專利名稱：降低pcv-2組合物殺病毒活性之方法及具有改良免疫原性之pcv-2組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明系關(guān)于用于降低通常會(huì)具有一定程度之殺病毒活性的組合物之殺病毒活性的方法及組合物。藉由使用本發(fā)明方法可使該等組合物之殺病毒活性與不包括本發(fā)明步驟的組合物之殺病毒活性相比降低。更特定言之，本發(fā)明系關(guān)于制備抗原性II型豬環(huán)狀病毒(PCV-幻組合物之方法，特征在于使用當(dāng)前檢測(cè)方法，該等組合物與在此項(xiàng)技術(shù)中已知之組合物相比，尤其與并非藉由本發(fā)明方法制備之組合物相比不具有或具有較低殺病毒活性。本發(fā)明進(jìn)一步系關(guān)于一種新穎免疫原性組合物，較佳為根據(jù)本專利申請(qǐng)案提供之方法制備的含有PCV-2之組合物，其較佳特征在于相對(duì)于此項(xiàng)技術(shù)中已知之可比組合物，具有降低的或不具有殺病毒活性。根據(jù)另一方面，本發(fā)明亦提供包含純化PCV-2抗原(較佳具有改良免疫原性之純化PCV-2抗原)的免疫原性組合物。先前技術(shù)2型豬環(huán)狀病毒(PCV-2)為小型(直徑為17-22nm) 二十面體無包膜DNA病毒， 其含有單鏈圓形基因組。PCV-2與1型豬環(huán)狀病毒(PCV-I)具有約80%序列同一性。然而，與通常無毒力之PCV-I相比，感染有PCV-2之豬展現(xiàn)通常稱為斷乳后多系統(tǒng)消耗性癥候群(PMWQ之癥候群。PMWS之臨床特征為消瘦、皮膚蒼白、身體憔悴、呼吸窘迫、腹瀉及黃疸(icterus/jaundice)。在一些受感染之豬中，所有癥狀之組合將顯而易見而其它豬將僅僅具有此等癥狀中之一或兩者。在尸檢期間，顯微鏡可見及肉眼可見之病損亦出現(xiàn)于多個(gè)組織及器官上，淋巴器官為最常見之病損部位。已觀測(cè)到PCV-2核酸或抗原之量與顯微鏡可見淋巴病損的嚴(yán)重性之間強(qiáng)相關(guān)。感染有PCV-2之豬之死亡率可達(dá)80%。除PMWS夕卜， PCV-2與包括以下之若干其它感染相關(guān)假性狂犬病、豬生殖及呼吸癥候群(PRRQ、格拉塞氏病(Glasser' s disease)、鏈球菌性腦膜炎、沙門氏菌病、斷乳后大腸桿菌病、飲食性肝障礙及化膿性支氣管肺炎?？衫萌舾梢呙鐏頊p少PCV-2感染對(duì)豬之影響。美國(guó)專利第6，703，023號(hào)提供用于預(yù)防豬之PMWS的基于DNA之疫苗。在WO 03/049703中，描述活嵌合疫苗之制備，該疫苗包含非病原性PCVl病毒，但其中0RF2蛋白經(jīng)病原性PCV-2之0RF2蛋白置換。WO 99/18214及WO 99/29717已提供制備PVC2死疫苗之程序及若干PCV-2株。WO 99/18214 及TO 99/29717亦已描述亞單位疫苗之制備。WO 06/072065已報(bào)導(dǎo)基于0RF2之有效亞單位疫苗。WO 07Λ8823亦描述另一基于0RF-2之亞單位疫苗。然而，先前技術(shù)中所述之疫苗均不包括非殺病毒及/或純化的PCV-2抗原，較佳高度純化之PCV-2 0RF2抗原。針對(duì)PCV-2之免疫原性組合物及針對(duì)其它病原體之各種免疫原性組合物常常對(duì)其他抗原具有殺病毒效應(yīng)。當(dāng)前管理標(biāo)準(zhǔn)(9 CFR 113. 35)允許多價(jià)組合物中有一些殺病毒活性，但在與免疫原性組合物之其它組份組合時(shí)，此殺病毒活性不能造成超過0. 71og/ml 之活病毒或小于0.71og/ml CFU之活細(xì)菌的損失。殺病毒活性高于所允許者之組合物不能與其它抗原組合來形成多價(jià)疫苗。PCV-2之可讀框2 (0RF2)蛋白當(dāng)在SDS-PAGE凝膠上跑行時(shí)具有30kDa之近似分子量，其在以往用作PCV-2之疫苗及免疫原性組合物中之抗原組份。獲得適用于該等疫苗及組合物中的0RF2之典型方法一般由以下步驟組成擴(kuò)增編碼0RF2之PCV-2 DNA、在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)0RF2蛋白及經(jīng)由細(xì)胞溶解自宿主細(xì)胞提取0RF2蛋白。接著將回收的0RF2細(xì)胞溶解物用作免疫原性組合物或疫苗之抗原部分。在一些情況下，將含有0RF2之細(xì)胞溶解物與細(xì)胞碎片分離。需要一種降低含有PCV-2之免疫原性組合物及其中之抗原的殺病毒活性的方法， 以便滿足管理要求且施用有效的多價(jià)組合物。另外需要減小或降低含有PCV-2之組合物對(duì)豬生殖及呼吸癥候群病毒(PRRSV)之殺病毒活性及效應(yīng)的方法。另外需要彼等免疫原性組合物，其已經(jīng)歷本發(fā)明方法使得其殺病毒活性已降低至可接受標(biāo)準(zhǔn)且可與其它抗原組合以形成多價(jià)免疫原性組合物。發(fā)明概述除非另有所述，否則本發(fā)明之實(shí)施將采用此項(xiàng)技術(shù)技能范圍內(nèi)之分子生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA技術(shù)、蛋白質(zhì)化學(xué)及免疫學(xué)常規(guī)技術(shù)。文獻(xiàn)中充分解釋了該等技術(shù)。參見，例如，Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning :A Laboratory Manual， 第 I，II 及 III 卷，第二版(1989) ；DNA Cloning,第 I 及 II 卷(D. N. Glover 編，1985)； Oligonucleotide Synthesis (Μ. J. Gait 編，1984) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins 1984) ；Animal Cell Culture (R. K. Freshney 1986)； Immobilized Cells and Enzymes(IRL press，1986) ；Perbal, B.，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984) ；the series,Methods In Enzymology(S. Colowick及N. Kaplan 編，Academic Press，Inc.) ；Protein purification methods-a practical approach (E· L V· Harris 及 S· Angal 編，IRL Press at Oxford University Press)；及 Handbook of Experimental Immunology,第 I-IV ^ (D. Μ. Weir R C. C. Blackwell 編，1986, Blackwell Scientific Publications)。在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，應(yīng)了解本發(fā)明不限于特定DNA、多肽序列或過程參數(shù)，其當(dāng)然可變化。亦應(yīng)了解本文中所使用之術(shù)語僅為了達(dá)成描述本發(fā)明之特定實(shí)施方案之目的且并非意欲限制本發(fā)明。應(yīng)注意，除非文中明確另外指示，否則如本說明書及隨附權(quán)利要求所用之單數(shù)形式“一”及“該”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物。因此，舉例而言，“一抗原”包括兩種或兩種以上抗原之混合物，“一賦形劑”包括兩種或兩種以上賦形劑之混合物，諸如此類。本發(fā)明解決先前技術(shù)中所固有之問題且相對(duì)于當(dāng)前技術(shù)有明顯進(jìn)步。一般而言， 本發(fā)明提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，并ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體。該P(yáng)CV-2抗原較佳用作PCV-2抗原性組合物或用于PCV-2抗原性組合物中。
出于本發(fā)明之目的，“第一液體”系指通常與細(xì)胞、抗原、免疫原性組合物、疫苗等等組合使用的液體、水性或流體培養(yǎng)基。第一液體較佳包含抗原性組合物之培養(yǎng)基，第一液體更佳包含用于在培養(yǎng)宿主細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基或較佳由其組成。該等培養(yǎng)宿主細(xì)胞可為細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞及哺乳動(dòng)物細(xì)胞，以昆蟲及哺乳動(dòng)物細(xì)胞尤佳。因此，第一流體可包含用于培養(yǎng)細(xì)菌、酵母、昆蟲細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞之培養(yǎng)基或由其組成。當(dāng)使用昆蟲細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)基較佳為不含血清之細(xì)胞培養(yǎng)基，且該培養(yǎng)基最佳為EX-CELL 420不含血清培養(yǎng)基。EX-CELL 420是一種完全培養(yǎng)基，其不含蛋白質(zhì)且含有L-谷氨酰胺，而且是為Sf9和Sf21昆蟲細(xì)胞系的無血清生長(zhǎng)而開發(fā)并優(yōu)化的。出于本發(fā)明之目的，“第二液體”系指通常與細(xì)胞、抗原、免疫原性組合物、疫苗等等組合使用的任何液體，其不同于第一液體。第二液體較佳為水溶液，甚至更佳為醫(yī)藥學(xué)上可接受之溶液，且甚至更佳為緩沖液，諸如鹽水或磷酸鹽緩沖液等等。最佳，第二流體之特征在于當(dāng)活病毒或活細(xì)菌在該流體中培養(yǎng)或儲(chǔ)存時(shí)，其不對(duì)任何活病毒或任何活細(xì)菌有殺病毒作用(在本文中，除非明確說明或根據(jù)上下位顯而易見，術(shù)語“殺病毒”包括殺細(xì)菌活性)。出于本發(fā)明之目的，“部分”系指不包涵完整量之任何量。舉例而言，一部分液體將為小于100 %液體之體積，諸如90 %液體、80 %液體、70 %液體之任何物且所有量均介于超過0%與小于100%之間。"PCV-2抗原”系指包含至少一種當(dāng)施用動(dòng)物(較佳豬)時(shí)可誘導(dǎo)、刺激或增強(qiáng)針對(duì)PCV-2感染之免疫反應(yīng)的抗原的任何物質(zhì)組合物。該P(yáng)CV-2抗原較佳為全PCV-2病毒 (較佳呈滅活形式)、經(jīng)修飾或減毒之PCV-2活病毒、包含至少一個(gè)PCV-2免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒、包含至少一個(gè)PCV-2免疫原性氨基酸序列(較佳0RF2)的任何其它多肽或組份。如本文中所用之術(shù)語“免疫原性蛋白”、“免疫原性多肽”或“免疫原性氨基酸序列” 系指引發(fā)宿主中針對(duì)PCV-2之免疫反應(yīng)的任何PCV-2氨基酸序列。該P(yáng)CV-2免疫原性蛋白、免疫原性多肽或免疫原性氨基酸較佳為國(guó)際專利申請(qǐng)案WO 2006/072065(其教示內(nèi)容以引用的方式并入本文中)中所揭示或提供之任一者，或?yàn)樵诖隧?xiàng)技術(shù)中已知之任何其它 PCV-2多肽。舉例而言，PCV-2 0RF2 DNA之代表性序列包含核苷酸序列Genbank寄存編號(hào) AF086834(SEQ ID NO 3)及 SEQ ID NO :4。然而，熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者應(yīng)了解此序列在序列同源性方面可變化高達(dá)-10% 且仍保持使其適用于免疫原性組合物中之抗原特征。免疫學(xué)組合物之抗原特征可例如藉由W006/072065之實(shí)施例4所提供之攻毒實(shí)驗(yàn)來評(píng)估。此外，當(dāng)經(jīng)修飾抗原與由如WO 06/072065中提供之SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :4之多核苷酸序列編碼的PCV-2 0RF2蛋白相比賦予至少70%，較佳80%，更佳90%或更多之保護(hù)性免疫力時(shí)，仍保留經(jīng)修飾抗原之抗原特征。其它較佳PCV-2 0RF2抗原為下文描述者i)包含 WO 06/07065 之 SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10或SEQ ID NO 11序列的多肽；ii)與i)之多肽有至少80%同源性及/或同一性之任何多肽；iii) i)及/或ii)之多肽之任何免疫原性部分；iv)iii)之免疫原性部分，包含至少5個(gè)，較佳8個(gè)，更佳10個(gè)于WO 06/072065之 SEQ ID NO 5, SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10 或 SEQ ID NO :11 序列任一中之鄰接氨基酸；ν)由包含 WO 06/072065 之 SEQ ID NO :3 或 SEQ ID NO :4 序列之 DNA 編碼的多肽；vi)由與ν)之多核苷酸有至少80%同源性及/或同一性的多核苷酸編碼之任何多肽；vii)由ν)及/或vi)之多核苷酸編碼的多肽之任何免疫原性部分；viii) vii)之免疫原性部分，其中編碼該免疫原性部分之多核苷酸包含至少30個(gè)包括于WO 06/072065之SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4序列中的鄰接核苷酸。WO 06/072065之序列表與本申請(qǐng)案隨附之序列表相同。上述任一免疫原性部分較佳具有由WO 06/07065之SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 4 之序列編碼的PCV-2 0RF2抗原之抗原特征。如此項(xiàng)技術(shù)中已知，“序列同一性”系指兩個(gè)或兩個(gè)以上多肽序列或兩個(gè)或兩個(gè)以上多核苷酸序列(亦即參考序列與有待與參考序列比較之指定序列)之間的關(guān)系。序列同一性系藉由在指定序列與參考序列經(jīng)最佳比對(duì)以產(chǎn)生最高序列相似度后，將其比較而測(cè)定，如由此等序列串之間的匹配度所測(cè)定。在此比對(duì)后，逐個(gè)位置測(cè)定序列同一性，例如，若在一特定位置處核苷酸或氨基酸殘基相同，則該等序列在彼位置處“相同”。隨后，此等位置同一性之總數(shù)除以參考序列中核苷酸或殘基之總數(shù)得到序列同一性百分比。舉例而言， 核苷酸序列與參考核苷酸序列之“序列同一性”為至少(例如)85%，較佳90%，甚至更佳 95%的多核苷酸意謂除參考核苷酸序列之每100個(gè)核苷酸，指定多核苷酸序列可能包括至多15個(gè)，較佳至多10個(gè)，甚至更佳至多5個(gè)點(diǎn)突變外，指定多核苷酸之核苷酸序列與參考序列相同。換言之，在核苷酸序列相對(duì)于參考核苷酸序列具有至少85 %，較佳90 %，甚至更佳95 %之同一性的多核苷酸中，參考序列中至多15 %，較佳10 %，甚至更佳5 %之核苷酸可刪除或經(jīng)另一核苷酸替代，或可將參考序列中數(shù)目為至多15%，較佳10%，甚至更佳5%核苷酸總數(shù)之核苷酸插入?yún)⒖夹蛄兄?。參考序列之此等突變可發(fā)生在參考核苷酸序列之5' 末端位置或3'末端位置處或彼等末端位置之間的任何地方，個(gè)別地散布于參考序列中之核苷酸間或參考序列內(nèi)之一或多個(gè)鄰接組中。類似地，指定氨基酸序列具有與參考氨基酸序列之至少(例如)85 %，較佳90 %，甚至更佳95 %序列同一性的多肽意謂除參考氨基酸序列之每100個(gè)氨基酸，指定多肽序列可能包括至多15個(gè)，較佳至多10個(gè)，甚至更佳至多 5個(gè)氨基酸改變外，該多肽之指定氨基酸序列與參考序列相同。換言之，為獲得具有與參考氨基酸序列之至少85%，較佳90%，甚至更佳95%序列同一性之指定多肽序列，參考序列中至多15%，較佳至多10%，甚至更佳至多5%之氨基酸殘基可刪除或經(jīng)另一氨基酸替代， 或可將參考序列中數(shù)目為至多15%，較佳至多10%，甚至更佳至多5%氨基酸殘基總數(shù)之氨基酸插入?yún)⒖夹蛄兄?。參考序列之此等改變可發(fā)生于參考氨基酸序列之氨基末端或羧基末端位置處或彼等末端位置之間的任何地方，個(gè)別地散布于參考序列之殘基間或參考序列內(nèi)之一或多個(gè)鄰接組中。較佳地，不相同的殘基位置的不同之處為保守性氨基酸替代。然而，測(cè)定序列同一性時(shí)不包括保守替代作為匹配。出于本發(fā)明之目的，“活”病毒或細(xì)菌系指能夠在宿主中復(fù)制之病毒或細(xì)菌。本發(fā)明之較佳活病毒及較佳活細(xì)菌分別為PRRS病毒及豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumonia)細(xì)菌。然而，術(shù)語活病毒或活細(xì)菌分別不限于PRRS病毒及豬肺炎支原體。
可藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體，其中該第二液體不同于該第一液體(參見第二流體之定義)。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中藉由以第二液體交換該部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分該第一液體，且其中該第二液體不同于該第一液體。較佳地，以該第二液體交換部分該第一液體之操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有 PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮 PCV-2抗原。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)藉由以第二液體交換至少一部分第一液體自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，交換操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原?？墒褂眠^濾器藉由過濾步驟自PCV-2抗原移除部分第一液體。然而，可使用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之任何其它方法自PCV-2抗原移除部分任何流體，包括第一流體及(當(dāng)適用時(shí))一部分第二流體。舉例而言，該方法包括(但不限于)離心及/或?qū)游?。然而，過濾最佳。移除該部分第一流體或(當(dāng)適用時(shí))任何其它流體之較佳過濾方法包含超濾及/ 或透濾。超濾及透濾為熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之標(biāo)準(zhǔn)方法，例如在以下文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述 Protein Purification Methods-Α Practical Approach-編者Ε· L. V. Harris及S. Angel, OxfordUniversity Press 1995 (其內(nèi)容及教示以引用的方式并入本文中)。詳言之，在彼教科書之第3章中，描述若干方法及設(shè)備類型，一般技術(shù)者可出于本發(fā)明之目的以例示性方式使用所有該等方法及設(shè)備。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中藉由過濾(較佳藉由透濾或超濾)自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳地，藉由以第二液體交換至少一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分該第一液體，該交換操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原。如上所定義，欲用于所述任一方法中之較佳第二液體為緩沖液，較佳為生理學(xué)上可接受之緩沖液且以鹽水尤佳。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)藉由用緩沖液，較佳生理學(xué)上可接受之緩沖液(諸如鹽水或磷酸鹽緩沖液等等)交換自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體。較佳地，藉由過濾，較佳藉由透濾及/或超濾自PCV-2抗原移除該部分第一液體。更佳地，以緩沖液，較佳生理學(xué)上可接受之緩沖液(諸如鹽水或磷酸鹽緩沖液等等)交換至少一部分第一液體之操作包含以下步驟a)將該緩沖液，較佳該生理學(xué)上可接受之緩沖液(諸如鹽水或磷酸鹽緩沖液等等)添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中， 及b)較佳藉由過濾，甚至更佳藉由透濾及/或超濾自PCV-2抗原移除一部分該第一液體及該流體來濃縮PCV-2抗原，該流體為緩沖液，較佳生理學(xué)上可接受之緩沖液，諸如鹽水或磷酸鹽緩沖液等等。如本文所述之方法之濃縮步驟及液體添加步驟可實(shí)質(zhì)上同時(shí)執(zhí)行，或者該濃縮步驟與該液體添加步驟依次執(zhí)行。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)藉由以第二液體交換一部分第一液體自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，交換操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原，其中實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行液體添加步驟。 較佳地，藉由過濾，較佳藉由透濾及/或超濾自PCV-2抗原移除該部分第一液體且在添加第二液體之情況下移除第一流體與第二流體之混合物。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。舉例而言，在另一方面中，在該濃縮步驟之前進(jìn)行該液體添加步驟且在一替代方面中，在該液體添加步驟之前進(jìn)行該濃縮步驟。可多次執(zhí)行該液體添加步驟及該濃縮步驟，不管執(zhí)行該等步驟之順序如何。舉例而言，此等各別步驟之每一者可執(zhí)行至少兩次，至少三次，至少四次，至少五次， 至少十次，直至所需之多次。在一方面中，該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執(zhí)行至少兩次。在另一方面中，該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執(zhí)行至少三次。因此，根據(jù)本申請(qǐng)案之另一方面，提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其中該方法一般包含以下步驟 i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)藉由以第二液體交換至少一部分該第一液體自該 PCV-2抗原移除該部分第一液體，其中多次執(zhí)行該交換操作。較佳地，以一部分第二流體交換部分第一流體之操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原，其中多次 (例如兩次、三次、五次、十次等)執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。較佳地，兩次，最佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。如上所述，過濾為自PCV-2抗原移除一部分該第一液體或在如上所述多個(gè)移除步驟之情況下，移除一部分第一與第二流體之混合物的較佳方法。過濾器可為此項(xiàng)技術(shù)中之任何常規(guī)過濾器。較佳地，該過濾器包括半透膜。在另一較佳形式中，該半透膜具有小于PCV-2抗原之平均孔徑，藉此防止至少90 %該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且由過濾器截留PCV-2抗原。在另一方面中，該過濾器具有防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)通過的平均孔徑，更佳地，該過濾器具有防止至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)通過的平均孔徑，且最佳地，該過濾器具有防止至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過的平均孔徑。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。在另一方面中，該半透膜包括選自由聚砜、聚醚砜及再生纖維素組成之群的材料。然而，可使用能夠自PCV-2抗原移除一部分第一流體且在多個(gè)方法步驟之情況下移除第一與第二流體之混合物的任何其它材料。該過濾器可選自由中空纖維膜超濾筒、 平板或過濾盒(cassette)組成之群，以中空纖維膜超濾筒尤佳。因此，根據(jù)本申請(qǐng)案之另一方面，如上所述提供制備PCV-2抗原性組合物之方法。該方法一般包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)藉由過濾步驟自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中該過濾器較佳為半透膜或包含半透膜。較佳地，該半透膜具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。較佳地，半透膜之平均孔徑防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)通過，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)通過，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。如上所述，移除步驟一般包括以一部分第二流體交換部分第一流體，該交換操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體濃縮PCV-2抗原，其中多次(例如兩次、三次、五次、十次等)執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。較佳兩次，最佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。執(zhí)行本文中所提供之方法之濃縮步驟，以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍。更佳地，進(jìn)行該濃縮步驟以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮4倍至20倍。最佳地，進(jìn)行濃縮步驟以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮 7倍至10倍。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中自PCV-2抗原移除部分該第一液體，且其中該P(yáng)CV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮了 3倍至50倍，較佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一流體，該交換操作包含以下步驟 a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍，較佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。 較佳地，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)， 步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2 抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。較佳地，半透膜之平均孔徑防止至少90%大小為50kDa 至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。在另一方面中，藉由本文之方法制備的PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經(jīng)歷該方法之該液體相比降低至少10%。更佳地，PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經(jīng)歷該方法之該第一液體相比降低至少50%。更佳地，PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經(jīng)歷該方法之該第一液體相比降低至少70%。出于本發(fā)明之目的，術(shù)語“殺病毒活性”意謂當(dāng)流體、溶液或組合物與活病毒或活細(xì)菌混合時(shí)，該流體、溶液或組合物在某種程度上滅活或殺滅該活病毒或活細(xì)菌。因此，流體、溶液或組合物之殺病毒活性降低至少10%意謂活病毒或活細(xì)菌在經(jīng)歷本文所述之任一方法之流體、溶液或組合物中之存活率比在未經(jīng)歷本文所述之任一方法之流體、溶液或組合物中的存活率高90%。根據(jù)本發(fā)明，PRRS病毒(較佳具有ATCC寄存編號(hào)VR 2332之PRRS 病毒)為用于測(cè)定殺病毒活性之參考病毒。為測(cè)定對(duì)于細(xì)菌之殺病毒活性，建議使用豬肺炎支原體細(xì)菌，較佳豬肺炎支原體之J株。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中在步驟ii)之后獲得的PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性(較佳對(duì)于PRRS病毒)與第一液體之殺病毒活性相比降低至少10 %，較佳至少50 %，更佳至少70 %，甚至更佳至少90%。較佳地，藉由以第二液體交換一部分具有殺病毒活性之第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，且甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地， 如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該 PCV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90 %大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90 %大小為75kDa至400kDa 之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。在另一方面中，該方法進(jìn)一步包含收獲在自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體之后所獲得的PCV-2抗原之步驟。如本文中所用，“收獲(harvesting/harvest)”系指收集或回收PCV-2抗原。當(dāng)制備為本申請(qǐng)案之方法及組合物使用的抗原時(shí)，或當(dāng)PCV-2抗原經(jīng)歷本文所述之方法時(shí)，可使用此項(xiàng)技術(shù)中已知之任何常規(guī)方法來回收PCV-2抗原。在一尤佳收獲方式中，經(jīng)由過濾步驟自該P(yáng)CV-2抗原移除部分該第一液體且自過濾器阻滯物回收或收獲PCV-2抗原。在一更佳形式中，自具有本文所述之孔徑的半透膜之阻滯物收獲或收集或回收PCV-2抗原。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟: i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中收獲在該步驟ii)之后獲得的PCV-2抗原。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至 20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。 較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾 (較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90 %該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa 至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。將在經(jīng)歷本文所提供之方法之后(較佳在自過濾器阻滯物收獲之后)剩余的 PCV-2抗原與選自由醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合組成之群的另一組份混合。較佳地，該另一組份為佐劑，甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中該佐劑為卡波姆(Carbomer)(合成的高分子量的丙烯酸聚合物的通稱)。如本文中所用之“醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑”及“獸醫(yī)學(xué)上可接受之載劑”包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、涂料、穩(wěn)定劑、稀釋劑、防腐劑、抗細(xì)菌劑及抗真菌劑、等張劑、吸收延遲劑等等。如本文所用之“佐劑”可包括氫氧化鋁及磷酸鋁、例如Quil A、QS-21 (Cambridge Biotech Inc. , Cambridge ΜΑ)>GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals, Inc. ,Birmingham, AL)之皂素、油包水乳液、水包油乳液、水包油包水乳液。該乳液可尤其基于輕液體石蠟油 (歐洲藥典型)；類異戊二烯油，諸如角鯊?fù)榛蚪酋徬?；由烯烴(尤其異丁烯或癸烯)之低聚合產(chǎn)生的油；含有直鏈烴基/烷基之酸或醇之酯，更尤其植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；支鏈脂肪酸或醇之酯，尤其異硬脂酸酯。將油與乳化劑組合使用以形成乳液。乳化劑較佳為非離子表面活性劑，尤其為視情況經(jīng)乙氧基化之山梨聚糖酯、Mannide (例如無水甘露醇油酸酯)、二醇酯、聚甘油酯、丙二醇酯及油酸酯、異硬脂酸酯、蓖麻酸酯或羥基硬脂酸酯，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物(尤其為Pluronic產(chǎn)物，特別為L(zhǎng)121)。參見Hunter等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants(Stewart-Tull,D. E. S.編)。JohnWiley and Sons, NY,第 51-94 頁(1995)及 Todd 等人，Vaccine 15 :564-570 (1997)。舉例而言，可使用由 M. Powell 及 M. Newman 所編之“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach，，， Plenum Press, 1995之第147頁所述之SPT乳液及同一本書中第183頁所述之乳液MF59。 其他合適之佐劑包括(但不限于)RIBI佐劑系統(tǒng)(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx，Atlanta GA)、SAF-M(Chiron，Emeryvilie CA)、單磷?；|(zhì)Α、阿夫立定(Avridine)脂質(zhì)-胺佐劑、 來自大腸桿菌(E.coli)之熱不穩(wěn)定性腸毒素(重組或其他方式)、霍亂毒素、IMS 1314或胞壁酰基二肽等。在馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物中，包括共聚物EMA(Monsanto)，其為馬來酸酐與乙烯之共聚物。此等聚合物在水中溶解產(chǎn)生酸性溶液，將其中和，較佳中和至生理PH值以產(chǎn)生佐劑溶液，將向該佐劑溶液中并入免疫原性、免疫學(xué)或疫苗組合物本身。佐劑之另一實(shí)例為選自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物及馬來酸酐與烯基衍生物之共聚物的化合物。有利之佐劑化合物為尤其與糖類或多元醇類之聚烯基醚交聯(lián)的丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物。此等化合物以術(shù)語卡波姆來指稱(Wiameuropa第8卷，第2期， 1996年6月)。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者亦可參考美國(guó)專利第2，909，462號(hào)，其描述與具有至少3個(gè)羥基，較佳不超過8個(gè)羥基之多羥基化合物交聯(lián)之丙烯酸聚合物，至少三個(gè)羥基之氫原子經(jīng)具有至少2個(gè)碳原子之不飽和脂族根置換。較佳根為彼等含有2至4個(gè)碳原子之根，例如乙烯基、烯丙基及其它烯系不飽和根。該等不飽和基團(tuán)本身可含有諸如甲基之其它取代基。 以名稱卡波莫 (Carbopol)出售之產(chǎn)品(BF Goodrich,Ohio,USA)特別適合。它們是與聚烯基醚或聯(lián)乙烯基二醇交聯(lián)或與烯丙基蔗糖或與烯丙基季戊四醇交聯(lián)的丙烯酸聚合物。其中，可提及卡波莫 974P、934P及971P。最佳使用卡波莫 971P。較佳以每劑量約100 μ g至約IOmg之量添加佐劑。更佳以每劑量約100 μ g至約 IOmg之量添加佐劑。更佳以每劑量約500 μ g至約5mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約 750 μ g至約2. 5mg之量添加佐劑。最佳地，以每劑量約Img之量添加佐劑。“稀釋劑”可包括水、鹽水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等張劑可包括氯化鈉、右旋糖、 甘露醇、山梨醇及乳糖等。穩(wěn)定劑包括清蛋白及乙二胺四乙酸之堿鹽等。如本文中所用之“防腐劑”系指抗微生物活性劑，諸如例如慶大霉素 (Gentamycin)、硫柳汞(Merthiolate)等等。詳言之，添加防腐劑對(duì)于制備多劑量組合物而言最佳。以有效防止相關(guān)組合物受任何微生物污染或抑制相關(guān)組合物內(nèi)的任何微生物生長(zhǎng)之濃度添加彼等抗微生物活性劑。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，進(jìn)一步包含以下步驟將在步驟ii)之后剩余的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。較佳地，其中該另一組份為佐劑，甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中該佐劑為卡波姆。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10 倍。較佳地，多次，較佳兩次，且甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。上述方法中所用之PCV-2抗原可為本文中所定義之任何PCV-2抗原。PCV-2抗原較佳包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳包含PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳包含0RF-2蛋白之病毒樣粒子，且甚至更佳包含INGELVAC CIRC0FLEX 中所包括之抗原。因此，根據(jù)本申請(qǐng)案之另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i) 獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中該 PCV-2抗原包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至 10倍。較佳地，執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟多次，較佳兩次，甚至更佳三次。在該等情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原，且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收的平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備PCV-2抗原呈全病毒或病毒樣粒子時(shí)，此孔徑較佳。
所用含有PCV-2抗原之第一液體可由此項(xiàng)技術(shù)中已知之任何方法獲得。較佳地， 含有PCV-2抗原之該第一液體以及PCV-2抗原可由國(guó)際專利申請(qǐng)案WO 2006/072065 (其內(nèi)容及教示以引用的方式并入本文中)中所述之任何方法獲得。特別地，當(dāng)PCV-2抗原于宿主細(xì)胞中于活體外重組表達(dá)時(shí)，PCV-2抗原可經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF-2)之病毒載體，較佳重組桿狀病毒之病毒載體獲得。用于表達(dá)PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之載體及制造及/或使用該等載體(或重組體)之方法可藉由或類似于以下所揭示之方法實(shí)現(xiàn)美國(guó)專利第 4，603，112 號(hào)；第 4，769，330 號(hào)；第 5，174，993 號(hào)；第 5，505,941 號(hào)；第 5，338，683 號(hào)；第 5，494，807 號(hào)；第 4，722，848 號(hào)；第 5，942，235 號(hào)；第 5，364，773 號(hào)；第 5，762，938 號(hào)；第 5，770, 212 號(hào)；第 5，942，235 號(hào)；第 382，425 號(hào)；PCT 公開案 WO 94/16716 ；WO 96/39491 ； WO 95/30018 ；Paoletti,"Applications of pox virus vectors to vaccination :An update”，PNAS USA 93 :11349-11353,1996 年 10 月；Moss，‘‘Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety", PNAS USA 93 :11；341-11；348，1996 年 10 月；Smith 等人，美國(guó)專利第 4，745，051 號(hào)(重組桿狀病毒)；Richardson, C. D.(編者)，Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols，，(1995, Humana Press Inc.) ；Smith 等人，"Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, 1983 年 12 月，第 3 卷，第 12 期，第 2156-2165 頁；Permock 等 Α "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector，，，Molecular and Cellular Biology, 1984 年 3 月，第 4 卷，第 3 期，第 399-406 頁；EPA O 370 573 ； 1986年10月16日申請(qǐng)之美國(guó)申請(qǐng)案第920，197號(hào)；EP專利公開案第沈5785號(hào)；美國(guó)專利第 4，769，331 號(hào)(重組皰疹病毒)；Roizman，‘‘The function of herpes simplex virus genes :A primer for genetic engineering of novel vectors，，，PNAS USA 93 11307-11312,1996 年 10 月；Andreansky 等人,‘‘The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors，，，PNAS USA 93 :11313-11318,1996 年 10 月；Robertson 等人，"Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93 :11334-11340, 1996 年 10 月；Frolov 等人，"Alphavirus-based expression vectors Strategies and applications”，PNAS USA 93 :11371-11377,1996 年 10 月；Kitson 等人，J.Virol. 65, 3068-3075,1991 ；美國(guó)專利第 5，591，439 號(hào)；第 5，552，143 號(hào)；WO 98/00166 ；已核準(zhǔn)之美國(guó)申請(qǐng)案流水第08/675，556號(hào)及第08/675，566號(hào)，均申請(qǐng)于1996年7月3日(重組腺病毒)； Grunhaus等人，1992,"Adenovirus as cloning vectors，，, Seminars in Virology (第 3卷) 第 237-52 頁，1993 ;Ballay 等人，EMBO Journal，第 4 卷，第 3861-65 頁，Graham, Tibtech 8，85-87，1990 年 4 月；Prevec 等人，J. Gen Virol. 70,42434 ；PCT WO 91/11525 ；Feigner 等人(1994)，J. Biol. Chem. 269,2550-2561, Science，259 1745-49，1993 及 McClements 等人，“Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease”，PNAS USA 93 :11414-11420,1996 年 10 月；及美國(guó)專利第 5，591，639 號(hào)；第 5，589，466 號(hào)及第 5，580，859 號(hào)；以及 WO 90/11092 ；WO 93/19183 ； WO 94/21797 ；WO 95/11307 ；WO 95/20660 ；Tang 等人，Nature 及 Furth 等人，Analytical Biochemistry，涉及 DNA 表達(dá)載體，等等。亦參見 WO 98/33510 ； Ju 等人，Diabetologia，41 736-739，1998 (慢病毒表達(dá)系統(tǒng))；Sanford等人，美國(guó)專利第4，945，050號(hào)；Fischbach等人 Gntracel)，W0 90/01543 ;Robinson 等人，seminars in Immunology，第 9卷，第 271183
頁(1997)，(DNA載體系統(tǒng))；Szoka等人，美國(guó)專利第_號(hào)(將DNA插入活細(xì)
胞中的的方法)；McCormick等人，美國(guó)專利第5，677，178號(hào)(細(xì)胞病變病毒的用途)；及美國(guó)專利第5，928，913號(hào)(用于基因投遞的載體)以及本文中所引用之其它文獻(xiàn)。PCV-2 0RF2抗原在昆蟲細(xì)胞中之表達(dá)描述于例如WO 06/072065中。本發(fā)明之純化PCV-2 0RF2抗原可藉由此項(xiàng)技術(shù)中已知之若干方法獲得。較佳方法為本文所述之彼等方法。PCV-2 0RF2 抗原可藉由包含以下步驟之方法活體外重組制得i)允許用含有PCV-2 0RF2編碼序列之重組病毒載體感染于培養(yǎng)物中之易感細(xì)胞，其中由重組病毒載體表達(dá)PCV-2 0RF2蛋白，及 )此后自細(xì)胞培養(yǎng)物回收PCV-2 0RF2抗原。藉由收獲表達(dá)PCV-2 0RF2抗原之全(亦即完整)SF+細(xì)胞來回收PCV-2 0RF2抗原。因此，根據(jù)本申請(qǐng)案之另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中該P(yáng)CV-2抗原系經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF-2) 之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得，且其中該P(yáng)CV-2抗原包含PCV-2之0RF-2 蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。當(dāng)使用含有及表達(dá)該P(yáng)CV-2抗原之病毒載體(尤其重組桿狀病毒)制備/獲得PCV-2抗原時(shí)，上述方法進(jìn)一步包含較佳在約1至約20mM 二元乙撐亞胺存在下以DNA滅活劑滅活該病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)之步驟。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之后，更佳在收獲PCV-2抗原之后執(zhí)行滅活步驟。甚至更佳地，在藉由以第二液體交換一部分第一液體自 PCV-2抗原移除部分第一液體之后執(zhí)行滅活步驟。當(dāng)藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時(shí)a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍，在該濃縮之后進(jìn)行滅活步驟。當(dāng)多次，較佳兩次，甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟時(shí)，在最后一次液體添加步驟及濃縮步驟之后執(zhí)行該滅活步驟。當(dāng)使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟時(shí)，在較佳使用半透膜進(jìn)行的上述該過濾步驟之后，執(zhí)行該滅活步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2 抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至 300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。出于本發(fā)明之目的，“DNA滅活劑”系指滅活DNA (較佳病原體之DNA)使得病原體不能引起主動(dòng)感染或具有傳染性或復(fù)制但仍能誘導(dǎo)受試者之免疫反應(yīng)的任何化學(xué)試劑。DNA 滅活劑較佳為福爾馬林(formalin)。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中該P(yáng)CV-2抗原系經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF-2)之病毒載體 (較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得，其中該方法進(jìn)一步包含較佳在約1至約20mM 二元乙撐亞胺存在下以DNA滅活劑滅活該病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)之步驟，且其中該P(yáng)CV-2抗原包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之后，更佳在收獲PCV-2 抗原之后執(zhí)行滅活步驟。甚至更佳在藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除部分第一液體之后執(zhí)行滅活步驟。當(dāng)藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時(shí)a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至 50倍，甚至更佳4倍至20倍，甚至更佳7倍至10倍，在該濃縮步驟之后進(jìn)行滅活步驟。當(dāng)多次，較佳兩次，甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟時(shí)，在最后一次液體添加步驟及濃縮步驟之后執(zhí)行該滅活步驟。當(dāng)使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟時(shí)，在較佳使用半透膜進(jìn)行的上述該過濾步驟之后，執(zhí)行該滅活步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。在本發(fā)明方法中使用DNA滅活劑之情況下，該方法進(jìn)一步包含添加一定量之中和該DNA滅活劑之試劑的步驟，該量等于該DNA滅活劑之量，其中中和DNA滅活劑之試劑包含濃縮至約1至約20mM之最終濃度的硫代硫酸鈉且其中該DNA滅活劑為BEI。較佳地，在自 PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之后執(zhí)行該滅活步驟。如本文中所用“中和滅活劑之試劑”或“中和劑”系指能中和上列滅活劑使得滅活劑不能滅活DNA之任何試劑。中和滅活劑之試劑較佳為硫代硫酸鈉。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原，其中該P(yáng)CV-2抗原系經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2 抗原(較佳PCV-2 0RF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得，且其中該P(yáng)CV-2 抗原包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體；iii)較佳在約1至約20mM 二元乙撐亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體；iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑，該中和劑量等于滅活劑之量，其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液，且其中滅活劑較佳包含BEI。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之后，更佳在收獲PCV-2抗原之后執(zhí)行滅活及中和步驟。甚至更佳在藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體之后執(zhí)行滅活及中和步驟。當(dāng)藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時(shí)a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍， 且甚至更佳7倍至10倍，在該濃縮步驟之后進(jìn)行滅活及中和步驟。當(dāng)多次，較佳兩次，甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟時(shí)，在最后一次液體添加步驟及濃縮步驟之后執(zhí)行該滅活及中和步驟。當(dāng)使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟時(shí)，在較佳使用半透膜進(jìn)行的上述該過濾步驟之后，執(zhí)行該滅活及中和步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90% 大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。在本申請(qǐng)案之另一方面中，上述方法進(jìn)一步包含將在該滅活及中和步驟之后獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合之步驟醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原，其中該P(yáng)CV-2抗原系經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體) 獲得，且其中該P(yáng)CV-2抗原包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體；iii)較佳在約1至約20mM 二元乙撐亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體；iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑，該中和劑量較佳等于滅活劑之量，其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液，且其中滅活劑較佳包含BEI ；及ν) 將在步驟iv)中獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。較佳該P(yáng)CV-2抗原包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳在步驟ii)中，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自 PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次， 甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。 當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90 %該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。根據(jù)另一方面，獲得具有降低殺病毒活性之PCV-2抗原的上述任何方法可包括進(jìn)一步純化步驟以獲得純化PCV-2抗原。意外地發(fā)現(xiàn)包含純化PCV-2抗原(較佳與佐劑組合)之抗原性或免疫原性組合物不僅展示如本文所述之降低殺病毒活性，而且展示與不包含純化PCV-2抗原(意謂其包含非純化或粗PCV-2抗原)之免疫原性組合物相比，提高的免疫原性。
術(shù)語“純化PCV-2抗原”意謂PCV-2抗原在制劑中純化至以免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)超過50% (w/w)，較佳超過60% (w/w)，較佳超過70% (w/w)，較佳超過 80 % (w/w)，較佳超過85 % (w/w)，更佳超過90 % (w/w)，甚至更佳超過95 % (w/w)之程度。 換言之，若制劑包含具有80% (w/w)純度等級(jí)之PCV-2抗原，則該制劑包含以免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)不超過20% (w/w)之非PCV-2蛋白。較佳地，在制劑中，亦即在與佐劑或任何其它賦形劑或滅活劑混合之前的免疫原性組合物中測(cè)量純度等級(jí)。然而， 若用于最終免疫原性組合物中之佐劑為非蛋白基佐劑，則添加佐劑對(duì)純度值無任何影響。 可藉由熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之標(biāo)準(zhǔn)方法評(píng)估PCV-2抗原之純度等級(jí)，例如藉由在SDS-PAGE 分離之后的Imperial Protein Stain (Pierce)、氣相層析、HPLC分析等。評(píng)估制劑(亦即免疫原性組合物)中的PCV-2抗原之純度或純度等級(jí)的本發(fā)明之較佳方法為Imperial Protein Stain(Pierce)染色，其如下進(jìn)行使用 NuPAGE MOPS 緩沖系統(tǒng)(Invitrogen)，經(jīng)由NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠(Invitrogen)分離包含PCV-2抗原之制劑。在變性(所有緩沖液中均含有SDQ及還原條件(載入緩沖液含有2-巰基乙醇)下跑膠。在將樣品載入凝膠之后，在200伏特恒定電壓下跑膠55分鐘。在跑膠完成之后，使用Imperial Protein Stain(Pierce)根據(jù)制造商說明書對(duì)凝膠進(jìn)行染色且脫色。相比而言，術(shù)語“非純化”或“粗”PCV-2抗原系指包含PCV-2抗原之粗制劑。通常在細(xì)胞培養(yǎng)物中活體外制備PCV-2抗原。因此，粗PCV-2抗原系指PCV-2抗原與用于制備 PCV-2抗原之細(xì)胞培養(yǎng)物或細(xì)胞培養(yǎng)材料之混合物。此外，非純化PCV-2抗原亦意謂部分純化之PCV-2抗原，其較佳具有以免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)小于50% (w/w), 更佳小于40% (w/w)，甚至更佳小于30% (w/w)，甚至更佳小于20% (w/w)之純度等級(jí)。此外，如本文中所用術(shù)語“提高免疫原性或改良免疫原性”意謂與包含不同抗原或不同純度等級(jí)之抗原的參考免疫原性組合物相比，由包含相關(guān)抗原之免疫原性組合物所引起的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，不管此免疫反應(yīng)為細(xì)胞介導(dǎo)及/或抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)。根據(jù)一較佳實(shí)施方案，術(shù)語提高免疫原性或改良免疫原性意謂與包含不同抗原或不同純度等級(jí)之抗原的參考免疫原性組合物相比，由包含相關(guān)抗原之免疫原性組合物所引發(fā)的抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)增強(qiáng)。就此而言，抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)意謂與由包含不同抗原或不同純度等級(jí)之抗原的參考免疫原性組合物引發(fā)之抗體產(chǎn)生相比，對(duì)相關(guān)抗原有特異性之抗體產(chǎn)生增加。術(shù)語“增強(qiáng)”意謂與由包含不同抗原或不同純度等級(jí)之抗原的參考免疫原性組合物所引發(fā)之細(xì)胞及/或抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)相比，細(xì)胞及/或抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)增強(qiáng)至少10 %，較佳至少20 %，更佳至少30 %，甚至更佳至少40 %，甚至更佳至少50 %，甚至更佳至少75%，最佳至少100%。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者一般知曉如何測(cè)量細(xì)胞及/或抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)。詳言之，熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者很清楚要比較相關(guān)免疫原性組合物之細(xì)胞介導(dǎo)之免疫反應(yīng)與參考組合物之細(xì)胞介導(dǎo)之免疫反應(yīng)，或比較相關(guān)免疫原性組合物之抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)與參考組合物之抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)，而不比較相關(guān)免疫原性組合物之細(xì)胞介導(dǎo)之免疫反應(yīng)與參考組合物之抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)或相關(guān)免疫原性組合物之抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)與參考組合物之細(xì)胞介導(dǎo)之免疫反應(yīng)。此外，可例如藉由測(cè)量相關(guān)免疫原性組合物/抗原對(duì)細(xì)胞毒性T細(xì)胞之活化來測(cè)量細(xì)胞介導(dǎo)之免疫反應(yīng)?？衫缃逵蓽y(cè)量由于向動(dòng)物施用包含該抗原之免疫原性組合物而產(chǎn)生的抗原特異性抗體之量來測(cè)量抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)?？衫缃逵墒褂眯∈竽Ｐ蛠頊y(cè)量細(xì)胞及/或抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明，小鼠模型用作參考方法。術(shù)語“免疫原性組合物”意謂(但不限于)包含至少一種在宿主中引發(fā)針對(duì)相關(guān)抗原之細(xì)胞及/或抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)的抗原之物質(zhì)組合物。通常，“免疫反應(yīng)”包括(但不限于)一或多種以下效應(yīng)產(chǎn)生或活化特異性針對(duì)在相關(guān)組合物或疫苗中所包括之抗原的抗體、B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、抑制T細(xì)胞及/或細(xì)胞毒性T細(xì)胞及/或Y - δ T細(xì)胞。宿主較佳將展現(xiàn)治療或保護(hù)性免疫反應(yīng)以便增強(qiáng)對(duì)新感染之抵抗力及/或降低疾病之臨床嚴(yán)重性。在該情況下，免疫原性組合物為“疫苗”。該種保護(hù)將由通常受感染宿主所呈現(xiàn)之癥狀減輕或缺失、受感染宿主之恢復(fù)時(shí)間縮短及/或病毒滴度降低來證明。可藉由層析程序(較佳兩步層析程序)實(shí)現(xiàn)PCV-2抗原之進(jìn)一步純化。若PCV-2 抗原裝配至病毒樣粒子(VLP)中，則一步(較佳第一步驟)較佳為大小排阻(凝膠過濾) 層析，其可例如藉由使用kphacryl S300基質(zhì)進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下，最佳使用Hift^p 26/60 Sephacryl S300HR管柱。然而，可使用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之任何其它大小排阻層析基質(zhì)，其能夠自培養(yǎng)濾液或上清液中分離出PCV-2 0RF2 VLP。合適之基質(zhì)描述于例如 E. L. V. Harris 及 S. Angel (編者)，Protein purification methods-a practical approach, IRL Press Oxford 1995)中?？衫缃逵梢?. OmL/min之流動(dòng)速率用包含PCV-2 抗原之粗制劑裝載管柱且以1.5個(gè)管柱體積的包含20mM Tris (pH 6. 5)、5mM DTT之緩沖液洗脫管柱來進(jìn)行凝膠過濾層析。然而，亦可藉由使用親和性層析，例如，經(jīng)由選擇性結(jié)合至已固定PCV-2 0RF2特異性抗體或熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之任何其它方法純化PCV-2 0RF2抗原。因此，根據(jù)一較佳實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法， 其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，及iii)藉由層析程序純化包含PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2)之步驟 )收獲物。較佳如本文所述，較佳如實(shí)施例3中所述執(zhí)行大小排阻層析。較佳地，大小排阻產(chǎn)生具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)超過80% (w/ w)，較佳超過90% (w/w)純度等級(jí)之免疫原性組合物?？稍谑褂肗uPAGE MOPS緩沖系統(tǒng) (Invitrogen)，經(jīng)由 NuPAGE 10% Bis-Tris 凝膠(Invitrogen)進(jìn)行 SDS PAGE 之后，藉由 Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評(píng)估純度等級(jí)。因此，根據(jù)一較佳實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，及iii)藉由大小排阻層析(凝膠過濾)純化包含PCV-2抗原之步驟ii)收獲物。為了獲得更高純度等級(jí)，可進(jìn)行不同于第一層析步驟之第二層析步驟。舉例而言，若第一純化步驟/層析步驟為大小排阻(凝膠過濾)，則第二步驟應(yīng)不同于其，為例如親和性層析、離子交換層析等。較佳地，若純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 0RF2抗原) 之第一步驟為大小排阻(凝膠過濾)層析，則第二步驟可為離子交換層析，較佳陰離子交換層析(AIEX)。用于純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之較佳陰離子交換層析基質(zhì)為Q Sepharose0在約50ml之小規(guī)模中，最佳使用5ml HiTrap Q Sepharose HP管柱。 可例如如實(shí)施例3中所述進(jìn)行陰離子交換層析。簡(jiǎn)言之，可將來自大小排阻層析步驟之約 50ml空隙體積級(jí)分匯集物以3. Oml/min之流動(dòng)速率裝載于AIEX管柱上。在使用例如20mMTris (pH 6. 5),5mM DTT移除未結(jié)合材料之洗滌步驟之后，可以8個(gè)管柱體積之下列緩沖液 (20mMTris(pH 6. 5)、5mM DTT、1.0M NaCl)之單一步驟來洗脫蛋白質(zhì)?？蓪碜訟IEX跑柱之流過物裝載回Q kpharose管柱上且如上所述進(jìn)行洗脫以提高產(chǎn)率。此兩步技術(shù)(大小排阻繼之以陰離子交換層析)將PCV-2 0RF2抗原與培養(yǎng)收獲物之大部分其它蛋白組份有效地分離。因此，根據(jù)一較佳實(shí)施方案，本發(fā)明提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，及iii)藉由兩步層析純化包含PCV-2抗原之步驟ii)收獲物。第一層析步驟較佳不同于第二步驟。若第一步驟為大小排阻(凝膠過濾)層析，則第二步驟可為離子交換層析，較佳陰離子交換層析(AIEX)。較佳地，在包括一或多個(gè)進(jìn)一步純化步驟以獲得純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF-2蛋白)的上述任何方法中，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作 a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，且甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2 抗原且防止至少90 %該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90% 大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2 抗原時(shí)，此孔徑較佳。在較佳形式中，上述制備PCV-2抗原性組合物之方法進(jìn)一步包含以下步驟i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原，其中該P(yáng)CV-2抗原系經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得，且其中該P(yáng)CV-2 抗原包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體；iii)較佳在約1至約20mM 二元乙撐亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體；iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑，該中和劑量等于滅活劑之量，其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液，且其中滅活劑較佳包含BEI ；及ν)將在步驟iv)中獲得的PCV-2 抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。進(jìn)一步純化(較佳包括預(yù)過濾步驟之兩步純化策略)產(chǎn)生具有以在與任何佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)超過80% (w/w)，較佳超過85% (w/ w)，甚至更佳超過90% (w/w)，最佳超過95% (w/w)之純度等級(jí)的免疫原性組合物。當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳 4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4 天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上， 甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，最佳2年以上時(shí)，藉由本文所述之方法制備的PCV-2抗原性組合物造成小于llog TCID5tl活病毒或小于llog CFU/毫升活細(xì)菌之損失。 當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上，甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，最佳2年以上時(shí)，藉由本文所述之方法制備的PCV-2 抗原性組合物更佳造成小于0.91og TCID5c/毫升活病毒或小于0.91og CFU/毫升活細(xì)菌之損失。當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳 4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上， 甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上， 甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，最佳2年以上時(shí)，藉由本文所述之方法制備的PCV-2抗原性組合物甚至更佳造成小于0. 71og TCID50/毫升活病毒或小于0. 71og CFU/ 毫升活細(xì)菌之損失。當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2 小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上，甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳 9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，最佳2年以上時(shí)，藉由本文所述之方法按步驟制備的PCV-2抗原性組合物更佳造成小于0. 51og TCID5tl/毫升活病毒或小于 0.51og CFU/毫升活細(xì)菌之損失。當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上，甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，最佳2年以上時(shí)， 藉由本文所述之方法制備的PCV-2抗原性組合物甚至更佳造成小于0. 31og TCID50/毫升活病毒或小于0.31og CFU/毫升活細(xì)菌之損失。活病毒可為任何活病毒，但活病毒較佳為 PRRS病毒，較佳具有ATCC寄存編號(hào)VR 2332之PRRS病毒?；罴?xì)菌可為任何細(xì)菌，但較佳為豬肺炎支原體細(xì)菌，較佳豬肺炎支原體之J株?？山逵赡軌蛟u(píng)估活病毒之量的標(biāo)準(zhǔn)活體外滴定檢定評(píng)估TCID5tl/毫升。亦可藉由能夠評(píng)估活細(xì)菌之量的標(biāo)準(zhǔn)活體外滴定檢定測(cè)定 CFU/毫升。術(shù)語“每毫升”較佳系指1毫升流體。該純化PCV-2抗原不僅顯示如本文所定義之降低殺病毒活性，而且亦顯示與如本文所定義之非純化PCV-2抗原相比提高的免疫原性，較佳該純化PCV-2抗原使細(xì)胞及/或抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)與由包含非純化PCV-2抗原之參考免疫原性組合物引發(fā)的細(xì)胞及/或抗體介導(dǎo)之免疫反應(yīng)相比增強(qiáng)至少10%，較佳至少20 %，更佳至少30 %，甚至更佳至少40 %，甚至更佳至少50 %，甚至更佳至少75 %，最佳至少100%。 因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中當(dāng)活病毒(較佳PRRSV)或活細(xì)菌(較佳豬肺炎支原體)與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳 24小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上，甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上， 甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上， 最佳2年以上時(shí)，在步驟ii)之后獲得的PCV-2抗原性組合物造成小于llog TCID5tl(較佳 /毫升)，較佳小于0.91og TCID5tl (較佳/毫升)，甚至更佳小于0.71og TCID5tl (較佳/毫升)，甚至更佳小于0.51og TCID5tl (較佳/毫升)，最佳小于0.31og TCID5tl (較佳/毫升) 活病毒(較佳活PRRSV)或小于llog CFU(較佳/毫升)，較佳小于0. 91og CFU(較佳/毫升)，甚至更佳小于0.71og CFU (較佳/毫升)，甚至更佳小于0.51og CFU (較佳/毫升)， 最佳小于0.31og CFU (較佳/毫升)活細(xì)菌(較佳豬肺炎支原體)之損失。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮， 較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器 (其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至 400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。當(dāng)該P(yáng)CV-2抗原經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得時(shí)，該方法進(jìn)一步包含iii)較佳在約1至約20mM 二元乙撐亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體；iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑，該中和劑量等于滅活劑之量，其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液，且其中滅活劑較佳包含BEI。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之后，更佳在收獲PCV-2抗原之后執(zhí)行滅活及中和步驟。甚至更佳在藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體之后執(zhí)行滅活及中和步驟。當(dāng)藉由包含以下步驟之方式以第二液體交換一部分第一液體時(shí)a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自 PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，甚至更佳7倍至10倍，在該濃縮步驟之后進(jìn)行滅活及中和步驟。當(dāng)多次，較佳兩次且甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟時(shí)，在最后一次液體添加步驟及濃縮步驟之后執(zhí)行該滅活及中和步驟。當(dāng)使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟時(shí)，在較佳使用半透膜進(jìn)行的上述該過濾步驟之后，執(zhí)行該滅活及中和步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90 %該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90 %大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90 %大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。較佳地，獲得如本文所定義之純化PCV-2抗原之進(jìn)一步純化可藉由執(zhí)行包含以下步驟之進(jìn)一步純化步驟來實(shí)現(xiàn)iii)藉由層析步驟純化在移除一部分第一液體之后獲得的包含PCV-2抗原之步驟ii)收獲物。為了獲得更高純度等級(jí)，可進(jìn)行不同于第一步驟之第二層析步驟。舉例而言，若第一純化步驟/層析步驟為大小排阻(凝膠過濾)，則第二步驟應(yīng)不同于其，為例如親和性層析、離子交換層析等。較佳地，若純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 0RF2抗原)之第一步驟為大小排阻(凝膠過濾)層析，則第二步驟可為離子交換層析，較佳陰離子交換層析(AIEX)。用于純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之較佳陰離子交換層析基質(zhì)為Q Sepharose0在約50ml之小規(guī)模中，最佳使用5ml HiTrap Q Sepharose HP管柱?？衫缛鐚?shí)施例3中所述進(jìn)行陰離子交換層析。簡(jiǎn)言之，可將來自大小排阻層析步驟之約50ml空隙體積級(jí)分匯集物以3. Oml/min之流動(dòng)速率裝載于AIEX管柱上。在使用例如20mM Tris (pH 6. 5),5mM DTT移除未結(jié)合材料之洗滌步驟之后，可以8個(gè)管柱體積之下列緩沖液(20mM Tris (pH 6. 5)、5mM DTTU. OM NaCl)之單一步驟洗脫蛋白質(zhì)。 可將來自AIEX跑柱之流過物裝載回Q Sepharose管柱上且如上所述進(jìn)行洗脫以提高產(chǎn)率。 此兩步技術(shù)(大小排阻繼之以陰離子交換層析)將PCV-2 0RF2抗原與培養(yǎng)收獲物之大部分其它蛋白組份有效地分離。 根據(jù)上述方法獲得之PCV-2抗原性組合物或上述方法之步驟i)中所用之PCV-2 抗原可與至少一種另外抗原(較佳病毒或細(xì)菌抗原，且甚至更佳來自豬中至少一種其它致病有機(jī)體的病毒或細(xì)菌抗原)組合。另外抗原可為國(guó)際專利申請(qǐng)案WO 2007/094893(其內(nèi)容及教示以引用的方式并入本文中)中所揭示之任何彼等抗原。簡(jiǎn)言之，該另外抗原可為豬之任何其它致病有機(jī)體的抗原。豬之“另一致病有機(jī)體”較佳選自由以下組成之群胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumonia) (1)；腺病毒O) ； α病毒，諸如東方馬腦脊髓炎病毒(3)；支氣管敗血性博德氏桿菌(Bordetella bronchiseptica) (4)；短螺旋體屬(Brachyspira spp. ) (5)，較佳豬痢疾短螺旋體(B. hyodyentheriae) (6)； 結(jié)腸菌毛樣短螺旋體(B.piosicoli) (7)；豬布氏桿菌(Brucellasuis)，較佳生物變種1、 2及3(8)；經(jīng)典豬瘟病毒(9)；芽胞梭菌屬(Clostridium spp.) (10)，較佳難養(yǎng)芽胞梭菌 (Cl. difficile) (11)，A型、B型及C型產(chǎn)氣莢膜芽胞梭菌(Cl. perfringens) (12)，諾維氏芽胞梭菌(Cl. Novyi) (13)；敗血芽胞梭菌(Cl. s印ticum) (14)，破傷風(fēng)梭菌(Cl. tetani) (15)；冠狀病毒(16)，較佳豬呼吸道冠狀病毒(17)；豬附紅血球體(Eperythrozoonosis suis) (18)；豬丹毒桿菌(Erysipelothrix rhsiopathiae) (19)；大腸桿菌(Escherichia coli) (20)；豬副嗜血桿菌(Haemophilus parasuis)，較佳亞型1、7及14Ql)；血球凝集性腦脊髓炎(Hemagglutinating encephalomyelitis)病毒 Q2)；日本腦炎病毒 03)； 胞內(nèi)勞森菌(Lawsonia intracellularis) (24)；鉤端螺方寵體屬(Leptospira spp.) (25)，較佳澳洲鉤端螺旋體(Leptospira australis) (26)；犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola) (27)；感冒傷寒性鉤端螺旋體(Leptospira grippotyphosa) (28)；出血性黃疸鉤端螺方 體(Leptospira icterohaemorrhagicae) (29)；及問號(hào)鉤端螺方 體(Leptospira interrogans) (30)；波莫那鉤端螺旋體(Leptospira pomona) (31)；塔拉索夫鉤端螺旋體(Leptospiratarassovi) (32)；分枝桿菌屬(Mycobacterium spp.) (33)，較佳鳥分枝桿菌(M. avium) (34)，細(xì)胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare) (35)及牛分枝桿菌(M. bovis) (36)；豬肺炎支原體(37)；多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida) (38)；豬細(xì)胞巨大病毒(39)；豬小病毒^))；豬生殖及呼吸癥候群病毒Gl)；假性狂犬病病毒G2)；輪狀病毒G3)；沙門桿菌屬(Salmonella spp.) (44)，較佳鼠傷寒沙門桿菌(S. thyhimurium) (45) 及豬霍亂沙門桿菌(S. choleraesuis) (46)；豬葡萄球菌(Maph. hyicus) (47)；葡萄球菌屬 (Staphylococcus spp. ) (48)；較佳，鏈球菌屬(Streptococcus spp. ) (49),較佳豬鏈球菌 (50)；豬皰疹病毒(51)；豬流感病毒(52)；豬痘病毒(53)；豬痘病毒(54)；水泡性口炎病毒 (55)；豬水皰疹病毒(56)；哈德焦鉤端螺旋體(Leptospira Hardjo) (57)；及/或豬關(guān)節(jié)滑膜支原體(58)。因此，根據(jù)本發(fā)明之另一方面，本發(fā)明提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法， 其包含以下步驟i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體；及將該P(yáng)CV-2抗原與至少一種另外抗原(較佳病毒或細(xì)菌抗原，且更佳來自豬中至少一種其它致病有機(jī)體的病毒或細(xì)菌抗原)組合。較佳該P(yáng)CV-2抗原包含PCV-2之 0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，且甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第一液體， 而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2 抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa 至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳?？扇缟纤鲞M(jìn)行進(jìn)一步純化以獲得純化 PCV-2抗原。在較佳形式中，上述制備PCV-2抗原性組合物之方法進(jìn)一步包含以下步驟i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原，其中該P(yáng)CV-2抗原系經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2抗原(較佳 PCV-2 0RF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得，且其中該P(yáng)CV-2抗原包含 PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子；ii) 自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體；iii)較佳在約1至約20mM二元乙撐亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體；iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑，該中和劑量等于滅活劑之量，其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液，且其中滅活劑較佳包含BEI ；及ν)將在步驟iv)中獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。在該方法之另一方面中，該至少一種另外抗原為病毒抗原，較佳來自豬生殖及呼吸癥候群病毒之抗原。該豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒，且更佳經(jīng)修飾之活病毒，甚至更佳經(jīng)修飾之減毒活病毒。該經(jīng)修飾之豬生殖及呼吸癥候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存編號(hào)VR 2332之經(jīng)修飾之活病毒株，且更佳包含INGELVAC PRRS MLV0 因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體， 及將該P(yáng)CV-2抗原與來自豬生殖及呼吸癥候群病毒之抗原組合。該豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原較佳包含活病毒，更佳經(jīng)修飾之活病毒，且甚至更佳經(jīng)修飾之減毒活病毒。該經(jīng)修飾之豬生殖及呼吸癥候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存編號(hào)VR 2332之經(jīng)修飾之活病毒株，且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。該P(yáng)CV-2抗原較佳包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳 PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50 倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在此情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2 抗原且防止至少90 %該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90% 大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2 抗原時(shí)，此孔徑較佳。可如上所述進(jìn)行進(jìn)一步純化以獲得純化PCV-2抗原。
在本申請(qǐng)案之另一方面中，該至少一種另外抗原為細(xì)菌抗原，較佳為豬肺炎支原體。該豬肺炎支原體抗原較佳為菌苗，且該豬肺炎支原體菌苗更佳為INGELVAC MYCOFLEX。 因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體， 及將該P(yáng)CV-2抗原與細(xì)菌抗原(較佳豬肺炎支原體)組合。該豬肺炎支原體抗原較佳為菌苗，且該豬肺炎支原體菌苗更佳為INGELVAC MYC0FLEX。該P(yáng)CV-2抗原較佳包含PCV-2之 0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，且甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第一液體， 而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2 抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa 至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。可如上所述進(jìn)行進(jìn)一步純化以獲得純化 PCV-2抗原。在本申請(qǐng)案之另一方面中，該至少一種另外抗原包括病毒抗原，較佳如上所述之豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原；及細(xì)菌抗原，較佳如上所述之豬肺炎支原體抗原。該豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原較佳包含活病毒，更佳經(jīng)修飾之活病毒，且更佳包含ATCC寄存編號(hào) VR 2332之經(jīng)修飾之活病毒株，且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。該豬肺炎支原體抗原較佳為菌苗，且該豬肺炎支原體菌苗更佳為INGELVAC MYC0FLEX。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體， )自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，及將該P(yáng)CV-2抗原與病毒抗原(較佳如上所述之豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原)及細(xì)菌抗原(較佳如上所述之豬肺炎支原體抗原)組合。該豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原較佳包含活病毒，更佳經(jīng)修飾之活病毒，且更佳包含ATCC寄存編號(hào)VR 2332之經(jīng)修飾之活病毒株，且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。該豬肺炎支原體抗原較佳為菌苗，且該豬肺炎支原體菌苗更佳為INGELVAC MYC0FLEX。該P(yáng)CV-2抗原較佳包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮，較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍， 且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，且甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行該液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少 90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至 500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。可如上所述進(jìn)行進(jìn)一步純化以獲得純化PCV-2抗原。本申請(qǐng)案不僅提供制備PCV-2抗原性組合物之方法，而且系關(guān)于PCV-2抗原性組合物。因此，根據(jù)另一方面，本專利申請(qǐng)案進(jìn)一步提供一種PCV-2抗原性組合物，其特征在于當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上， 甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上，甚至更佳 3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12 個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，且最佳2年以上時(shí)，該P(yáng)CV-2抗原性組合物造成小于Ilog TCID5tl/毫升活病毒或小于llog CFU/毫升活細(xì)菌之損失。當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上，甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，且最佳2年以上時(shí)，該P(yáng)CV-2抗原性組合物更佳造成小于0. 91og TCID50/毫升活病毒或小于0.91og CFU/毫升活細(xì)菌之損失。當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上，甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，且最佳 2年以上時(shí)，該P(yáng)CV-2抗原性組合物甚至更佳造成小于0. 71og TCID50/毫升活病毒或小于 0.71og CFU/毫升活細(xì)菌之損失。當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上，甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，且最佳2年以上時(shí)， 該P(yáng)CV-2抗原性組合物更佳造成小于0. 51og TCID50/毫升活病毒或小于0. 51og CFU/毫升活細(xì)菌之損失。當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上， 甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2 個(gè)月以上，甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，且最佳2年以上時(shí)，該P(yáng)CV-2抗原性組合物甚至更佳造成小于0.31og TCID5c/毫升活病毒或小于0.31og CFU/毫升活細(xì)菌之損失。活病毒可為任何活病毒，但活病毒較佳為PRRS病毒，較佳具有ATCC寄存編號(hào)VR 2332 之PRRS病毒。活細(xì)菌可為任何細(xì)菌，但較佳為豬肺炎支原體細(xì)菌，較佳豬肺炎支原體之J 株?？山逵赡軌蛟u(píng)估活病毒之量的標(biāo)準(zhǔn)活體外滴定檢定評(píng)估TCID5tl/毫升。亦可藉由能夠評(píng)估活細(xì)菌之量的標(biāo)準(zhǔn)活體外滴定檢定測(cè)定CFU/毫升。術(shù)語“每毫升”較佳系指1毫升流體。在另一方面中，上述PCV-2抗原性組合物包含選自由以下組成之群的另一組份 醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。該另一組份較佳為佐劑，甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中該佐劑為卡波姆。較佳以每劑量約100 μ g至約IOmg之量添加佐劑。甚至更佳以每劑量約100 μ g至約IOmg之量添加佐劑。 更佳以每劑量約500 μ g至約5mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約750 μ g至約2. 5mg之量添加佐劑。最佳以每劑量約Img之量添加佐劑。本申請(qǐng)案不僅提供制備PCV-2抗原性組合物之方法及/或如上文所定義之PCV-2 抗原性組合物，其亦系關(guān)于可藉由本文所述之任何方法獲得的PCV-2抗原性組合物。因此，在另一方面中，本申請(qǐng)案系關(guān)于藉由包含以下步驟之方法獲得的PCV-2抗原性組合物 i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體。該 PCV-2抗原較佳用作PCV-2抗原性組合物或用于該P(yáng)CV-2抗原性組合物中。術(shù)語“藉由本文所提供之方法獲得的PCV-2抗原性組合物”亦意謂該P(yáng)CV-2抗原性組合物可藉由本文中所提供之方法獲得。根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案亦系關(guān)于藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體獲得的PCV-2抗原性組合物，其中該第二液體不同于該第一液體。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案系關(guān)于藉由包含以下步驟之方法獲得的PCV-2抗原性組合物，i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體，其中該第二液體不同于該第一液體。較佳地，以該第二液體交換部分該第一液體之操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原。根據(jù)另一方面，較佳藉由以下方法獲得PCV-2抗原性組合物其中使用過濾器藉由過濾步驟自PCV-2抗原移除部分該第一液體。然而，可使用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之任何其它方法(例如，離心及/或?qū)游?自PCV-2抗原移除部分第一及第二流體。然而，最佳為過濾。移除該部分第一流體之較佳過濾方法包含超濾及/或透濾。如本文所述之方法之濃縮步驟及液體添加步驟可實(shí)質(zhì)上同時(shí)或另外執(zhí)行，依次執(zhí)行該濃縮步驟與該液體添加步驟。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案系關(guān)于藉由包含以下步驟之方法獲得的PCV-2抗原性組合物，i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除部分該第一液體，其中該第二液體不同于該第一液體。較佳地，以該第二液體交換部分該第一液體之操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原，其中實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行液體添加步驟。 當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。舉例而言，在另一方面中， 該液體添加步驟在該濃縮步驟之前進(jìn)行且在一替代方面中，該濃縮步驟在該液體添加步驟之前進(jìn)行。在另一方面中，本申請(qǐng)案系關(guān)于可使用本文所述之方法獲得的PCV-2抗原性組合物，其中可多次執(zhí)行該液體添加步驟及該濃縮步驟，不管執(zhí)行該等步驟之順序如何。舉例而言，此等各別步驟之每一者可執(zhí)行至少兩次，至少三次，至少四次，至少五次，至少十次，直至所需之多次。在一方面中，該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執(zhí)行至少兩次。在另一方面中，該濃縮步驟與該液體添加步驟各自執(zhí)行至少三次。在本申請(qǐng)案之另一方面中，如上所述獲得本發(fā)明之PCV-2抗原性組合物，其中過濾為自PCV-2抗原移除一部分該第一液體或在如上所述多個(gè)移除步驟之情況下，移除一部分第一流體與第二流體之混合物的較佳方法。過濾器可為此項(xiàng)技術(shù)中之任何常規(guī)過濾器。 該過濾器較佳包括半透膜。在另一較佳形式中，該半透膜具有小于PCV-2抗原之平均孔徑， 藉此防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且由過濾器截留PCV-2抗原。在另一方面中，該過濾器具有防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)通過的平均孔徑，更佳地，該過濾器具有防止至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)通過的平均孔徑，且最佳地，該過濾器具有防止至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過的平均孔徑。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。在另一方面中，該半透膜包括選自由聚砜、聚醚砜及再生纖維素組成之群的材料。然而，可使用能夠自PCV-2抗原移除一部分第一流體且在多個(gè)方法步驟之情況下移除第一流體與第二流體之混合物的任何其它材料。 在另一方面中，該過濾器系選自由中空纖維膜超濾濾筒、平板或過濾片組成之群，以中空纖維膜超濾濾筒尤佳。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案系關(guān)于使用如上所述之方法獲得的PCV-2抗原性組合物，其中過濾器較佳為半透膜或包含半透膜。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半透膜之平均孔徑較佳防止至少 90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之 PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。如上所述，移除步驟一般包括以一部分第二流體交換部分第一流體，該交換操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中， 及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體來濃縮PCV-2抗原，其中多次(例如兩次、三次、五次、十次等)執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。較佳地，兩次，最佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。執(zhí)行本文所提供之獲得PCV-2抗原性組合物之方法之濃縮步驟，以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍。更佳地，進(jìn)行該濃縮步驟以便使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮4倍至20倍。最佳地，進(jìn)行濃縮步驟以便使PCV-2抗原與第一液體之體積相比濃縮7倍至10倍。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案系關(guān)于藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物，其中與該第一液體之體積相比，該P(yáng)CV-2抗原濃縮了 3倍至50 倍，較佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，藉由以第二液體交換部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一流體，該交換操作包含以下步驟a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體， 使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍，較佳4倍至20倍，且甚至更佳7 倍至10倍。液體添加步驟較佳與濃縮步驟實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)， 藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半透膜之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。較佳地，獲得如本文中所定義之包含純化PCV-2抗原之PCV-2抗原性組合物的進(jìn)一步純化可藉由執(zhí)行包含以下步驟之進(jìn)一步純化步驟來實(shí)現(xiàn)iii)藉由層析步驟純化在移除一部分第一液體之后獲得的包含PCV-2抗原的步驟ii)收獲物(本文所述任何方法)。 為了獲得更高純度等級(jí)，可進(jìn)行不同于第一步驟之第二層析步驟。舉例而言，若第一純化步驟/層析步驟為大小排阻(凝膠過濾)，則第二純化步驟應(yīng)不同于其，為例如親和性層析、離子交換層析等。較佳地，若純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 0RF2抗原)之第一步驟為大小排阻(凝膠過濾)層析，則第二步驟可為離子交換層析，較佳陰離子交換層析(AIEX)。用于純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之較佳陰離子交換層析基質(zhì)為Q Sepharose0 在約50ml之小規(guī)模中，最佳使用5ml HiTrap Q Sepharose HP管柱?？衫缛鐚?shí)施例3 中所述進(jìn)行陰離子交換層析。簡(jiǎn)言之，可將來自大小排阻層析步驟之約50ml空隙體積級(jí)分匯集物以3. Oml/min之流動(dòng)速率裝載于AIEX管柱上。在使用例如20mM Tris (pH 6. 5)、 5mM DTT移除未結(jié)合材料之洗滌步驟之后，可以8個(gè)管柱體積之下列緩沖液QOmM Tris (pH6. 5)、5mM DTT、1. OM NaCl)之單一步驟洗脫蛋白質(zhì)?？蓪碜訟IEX跑柱之流過物裝載回Q kpharose管柱上且如上所述進(jìn)行洗脫以提高產(chǎn)率。此兩步技術(shù)(大小排阻繼之以陰離子交換層析)將PCV-2 0RF2抗原與培養(yǎng)收獲物之大部分其它蛋白組份有效地分離。在另一方面中，由本文所述方法制備的PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經(jīng)歷該方法之該液體相比降低至少10%。更佳地，該P(yáng)CV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經(jīng)歷該方法之該第一液體相比降低至少50%。更佳地，該P(yáng)CV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經(jīng)歷該方法之該第一液體相比降低至少70%。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案系關(guān)于藉由一種包含以下步驟之方法獲得的PCV-2 抗原性組合物i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體，其中在步驟ii)之后獲得的PCV-2抗原性組合物之殺病毒活性(較佳針對(duì)PRRS 病毒)與第一液體之殺病毒活性相比降低至少10%，較佳至少50%，更佳至少70%，甚至更佳至少90%。較佳地，藉由以第二液體交換第一液體之一部分而自PCV-2抗原移除具有殺病毒活性之第一液體部分。較佳以包含以下之步驟進(jìn)行交換a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使 PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，甚至更佳7倍至10倍。如上所述，液體添加步驟較佳與濃縮步驟實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于 PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90%大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備PCV-2抗原呈全病毒或病毒樣粒子時(shí)，此孔徑較佳。可如上所述進(jìn)行進(jìn)一步純化以獲得純化之PCV-2抗原。根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案系關(guān)于藉由本文所述之方法獲得的PCV-2抗原性組合物，其中當(dāng)活病毒(較佳PRRSV)或活細(xì)菌(較佳豬肺炎支原體)與PCV-2抗原性組合物混合且一起培育2小時(shí)或2小時(shí)以上，較佳4小時(shí)以上，甚至更佳12小時(shí)以上，甚至更佳M小時(shí)以上，甚至更佳2天以上，甚至更佳4天以上，甚至更佳7天以上，甚至更佳2周以上，甚至更佳4周以上，甚至更佳2個(gè)月以上，甚至更佳3個(gè)月以上，甚至更佳4個(gè)月以上，甚至更佳6個(gè)月以上，甚至更佳9個(gè)月以上，甚至更佳12個(gè)月以上，甚至更佳18個(gè)月以上，且最佳 2年以上時(shí)，該P(yáng)CV-2抗原性組合物造成小于llog TCID5tl(較佳/毫升)，較佳小于0. 91og TCID50 (較佳/毫升)，甚至更佳小于0. 71og TCID50 (較佳/毫升)，甚至更佳小于0. 51og TCID5tl (較佳/毫升)，最佳小于0.31og TCID5tl (較佳/毫升)活病毒(較佳活PRRSV)或小于llog CFU (較佳/毫升)，較佳小于0. 91og CFU (較佳/毫升)，甚至更佳小于0. 71og CFU (較佳/毫升)，甚至更佳小于0.51og CFU (較佳/毫升)，最佳小于0.31og CFU (較佳 /毫升)活細(xì)菌(較佳豬肺炎支原體)之損失?；畈《究蔀槿魏位畈《荆畈《据^佳為 PRRS病毒，較佳具有ATCC寄存編號(hào)VR 2332之PRRS病毒?；罴?xì)菌可為任何細(xì)菌，但較佳為豬肺炎支原體細(xì)菌，較佳豬肺炎支原體之J-菌株?？山逵赡軌蛟u(píng)估活病毒之量的標(biāo)準(zhǔn)活體外滴定檢定評(píng)估TCID5tl/毫升。亦可藉由能夠評(píng)估活細(xì)菌之量的標(biāo)準(zhǔn)活體外滴定檢定測(cè)定 CFU/毫升。術(shù)語“每毫升”或“/毫升”較佳系指1毫升流體。
在另一方面中，本專利申請(qǐng)案系關(guān)于藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物， 上述方法進(jìn)一步包含收獲步驟ii)之后剩余的PCV-2抗原之步驟?？梢匀魏纬Ｒ?guī)方式進(jìn)行此收獲操作。在一尤佳收獲方式中，經(jīng)由過濾步驟自該P(yáng)CV-2抗原移除部分該第一液體且自過濾器阻滯物回收或收獲PCV-2抗原。在另一方面中，將藉由本文所述之任何方法獲得的PCV-2抗原性組合物與選自由以下組成之群的另一組份混合醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。該另一組份較佳為佐劑，甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中該佐劑為卡波姆。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物，該方法進(jìn)一步包含以下步驟將藉由本文所述之方法獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。該另一組份較佳為佐劑，甚至更佳其中該佐劑為丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物，且更佳其中該佐劑為卡波姆。較佳以每劑量約IOOyg至約IOmg之量添加佐劑。甚至更佳以每劑量約100 μ g至約IOmg之量添加佐劑。更佳以每劑量約500 μ g至約5mg之量添加佐劑。更佳以每劑量約 750 μ g至約2. 5mg之量添加佐劑。最佳以每劑量約Img之量添加佐劑。在另一方面中，上述PCV-2抗原性組合物包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。因此，根據(jù)本申請(qǐng)案之另一方面，本申請(qǐng)案提供藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物，其中該P(yáng)CV-2抗原包含PCV-2之0RF-2 蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。如上所述，本文所述之方法中使用的PCV-2抗原可藉由此項(xiàng)技術(shù)中已知之任何方法獲得。較佳地，PCV-2抗原系經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得。在較佳形式中，該P(yáng)CV-2抗原系根據(jù) W02006/072065(其教示及內(nèi)容先前以引用的方式并入)中所述之程序獲得。因此，根據(jù)本申請(qǐng)案之另一方面，本申請(qǐng)案提供藉由上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物，其中該P(yáng)CV-2 抗原系經(jīng)由含有及表達(dá)PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF-2)之病毒載體(較佳重組桿狀病毒病毒載體)獲得，且其中該P(yáng)CV-2抗原包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2 蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。在本申請(qǐng)案之另一方面中，PCV-2抗原性組合物系藉由上述方法獲得且該方法進(jìn)一步包含較佳在約1至約20mM 二元乙撐亞胺存在下以DNA滅活劑滅活該重組桿狀病毒病毒載體之步驟。在較佳形式中，該方法進(jìn)一步包含添加一定量之中和該DNA滅活劑之試劑， 該量等于該DNA滅活劑之量，其中中和DNA滅活劑之試劑包含濃縮至約1至約20mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液，且其中該DNA滅活劑為BEI。較佳在自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體之后執(zhí)行該滅活步驟。在本申請(qǐng)案之另一方面中，PCV-2抗原性組合物系藉由上述方法獲得，該方法進(jìn)一步包含混合在滅活及中和步驟之后獲得的PCV-2抗原之步驟。因此，根據(jù)另一方面，本申請(qǐng)案提供藉由包含以下步驟之上述方法獲得的PCV-2抗原性組合物i)獲得在第一液體中之 PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體；iii)較佳在約1至約20mM二元乙撐亞胺存在下以DNA滅活劑滅活重組桿狀病毒病毒載體；iv)添加一定量之中和該滅活劑之中和劑，該中和劑量等于滅活劑之量，其中中和劑較佳包含較佳濃縮至約1至約20mM之最終濃度的硫代硫酸鈉溶液且其中滅活劑較佳包含BEI ；及(較佳)步驟ν)，包含將步驟 iv)中獲得的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、 佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。在本申請(qǐng)案之另一方面中，較佳藉由上述方法獲得的上述PCV-2抗原性組合物進(jìn)一步包含至少一種另外抗原，較佳病毒或細(xì)菌抗原，且更佳來自豬中至少一種其它致病有機(jī)體的病毒或細(xì)菌抗原。在另一方面中，該至少一種另外抗原為豬生殖及呼吸癥候群病毒。該豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒，且更佳包含經(jīng)修飾之活病毒。 該經(jīng)修飾之豬生殖及呼吸癥候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存編號(hào)VR 2332之經(jīng)修飾之活病毒株，且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。在本申請(qǐng)案之另一方面中，該至少一種另外抗原為豬肺炎支原體。該豬肺炎支原體抗原較佳為菌苗，且該豬肺炎支原體菌苗更佳為 INGELVAC MYCOFLEX。在本申請(qǐng)案之另一方面中，較佳藉由上述方法獲得的上述PCV-2抗原性組合物進(jìn)一步包含豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原，較佳經(jīng)修飾之豬生殖及呼吸癥候群活病毒，更佳具有ATCC寄存編號(hào)VR 2332之豬生殖及呼吸癥候群病毒，或在INGELVAC PRRS MLV或INGELVAC PRRS ATP中所包括的豬生殖及呼吸癥候群病毒。在本申請(qǐng)案之另一方面中，較佳藉由上述方法獲得的上述PCV-2抗原性組合物進(jìn)一步包含豬肺炎支原體， 較佳豬肺炎支原體菌苗，且更佳INGELVAC MYC0FLEX或INGELVAC MYC0FLEX中所包括的豬肺炎支原體菌苗。在另一方面中，本文所述之PCV-2抗原性組合物包含豬生殖及呼吸癥候群病毒，較佳上述彼等任一者；及豬肺炎支原體，較佳上述彼等任一者。當(dāng)包含至少一種來自如上所述豬中至少一種其它致病有機(jī)體的另外抗原(較佳豬生殖及呼吸癥候群病毒及/或豬肺炎支原體抗原)之PCV-2抗原性組合物藉由本文所述之方法獲得時(shí)，該方法包含以下步驟i)獲得在第一液體中之PCV-2抗原；ii)自PCV-2抗原移除至少一部分該第一液體；及將該P(yáng)CV-2抗原與至少一種另外抗原，較佳病毒或細(xì)菌抗原，且更佳來自豬中至少一種其它致病有機(jī)體的病毒或細(xì)菌抗原混合。較佳該P(yáng)CV-2抗原包含PCV-2之0RF-2蛋白，更佳PCV-2之重組0RF-2蛋白，且更佳0RF-2蛋白之病毒樣粒子。較佳地，藉由以第二液體交換一部分第一液體自PCV-2抗原移除該部分第一液體。較佳以包含以下步驟之方式進(jìn)行交換操作a)將該第二液體添加至含有PCV-2抗原之該第一液體中，及b)藉由自PCV-2抗原移除一部分該第一及第二液體，使PCV-2抗原與該第一液體之體積相比濃縮較佳3倍至50倍，甚至更佳4倍至20倍，且甚至更佳7倍至10倍。較佳地，多次，較佳兩次，甚至更佳三次執(zhí)行液體添加步驟及濃縮步驟。在該等情況下，不僅移除第一液體，而且移除第一液體與第二液體之混合物。較佳地，如上所述，實(shí)質(zhì)上同時(shí)或依次執(zhí)行各液體添加步驟。當(dāng)依次執(zhí)行濃縮步驟及液體添加步驟時(shí)，步驟之順序無關(guān)緊要。此外，較佳使用過濾器(其較佳含有半透膜)，藉由過濾(較佳藉由透濾及/或超濾)進(jìn)行濃縮步驟。該半透膜較佳具有小于PCV-2抗原且防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將PCV-2抗原截留在過濾器內(nèi)以便收獲或回收之平均孔徑。半透膜或本文中所用任何其它過濾器之平均孔徑較佳防止至少90%大小為50kDa至500kDa之蛋白質(zhì)，更佳至少90% 大小為75kDa至400kDa之蛋白質(zhì)，且最佳至少90%大小為IOOkDa至300kDa之蛋白質(zhì)通過。當(dāng)制備呈全病毒或病毒樣粒子之PCV-2抗原時(shí)，此孔徑較佳。如上文所定義之本發(fā)明提供制備PCV-2抗原及包含PCV-2抗原之免疫原性組合物的新方法，其中PCV-2抗原展示降低殺病毒活性及/或提高免疫原性(各自如本文中所定義)，其中該方法包含以下步驟i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體，ii)自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體。此外，本發(fā)明亦提供PCV-2抗原以及包含該P(yáng)CV-2抗原之免疫原性組合物，該P(yáng)CV-2抗原展示降低殺病毒活性及/或提高免疫原性(各自如本文中所定義)。根據(jù)另一方面，PCV-2抗原以及包含展示降低殺病毒活性及/或提高免疫原性之純化PCV-2抗原之免疫原性組合物可另外藉由下列方法(II)獲得。本發(fā)明之純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 0RF2抗原)可藉由純化PCV-2病毒制劑，尤其藉由純化全病毒獲得。 全病毒制劑描述于例如WO 99/18214或WO 03/049703中。此外，純化PCV-2抗原亦可藉由純化重組表達(dá)之PCV-2抗原，較佳藉由純化重組PCV-2 0RF2抗原獲得。制備重組PCV-2抗原(較佳制備重組PCV-2 0RF2抗原)之表達(dá)系統(tǒng)在此項(xiàng)技術(shù)中熟知且包括(但不限于) 細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)。表達(dá)PCV-2抗原之載體及制造及/或使用該等載體(或重組體)之方法在本申請(qǐng)案中別處描述。較佳細(xì)胞為彼等易受含有PCV-2 0RF2 DNA且表達(dá)PCV-2 0RF2蛋白的適當(dāng)重組病毒載體感染之細(xì)胞。細(xì)胞較佳為昆蟲細(xì)胞，且其更佳包括以商標(biāo)SF+昆蟲細(xì)胞(Protein Sciences Corporation，Meriden，CT)出售之昆蟲細(xì)胞。較佳細(xì)胞培養(yǎng)物具有介于約 0. 3-2. 0 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升，更佳約0. 35-1. 9 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升，更佳約0. 4-1. 8 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升，甚至更佳約0. 45-1. 7 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升，且最佳約0. 5-1. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升之間的細(xì)胞計(jì)數(shù)。較佳之病毒載體包括桿狀病毒,諸如BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego，CA)，尤其只要該等生產(chǎn)細(xì)胞為昆蟲細(xì)胞。雖然桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)較佳，但熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者應(yīng)了解其它表達(dá)系統(tǒng)(包括上述彼等)將用于本發(fā)明之目的，亦即用于表達(dá) PCV-2 0RF2 抗原。適當(dāng)生長(zhǎng)培養(yǎng)基亦將由熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者確定，較佳之生長(zhǎng)培養(yǎng)基為不含血清之昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基，諸如 Excell 420 (JRH Biosciences, Inc.，Lenexa, KS)等等。含有PCV-2 0RF2 DNA序列之重組病毒載體當(dāng)用于感染易感細(xì)胞時(shí)具有介于約 0. 03-1. 5，更佳約0. 05-1. 3，更佳約0. 09-1. 1，且最佳約0. 1-1. 0之間的較佳感染倍率 (MOI)。上述MOI較佳系指1毫升細(xì)胞培養(yǎng)流體。本文所述之方法較佳包含以含有PCV-2 0RF2 DNA且表達(dá)PCV-2 0RF2抗原蛋白之重組病毒載體感染0. 35-1. 9 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升， 更佳約0. 4-1. 8X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升，甚至更佳約0. 45-1. 7X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升且最佳約 0. 5-1. 5 X IO6個(gè)細(xì)胞/毫升，該重組病毒載體之MOI (感染倍率)介于約0. 03-1. 5，更佳約 0. 05-1. 3，更佳約0. 09-1. 1，且最佳約0. 1-1. 0之間。接著培育受感染細(xì)胞至多10天時(shí)間，更佳約2天至約10天，更佳約4天至約9天， 且最佳約5天至約8天。較佳培育條件包括約22-32°C，更佳約M-30°C，更佳約25-29°C， 甚至更佳約^_28°C，且最佳約27°C之溫度。較佳地，在接種之后觀察SF+細(xì)胞之特征性桿狀病毒誘導(dǎo)之變化。該觀察可包括監(jiān)測(cè)感染后期間細(xì)胞密度趨勢(shì)及生存率降低。發(fā)現(xiàn)在感染之后3-5天觀察到病毒滴度峰值且在感染后5至8天及/或當(dāng)細(xì)胞生存率降低至小于 10%時(shí)細(xì)胞中PCV-2 0RF2抗原產(chǎn)生達(dá)到峰值?？山逵墒炝?xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之標(biāo)準(zhǔn)方法，例如藉由ftOtein purification methods-a practical approach (Ε· L. V. Harris 及 S. Angal,編者，IRL Press at Oxford University Press)中所述之彼等方法由收獲物純化PCV_2 0RF2抗原。彼等方法包括(但不限于)藉由離心及/或過濾進(jìn)行分離、沉淀、大小排阻(凝膠過濾)層析、親和性層析、金屬螯合物層析、離子交換層析、共價(jià)層析、疏水性相互作用層析等。PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之回收方法較佳以經(jīng)由分離步驟將細(xì)胞碎片與已表達(dá)之PCV-2 0RF2抗原分離開始。較佳分離步驟包括過濾、在至多約20，OOOXg 之速度下離心、連續(xù)流動(dòng)離心、使用離子交換或凝膠過濾進(jìn)行層析分離及常規(guī)免疫親和方法。熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者由例如(E. L.V.Harris 及 S. Angel (編者)，Protein purification methods-a practical approach, IRL Press Oxford 1995)已知彼等方法。最佳分離方法包括在至多約20，000Xg之速度下離心及過濾。較佳過濾方法包括死端型微過濾及切向流動(dòng)(或交叉流動(dòng))過濾，包括中空纖維過濾死端型微過濾。在此等過濾方法中，死端型微過濾較佳。死端型微過濾之較佳孔徑介于約0. 30-1. 35 μ m之間，更佳介于約0. 35-1. 25 μ m 之間，更佳介于約0. 40-1. 1 μ m之間，且最佳介于約0. 45-1. 0 μ m之間。咸信任何常規(guī)濾膜將用于本發(fā)明之目的且聚醚砜膜較佳。在過濾步驟期間移除任何低分子量核酸物質(zhì)。PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之進(jìn)一步純化可藉由層析程序(較佳兩步層析程序)實(shí)現(xiàn)。然而，若裝載材料不包含細(xì)胞碎片，則亦可以層析程序起始。若PCV-2抗原裝配至病毒樣粒子(VLP)中，則第一步驟較佳為大小排阻(凝膠過濾)層析，其可例如藉由S300基質(zhì)進(jìn)行。在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模下，最佳使用 HiPrep 26/60 Sephacryl S300HR管柱。然而，可使用熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之任何其它大小排阻層析基質(zhì)，其能夠自培養(yǎng)濾液或上清液中分離出PCV-2 0RF2 VLP。合適之基質(zhì)描述于例如 E. L. V. Harris 及 S. Angel (編者)，Protein purification methods-a practical approach, IRL Press Oxford 1995)中?？衫缃逵梢?. OmL/min之流動(dòng)速率用包含PCV-2 抗原之粗制劑裝載管柱且以1. 5個(gè)管柱體積的包含20mMTris(pH 6. 5)、5mM DTT之緩沖液洗脫管柱來進(jìn)行凝膠過濾層析。然而，亦可藉由使用親和性層析，例如，經(jīng)由選擇性結(jié)合至已固定化PCV-2 0RF2特異性抗體或熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之任何其它方法純化PCV-2 0RF2 抗原。因此，根據(jù)一較佳實(shí)施方案，包含純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 0RF2抗原) 及佐劑之免疫原性組合物可藉由包含以下步驟之方法獲得a)在宿主細(xì)胞中表達(dá)PCV-2抗原，較佳PCV-2 0RF2抗原；b)收獲獲得PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之細(xì)胞培養(yǎng)物；c)藉由大小排阻層析(凝膠過濾)純化包含PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原) 之收獲物；d)將純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)與佐劑混合。根據(jù)一較佳實(shí)施方案，如本文所述，較佳如實(shí)施例3中所述執(zhí)行大小排阻層析。較佳地，大小排阻產(chǎn)生具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)超過80% (w/w)，較佳超過90% (w/w)純度等級(jí)之免疫原性組合物?？稍谑褂肗uPAGE MOPS 緩沖系統(tǒng)(Invitrogen)，經(jīng)由 NuPAGE 10% Bis-Tris 凝膠(Invitrogen)進(jìn)行 SDS PAGE 之后，藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評(píng)估純度等級(jí)。為了獲得更高純度等級(jí)，可進(jìn)行不同于第一步驟之第二層析步驟。舉例而言，若第一純化步驟/層析步驟為大小排阻(凝膠過濾)，則第二步驟應(yīng)不同于其，為例如親和性層析、離子交換層析等。
較佳地，若純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 0RF2抗原)之第一步驟為大小排阻 (凝膠過濾)層折，則第二步驟可為離子交換層折，較佳陰離子交換層析(AIEX)。用于純化 PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之較佳陰離子交換層析基質(zhì)為Q Sepharose0在約 50ml之小規(guī)模中，最佳使用5ml HiTrap Q Sepharose HP管柱?？衫缛鐚?shí)施例3中所述進(jìn)行陰離子交換層折。簡(jiǎn)言之，可將來自大小排阻層析步驟之約50ml空隙體積級(jí)分匯集物以3. Oml/min之流動(dòng)速率裝載于AIEX管柱上。在使用例如20mM Tris (pH 6. 5)、5mM DTT移除未結(jié)合材料之洗滌步驟之后，可以8個(gè)管柱體積之下列緩沖液OOmM Tris (pH 6. 5)、5mM DTTU.OM NaCl)之単一步驟洗脫蛋白質(zhì)?？蓪碜訟IEX跑柱之流過物裝載回Q Sepharose 管柱上且如上所述進(jìn)行洗脫以提高產(chǎn)率。此兩步技術(shù)(大小排阻繼之以陰離子交換層折) 將PCV-2 0RF2抗原與培養(yǎng)收獲物之大部分其它蛋白組份有效地分離。因此，根據(jù)ー較佳實(shí)施方案，包含純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)及佐劑之免疫原性組合物可藉由包含以下步驟之方法獲得a)在宿主細(xì)胞中表達(dá)PCV-2抗原，較佳PCV_2 0RF2抗原；b)收獲獲得PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之細(xì)胞培養(yǎng)物；c)藉由大小排阻層折(凝膠過濾)，繼之以陰離子交換層析純化包含PCV-2抗原 (較佳PCV-2 0RF2抗原)之收獲物；d)將純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)與佐劑混合。根據(jù)ー較佳實(shí)施方案，如本文所述，較佳如實(shí)施例3中所述執(zhí)行大小排阻層析及陰離子交換層折。較佳地，兩步純化策略產(chǎn)生具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)超過90% (w/w)，較佳超過95% (w/w)純度等級(jí)之免疫原性組合物?？稍谑褂肗uPAGE MOPS緩沖系統(tǒng)Qnvitrogen)，經(jīng)由NuPAGE 10% Bis-Tris凝膠 (Invitrogen)進(jìn)行 SDS PAGE 之后，藉由 Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評(píng)估純度等級(jí)。如上所述，PCV-2抗原(較佳PCV 0RF2抗原)之回收方法以經(jīng)由分離步驟將細(xì)胞碎片與已表達(dá)之PCV-2 0RF2抗原分離開始。較佳分離步驟包括經(jīng)由具有約0.6μπι至約 2 μ m之孔徑，較佳具有約0. 8mm至約1. 2 μ m之孔徑的過濾器進(jìn)行微過濾。因此，包含純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)及佐劑之免疫原性組合物可藉由包含以下步驟之方法獲得a)在宿主細(xì)胞中表達(dá)PCV-2抗原，較佳PCV-2 0RF2抗原； b)收獲獲得PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之細(xì)胞培養(yǎng)物；c)經(jīng)由具有0.6至2.0 μ m之孔徑的過濾器過濾在步驟b)獲得的收獲物；d)藉由大小排阻層折(凝膠過濾)，視情況繼之以陰離子交換層析純化包含PCV-2 抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)且在步驟c)獲得之濾液；并e)將純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)與佐劑混合。根據(jù)ー較佳實(shí)施方案，如本文所述，較佳如實(shí)施例3中所述執(zhí)行微過濾、大小排阻層析及陰離子交換層折。較佳地，包括預(yù)過濾步驟的兩步純化策略產(chǎn)生具有以在與佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)超過90% (w/w)，較佳超過95% (w/ w)純度等級(jí)之免疫原性組合物?？稍谑褂肗uPAGE MOPS緩沖系統(tǒng)anvitrogen)，經(jīng)由 NuPAGE 10% Bis-Tris 凝膠(Invitrogen)進(jìn)行 SDS PAGE 之后，藉由 Imperial ProteinStain(Pierce)染色來評(píng)估純度等級(jí)。包含純化PCV-2抗原(較佳本文所述之純化PCV-2 0RF2抗原)之免疫原性組合物(較佳可藉由本文所述之方法獲得者)之特征在于與不包含該純化PCV-2抗原或純化 PCV-2 0RF2抗原之免疫原性組合物相比提高的免疫原性。若使用諸如重組痘病毒、腺病毒或桿狀病毒之病毒載體制備PCV-2抗原(較佳 PCV-2 0RF2抗原)，則建議藉由適當(dāng)滅活處理來滅活病毒核酸。該滅活可在純化PCV-2抗原 (較佳PCV-2 0RF2抗原)期間的任何時(shí)間進(jìn)行。因此，滅活可在收獲包含PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之細(xì)胞培養(yǎng)流體之后，或在微過濾PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之后(若進(jìn)行微過濾)，在純化步驟之前或之后，例如在凝膠過濾之前或之后，且在陰離子交換層析之前或之后(若進(jìn)行此操作)進(jìn)行。任何常規(guī)滅活方法可用于本發(fā)明之目的。因此，可藉由化學(xué)及/或物理處理執(zhí)行滅活。在較佳形式中，測(cè)定收獲流體之體積且使溫度介于約32°C -42°C，更佳約34°C -40°C， 且最佳約35°C _39°C之間。較佳滅活方法包括添加較佳濃度為約1至約20mM，較佳約2至約 IOmM,更佳約2至約8mM，更佳約3至約7mM，最佳約5mM之環(huán)化ニ元乙撐亞胺(BEI)。舉例而言，滅活包括向流體中添加較佳約0. 4M之2-溴乙烯胺氫溴酸鹽(BEA)(其已環(huán)化為0. 2M ニ元乙撐亞胺(BEI))于0.3N NaOH中之溶液以得到約5mM BEI之最終濃度。較佳接著連續(xù)攪拌流體2-96小時(shí)且可將滅活收獲流體冷凍儲(chǔ)存于-40°C或-40°C以下或約1°C _7°C之間。在完成滅活之后，添加較佳1. OM之硫代硫酸鈉溶液以中和任何剰余BEI。較佳添加與在滅活之前添加的BEI相比等量的硫代硫酸鈉。舉例而言，若添加BEI至5mM之最終濃度， 則添加1. OM硫代硫酸鈉溶液以得到5mM之最終最小濃度，以中和任何剰余BEI。在將純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)與佐劑混合之前，亦建議使純化 PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)相對(duì)于磷酸鹽緩沖鹽水(pH 7. 4)或任何其它生理緩沖液透析。上述方法產(chǎn)生具有如本文中所定義之降低殺病毒活性以及改良免疫原性之PCV-2 抗原，倘若該P(yáng)CV-2抗原具有以在與任何佐劑混合之前免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)超過50% (w/w)，較佳超過70% (w/w)，甚至更佳超過80% (w/w)，甚至更佳超過 85% (w/w)，甚至更佳超過90% (w/w)，最佳超過95% (w/w)之純度等級(jí)。然而，可根據(jù)方法II獲得的純化PCV-2抗原亦可與佐劑(較佳與本文所述之任何佐劑)混合且一起使用。 較佳佐劑為卡波莫，其較佳濃度為約0. 1至10mg/mL，更佳濃度為0. 5至5mg/mL，最佳為約 lmg/mL最終免疫原性組合物。再者，本發(fā)明不僅提供本文所述之任何方法(包括替代性方法II)，其亦提供可藉由本文所述之任何方法(包括替代性方法II)獲得的PCV-2抗原，較佳純化PCV-2抗原，最佳純化PCV-2 0RF-2蛋白。此外，本發(fā)明亦提供可藉由本文所述之任何方法(包括替代性方法II)獲得的包含PCV-2抗原(較佳純化PCV-2抗原，最佳純化PCV-2 0RF-2蛋白)之 PCV-2抗原性組合物。在最終免疫原性組合物中的PCV-2抗原(詳言之純化PCV-2 0RF2抗原)之量以最終免疫原性組合物計(jì)應(yīng)在每劑量約0. 25至約400 μ g之范圍內(nèi)。較佳地，最終免疫原性組合物應(yīng)包括含量在每劑量約2至約200 μ g，甚至更佳每劑量約3至約150 μ g， 更佳每劑量約4至約100 μ g，更佳每劑量約5至約80 μ g，更佳每劑量約6至約60 μ g，甚至更佳每劑量約7至約50 μ g，甚至更佳每劑量約8至約40 μ g，更佳每劑量約8至約32 μ g，甚至更佳每劑量約8至約M μ g且最佳每劑量約8至約16 μ g范圍內(nèi)之PCV-2抗原，較佳 PCV-2 0RF2 抗原。本文所提供之免疫原性組合物(包括彼等可藉由方法II獲得者)包含一或多種來自另一致病有機(jī)體的另外抗原。上文定義彼等“另一致病有機(jī)體”。該另外抗原較佳為豬生殖及呼吸癥候群病毒。該豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原甚至更佳包含活病毒，且更佳包含經(jīng)修飾之活病毒。該經(jīng)修飾之豬生殖及呼吸癥候群活病毒抗原更佳包含ATCC寄存編號(hào) VR 2332之經(jīng)修飾之活病毒株，且更佳包含INGELVAC PRRS MLV。在本申請(qǐng)案之另一方面中，該另外抗原為豬肺炎支原體。該豬肺炎支原體抗原較佳為菌苗，且該豬肺炎支原體菌苗更佳為INGELVAC MYCOFLEX。最佳為豬生殖及呼吸癥候群病毒與豬肺炎支原體兩種抗原的組合。由于包括本文所提供之純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 0RF2抗原)之免疫原性組合物的免疫原性提高，所以與不接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比，該免疫原性組合物可用于降低或減輕由PCV-2感染所引起或與PCV-2感染相關(guān)的臨床征象之發(fā)生率或嚴(yán)重程度。術(shù)語“臨床征象之發(fā)生率降低或嚴(yán)重程度減輕”應(yīng)意謂接受疫苗投藥之動(dòng)物與動(dòng)物“對(duì)照組”相比，該等征象中之任一者的發(fā)生率降低或嚴(yán)重程度減輕，兩種動(dòng)物均已受產(chǎn)生免疫活性組份的病原體感染或攻毒且其中對(duì)照組并未接受疫苗或免疫原性組合物之投藥。在此情況下，術(shù)語“減輕”或“降低”意謂與不接種疫苗之對(duì)照組相比，已接種疫苗組有至少10 %，較佳25 %，甚至更佳50 %，最佳超過100 %的降低。如本文中所用，“臨床癥狀”或“臨床征象”系指可由活動(dòng)物直接觀察到的病原體感染之征象，諸如癥狀。代表性實(shí)例將視所選病原體而定，可包括諸如流涕、嗜睡、咳嗽、發(fā)燒、 體重増加或減輕、脫水、腹瀉、腫脹、跛行等等。PCV-2臨床征象可包括消痩、皮膚蒼白、身體憔悴、呼吸窘迫、腹瀉、黃疸及膿病。動(dòng)物由PCV-2感染引起或與PCV-2感染相關(guān)的臨床征象之發(fā)生率降低或嚴(yán)重程度減輕可藉由向需要該處理之動(dòng)物僅施用單劑量之該免疫原性組合物而實(shí)現(xiàn)。然而，本文所提供之免疫原性組合物亦可以兩個(gè)或兩個(gè)以上劑量施用，首次劑量與任何后續(xù)劑量之施用間隔時(shí)間為2至4周。因此，根據(jù)另ー實(shí)施方案，可向有需要之動(dòng)物以ー個(gè)、兩個(gè)或兩個(gè)以上劑量施用本文所提供之包括純化PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 0RF2抗原)的免疫原性組合物。詳言之，在本申請(qǐng)案之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物當(dāng)向動(dòng)物施用時(shí)使動(dòng)物之淋巴流失及炎癥與不接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕至少80%。因此，在本申請(qǐng)案之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物且該免疫原性組合物使已接受該免疫原性組合物投藥之動(dòng)物的淋巴流失及炎癥與不接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕至少 80%。在本申請(qǐng)案之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物當(dāng)向動(dòng)物施用時(shí)使動(dòng)物之肺病變與不接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕至少80%。因此，在本申請(qǐng)案之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2 抗原性組合物的免疫原性組合物且該免疫原性組合物使已接受該免疫原性組合物投藥之動(dòng)物的肺病變與不接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕至少80%。在本發(fā)明之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物之免疫原性組合物，其中在施用ー個(gè)劑量之該免疫原性組合物之后，該免疫原性組合物誘導(dǎo)針對(duì)PCV-2 之保護(hù)性免疫反應(yīng)。包含PCV-2抗原性組合物之免疫原性組合物可為任何體積，包括1ml、 aiil、;3ml、％il、5ml及5ml以上。在較佳形式中，2ml該免疫原性組合物包含ー個(gè)劑量之該 PCV-2抗原。因此，在本發(fā)明之另一方面中，提供如上所述之免疫原性組合物，其中在施用一個(gè)劑量之該免疫原性組合物之后，包含PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合物誘導(dǎo)針對(duì) PCV-2之保護(hù)性免疫反應(yīng)。在另一方面中，2ml該免疫原性組合物包含ー個(gè)劑量之該P(yáng)CV-2 抗原。如本文中所用，“保護(hù)性免疫反應(yīng)”系指相關(guān)病原體感染之臨床、病理學(xué)或組織病理學(xué)征象或癥狀的發(fā)生率降低或嚴(yán)重程度減輕，直至且包括完全預(yù)防該等征象或癥狀。 術(shù)語“病理學(xué)”征象系指在顯微鏡或分子層面上經(jīng)由生物化學(xué)試驗(yàn)，或尸檢時(shí)肉眼可觀察之感染征象。對(duì)于PCV-2而言，病理學(xué)征象將包括多個(gè)組織及器官上顯微鏡及肉眼可見的病變，淋巴器官為最常見之病變部位。術(shù)語“病理組織學(xué)”征象系指由感染引起的組織變化之征象。術(shù)語“臨床癥狀”或“臨床征象”由上文定義。在本發(fā)明之另一方面中，提供如上所述之包含PCV-2抗原性組合物及PRRRS抗原 (較佳本文所述之任一 PRRS抗原)的免疫原性組合物，其中在施用ー個(gè)劑量之該免疫原性組合物之后，該免疫原性組合物誘導(dǎo)針對(duì)PRRS病毒之保護(hù)性免疫反應(yīng)。再者，可制備任何劑量體積，但在較佳形式中，2ml該免疫原性組合物包含ー個(gè)劑量之該P(yáng)RRS抗原及ー個(gè)劑量之該P(yáng)CV-2抗原。因此，在本發(fā)明之另一方面中，提供如上所述之包含PRRSV及如本文所述之PCV-2抗原性組合物的免疫原性組合物，其中在施用ー個(gè)劑量之該免疫原性組合物之后，該免疫原性組合物誘導(dǎo)針對(duì)PRRS之保護(hù)性免疫反應(yīng)。在另一方面中，2ml該免疫原性組合物包含ー個(gè)劑量之該P(yáng)RRS抗原及ー個(gè)劑量之該P(yáng)CV-2抗原。在本發(fā)明之另一方面中，提供包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如上所述之豬肺炎支原體抗原的免疫原性組合物，其中在施用ー個(gè)劑量之該免疫原性組合物之后， 該免疫原性組合物誘導(dǎo)針對(duì)豬肺炎支原體之保護(hù)性免疫反應(yīng)。再者，可制備任何劑量體積， 但在較佳形式中，2ml該免疫原性組合物包含一個(gè)劑量之該豬肺炎支原體抗原及一個(gè)劑量之PCV-2抗原。因此，在本發(fā)明之另一方面中，提供如上所述之免疫原性組合物，其中在施用一個(gè)劑量之包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及豬肺炎支原體抗原之該免疫原性組合物之后，該免疫原性組合物誘導(dǎo)針對(duì)豬肺炎支原體之保護(hù)性免疫反應(yīng)。在另一方面中， 2ml該免疫原性組合物包含一個(gè)劑量之該豬肺炎支原體抗原。在本申請(qǐng)案之另一方面中，如上所述之免疫原性組合物制備成每劑量施用2毫升。在本申請(qǐng)案之另一方面中，提供一種使動(dòng)物PCV-2感染之一或多種臨床癥狀與不接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕的方法。一般而言，該方法包含向動(dòng)物施用任一包含如上所述之PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合物的步驟。較佳地，在施用單劑量之該免疫原性組合物之后PCV-2感染之一或多種臨床癥狀減輕。因此，根據(jù)本申請(qǐng)案之另ー 方面，提供一種使動(dòng)物PCV-2感染之一或多種臨床癥狀與不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕的方法。一般而言，該方法包含向動(dòng)物施用任一包含上述PCV-2抗原性組合物之該免疫原性組合物的步驟，其中較佳在施用單劑量之包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物的該免疫原性組合物之后PCV-2感染之一或多種臨床癥狀減輕。在本申請(qǐng)案之另一方面中，提供一種使動(dòng)物PRRS感染之一或多種臨床癥狀與不接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕的方法。一般而言，該方法包含向動(dòng)物施用任一上述包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之PRRS病毒的該免疫原性組合物的步驟。較佳地，在施用單劑量之包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之 PRRS病毒的該免疫原性組合物之后PRRS感染之一或多種臨床癥狀減輕。因此，根據(jù)本申請(qǐng)案之另一方面，提供一種使動(dòng)物PRRS感染之一或多種臨床癥狀與不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之PRRS病毒的該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕的方法。豬生殖及呼吸癥候群病毒(PRRSV)之臨床征象包括(但不限干)食欲不振、發(fā)熱、流產(chǎn)、短暫變色、乏情期延長(zhǎng)、咳嗽、呼吸征象、乳房炎、無乳、嗜睡、木乃伊化仔豬、死產(chǎn)、新生仔豬虛弱、母豬產(chǎn)仔率減少、早產(chǎn)、腹瀉、消痩、打噴嚏、眼分泌物、皮膚蒼白、死亡及其組合。在本申請(qǐng)案之另一方面中，提供一種使動(dòng)物豬肺炎支原體感染之一或多種臨床癥狀與不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之豬肺炎支原體抗原的該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕的方法。一般而言，該方法包含向動(dòng)物施用任一上述該免疫原性組合物的步驟。較佳地，在施用單劑量之包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之豬肺炎支原體抗原之該免疫原性組合物之后豬肺炎支原體感染之一或多種臨床癥狀減輕。因此，根據(jù)本申請(qǐng)案之另一方面，提供一種使動(dòng)物豬肺炎支原體感染之一或多種臨床癥狀與不接受包含如本文所述之PCV-2抗原性組合物及如本文所述之豬肺炎支原體抗原的該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕的方法。豬肺炎支原體(M. hyo)感染之臨床癥狀包括(但不限于)干咳、動(dòng)作障礙(impaired performance)及肺病變。包含如本文所提供之純化PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)之免疫原性組合物具有改良免疫原性。因此，本文所提供之免疫原性組合物適用于改良接受該免疫原性組合物之動(dòng)物的免疫反應(yīng)。因此，根據(jù)另ー實(shí)施方案，本發(fā)明提供ー種改良動(dòng)物針對(duì)PCV-2之免疫反應(yīng)的方法，其包含以下步驟向有需要之動(dòng)物施用如本文所述具有本文所提供之純化 PCV-2抗原(較佳純化PCV-2 0RF-2蛋白)的免疫原性組合物。根據(jù)ー較佳方面，將用于該方法中之PCV-2抗原(較佳PCV-2 0RF2抗原)純化至以免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)超過60% (w/w)，較佳超過60% (w/w)，甚至更佳超過70% (w/w)，甚至更佳超過 80% (w/w)，甚至更佳超過90% (w/w)，最佳超過95% (w/w)之程度?？稍谑褂肗uPAGE MOPS 緩沖系統(tǒng) Qnvitrogen)，經(jīng)由 NuPAGE 10% Bis-Tris 凝膠(Invitrogen)進(jìn)行 SDS PAGE 之后，藉由Imperial Protein Stain(Pierce)染色來評(píng)估純度等級(jí)?？墒褂檬炝?xí)此項(xiàng)技術(shù)者所熟知之常規(guī)方法純化PCV-2，且較佳PCV-2 0RF2。


下面的附圖構(gòu)成本說明書的一部分，而且被包括用來進(jìn)ー步演示本發(fā)明的某些方面。通過參照一或多幅這些附圖，結(jié)合本文所示具體實(shí)施方案的詳述，可以更好地理解本發(fā)明。
圖1顯示使用10% Bis-Tris/MOPS凝膠的超濾組態(tài)中試規(guī)模的結(jié)果，展示過濾方法之后0RF2的存在。如下裝載各道(1)標(biāo)志物；(2)n/2；(3)24-180/181濃縮前-20 μ 1 ； (5) 25-180/181 1 倍抗原-20 μ 1 ； (6) 26-180/181 過濾器洗滌液-20μ 1 ； (7) 27-PCV 504 濃縮前-8 μ 1 ； (8) 28-PCV 504 透過物-20 μ 1 ； (9) 29-PCV 504 1倍-20μ 1 ； (10)092704PD-20y 1 ； (11)標(biāo)志物。詳述以下實(shí)施例闡述根據(jù)本發(fā)明之較佳材料及程序。然而，應(yīng)了解僅僅經(jīng)由說明提供此等實(shí)施例且不應(yīng)認(rèn)為其中之實(shí)施例限制本發(fā)明之總范疇。實(shí)施例1此實(shí)施例描述制造具有降低殺病毒活性之濃縮PCV-20RF2抗原之實(shí)驗(yàn)室規(guī)模及中試規(guī)模方法與不包括本發(fā)明步驟之制造方法的比較。特定言之，將確定本發(fā)明對(duì)PCV-2 0RF2抗原對(duì)PRRS病毒之殺病毒活性之作用。材料及方法生產(chǎn)抗原實(shí)驗(yàn)室規(guī)模PCV SUB037 H1-F,18. 94kgPCV 1025,20. 6kgPCV 180/181,20. OkgPCV SUB 504PD，40kg中試規(guī)模PCV SUB 506PD,362kgPCV SUB 507PD,384kgPCV SUB 512PD,430kgPCV SUB 513PD,405kg超濾濾筒GEHealthcare, Steam-In-Place (SIP)，中空纖維膜濾筒UFP-100-E-55-STM:100，000NMWC，lmm 直徑之小管；用于 X109 中之 UF-002 中，實(shí)
驗(yàn)室規(guī)摸。UFP-300-E-55-STM:300，000NMWC，lmm 直徑之小管；用于 X109 中之 UF-002 中，實(shí)
驗(yàn)室規(guī)摸。UFP-100-E-65-MSM :100, 000NMWC, Imm直徑之小管；用于 APU-1 中之 UF_B^14 中， 中試規(guī)摸。UFP-300-E55-SM0 :300, 000NMWC, Imm 直徑之小管；用于 VP-1 中之 UF-2713 中，中試規(guī)摸。下列超濾設(shè)備系用于可行性評(píng)估及初始方法開發(fā)中表1.設(shè)備
權(quán)利要求
1.一種制備PCV-2抗原性組合物之方法，其包含以下步驟 i)獲得含有PCV-2抗原之第一液體；及 )自該P(yáng)CV-2抗原移除至少一部分該第一液體。
2.如權(quán)利要求1之方法，其中藉由以第二液體交換該第一液體之該部分而自該P(yáng)CV-2 抗原移除該第一液體之該部分，其中該第二液體不同于該第一液體。
3.如權(quán)利要求2之方法，其中以該第二液體交換該第一液體之該部分包含以下步驟a)包含將該第二液體添加至含有該P(yáng)CV-2抗原之該第一液體中的液體添加；及b)藉由移除一部分該第一及第二液體濃縮該P(yáng)CV-2抗原。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)之方法，其中使用過濾器，藉由過濾步驟自該P(yáng)CV-2抗原移除該第一液體之該部分。
5.如權(quán)利要求3至5中任一項(xiàng)之方法，其中實(shí)質(zhì)上同時(shí)執(zhí)行該濃縮步驟及該液體添加步驟。
6.如權(quán)利要求3至6中任一項(xiàng)之方法，其中至少兩次執(zhí)行該濃縮步驟及該液體添加步驟。
7.如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)之方法，其中該過濾器包括半透膜。
8.如權(quán)利要求7之方法，其中該半透膜具有小于該P(yáng)CV-2抗原之平均孔徑，藉此防止至少90%該P(yáng)CV-2抗原通過該半透膜孔且將該P(yáng)CV-2抗原截留在該過濾器內(nèi)。
9.如權(quán)利要求4至8中任一項(xiàng)之方法，其中該過濾器具有防止至少90%大小為50kDa 至500kDa之蛋白質(zhì)通過的平均孔徑。
10.如權(quán)利要求3至9中任一項(xiàng)之方法，其中該濃縮步驟使該抗原與該第一液體之體積相比濃縮3倍至50倍。
11.如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)之方法，其中該P(yáng)CV-2抗原性組合物之殺病毒活性與未經(jīng)歷該方法之該液體相比降低至少10%。
12.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)之方法，其中當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與該P(yáng)CV-2抗原性組合物混合2小時(shí)或2小時(shí)以上時(shí)，由步驟i)至ii)制備的PCV-2抗原性組合物造成小于 Ilog TCID5ciAil該活病毒或小于llog CFU/ml該活細(xì)菌之損失。
13.如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)之方法，其中當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與該P(yáng)CV-2抗原性組合物混合2小時(shí)或2小時(shí)以上時(shí)，由步驟i)至ii)制備的PCV-2抗原性組合物造成小于 0. 71og TCID5ciAil該活病毒或小于0. 71og CFU/ml該活細(xì)菌之損失。
14.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)之方法，其中該方法進(jìn)一步包含收獲在步驟ii)之后剩余PCV-2抗原之步驟。
15.如權(quán)利要求14之方法，其中該方法進(jìn)一步包含藉由層析程序純化包含該P(yáng)CV-2抗原之步驟ii)收獲物的步驟。
16.如權(quán)利要求15之方法，其中該P(yáng)CV-2抗原經(jīng)純化至以蛋白質(zhì)總量計(jì)超過50%(w/ w)之該P(yáng)CV-2抗原之純度等級(jí)。
17.如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)之方法，進(jìn)一步包含將步驟ii)后剩余的PCV-2抗原與選自由以下組成之群的另一組份混合之步驟醫(yī)藥學(xué)上可接受之載劑、佐劑、稀釋劑、賦形劑及其組合。
18.如權(quán)利要求17之方法，其中該另一組份為佐劑。
19.如權(quán)利要求18之方法，其中該佐劑為卡波姆(Carbomer)。
20.如權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)之方法，其中該P(yáng)CV-2抗原包含PCV-2之0RF-2蛋白。
21.如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)之方法，其中該P(yáng)CV-2抗原包含0RF-2蛋白之病毒樣粒子。
22.如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)之方法，其中該方法進(jìn)一步包含將該P(yáng)CV-2抗原性組合物與至少一種其它抗原組合之步驟。
23.如權(quán)利要求22之方法，其中該至少一種其它抗原包括豬生殖及呼吸癥候群病毒抗原及/或豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)抗原。
24.一種PCV-2抗原性組合物，其可藉由如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)之方法獲得。
25.—種PCV-2抗原性組合物，其中當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與該P(yáng)CV-2抗原性組合物混合至少2小時(shí)時(shí)，該P(yáng)CV-2抗原性組合物造成小于llog TCID5ciAil該活病毒或小于llog CFU/ ml該活細(xì)菌之損失。
26.如權(quán)利要求25之PCV-2抗原性組合物，其中當(dāng)活病毒或活細(xì)菌與該P(yáng)CV-2抗原性組合物混合至少2小時(shí)時(shí)，該P(yáng)CV-2抗原性組合物造成小于0. 71og TCID50/ml該活病毒或小于0. 71og CFU/ml該活細(xì)菌之損失。
27.如權(quán)利要求25或沈之PCV-2抗原性組合物，其中該活病毒為豬生殖及呼吸癥候群 (PRRS)病毒。
28.一種免疫原性組合物，其包含可由如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)之方法獲得的 PCV-2抗原性組合物。
29.一種免疫原性組合物，其包含如權(quán)利要求M至沈中任一項(xiàng)之PCV-2抗原性組合物。
30.如權(quán)利要求四之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進(jìn)一步包含豬之至少一種其它致病有機(jī)體的減毒活病毒或減毒活細(xì)菌。
31.如權(quán)利要求30之免疫原性組合物，其中該減毒活病毒為豬生殖及呼吸癥候群 (PRRS)病毒。
32.如權(quán)利要求四至31中任一項(xiàng)之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進(jìn)一步包含豬肺炎支原體菌苗(bacterin)。
33.如權(quán)利要求四至32中任一項(xiàng)之免疫原性組合物，其中該免疫原性組合物進(jìn)一步包含佐劑。
34.如權(quán)利要求33之免疫原性組合物，其中該佐劑為卡波姆。
35.一種免疫原性組合物，其包含純化PCV-2抗原及佐劑。
36.如權(quán)利要求35之免疫原性組合物，其中該P(yáng)CV-2抗原之純度等級(jí)以該免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)高于50% (w/w) 0
37.如權(quán)利要求35或36之免疫原性組合物，其中該P(yáng)CV-2抗原為動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌中表達(dá)的重組豬環(huán)狀病毒0RF2蛋白。
38.如權(quán)利要求35至37中任一項(xiàng)之免疫原性組合物，其中該豬環(huán)狀病毒0RF2蛋白可由包含以下步驟之方法獲得a.在宿主細(xì)胞中表達(dá)該P(yáng)CV-2抗原；b.收獲細(xì)胞培養(yǎng)物獲得該P(yáng)CV-2抗原；c.藉由凝膠過濾純化包含該P(yáng)CV-2抗原之收獲物；d.將該純化之PCV-2抗原與佐劑混合。
39.如權(quán)利要求28至38之免疫原性組合物，其中在施用一劑該免疫原性組合物之后， 該免疫原性組合物誘導(dǎo)針對(duì)PCV-2之保護(hù)性免疫反應(yīng)。
40.權(quán)利要求28至38之免疫原性組合物，其中施用該免疫原性組合物之動(dòng)物之淋巴流失(lymphoid depletion)及炎癥與未接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕至少80%。
41.如權(quán)利要求31至38之免疫原性組合物，其中在施用一劑該免疫原性組合物之后， 該免疫原性組合物誘導(dǎo)針對(duì)PRRS病毒之保護(hù)性免疫反應(yīng)。
42.如權(quán)利要求32至38之免疫原性組合物，其中在施用一劑該免疫原性組合物之后， 該免疫原性組合物誘導(dǎo)針對(duì)豬肺炎支原體之保護(hù)性免疫反應(yīng)。
43.如權(quán)利要求28至38之免疫原性組合物，其中2ml該免疫原性組合物包含1個(gè)劑量之該P(yáng)CV-2抗原。
44.一種使動(dòng)物PCV-2感染之一或多種臨床癥狀與未接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕的方法，其包含對(duì)動(dòng)物施用如權(quán)利要求28至38中任一項(xiàng)之免疫原性組合物的步驟。
45.如權(quán)利要求觀至38中任一項(xiàng)之免疫原性組合物，其系用于使動(dòng)物PCV-2感染之一或多種臨床癥狀與未接受該免疫原性組合物之動(dòng)物相比減輕。
46.一種改良免疫原性組合物對(duì)豬環(huán)狀病毒之免疫原性的方法，其包含以下步驟a.在宿主細(xì)胞中表達(dá)PCV-2抗原；b.收獲該P(yáng)CV-2抗原；c.純化該P(yáng)CV-2抗原至以該免疫原性組合物中所包括的蛋白質(zhì)總量計(jì)高于50%(w/w) 之純度等級(jí)；d.將該純化之PCV-2抗原與佐劑混合。
全文摘要
本發(fā)明提供降低包含PCV-2抗原之組合物之殺病毒活性的方法，以及包含PCV-2抗原之抗原性制劑及免疫原性組合物，其殺病毒活性已降低。此外，本發(fā)明亦關(guān)于一種提高包含PCV-2抗原之免疫原性組合物之免疫原性的方法，以及具有提高免疫原性之免疫原性組合物。
文檔編號(hào)A61K39/12GK102573899SQ201080048350
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2010年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月2日
發(fā)明者A.卡茲雷納茲普爾, B.C.艾肯穆勒, C.A.科勒, G.海威克, M.艾克梅耶, M.謝弗, 趙國(guó)頌 申請(qǐng)人:貝林格爾.英格海姆維特梅迪卡有限公司