酯。水性載體包括水、醇溶液/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒劑(vehicle)包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏液，或固定油。靜脈內(nèi)媒劑包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格氏右旋糖的那些)等。還可以存在防腐劑和其它添加劑，如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等。此外，本發(fā)明藥物組合物可以包含此外的物質(zhì)如白細(xì)胞介素和/或干擾素，這取決于該藥物組合物的預(yù)期用途。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，如本文定義的藥物組合物是疫苗。疫苗尤其可以由如本文描述的一種或多種CPS，或由一種或多種抗體、所述抗體的片段或本發(fā)明抗體，即，針對(duì)如本文公開(kāi)的CPS的抗體的衍生物制備。因此，在本發(fā)明背景下，疫苗可以包含如本文描述的一種或多種CPS和/或一種或多種抗體、所述抗體的片段或本發(fā)明抗體，即，針對(duì)如本文公開(kāi)的CPS的抗體的衍生物。用在作為疫苗的藥物組合物中的本發(fā)明CPS或抗體、所述抗體的片段或衍生物可以調(diào)配為，例如中性或鹽形式。藥物可接受鹽，如酸加成鹽，和其它鹽在本領(lǐng)域中是已知的。疫苗尤其可用于治療和/或預(yù)防病原體如奈瑟氏菌的感染，并以與調(diào)配方法相容的劑量，和以此種對(duì)預(yù)防或治療性處理藥理學(xué)有效的量給予。疫苗接種方案可以包含主動(dòng)或被動(dòng)免疫，其中主動(dòng)免疫需要向宿主/患者給予一種抗原或多種抗原(如本發(fā)明嵌合多糖或抗體、所述抗體的片段或針對(duì)這些CPS的抗體的衍生物)，試圖引出保護(hù)性免疫反應(yīng)。被動(dòng)免疫需要將預(yù)先形成的免疫球蛋白或其衍生物或片段(例如，本發(fā)明抗體，其衍生物或片段，即，針對(duì)本發(fā)明嵌合CPS和如通過(guò)本文提供的方式和方法獲得的特異性抗體)轉(zhuǎn)移到宿主/患者中。疫苗接種的原理和實(shí)踐以及疫苗是技術(shù)人員已知的，參見(jiàn)，例如，Paul，“ Fundamental Immunology“ RavenPress, New York(1989)or Morein, " Concepts in Vaccine Development " , ed S. H. E. Kaufmann, Walter de Gruyter, Berlin, New York(1996), 243-264 ；Dimitriu S,editor. "Polysaccharides in medicinal application" ；New York :Marcel Dekker,PP 575-602。典型地，疫苗被制備成注射型液體溶液或懸浮液，也可以制備適合于在注射之前溶解或懸浮在液體中的固體劑型。該制劑可以乳化或者該蛋白質(zhì)可以包裹在脂質(zhì)體中。通常將活性免疫原性成分與可與該活性成分相容的藥物學(xué)可接受賦形劑混合。合適的賦形劑包括，但不局限于水、鹽水、右旋糖、甘油、乙醇等；也可以使用各種量的這些賦形劑的組合。該疫苗也可以包含少量輔助物質(zhì)如潤(rùn)濕劑或乳化劑、PH緩沖劑，和/或增強(qiáng)該疫苗有效性的佐劑。例如，此種佐劑可以包括鋁組合物(aluminum compositions)，如氫氧化鋁、磷酸鋁或磷酸氫氧化鋁(aluminumphosphohydroxide)(如"Gen H-B-Vax或〃 DPT-Impfstoff Behring"中使用的)、N-乙酰基-胞壁?；?muramyl)-L-蘇氨酰(threonyl) -D-異谷酰胺(thr-DMP)、N-乙?；?去甲胞壁酰基(nornuramyl) -L-丙氨?；?D-異谷酰胺(CGP 11687，也稱為nor-MDP)、N_乙酰胞壁?；?L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰基-L-丙氨酸-2-(1 ‘ 2' - 二棕櫚?；?sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A,也稱為 MTP-PE)、2%鯊烯 / 吐溫-80 ⑧乳液中的 MF59 和 RIBI (MPL+TDM+CWS)。該疫苗通常通過(guò)靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射給予。適合于其它給予模式的另外制劑包括栓劑，且在一些情況下包括口服制劑。對(duì)于栓劑，傳統(tǒng)粘合劑和載體可以包括但不局限于，聚亞烷基二醇(polyalkylene glycol)或甘油三酯?？诜苿┌ù朔N通常采用的賦形劑，如醫(yī)藥級(jí)的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉(sodium saccharine)、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物可以采用溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋制劑或粉末形式，且包含約10 % 約95 %的活性成分，優(yōu)選約25 % 約70 %。疫苗以與劑量配方(dosage formulation)相容的方式，以預(yù)防和/或治療有效的量給予。待給予的量一般在每劑約0. 01 μ g Ig抗原，或每劑約0. 5 μ g 500 μ g抗原，或每劑約Iyg 300μg抗原(在當(dāng)前情況下，CPS是抗原)的范圍內(nèi)，且取決于待給藥的主體、主體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力，和期待的保護(hù)程度。需要給予的活性成分的精確量也取決于醫(yī)生的判斷，而且對(duì)于每個(gè)主體可能是獨(dú)特的。該疫苗可以單劑量或多劑量給藥方式給予。多劑量是這樣的，即，可以在疫苗接種的初始時(shí)程使用1 10種單獨(dú)的劑量，接著在維持和/或加強(qiáng)免疫反應(yīng)所需的后續(xù)時(shí)間間隔給予其它劑量，例如，在1 4個(gè)月給予第2劑量，且如果個(gè)體需要，在幾個(gè)月后給予一種(或多種)后續(xù)劑量。該給藥方案也至少部分地由個(gè)體需要確定，且取決于醫(yī)生的判斷?？紤]到，包含本發(fā)明免疫原性復(fù)合物(化合物)的疫苗可以聯(lián)合其它免疫調(diào)節(jié)劑，例如，聯(lián)合免疫球蛋白，聯(lián)合細(xì)胞因子或聯(lián)合可優(yōu)化抗原處理的分子，如李斯特菌溶胞素(listeriolysin)給予。對(duì)于臨床和/或科學(xué)標(biāo)本中如奈瑟氏菌的病原體、病原片段、其衍生物、其(多)肽(蛋白質(zhì))、其多核苷酸等的診斷和量化，已開(kāi)發(fā)出多種免疫學(xué)方法以及分子生物方法，如核酸雜交測(cè)定、PCR測(cè)定或DNA酶免疫測(cè)定(DEIA ；Mantero等人，Clinical Chemistry37(1991)，422-4四)，它們?cè)诒绢I(lǐng)域中是眾所周知的。在這種情況下，應(yīng)注意本發(fā)明核酸分子還可以包含PNA、含有酰胺骨架連鍵的修飾DNA類似物。此種PNA尤其作為DNA/RNA雜交的探針有用處。本發(fā)明蛋白質(zhì)尤其對(duì)受感染個(gè)體生物測(cè)試樣品中的抗病原(如，例如抗細(xì)菌或抗病毒)抗體的檢測(cè)有用。還考慮了，抗體和包含本發(fā)明此種抗體的組合物對(duì)區(qū)分急性與非急性感染有用。如本文提供的CPS也可以用于診斷環(huán)境中，例如作為例如色譜方法中的“標(biāo)準(zhǔn)”。因此，本發(fā)明CPS可以用于比較分析，且可以單獨(dú)或結(jié)合用于本領(lǐng)域已知的診斷方法。該診斷組合物可選地包含合適的檢測(cè)方式(裝置，means)。如本文公開(kāi)和描述的CPS以及針對(duì)或特異性對(duì)抗這些嵌合多糖而產(chǎn)生的特異性抗體或其片段或衍生物，例如適用于免疫分析，其中它們可以液相利用或結(jié)合到固相載體上。固相載體在本領(lǐng)域中是已知的，且可以包含聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠、膠體金屬顆粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝基纖維素條(nitrocellulose strips)、膜、片、動(dòng)物紅細(xì)胞，或紅細(xì)胞影泡(血影，ghosts)、硬膜細(xì)胞(duracytes)和反應(yīng)盤(pán)的壁和孔、塑料管或其它測(cè)試管。將核酸、(多)肽、蛋白質(zhì)、抗體、微生物等固定在固相上的合適的方法包括但不局限于，離子、疏水、共價(jià)相互作用等?？衫盟龅鞍踪|(zhì)、抗原片段、融合蛋白、本發(fā)明抗體或所述抗體的片段或衍生物的免疫分析實(shí)例為直接或間接方式的競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性免疫分析。常用的檢測(cè)分析可以包含，放射性同位素或非放射性同位素方法。此種免疫分析的實(shí)例為放射免疫分析(RIA)、三明治型(免疫測(cè)定分析(immunometric assay))和^festern印跡分析。此外，這些檢測(cè)方法包括，尤其IRMA (免疫放射免疫測(cè)定分析)、EIA (酶免疫分析)、ELISA (酶聯(lián)免疫分析)、FIA (熒光免疫分析)，和CLIA (化學(xué)發(fā)光免疫分析)。本領(lǐng)域中使用的其它檢測(cè)方法是沒(méi)有利用示蹤分子的那些。這些方法的一種原型是基于給定分子橋接至少兩種顆粒的特性的凝集反應(yīng)(agglutination)分析。本發(fā)明CPS可以結(jié)合到許多不同載體上。眾所周知的載體實(shí)例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈淀粉(amyloses)、天然和改性的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖，和磁鐵礦。對(duì)于本發(fā)明目的，該載體的性質(zhì)可以是可溶性或不可溶性的?？捎糜跇?biāo)記生物分子的多種技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，且包含，尤其，酶或生物素基(biotinyl group)的共價(jià)偶聯(lián)、碘化、磷酸化、生物素化、隨機(jī)引物法、缺口平移法(nick-translations)、碳水化合物的加尾(利用末端轉(zhuǎn)移酶)或標(biāo)記。此種技術(shù)，例如描述在下列文獻(xiàn)中TijSSen，“ Practiceand theory of enzyme immuno assays“，Burden，RH and von Knippenburg (Eds)，卷15(1985)，“ Basic methods in molecular biology“ ；Davis LG, Dibmer MD ；BatteyElsevier (1990)，Mayer 等人，(Eds)" Immunochemical methods in cell and molecularbiology “ Academic Press，London (1987)，或"Methods in Enzymology “系列，AcademicPress, Inc.,或 Fotini N. Lamari, Reinhard Kuhn, Nikos K.Karamanos, "Derivatizationof carbohydrates for chromatographic, electrophoretic and mass spectrometricstructure analysis", Journal of Chromatography B,^ 793,1 Derivatization ofLarge Biomolecules, (2003),第 15-36 頁(yè)。檢測(cè)方法包括，但不局限于，自體放射照相術(shù)(autoradiography)、熒光顯微鏡術(shù)、直接和間接的酶促反應(yīng)，等等。本文描述的嵌合CPS可以通過(guò)本領(lǐng)域中已知的以及本文描述和列舉的方法檢測(cè)。例如，本文描述的基于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附分析)的方法可以用于檢測(cè)和量化本文描述的嵌合CPS。在這種情況下，本文描述的嵌合CPS可以通過(guò)與該嵌合CPS的一部分或結(jié)構(gòu)單元接觸的抗體或其它結(jié)合分子，如卵磷脂(Iectine)或類似物固定化。本文描述的嵌合CPS的第二部分或結(jié)構(gòu)單元的檢測(cè)可以通過(guò)，例如與標(biāo)記用于進(jìn)一步檢測(cè)的如本文描述的抗體或其它結(jié)合分子接觸，或者與標(biāo)記用于進(jìn)一步檢測(cè)的如本文描述的第二抗體(二抗)或其它結(jié)合分子接觸實(shí)現(xiàn)。本文在上面和下面描述和列舉了適合于這個(gè)目的的標(biāo)記分子。用于檢測(cè)本文描述的和可通過(guò)本文提供的方法獲得的嵌合CPS的實(shí)例在圖19中示出或描述下面的實(shí)例，特別是實(shí)施例14和15中。本發(fā)明涉及生產(chǎn)對(duì)抗奈瑟氏菌屬的疫苗的方法，包含以下步驟(a)合成或體外生產(chǎn)如上面定義的一種多糖(或多種多糖)；和(b)將所述一種多糖(或多種多糖)與藥物可接受載體結(jié)合。在用于生產(chǎn)疫苗的這個(gè)方法的優(yōu)選實(shí)施方式中，所述“一種多糖(或多種多糖)，，是如本文公開(kāi)的嵌合CPS。此外，本發(fā)明涉及生產(chǎn)抗奈瑟氏菌屬的一種菌株或多種菌株，特別是腦膜炎奈瑟氏菌的疫苗的方法，該方法通過(guò)(a)將本發(fā)明一種多糖(或多種多糖)(優(yōu)選一種嵌合多糖(或多種嵌合多糖)與生物可接受載體結(jié)合(而完成)。


圖1 :UDP-Gal、CMP-Neu5Ac及其可能的衍生物的示意圖。A) UDP-半乳糖；B)UDP-半乳糖衍生化的潛在靶位用R1、R2> R3和R4表示。Rh的實(shí)例為=R = H, R = OH, R =N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3,R = 0 (CO) CH3, R = O(CO) (CH2)xCH3 ；C) CMP-唾液酸；D) CMP-唾液酸衍生化的潛在靶位用禮、R2>R3>R4 和 R5 表示。R1-S 的實(shí)例為:R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H，R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) XCH3。圖2 =UDP-Glc及其可能的衍生物的示意圖。A)UDP-葡萄糖；B)UDP-葡萄糖衍生化的潛在靶位用R!>R2>R3和R4表示。Rh的實(shí)例為:R = H，R = 0H，R = N3, R = F，R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R =O(CO) (CH2) xCH3。圖 3 :UDP-GlcNAc 及其可能的衍生物的示意圖。A)UDP_GlcNAc ；B)UDP-GlcNAc 衍生化的潛在靶位用R1^ R2> R3和R4表示。Rh的實(shí)例為=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R =(CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3,R = O(CO) (CH2) xCH3。
圖4:Gal-l-P、唾液酸及其可能的衍生物的示意圖。A)半乳糖磷酸；B) Gal-I-P衍生化的潛在靶位用R” R2> R3和R4表示。R1^的實(shí)例為=R = H, R = OH, R = N3, R = F，R = (CH2) XN3，R = C00H, R = (CH2) xC00H, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2) XCH3, R = O(CO)CH3, R = O(CO) (CH2)xCH3 ；C) N-乙?；窠?jīng)氨酸；D)N_乙?；窠?jīng)氨酸衍生化的潛在靶位用 R1、R2> R3 和 R4 表示。Rh 的實(shí)例為=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3' R =C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。圖5 受體衍生物的示意圖。Α)在帶有附接到異頭碳(anomeric carbon) C2上的官能團(tuán)的寡聚/多聚的血清組W-135或Y莢膜多糖還原端的末端糖(terminal sugar)。R1 = OH, R1 = [ — 2) - α-Neu5Ac_ (8 — ]χ, R1 = [—2) - α-Neu5Ac_ (9 — ]χ，R1 = [ — 1) - α -D-Glc-(6 — 2) - α -Neu5Ac (4 — ]χ，R1 = [—1) - α -D-Gal-(6 — 2) - α -Neu5Ac (4 — ] χ ；B)在帶有附接到異頭碳C2上的官能團(tuán)的寡聚/多聚的血清組B莢膜多糖還原端的末端糖。& = 0H，R2 = [ — 2)-a-Neu5Ac-(8 —) J ；C)在帶有附接到異頭碳C2上的官能團(tuán)的寡聚/多聚的血清組C莢膜多糖還原端的末端糖。R3 = OH, R3= [ — 2) - a-Neu5Ac-(9 — ) J。R = FITC-乳糖，R = FCHASE-乳糖，R = N3, R = F, R = (CH2) xN3 (對(duì)于圖 A、B 和 C)。圖6 野生型和嵌合腦膜炎奈瑟氏菌莢膜多糖的示意圖。NmW-135 :NmW-135[ —6)-a -D-Galp-(1 — 4) - α -Neu5Ac_ (2 — ]η 莢膜多糖，NmY =NmY [ — 6) - α -D-Glcp-(1 —4)-α -Neu5Ac-(2 — ]η 莢膜多糖，NmB/C :NmB[ — 8)- α -Neu5Ac-(2 — ]n 莢膜多糖或 NmC[ — 9) - α -Neu5Ac-(2 — ] 莢膜多糖，NmX :NmX[ — 4) - α -D-GlcpNAc-(1 — OPO3 — ]η 莢膜多糖，NmA :NmA[ — 4) - α-D-ManpNAc-(1 — OPO3 — ]η莢膜多糖。嵌合CPS可以包含指示的CPS結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)單元。該結(jié)構(gòu)單元可以具有可變的長(zhǎng)度。圖 7 =CP-Wl35 莢膜聚合酶 NmW-135。MK 肌球蛋白激酶(Sigma-Aldrich)，PK 丙酮酸激酶(Sigma-Aldrich)。CSS 來(lái)自NmB的CMP_Neu5Ac合成酶。IPP 無(wú)機(jī)焦磷酸酶 (Molecular Probes)。USP 來(lái)自碩大利什曼原蟲(chóng)的UDP-糖-焦磷酸化酶(Damerow等人， J Biol Chem (2010), 285 (2) :878-887)。PEP 磷酸烯醇丙酮酸。Gal-IP 半乳糖-1-磷酸。圖8 在一鍋(one-pot)/六酶反應(yīng)中從簡(jiǎn)單原料(半乳糖-IP、磷酸烯醇丙酮酸和唾液酸)體外合成W-135CPS。雙循環(huán)反應(yīng)的產(chǎn)物形成通過(guò)以下進(jìn)行分析A)使用抗-W-135CPS特異性抗體mAb MNW1-3的點(diǎn)印跡分析。B和C)多糖PAGE分析。B)在指示的時(shí)間步長(zhǎng)(time step) (0h、;3h、24h和47h)之后取出反應(yīng)樣品，將其與2M蔗糖以1 1混合之后施加到凝膠中。為了增加單一條帶Is的分辨率，還施加了稀釋液(1 10)。C)稀釋系列的5 50 μ g W-135CPS標(biāo)準(zhǔn)物使得人們可以評(píng)價(jià)該循環(huán)反應(yīng)(反應(yīng)1 10 [h])形成的，純化(純化反應(yīng))之后的多糖產(chǎn)物。對(duì)2、3和8泳道進(jìn)行比較，可以粗略評(píng)價(jià)加入的多糖和由此形成的產(chǎn)物量，所形成的產(chǎn)物量接近ang/200 μ L反應(yīng)體積。這相當(dāng)于理論最大產(chǎn)率的80 90%。所有樣品都通過(guò)25% PAGE分離，且在隨后的阿爾辛藍(lán)(Alcian blue)/ 銀染色中檢測(cè)到糖結(jié)構(gòu)。圖9 重組CP-W135和CP-Y的純化。A)在大腸桿菌中進(jìn)行C-端6xHis標(biāo)記的酶的表達(dá)，并通過(guò)兩步操作程序中的IMAC和尺寸排阻色譜純化。整個(gè)純化過(guò)程獲得的蛋白質(zhì)組分通過(guò)如所示的考馬斯染色的SDS-PAGE(10% )分析；B-C)CP-W-135和CP-Y的低聚狀態(tài)。純化的CP-W-135和CP-Y的四級(jí)結(jié)構(gòu)通過(guò)尺寸排阻色譜分析。標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的洗脫體積由箭頭指示(B)，主要峰組分(peak fraction)隨后通過(guò)針對(duì)6xHis-表位標(biāo)簽的flfestern 印跡分析進(jìn)行分析(C)。圖10 重組CP-X的純化。使C-端6xHis標(biāo)記的酶在N端融合到MBP上，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并通過(guò)MBP親和色譜和尺寸排阻色譜純化。細(xì)菌裂解液、流過(guò)液(flow through)、洗滌液、親和層析匯集物(pool)、凝膠過(guò)濾匯集物和80°C儲(chǔ)存的蛋白質(zhì)組分(級(jí)分、流分，fractions)通過(guò)考馬斯染色的SDS-Page (A)和通過(guò)針對(duì)6x His-標(biāo)簽(B)和 MBP-標(biāo)簽(C)，以抗-His mAb ( ^ -5His (anti-PentaHis), Qiagen)和抗 MBP mAb HRP 結(jié)合的(NEB)為探針的Western印跡分析進(jìn)行分析。(D)使C-端6xHis標(biāo)記的酶在N端融合到 MBP上，在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并通過(guò)MBP親和色譜純化。細(xì)菌裂解液和親和純化的蛋白質(zhì)組分通過(guò)考馬斯染色的SDS-PAGE (左側(cè))和以抗-His mAb (抗_5His，Qiagen)為探針的 Western印跡分析(右側(cè))進(jìn)行分析。圖11 長(zhǎng)血清組W-135和Y聚合物鏈的體外合成。A)CP-W-135和CP-Y合成產(chǎn)物的多糖PAGE分析。為了獲得低聚糖受體底物，使純化的血清組W-135CPS (泳道2)水解 (CPS7M ,泳道；3)，隨后用作體外聚合的引物材料。反應(yīng)混合物包含純化的酶催化劑、各種供體糖CMP-Neu5Ac/UDP-Gal (泳道4)和CMP-NeuSAc/UDP-Glc (泳道5)以及受體結(jié)構(gòu)CPS水解 (CPSaydro)。所有樣品都通過(guò)25 % PAGE分離，并在隨后的阿爾辛藍(lán)/銀染色中檢測(cè)到糖結(jié)構(gòu)； B)A(泳道 4-5)中合成的多糖利用抗-CPS-W-135(mAb MNW1-3)和抗-CPS-Y (mAb MNY4-1) 特異性抗體進(jìn)行免疫染色。在Imin和30min反應(yīng)時(shí)間之后將該反應(yīng)混合物的5 μ 1等分試樣點(diǎn)到Hybond膜上。利用等量的受體結(jié)構(gòu)CPS7wff (無(wú)酶)作為陰性對(duì)照。圖 12 血清組 X CPS 的體外合成。A) ^t UDP-[6- ] -GlcNAc (2mCi/mmol, Perkin Elmer)的存在下利用純化的CP-X作為催化劑以放射化學(xué)分析法分析聚合物合成。不添加受體(oA)，或添加完整的NmX-裂解液。在O、10和30min反應(yīng)時(shí)間之后分析5 μ 1等分試樣。通過(guò)下行紙(descending paper)色譜分離樣品，并通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量。B)另外，通過(guò) PAGE(25%)分析反射性標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物。將含有和不含有CP-X酶的樣品在反射性標(biāo)記的供體糖UDP-W-3H]-GlcNAc (2mCi/mmol,Perkin Elmer)和完整NmX-裂解液的存在下溫育。圖13 以定義的低聚糖受體為原料合成血清組W-135和Y CPS。利用純化的 CP-ff-135(A)和CP-Y (B)酶催化劑延伸人工受體。在CMP-[14C]Neu5Ac的存在下以反射化學(xué)分析法分析聚合物合成。反應(yīng)混合物另外包含需要的UDP-己糖供體底物(對(duì)于CP-W-135 為UDP-Gal，對(duì)于CP-Y為UDP-Glc)和如指示的人工受體底物。通過(guò)下行紙色譜分離樣品， 并通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)分析。ok 沒(méi)有添加受體，DPI 唾液酸單體，DP2 α 2，8_連接的唾液酸二聚體，DP3 α 2,8-連接的唾液酸三聚體，cps Nmff 純化的NmW_i;35CPS，cps NmY 純化的 Nmff-135CPS0圖14 嵌合W135/Y-聚合物的體外合成。A)在W-135或Y CPS存在下，以如圖13 描述的放射化學(xué)分析法分析純化的CP-W-135和CP-Y的產(chǎn)物形成，與在沒(méi)有任何CPS受體存在的情況下的反應(yīng)相比較；B)在平行分析中，分析CPS特異性抗體對(duì)合成的多糖的識(shí)別從而證實(shí)雙表位CPS分子的合成。用純化的血清組W-135CPS長(zhǎng)鏈(CPS(W-135))或水解 (CPS(ff-135)水解)組分作為體外CPS合成的引物材料。將該反應(yīng)液的5μ1等分試樣點(diǎn)到 Hybond 膜上，隨后通過(guò)使用抗-CPS-W-135(mAbMNWl-3，(25))和抗-CPS-Y (mAb MNY4-1,(25))特異性抗體進(jìn)行的免疫染色以及隨后的顯色反應(yīng)檢測(cè)結(jié)合的CPS。圖15 =Glc-I-P及其可能的衍生物的示意圖。A)葡萄糖磷酸；B) Glc-I-PS 生化的潛在靶位用R1^ R2> R3和R4表示。Rh的實(shí)例為=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2) xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。圖16 :GlcNAc-l-P及其可能的衍生物的示意圖。A)N_乙酰葡糖胺磷酸；B) GlcNAc-I-P衍生化的潛在靶位用R1、R2> R3和R4表示。R1^的實(shí)例為=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。圖17 =UDP-ManNAc及其可能的衍生物的示意圖。A)UDP_N_乙酰甘露糖胺；B) UDP-ManNAc衍生化的潛在靶位用R1^ R2> R3和R4表示。R1^的實(shí)例為=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。圖18 =ManNAc-I-P及其可能的衍生物的示意圖。A)N_乙酰甘露糖胺磷酸；B) ManNAc-I-P衍生化的潛在靶位用R1、R2> R3和R4表示。R1^的實(shí)例為=R = H, R = OH, R = N3, R = F, R = (CH2)xN3, R = C00H, R = (CH2)xCOOH, R = NH(CO) CH3, R = NH(CO) (CH2)xCH3, R = O(CO) CH3, R = O(CO) (CH2) xCH3。圖19 用于證實(shí)嵌合莢膜多糖B/W-135CPS和B/Y CPS的形成的基于ELISA的分析。A)對(duì)照樣品:DP50(由α-2，8連接的多聚Sia (polySia)組成的50個(gè)單元(unit) 的鏈長(zhǎng))W-135CPS(從細(xì)菌收獲的NmW-135莢膜多糖)W-135CPS hyd (從細(xì)菌收獲的水解的 NmW-135莢膜多糖(W-135CPS))樣品在存在(+)和不存在(-)聚合酶NmW-135 (CP-W-135) 和DP50的情況下進(jìn)行反應(yīng)從而證明嵌合CPS的形成。樣品分一式兩份進(jìn)行。B)對(duì)照樣品 DP50(由α -2，8連接的多聚Sia組成的50個(gè)單元的鏈長(zhǎng))Y CPS (從細(xì)菌收獲的NmY莢膜多糖)樣品在存在(+)和不存在(_)聚合酶NmY (CP-Y)和DP50的情況下進(jìn)行反應(yīng)從而證明嵌合CPS的形成。樣品分一式兩份完成。圖20 重組UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶和CP-A的純化。莢膜聚合酶(CP-A)以及NmA UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶(NmA差向異構(gòu)酶)的純化。對(duì)這兩種酶進(jìn)行表達(dá)，并純化帶有N-末端Strep和C-末端六組氨酸標(biāo)簽的融合構(gòu)建體。通過(guò)IMAC純化該酶，并通過(guò)考馬斯染色的SDS-PAGE(COO)和通過(guò)以抗-His mAb (抗-PentaHis，Qiagen)為探針的^festern印跡(WB)分析來(lái)分析蛋白質(zhì)組分。圖21 血清組A CPS的體外合成。A)在UDP-[14C]-GlcNAc的存在下利用純化的CP-A和純化的UDP-GlcNAc差向異構(gòu)酶作為酶催化劑以放射化學(xué)分析法分析聚合物合成。不添加受體(w/o)或添加從細(xì)菌細(xì)胞收獲的A CPS。在0、10和30min反應(yīng)時(shí)間之后分析5 μ 1等分試樣。通過(guò)下行紙色譜分離樣品，并通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)測(cè)量。B)將溫育Omin和60min之后的反應(yīng)樣品施加到PAGE中，并通過(guò)阿辛藍(lán)銀染色顯色。進(jìn)行包含或不包含NmA莢膜多糖(A CPS)的反應(yīng)，表明聚合酶可以在無(wú)受體的情況下運(yùn)作(重新)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1 質(zhì)粒分別利用寡核苷酸KS272(GC GGA TCC GCT GTT ATT ATA TTT GTT AACG)和 KS273 (CCG CTC GAG_TTT TTC TTG GCC AAA AAA CTG)，通過(guò) PCR 從質(zhì)粒 pHC4 和 pHC5 (Claus 等人，Molecular divergence of the sia locus in different serogroups of Neisseria meningitidis expressing polysialic acid capsules, Mol Gen Genet(1997),257(1) 28-34)中擴(kuò)增出CP-W-135酶(莢膜聚合酶W-135)和CP-Y酶(莢膜聚合酶Y)。將 PCR產(chǎn)物連接在源自pET-22b (Novagen)的表達(dá)載體pET22b_Str印(Schwarzer 等人，Characterization of a novel intramolecular chaperone domain conserved in endosialidases and other bacteriophage tail spike and fiber proteins, J Biol Chem(2007) ,282(5) :2821-2831)的 BamHI 和 XhoI 位點(diǎn)之間。所得構(gòu)建體 (pET22b-Strep-Nmffl35和pETMbltr印-NmY)帶有N-端Str印-標(biāo)簽II (其后為凝血酶切割位點(diǎn))，和C-端His-6-標(biāo)簽。通過(guò)測(cè)序證實(shí)所有構(gòu)建體的序列同一性。利用寡核苷酸 KS422 (GC ATCT CAT ATG GCT GTT ATT ATA TTT GTT AAC G)和 KS273 (CCG CTC GAG TTT TTC TTG GCC AAA AAA CTG)，從 pHC4 和 pHC5 (Claus 等人，Molecular divergence of the sia locus in different serogroups of Neisseria meningitidis expressing polysialic acid capsules, Mol Gen Genet (1997)，257 (1) :28-34)中擴(kuò)增出缺少 N-端 Strep-II-標(biāo)簽的表達(dá)構(gòu)建體。將PCR產(chǎn)物連接在表達(dá)載體pET22b (Novagen)的NdeI和 XhoI 位點(diǎn)之間。利用引物對(duì) KS423(GC GGA TCC ATT ATG AGC AAAATT AGC AAA TTG)和 KS424 (CCG CTC GAG TTG TCC ACT AGG CTG TGA TG)，通過(guò) PCR 從基因組血清組 X 奈瑟氏菌 DNA中擴(kuò)增出CP-X酶(莢膜聚合酶X)。將PCR產(chǎn)物連接到表達(dá)載體pMBPItr印-NmB-多聚(poly)ST(Freiberger 等人，Biochemical characterization of a Neisseria meningitidis polysialyltransferase reveals novel functional motifs in bacterial sialyltransferases, Mol Microbiol (2007), 65 (5) :1258-1275)的 BamHI 和 XhoI 位點(diǎn)之間，形成質(zhì)粒pMBP-XcbA-His。另夕卜，利用引物對(duì)AB20(GCA GAT CTT TTA TAC TTA ATA ACA GAA AAT GGC)和 AB21(CCG CTC GAG TTT CTCAAATGATGATGG TAA TG)，通過(guò) PCR 從基因組血清組 A 奈瑟氏菌 DNA中擴(kuò)增出CP-A (莢膜聚合酶A)。將PCR產(chǎn)物連接在源自pET_22b (Novagen)的表達(dá)載體 pET22b-Str印(Schwarzer 等人，J Biol Chem(2007), 282 (5) :2821-2831)的 BamHI 和 XhoI位點(diǎn)之間。所得構(gòu)建體(pET22b-Str印-NmA)帶有N-端Mi^p-標(biāo)簽II (其后為凝血酶切割位點(diǎn))，和C-端His-6-標(biāo)簽。通過(guò)測(cè)序證實(shí)序列同一性。利用引物對(duì)AB22(GCG GAT CCA AAG TCT TAA CCG TCT TTG GC)和 AB23(CCG CTC GAG TCT ATT CTT TAA TAAAGT TTC TAC A)，通過(guò)PCR從基因組血清組A奈瑟氏菌DNA中擴(kuò)增出UDP-GlcNAc-UDP-ManNAc 差向異構(gòu)酶(NmA-差向異構(gòu)酶)。將PCR產(chǎn)物連接在源自pET-22b (Novagen)的表達(dá)載體 pET22b-Str印(Schwarzer 等人，J Biol Chem(2007), 282 (5) :2821-2831)的 BamHI 和 XhoI 位點(diǎn)之間。所得構(gòu)建體(pET22b-Str印-NmA差向異構(gòu)酶)帶有位于N-端Mi^p-標(biāo)簽II (其后為凝血酶切割位點(diǎn))，和C-端His-6-標(biāo)簽。通過(guò)測(cè)序證實(shí)序列同一性。實(shí)施例2 :CP-ff-135和CP-Y酶的表達(dá)和純化
在15°C和225rpm下在含有100 μ g/ml羧芐青霉素的自誘導(dǎo)ZYM-5052培養(yǎng)基 (Studier,Protein production by auto-induction in high density shaking cultures, Protein Expr Purif (2005)，41 (1) :207-234)中培育新轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 BL21 (DE3)(用 pET22b-Strep-Nmffl35 或 pET22b_Str印-NmY 轉(zhuǎn)化的)。78h(6000x g, 15min，4°C )后收獲細(xì)胞，用PBS洗滌一次，存放在-20°C下。將來(lái)自250ml培養(yǎng)液的細(xì)菌顆粒重懸在添加有蛋白酶抑制劑(40mg/ml抑氨肽酶(Bestatin)、1 μ g/ml胃酶抑素(P印statin)和ImM PMSF) 的結(jié)合緩沖液(50mM Tris/HCl pH 8. 0,300mM NaCl)中，從而使最終體積為15ml。通過(guò)超聲處理破碎細(xì)胞，并對(duì)樣品進(jìn)行離心(16000x g ;30min，4°C )。過(guò)濾(Sartorius Minisart 0. 8 μ m)裂解液，并使重組蛋白質(zhì)結(jié)合到Iml His1Trap親和柱(GE Healthcare)上。在用 10個(gè)柱體積洗滌緩沖液(50mM Tris/HCl,pH 8. 0,300mM NaCl，50mM咪唑)洗滌之后，洗脫 (50mM Tris/HCl pH 8. 0，300mMNaCl，150mM咪唑)結(jié)合的蛋白質(zhì)。匯集含有重組蛋白質(zhì)的組分(流分)，過(guò)濾(Millipore Ultrafree MC 0. 2 μ m)并將其施加到 Superdex 20010/300GL 柱(GE Healthcare)上以便進(jìn)一步通過(guò)尺寸排阻色譜純化。以0. 5ml/min的流速，用50mM Tris/HCl,pH 8. 0,300mM NaCl,2mM DTT洗脫蛋白質(zhì)。利用 Amicon超離心設(shè)備(Millipore ； 50KDa MWC0)將獲得的蛋白質(zhì)樣品濃縮至ang/ml，速凍于液氮中并存放在_80°C下。結(jié)果在圖9中示出。從腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135克隆的，帶有N-端Str印II和C-端6xHis-標(biāo)簽的莢膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO :13中示出，相應(yīng)的多肽序列在SEQ ID N0 14 中示出。從腦膜炎奈瑟氏菌血清組Y克隆的，帶有N-端Str印II和C-端6xHis-標(biāo)簽的莢膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO :15中示出，相應(yīng)的多肽序列在SEQ ID N0:16中示出。 從腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135克隆的，帶有C-端6xHis-標(biāo)簽的莢膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO 17中示出，相應(yīng)的多肽序列在SEQ ID NO 18中示出。實(shí)施例3A =CP-X酶的表達(dá)和純化在15°C和225rpm下在含有100 μ g/ml羧芐青霉素的自誘導(dǎo)ZYM-5052培養(yǎng)基 (Studier,Protein production by auto-induction in high density shaking cultures, Protein Expr Purif (2005), 41 (1) :207-234)中培育新轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 BL2I (DE3) (pMBP-XcbA-His)。78h (6000x g，15min，4°C)后收獲細(xì)胞，用 PBS 洗滌一次，存放在 _20°C 下。將來(lái)自50ml培養(yǎng)液的細(xì)菌顆粒重懸在添加有蛋白酶抑制劑(40mg/ml抑氨肽酶、 1 μ g/ml 胃酶抑素和 ImM PMSF)的 5ml 結(jié)合緩沖液 QOmM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl, ImM DTT)中。通過(guò)超聲處理破碎細(xì)胞，并對(duì)樣品進(jìn)行離心(16000x g ;30min，4°C )。過(guò)濾 (Sartorius Minisart 0. 8 μ m)裂解液，并在室溫下使重組蛋白質(zhì)結(jié)合到Iml直鏈淀粉樹(shù)月旨(New England Biolabs)上 lh。在用 10 個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液(20mM Tris/HCl pH 7. 5， 200mM NaCl, ImM DTT)洗滌之后，洗脫 QOmM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl, ImM DTT，IOmM 麥芽糖)結(jié)合的蛋白質(zhì)。匯集含有重組蛋白質(zhì)的組分，利用Amicon超離心設(shè)備(Millipore ； 50KDa MWC0)濃縮至ang/ml，速凍于液氮中并存放在_80°C下。結(jié)果在圖10D中示出。從腦膜炎奈瑟氏菌血清組X克隆的，帶有N-端MBP和C-端6xHis-標(biāo)簽的莢膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO 19中示出，相應(yīng)的多肽序列在SEQ ID NO 20中示出。實(shí)施例;3B 通過(guò)親和色譜和尺寸排阻色譜對(duì)CP-X酶的擴(kuò)展純化(extended purification)對(duì)CP-X酶進(jìn)行表達(dá)，按實(shí)施例3中描述的方式存放。將來(lái)自50ml培養(yǎng)液的細(xì)菌顆粒重懸在添加有蛋白酶抑制劑(40mg/ml抑氨肽酶、lyg/ml胃酶抑素和ImM PMSF)的 5ml結(jié)合緩沖液QOmM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl, ImM DTT)中。通過(guò)超聲處理破碎細(xì)胞，并對(duì)樣品進(jìn)行離心(16000x g ;30min，4°C )。過(guò)濾(Sartorius Minisart 0. 8 μ m)裂解液，并在室溫下使重組蛋白質(zhì)結(jié)合到Iml直鏈淀粉樹(shù)脂(New England Biolabs)上lh。在用10個(gè)柱體積結(jié)合緩沖液QOmM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl,lmM DTT)洗滌之后，洗脫 (20mM Tris/HCl pH 7. 5,200mM NaCl, ImM DTT，IOmM麥芽糖)結(jié)合的蛋白質(zhì)。隨后匯集含有重組蛋白質(zhì)的組分，并將其施加到Superdex 200 10/300GL柱上以便進(jìn)一步通過(guò)尺寸排阻色譜純化。以lml/min的流速，用20mM Tris,pH 7，5完成洗脫。匯集含有重組蛋白質(zhì)的組分，利用Amicon超離心設(shè)備(Millipore ;50KDa麗CO)濃縮至ang/ml，速凍于液氮中并存放在-80°C下。在整個(gè)純化過(guò)程中取出樣品，結(jié)果在圖10A-10C中示出。從腦膜炎奈瑟氏菌血清組X克隆的，帶有N-端MBP和C-端6xHis-標(biāo)簽的莢膜聚合酶的核苷酸序列在SEQ ID NO 19中示出，相應(yīng)的多肽序列在SEQ ID NO 20中示出。實(shí)施例4 血清組W-135和血清組Y CPS的體外酶促合成在總體積為37. 5 μ 1的情況下，在反應(yīng)緩沖液(20mM Tris/HCl pH 8.0, IOmM MgCl2, ImM DTT)中，在 ImM CMP_Neu5Ac (GERBU)、2mM UDP-Gal (CP-ff-135)或 UDP-Glc(CP-Y)，以及作為低聚糖受體結(jié)構(gòu)的水解W-135 CPS(0. 16 μ g/μ 1)存在下分析純化的酶催化劑(5-15yg)。在室溫下溫育樣品，按適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔加入IM蔗糖終止反應(yīng)。通過(guò)PAGE(25% )分離合成的產(chǎn)品，利用聯(lián)合阿爾辛藍(lán)/銀染色操作程序進(jìn)行染色以便證明長(zhǎng)CPS鏈的體外合成，如(Bergfeld等人，The polysialic acid-specific 0-acetyltransferase OatC from Neisseria meningitidis serogroup C evolved apart from other bacterial sialate 0-acetyltransferases, J Biol Chem(2009),284(1) 6-16)中描述的。簡(jiǎn)言之，用1體積加樣緩沖液(1M蔗糖)稀釋樣品，之后將其加到25%聚丙烯酰胺凝膠(89mM Tris、89mM硼酸、2mM EDTA、25%聚丙烯酰胺)上。另外，施加規(guī)定分子大小的標(biāo)準(zhǔn)染料混合物(0，05%錐蟲(chóng)藍(lán)(trypan blue)、0，02%二甲苯藍(lán)(Xylene cyanol)、 溴酚藍(lán)、溴甲酚紫、酚紅)，對(duì)該樣品進(jìn)行電泳G°C，23V/cm)直至酚紅帶到達(dá)凝膠終點(diǎn)。隨后固定凝膠Ih (40% K0H，5%乙酸)，并用0，5%阿爾新藍(lán)染色30min。用水除去背景染色， 之后開(kāi)始5min的氧化步驟(0，7%高碘酸、40%乙醇、5%乙酸)。氧化之后，凝膠用水洗滌 3次，在銀染色(0，6%硝酸銀、201111 NaOH,0. 4% NH4OH)中溫育lOmin，然后再次用水洗滌三次。最后將凝膠溫育在顯色劑(0，05%甲醛、240 μ M檸檬酸)中，直至多糖帶清晰可見(jiàn)為止。 通過(guò)在5%乙酸溶液中溫育中止顯色反應(yīng)。在平行分析中，分析CPS特異性抗體對(duì)合成的多糖的識(shí)別。在添加蔗糖之前，將反應(yīng)液的5μ1等分試樣點(diǎn)到Hybond XL-膜上。干燥膜，并用干奶粉(dry-milk)封閉0%， PBS 配制)。通過(guò)利用抗-CPS-W-I35 (mAbMNWl-3, (Longworth 等人，0-Acetylation status of the capsular polysaccharides of serogroup Y and W135 meningococci isolated in the UK，F(xiàn)EMS Immunol Med Microbiol (2002), 32 (2) :119-123)禾Π 抗-CPS_Y(mAb MNY4-1, (Longworth ^ Α 0-Acetylation status of the capsular polysaccharides of serogroup Y and W135meningococci isolated in the UK, FEMS Immunol Med Microbiol (2002), 32 (2) :119-123)特異性抗體進(jìn)行的免疫染色，以及隨后的顯色反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)合的CPS。為了通過(guò)紅外熒光檢測(cè)量化，用Odyssey封閉緩沖液(LI-COR)封閉膜，并用山羊抗小鼠IR680 (LI-COR)作為第二抗體(50ng/ml，封閉緩沖液中)。然后根據(jù)Odyssey 紅外成像系統(tǒng)(LI-COR)的指導(dǎo)，對(duì)結(jié)合的CPS進(jìn)行量化。結(jié)果在圖11中示出。實(shí)施例5 血清組X CPS體外酶促合成在含有4mM 氚標(biāo)記的 UDP-R-3H]-GlcNAc QmCi/mmol，Perkin Elmer)，和 2μ 1 完整NmX細(xì)菌裂解液或無(wú)進(jìn)一步受體的，總體積為Μμ 1的反應(yīng)緩沖液QOmM Tris/HCl pH 8. 0，20mM MgCl2, 2mM DTT)中，分析純化的CP-X酶(5 μ g)。在37°C下溫育樣品，按適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔混合反應(yīng)溶液的5μ 1等分試樣與5μ 1冷凍乙醇(96% )來(lái)終止反應(yīng)。將樣品點(diǎn)到Whatman 3MM CHR紙上，并在用96%乙醇/IM乙酸銨，pH 7，5 (7 3，ν/ν)進(jìn)行下行紙色譜之后通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)量化色譜固定氚標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果在圖12Α中示出。另外，發(fā)現(xiàn)CP-X啟動(dòng)聚合物的從頭合成。而且，在將10μ 1反應(yīng)液與10μ 1 2Μ蔗糖混合之后，還對(duì)樣品應(yīng)用PAGE (25%)分析，并在400V下電泳汕。為了顯現(xiàn)[14C]-標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物，電泳之后立即真空干燥凝膠，并將其暴露到顯像膠片(成像膜，imaging film) (BioMax, Kodak)中。結(jié)果在圖12B中示出。實(shí)施例6 以定義的低聚糖受體為原料體外酶促合成血清組W-135和血清組Y多糖為了研究CP-W-135和CP-Y的最小受體底物要求，測(cè)試了一小組定義的低聚糖 α 2，8_連接的唾液酸單體(DPI)、二聚體(DP》和三聚體(DP!3)得自Nacalai Tesque, W-135CPS和Y CPS由U. Vogel, Wurzburg贈(zèng)送。這兩種酶CP-W_i;35和CP-Y都可以高效地啟動(dòng)以CPS受體和定義的DP3受體底物為原料的聚合物合成。而且，還發(fā)現(xiàn)CP-W-135啟動(dòng)聚合物的從頭合成。按所描述(Vogel 等人’ Complement factor C3 deposition and serum resistance in isogenic capsule and lipooligosaccharide sialic acid mutants of serogroup B Neisseria meningitidis, Infect Immun 1997,65(10) :4022-4029) ^Mf 酶分析。在 ImM 放射性碳標(biāo)記的 CMP-[14C]Neu5Ac(0. 13mCi/mmol, GE Healthcare)，和 2mM UDP-Gal (對(duì)于CP-W-135而言)或UDP-Glc (對(duì)于CP-Y而言)(這兩種碳水化合物都得自 Sigma)的存在下，在反應(yīng)緩沖液(20mM Tris/HCl pH 8. O, IOmM MgCl2，ImM DTT)中分析純化的重組蛋白質(zhì)(5-15yg)。另外，在25μ1總體積中加入2mM(低聚)糖受體或0，^ig/ ml W-135CPS或Y CPS。在室溫下溫育樣品，并按適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔混合反應(yīng)溶液的5 μ 1等分試樣與5μ 1冷凍乙醇(96% )來(lái)測(cè)定酶活性。將樣品點(diǎn)到Whatman 3匪CHR紙上，并在用96%乙醇/IM乙酸銨，pH 7,5(7 3, ν/ν)進(jìn)行下行紙色譜之后通過(guò)閃爍計(jì)數(shù)量化色譜固定(相中)mC標(biāo)記的反應(yīng)產(chǎn)物。結(jié)果在圖13中示出。實(shí)施例7 嵌合奈瑟氏菌莢膜多糖的體外酶促合成為了合成嵌合多糖，在總體積為37.5μ 1的反應(yīng)緩沖液QOmM Tris/HCl pH 8. O, IOmM MgCl2, ImM DTT)中，在 ImM CMP_Neu5Ac (GERBU)、2mM UDP-Gal (CP-ff-135) 或UDP-Glc(CP-Y)，以及CPS受體分子(Oj-lyg/yl)的存在下溫育純化的酶催化劑 (5-15 μ g)。利用下面的酶/受體對(duì)合成表1中指示的嵌合體。表 權(quán)利要求
1.生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriamentingitidis)的莢膜多糖(CPS)的體外方法，所述方法包括以下步驟(a)使至少一種供體碳水化合物與至少一種莢膜聚合酶(CP)接觸；(b)將所述碳水化合物與所述莢膜聚合酶溫育；和(c)分離得到的莢膜多糖，其中，所得莢膜多糖是腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135、Y、A或X特異性莢膜多糖的合成或人工莢膜多糖，或者其中，所得莢膜多糖是人工嵌合莢膜多糖，所述人工嵌合莢膜多糖包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組 Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-i;35、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/W-135/Y、C/W-135/Y、Χ/Α或Α/Χ的莢膜多糖或莢膜多糖亞基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述嵌合莢膜多糖包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135和Y的莢膜多糖或莢膜多糖亞基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，在步驟(a)中使所述至少一種供體碳水化合物和所述至少一種莢膜聚合酶進(jìn)一步與受體碳水化合物接觸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，活化所述至少一種供體碳水化合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述至少一種供體碳水化合物通過(guò)活化核苷酸的鍵連而活化。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述活化核苷酸選自CMP、UDP、TDP和AMP組成的組。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述莢膜聚合酶是CP-W-135。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，至少一種供體碳水化合物是CMP-NeU5Ac，且至少一種供體碳水化合物是UDP-Gal。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述莢膜聚合酶是CP-Y。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，至少一種供體碳水化合物是CMP-NeU5Ac，且至少一種供體碳水化合物是UDP-Glc。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述莢膜聚合酶是CP-X。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，至少一種供體碳水化合物是UDP-GlcNAc。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述莢膜聚合酶是CP-A。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，至少一種供體碳水化合物是UDP-ManNAc。
15.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，至少一種供體碳水化合物選自Gal-I-P和唾液酸組成的組。
16.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中，至少一種供體碳水化合物選自Glc-I-P和唾液酸組成的組。
17.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，所述唾液酸是Neu5Ac。
18.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中，至少一種供體碳水化合物是GlcNAc-1-P。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，至少一種供體碳水化合物是ManNAc-1-P。
20.根據(jù)權(quán)利要求15至19中任一項(xiàng)所述的方法，其中，至少一種供體碳水化合物在權(quán)利要求1的步驟(a)期間與活化酶接觸并在權(quán)利要求1的步驟(b)期間進(jìn)行活化。
21.編碼焦磷酸化酶或其片段的核酸分子，所述核酸分子包含選自以下組成的組中的核酸分子(a)具有SEQID NO 9的核苷酸序列的核酸分子；(b)編碼包含SEQID NO 10的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(c)具有SEQID NO :9的核苷酸序列的核酸分子，其中，添加、刪除或替換一個(gè)或多個(gè)核苷酸；(d)編碼包含SEQID NO :10的氨基酸序列的多肽的核酸分子，其中，添加、刪除或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基；(e)與SEQID NO 9的核苷酸序列具有至少45%的同一性的核酸分子；(f)編碼包含與SEQID NO 10的氨基酸序列具有至少45%同一性的氨基酸序列的多肽的核酸分子；(g)與(a) (f)中任一項(xiàng)的核酸分子互補(bǔ)的核酸分子；(h)在嚴(yán)格條件下與(a) (g)的核酸分子中任一種雜交的核酸分子；(i)由于遺傳密碼簡(jiǎn)并性而與(a) (h)中任一項(xiàng)的核酸分子序列不同的核酸分子；以及(j) (a) (i)核酸分子的功能片段。
22.包含權(quán)利要求21所述的核酸分子的載體。
23.包含權(quán)利要求22所述的載體的宿主細(xì)胞。
24.由權(quán)利要求21所述的核酸分子或其功能片段編碼的多肽。
25.根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，Gal-I-P或Glc-I-P在權(quán)利要求1的步驟(a)期間與根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸分子或其功能片段或根據(jù)權(quán)利要求M所述的多肽或其功能片段接觸，并在權(quán)利要求1的步驟(b)期間進(jìn)行活化。
26.根據(jù)權(quán)利要求20或25所述的方法，其中，在步驟(a)中，至少一種供體碳水化合物進(jìn)一步與PEP和/或至少一種核苷酸接觸。
27.根據(jù)權(quán)利要求沈所述的方法，其中，所述至少一種核苷酸選自CMP、⑶P、CTP、UMP、UDP和UTP組成的組。
28.根據(jù)權(quán)利要求7 10、15 17、20和25 27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受體是寡聚或多聚的W-135莢膜多糖、寡聚或多聚的Y莢膜多糖、寡聚或多聚的α 2,8-連接的唾液酸和/或寡聚或多聚的α 2，9-連接的唾液酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求觀所述的方法，其中，所述受體在其還原端帶有一個(gè)或多個(gè)另外的官能團(tuán)。
30.根據(jù)權(quán)利要求11 14、18 20J6或27中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受體是腦膜炎奈瑟氏菌血清組A或X的莢膜多糖或者含有末端GIcNAC殘基的碳水化合物結(jié)構(gòu)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中，所述包含末端GIcNAC殘基的碳水化合物結(jié)構(gòu)選自透明質(zhì)酸、硫酸肝素、硫酸乙酰肝素或蛋白質(zhì)連接的低聚糖組成的組。
32.根據(jù)權(quán)利要求觀至31中任一項(xiàng)所述的方法，其中，對(duì)所述受體莢膜多糖進(jìn)行純化。
33.根據(jù)權(quán)利要求觀至32中任一項(xiàng)所述的方法，其中，使所述受體莢膜多糖水解。
34.一種可通過(guò)根據(jù)權(quán)利要求1至20和25至33中任一項(xiàng)所述的方法獲得的腦膜炎奈瑟氏菌的嵌合莢膜多糖。
35.一種包含權(quán)利要求34所述的嵌合莢膜多糖的藥物組合物，其可選地進(jìn)一步包含可接受的藥物載體。
36.一種包含權(quán)利要求34所述的嵌合莢膜多糖或權(quán)利要求35所述的藥物組合物的復(fù)合物，其用于主體的疫苗接種。
37.包含根據(jù)權(quán)利要求34所述的嵌合莢膜多糖或根據(jù)權(quán)利要求35所述的藥物組合物的復(fù)合物在制備待給予主體的疫苗中的應(yīng)用。
38.根據(jù)權(quán)利要求36所述的復(fù)合物或根據(jù)權(quán)利要求37所述的應(yīng)用，其中，所述主體是人。
39.根據(jù)權(quán)利要求36或38所述的復(fù)合物或者根據(jù)權(quán)利要求37或38所述的應(yīng)用，其中，所述疫苗接種用于抵抗由腦膜炎奈瑟氏菌血清組A、B、C、W-135、X或Y引起的腦膜炎球菌性腦膜炎。
40.權(quán)利要求21所述的核酸分子或其功能片段、權(quán)利要求22所述的載體、權(quán)利要求23所述的宿主細(xì)胞，或權(quán)利要求M所述的多肽或其功能片段在將己糖-1-磷酸和/或戊糖-ι-磷酸活化成核苷酸糖中的體外應(yīng)用。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的應(yīng)用，其中，所述己糖-1-磷酸選自Glc-IP和(ial-1-P組成的組，且所述戊糖-ι-磷酸選自木糖-I-P和阿拉伯糖-I-P組成的組。
全文摘要
本發(fā)明提供了生產(chǎn)腦膜炎奈瑟氏菌的莢膜多糖的體外方法。本發(fā)明也提供了可通過(guò)本文描述的方法獲得的莢膜多糖。該莢膜多糖包含對(duì)腦膜炎奈瑟氏菌血清組W-135、Y、X和A有異特性的莢膜多糖。也包括這樣的嵌合莢膜多糖，其包含腦膜炎奈瑟氏菌血清組Y/W-135、W-135/Y、B/Y、C/Y、B/W-135、C/W-135、B/Y/W-135、C/Y/W-135、B/W-135/Y、C/W-135/Y、X/A或A/X的CPS，或者由它們組成。本發(fā)明也提供了這些莢膜多糖作為藥物，特別是作為疫苗和/或診斷劑的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K39/095GK102596241SQ201080048304
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月26日
發(fā)明者麗塔·熱拉爾迪沙恩, 卡塔琳娜·斯圖梅爾, 塞巴斯蒂安·達(dá)梅羅, 安德烈亞·貝特, 弗里德里?！じベ囏惛駹? 馬丁納·米倫霍夫 申請(qǐng)人:漢諾威醫(yī)學(xué)院