專利名稱：用于治療炎性病癥的組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的特征在于與結(jié)合CXXXC趨化分子(fractalkine)的抗體有關(guān)的組合物和方法。
背景技術(shù)：
CXX)(C趨化分子(FKN)是在活化內(nèi)皮細(xì)胞的表面上表達(dá)且與CX3CR1受體結(jié)合的跨膜趨化因子。膜結(jié)合的FKN與膜結(jié)合的CX3CR1的結(jié)合介導(dǎo)強(qiáng)細(xì)胞間粘附，而不牽涉選擇素或整聯(lián)蛋白。從膜結(jié)合的FKN脫落的分泌的FKN也結(jié)合CX3CR1，并且誘導(dǎo)整聯(lián)蛋白的活化和細(xì)胞趨化性。FKN的表達(dá)通過促炎細(xì)胞因子在內(nèi)皮細(xì)胞的表面上誘導(dǎo)。FKN的升高表達(dá)以及CX3CR1+細(xì)胞毒性效應(yīng)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的累積已在具有眾多病癥的受試者中報道，包括炎癥和自身免疫病癥，包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)、克羅恩病(⑶)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、自身免疫性肝炎(AIH)、多發(fā)性硬化(MS)和糖尿病。^iehara等人，Arterioscler. Thromb.Vase. Biol. 24:34-40(2004)描述了 FKN在動脈粥樣硬化和血管損傷中的作用。Nishimura等Χ,Αηη. NY Acad. Sci. 1173:350-356 (2009)討論了 FKN作為用于炎性腸病例如UC和⑶的潛在治療靶。由于其特異性，抗體和抗體的FKN結(jié)合片段是希望的治療試劑?？贵w和FKN結(jié)合片段可以用于靶向特異性細(xì)胞或組織，從而使非特異性靶向的潛在副作用降到最低。存在鑒定且表征在炎性病癥包括在本文中所述那些的治療中有用的治療抗體的需要。發(fā)明概述
在第一個方面，本發(fā)明的特征在于抗FKN抗體或其FKN結(jié)合片段，其中抗體或其片段包括選自下述的6個CDR:
(a)包括SEQID NO 28的氨基酸序列的CDR-Hl ；
(b)包括SEQID NO 29的氨基酸序列的CDR-H2 ；
(c)包括SEQID NO 30的氨基酸序列的CDR-H3 ；
(d)包括SEQID NO 31的氨基酸序列的CDR-Ll ；
(e)包括SEQID NO 32的氨基酸序列的CDR-L2 ；和
(f)包括SEQID NO 33的氨基酸序列的CDR-L3?？贵w可以是完整抗體。在一個例子中，抗體是人源化抗體。人源化抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域可以包括 SEQ ID NO 36,SEQ ID NO 37、SEQ ID NO 39、SEQ ID NO 42 或 SEQ IDNO :43的氨基酸序列，并且人源化抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域可以包括SEQ ID NO 38、SEQ IDNO 44或SEQ ID NO 45的氨基酸序列。在一個例子中，抗體是抗CXXXC趨化分子抗體或其FKN結(jié)合片段，其中抗體或其片段包括具有SEQ ID NO :37的氨基酸序列的重鏈和具有SEQ ID NO :44的氨基酸序列的輕鏈?？贵w還可以是嵌合抗體。在一個例子中，嵌合抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域包括SEQ IDNO :26的氨基酸序列，并且嵌合抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域包括SEQ ID NO :27的氨基酸序列。
還考慮了抗體的FKN結(jié)合片段。FKN結(jié)合片段可以是保留對于FKN的結(jié)合特異性的 Fab、Fab，、F (ab，)2 或Fv 片段。在特定例子中，當(dāng)抗體或其FKN結(jié)合片段包括人恒定區(qū)時，恒定區(qū)具有IgG同種型(例如IgG2同種型)。在其他例子中，抗體或HiN結(jié)合片段包括突變的Fc區(qū)，從而使得相對于缺乏突變的Fc區(qū)，抗體具有減少的ADCC和/或補(bǔ)體激活。例如，F(xiàn)c區(qū)可以在氨基酸殘基V234、G237、C131或C219的一個或多個上是突變的。 希望地，抗體或FKN結(jié)合片段使FKN與其受體CX3CR1的結(jié)合基本上減少或抑制至少50 %、60 %、70 %、80 %、90 %或更大，或在趨化性測定例如本文描述的一個測定中基本上抑制中和的hFKN。本發(fā)明的特征還在于藥物組合物，其包括本發(fā)明的抗體或FKN結(jié)合片段和藥學(xué)可接受的載體或賦形劑。在特定實施方案中，組合物包括一種或多種另外的治療試劑，例如下文描述的那些。還考慮的是編碼上述抗體或FKN結(jié)合片段的核酸。在一個實施方案中，核酸編碼抗體或其FKN結(jié)合片段的重鏈的全部或部分。在另一個實施方案中，核酸編碼抗體或其FKN結(jié)合片段的輕鏈的全部或部分。核酸可以在載體(例如表達(dá)載體)中。本發(fā)明的特征還在于包括本發(fā)明的一種或多種載體的宿主細(xì)胞。在一個例子中，宿主細(xì)胞包括2種載體，第一種載體包括編碼本文描述的抗體或FKN結(jié)合片段的重鏈的核酸，并且第二種載體包括編碼本文描述的抗體或FKN結(jié)合片段的輕鏈的核酸。重和輕鏈在宿主細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)生抗體或FKN結(jié)合片段。在一個實施方案中，宿主細(xì)胞是原核生物的。在另一個實施方案中，宿主細(xì)胞是真核生物的。對于產(chǎn)生抗體和FKN結(jié)合片段有用的示例性哺乳動物細(xì)胞是CHO細(xì)胞和NSO細(xì)胞。本發(fā)明的特征還在于用于制備抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段的方法。該方法包括(a)在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的載體，和(b)回收抗體?？贵w或FKN結(jié)合片段可以由宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基內(nèi)。在一個例子中，純化抗體或其FKN結(jié)合片段，以去除非抗體材料的至少95%或更大純度。還考慮了通過施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段來治療炎性病癥的方法。示例性炎性病癥是炎性腸病、克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎。對于這些病癥，該方法可以進(jìn)一步包括施用一種或多種另外的治療試劑。示例性治療試劑是阿片類、5-氨基水楊酸、6-巰嘌呤、硫唑嘌呤、糖皮質(zhì)激素、氨甲蝶呤、環(huán)孢菌素和甲硝唑。其他合適的治療試劑在下文描述?？梢酝ㄟ^施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段治療的炎性病癥還包括自身免疫性肝膽疾病(例如自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬變或原發(fā)性硬化性膽管炎)。對于這些病癥，該方法可以進(jìn)一步包括施用6-巰嘌呤、熊去氧膽酸、硫唑嘌呤、糖皮質(zhì)激素、噻嗪類利尿劑、抗醛固酮利尿劑、環(huán)孢菌素、白蛋白或螺內(nèi)酯。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)也可以通過施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段進(jìn)行治療。在RA的治療中，該方法可以進(jìn)一步包括施用非留體抗炎藥(NSAID)、氨甲蝶呤、來氟米特、布西拉明、5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素、羥氯喹(hydrochloroquine)、維生素D、鈣或阿屈膦酸鹽。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的狼瘡或狼瘡性腎炎)也可以通過施用單獨(dú)或與一種或多種另外的治療試劑組合的、有效量的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段進(jìn)行治療。示例性另外的治療試劑是糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、氨甲蝶呤、環(huán)孢菌素和他克莫司。多發(fā)性硬化和視神經(jīng)脊髓炎也可以通過施用有效量的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段進(jìn)行治療。治療可以進(jìn)一步包括施用一種或多種另外的治療試劑，例如糖皮質(zhì)激素、干擾素-β 或 Copaxone 。脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根病(例如格-巴二氏綜合征或慢性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根病)也可以通過施用有效量的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段進(jìn)行治療。再次，還考慮了協(xié)同療法，并且治療可以進(jìn)一步包括施用一種或多種另外的治療試劑，例如糖皮質(zhì)激素或靜脈內(nèi)免疫球蛋白。單獨(dú)或與另外的治療試劑組合施用有效量的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段也可以用于治療神經(jīng)病性疼痛。用于治療神經(jīng)病性疼痛的示例性另外試劑是拉莫三嗪、托吡酯、奧卡西平、左乙拉西坦、芬太尼、曲馬多、辣椒辣素、可樂定(cloridine)、NSAID、阿米替林、普瑞巴林、利多卡因、度洛西汀和卡馬西平。阿爾茨海默氏病也可以通過施用有效量的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段進(jìn)行治療。該方法可以進(jìn)一步包括施用一種或多種另外的治療試劑，例如鹽酸他克林、鹽酸多奈哌齊、酒石酸卡巴拉汀、氫溴酸加蘭他敏、鹽酸美金剛、帕羅西汀、利培酮、喹硫平或哌羅匹隆。與癌癥相關(guān)的內(nèi)臟痛也可以通過施用單獨(dú)或與一種或多種另外的治療試劑組合的，有效量的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段進(jìn)行治療，所述另外的治療試劑例如嗎啡、NSAID、芬太尼、利多卡因、噴他佐辛或可樂定。動脈粥樣硬化也可以通過施用有效量的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段進(jìn)行治療。該方法可以進(jìn)一步包括施用一種或多種另外的治療試劑，例如前列腺環(huán)素、阿司匹林、氯吡格雷、噻氯匹定、利馬前列素、前列腺素El、HMG CoA還原酶抑制劑、苯扎貝特、利多卡因、美西律、利尿劑、洋地黃、多巴胺、腎上腺素能受體激動劑、二硝酸異山梨酯、硝酸甘油、利鈉肽、華法林、肝素、組織型纖溶酶原激活物、尿激酶或普魯卡因胺。血管病變(例如年齡相關(guān)性黃斑變性、貝切特氏病、原田氏病和肉瘤樣病起源的葡萄膜炎)也可以通過施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段進(jìn)行治療。該方法可以進(jìn)一步包括施用選自下述的一種或多種另外的治療試劑糖皮質(zhì)激素、環(huán)磷酰胺、培加尼布、雷珠單抗、NSAID、秋水仙堿、苯丁酸氮芥、沙立度胺和維替泊芬。腎病(例如狼瘡性腎炎、腎小球腎炎或糖尿病性腎病)也可以通過施用有效量的根據(jù)本發(fā)明的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段進(jìn)行治療。糖皮質(zhì)激素、磺酰脲、環(huán)磷酰胺、格列奈類(glinides)、環(huán)孢菌素、他克莫司、霉酚酸酯、咪唑立賓、利尿劑、胰島素、雙胍、α-葡糖苷酶抑制劑、血管收縮素受體阻斷劑、噻唑烷二酮、血管收縮素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制劑、鈣通道阻斷劑或β-腎上腺素能受體抑制劑可以包括在治療方法中。腎上腺素能受體抑制劑可以包括在治療方法中。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段在治療本文描述的任何炎性病癥中的用途。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段在制備用于治療本文描述的任何炎性病癥的藥物中的用途。本發(fā)明的特征還在于抑制白細(xì)胞召募至受試者中的炎癥部位的方法，其通過給需要此類治療的受試者施用有效量的抗FKN抗體或FKN結(jié)合片段實施，由此抑制白細(xì)胞召募至炎癥部位。先體外后體內(nèi)策略也可以用于治療應(yīng)用。先體外后體內(nèi)策略涉及用編碼抗體或抗體片段的多核苷酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)得自受試者的細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞隨后送回受試者。細(xì)胞可以是廣泛范圍類型中的任何，包括但不限于造血細(xì)胞(例如骨髓細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、T細(xì)胞或B細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞或肌細(xì)胞。為了本發(fā)明的目的，下文定義了下述縮寫和術(shù)語。術(shù)語“抗體”(在本文中可與“免疫球蛋白”互換使用)包括完整單克隆和多克隆抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和顯示出所需生物學(xué)活性(例如結(jié)合FKN且調(diào)節(jié)FKN和CX3CR1之間的相互作用的能力)的抗體片段?！巴暾贵w”是約150，000道爾頓的異四聚糖蛋白，由2條等同輕(L)鏈和2條等同重(H)鏈組成。每條輕鏈通過一個共價二硫鍵與重鏈連接，而二硫鍵數(shù)目在不同免疫球蛋白同種型的重鏈中變化。每條重和輕鏈也具有規(guī)則間隔的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈具有在一個末端上的可變結(jié)構(gòu)域(VH)，隨后為許多恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈具有在一個末端上的可變結(jié)構(gòu)域(VL)和在其另一個末端上的恒定結(jié)構(gòu)域。輕鏈的恒定結(jié)構(gòu)域與重鏈的第一個恒定結(jié)構(gòu)域?qū)R，并且輕鏈可變結(jié)構(gòu)域與重鏈的可變結(jié)構(gòu)域?qū)R。特定氨基酸殘基認(rèn)為形成在輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域之間的界面。存在5個主要類別的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中幾個可以進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如IgG1. IgG2, IgG3、IgG4, IgA1和IgA2?？贵w可以是更大融合分子的部分，通過抗體與一種或多種其他蛋白質(zhì)或肽的共價或非共價結(jié)合形成?？贵w還可以是免疫綴合物的部分，其中抗體與第二種分子(例如毒素、放射性同位素或標(biāo)記)綴合。如本文使用的，術(shù)語“單克隆抗體”指得自基本上同質(zhì)抗體群體的抗體，即各個抗體是等同的，除可以以小量存在的可能突變外。非人抗體的“人源化”形式是包含具有基本上人免疫球蛋白的氨基酸序列的構(gòu)架區(qū)(FR)和具有基本上非人免疫球蛋白的氨基酸序列(即“輸入”序列)的互補(bǔ)決定區(qū)(⑶R)的抗體或其片段。在某些情況下，人免疫球蛋白的構(gòu)架區(qū)殘基通過相應(yīng)非人殘基替換?？梢宰龀鋈嗽椿贵w的進(jìn)一步修飾，以改善抗體性能?！盎パa(bǔ)決定區(qū)”或“⑶R”意指在免疫球蛋白輕和重鏈各自內(nèi)的可變區(qū)中的3個高變
序列之一?！皹?gòu)架區(qū)”或“FR”意指定位于免疫球蛋白輕和重鏈的3個⑶R的任一側(cè)上的氨基
酸序列。人源化抗體的FR和⑶R無需精確對應(yīng)于親本序列，例如輸入⑶R或共有FR可以通過至少一個殘基的置換、插入或缺失進(jìn)行誘變，從而使得在那個位點(diǎn)上的CDR或FR殘基不對應(yīng)于共有或輸入序列。然而，此類突變一般不是廣泛的。通常，至少75^^80^^85%,90 %、95 %或99 %的人源化抗體殘基將對應(yīng)于親本序列的殘基。如本文使用的，當(dāng)指可測量的值例如量、暫時持續(xù)時間等時，術(shù)語“約”意欲涵蓋距離指定值高達(dá)士 20%、優(yōu)選士 10%、更優(yōu)選士 5%、更加優(yōu)選士 2%的變動，當(dāng)此類變動適合于執(zhí)行公開的方法時。除非另有說明，在說明書和權(quán)利要求中使用的表達(dá)成分的數(shù)量、性質(zhì)例如分子量、反應(yīng)體積等等的所有數(shù)目應(yīng)理解為在所有情況下由術(shù)語“約”修飾。相應(yīng)地，除非指出相反，在下述說明書和附加權(quán)利要求中所示的數(shù)目參數(shù)是近似值，其可以取決于通過本發(fā)明尋求獲得的所需性質(zhì)而改變。最低限度地，并且不作為限制關(guān)于權(quán)利要求范圍的等價教義的應(yīng)用的嘗試，每個數(shù)目參數(shù)應(yīng)至少根據(jù)報道的有效數(shù)字的數(shù)目和通過應(yīng)用普通舍入技術(shù)加以解釋?！白銐虻牧俊被颉坝行Я俊币庵敢耘R床相關(guān)方式治療或改善病癥例如炎性病癥所需的治療抗體或其藥物組合物的量。用于實踐本發(fā)明用于例如炎性病癥的治療性處理的治療抗FKN抗體、其FKN結(jié)合片段或藥物組合物的足夠量取決于施用方式、患者的年齡和一般健康而改變。“結(jié)合親和力” 一般指在分子(例如抗體)的單個結(jié)合位點(diǎn)及其結(jié)合配偶體(例如抗原)之間的非共價相互作用的總和強(qiáng)度。結(jié)合親和力可以由解離常數(shù)(Kd)表示。親和力可以通過本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行測量，包括放射性標(biāo)記的FKN結(jié)合測定(RIA)或通過表面等離子體共振測定(例如BIAC0RE )?！扒逗稀被颉扒逗匣笨贵w(即免疫球蛋白)指這樣的抗體，其中重和/或輕鏈的部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列等同或同源，而一條或多條鏈的其余部分與衍生自另一個物種或?qū)儆诹硪粋€抗體類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列等同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們顯示出所需生物學(xué)活性(Morrison等人，Proc. Natl. Acad.. Sci. U. S. Α. 81:6851—6855,1984)。“表位”或“抗原決定簇”意指由于線性結(jié)構(gòu)或三維構(gòu)象，形成關(guān)于抗體的結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸序列。由于表位的三級結(jié)構(gòu)，可以包括抗原的氨基酸序列的不連續(xù)部分的構(gòu)象表位與抗體相互作用。相比之下，線性表位是基于其一級結(jié)構(gòu)由抗體識別的表位。在一個實施方案中，形成與Fab的最低限度界面的CXXXC趨化分子表位包括例如E66-Q69、W81-Q87、H70-F73 和 H88-D90。術(shù)語“表達(dá)”和“產(chǎn)生”在本文中可同義使用，并且指基因產(chǎn)物的生物合成。這些術(shù)語涵蓋基因轉(zhuǎn)錄成RNA。這些術(shù)語還涵蓋RNA翻譯成一種或多種多肽，且進(jìn)一步涵蓋所有天然存在的轉(zhuǎn)錄后和翻譯后修飾?？贵w的表達(dá)/產(chǎn)生可以在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，和/或進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境例如細(xì)胞培養(yǎng)的生長培養(yǎng)基內(nèi)。"CXXXC趨化分子”、“FKN”、“H(”或“神經(jīng)趨化蛋白(neurotactin)”意指這樣的多肽，其與由SEQ ID NO 1 (

圖1)限定的多肽同源，并且具有FKN生物學(xué)活性(例如與CX3CR1受體結(jié)合；化學(xué)吸引T細(xì)胞和單核細(xì)胞；或促進(jìn)白細(xì)胞粘附至活化內(nèi)皮細(xì)胞)。FKN多肽的生物學(xué)活性可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行測定。如本文使用的，F(xiàn)KN還包括任何FKN家族成員或同種型。參見例如在此引入作為參考的美國專利號7，390，490、WO 2006/046739和美國專利申請公開號2006/0233710。"FKN結(jié)合片段”包括完整抗體的部分，其包含其FKN結(jié)合區(qū)且能夠結(jié)合FKN。FKN結(jié)合片段可以是i^ab、Fab'、F (ab’)2或Fv片段；雙抗體；三抗體；四抗體；微型抗體；親和體分子；微體(minibodies)；線性抗體；單鏈抗體分子；或由抗體片段形成的多特異性抗體?！巴吹摹币庵溉魏位蚧虻鞍踪|(zhì)序列，其在比較序列的長度上與已知基因或蛋白質(zhì)序列具有至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多同源性?！巴础钡鞍踪|(zhì)還可以具有比較蛋白質(zhì)的至少一種生物學(xué)活性。對于多肽，比較序列的長度一般是至少15、20、25、35個或更多個氨基酸。對于核酸，比較序列的長度一般是至少50、60、75、100,125個或更多個核苷酸?！巴葱浴边€可以指在用于生成抗體的表位和抗體針對其的蛋白質(zhì)或其片段之間的基本相似性。在這種情況下，同源性指足以引發(fā)可以特異性識別所討論的蛋白質(zhì)的抗體產(chǎn)生的相似性。“人抗體”意指抗體單獨(dú)來自人起源或其中可變和恒定結(jié)構(gòu)域序列是人序列或人抗體的序列的任何抗體。該術(shù)語涵蓋這樣的抗體，其具有衍生自(即利用)人基因的序列，但已改變，例如以減少可能的免疫原性，增加親和力，消除可能引起不希望的折疊的半胱氨酸等。該術(shù)語涵蓋在非人細(xì)胞中重組產(chǎn)生的此類抗體，這可以賦予并非人細(xì)胞典型的糖基化?！半s交瘤”指在培養(yǎng)的瘤性淋巴細(xì)胞和預(yù)處理的B或T淋巴細(xì)胞之間的細(xì)胞融合產(chǎn)物，其表達(dá)親本細(xì)胞的特異性免疫潛力。如本文使用的，“炎性病癥”指其中免疫系統(tǒng)異常激活的任何疾病、病癥或狀況。炎性病癥可以是例如潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、炎性腸病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肌炎、多發(fā)性硬化、視神經(jīng)脊髓炎、動脈粥樣硬化、牛皮癬、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的狼瘡或狼瘡性腎炎)、腎炎、腎小球腎炎、自身免疫性肝膽疾病(例如自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化或原發(fā)性硬化性膽管炎)、移植物抗宿主病、特應(yīng)性皮炎、哮喘、神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默氏病)、脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根病(例如格-巴二氏綜合征或慢性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根病)、神經(jīng)病性疼痛、癌癥的內(nèi)臟痛、動脈粥樣硬化、年齡相關(guān)性黃斑變性、糖尿病性腎病、肉瘤樣病起源的葡萄膜炎或糖尿病?？商娲?，疾病、病癥或狀況是上或下呼吸道的疾病，例如淋巴瘤氣管支氣管炎；變應(yīng)性超敏反應(yīng)或分泌過多狀況，例如慢性支氣管炎和囊性纖維化；不同病因?qū)W的肺纖維化(例如特發(fā)性肺纖維化)；慢性阻塞性肺疾病(COPD)；肉瘤樣??；變應(yīng)性和非變應(yīng)性鼻炎；變應(yīng)性或非變應(yīng)性蕁麻疹；特征在于失調(diào)的炎癥、組織重塑、血管發(fā)生和贅生物的皮膚相關(guān)疾病；胃腸道的疾病，例如赫希施普龍(Hirschsprung)氏病、腹瀉、吸收不良狀況和炎性狀況；中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的病癥，例如抑郁、焦慮狀態(tài)、帕金森氏病、偏頭痛和其他形式的顱疼痛、中風(fēng)和嘔吐；免疫系統(tǒng)例如在脾和淋巴組織中的疾病，自身免疫疾病或其他免疫相關(guān)疾病；心血管系統(tǒng)的疾病，例如肺水腫、高血壓、先兆子癇、復(fù)雜區(qū)域性疼痛綜合征2型和中風(fēng)；慢性炎性疾病例如關(guān)節(jié)炎；骨相關(guān)疾病；慢性疼痛例如纖維肌痛；及其中神經(jīng)激肽、速激肽或其他相關(guān)物質(zhì)(例如血細(xì)胞激肽)的作用涉及發(fā)病機(jī)理、病理學(xué)和病因?qū)W的其他病癥。炎性病癥的另外例子是尋常座瘡；急性呼吸窘迫綜合征；阿狄森氏病、變應(yīng)性眼內(nèi)炎性疾??；ANCA相關(guān)小血管脈管炎；強(qiáng)直性脊柱炎；自身免疫性溶血性貧血；貝切特氏病；貝爾氏麻痹；大皰性類天皰瘡；腦缺血癥；肝硬化；寇甘(Cogan)氏綜合征；接觸性皮炎；庫興氏綜合征；皮肌炎；盤狀紅斑狼瘡；嗜酸性粒細(xì)胞筋膜炎；結(jié)節(jié)性紅斑；剝落性皮炎；局灶性腎小球硬化；局灶性節(jié)段性腎小球硬化；節(jié)段性腎小球硬化；巨細(xì)胞動脈炎；痛風(fēng)；痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；手部濕疹；亨諾-許蘭二氏(Henoch-khonlein)紫癜；妊娠皰疹；多毛癥；特發(fā)性角膜鞏膜炎(ceratoscleritis)；特發(fā)性血小板減少性紫癜；免疫性血小板減少性紫癜；炎性腸或胃腸病癥；炎性皮膚病；扁平苔蘚；淋巴瘤氣管支氣管炎；黃斑水腫；重癥肌無力；非特異性纖維肺?。还顷P(guān)節(jié)炎；胰腺炎；妊娠性類天皰瘡；尋常天皰瘡；牙周炎；結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎；風(fēng)濕性多肌痛；陰囊瘙癢；瘙癢(pruritis) /炎癥；牛皮癬關(guān)節(jié)炎；肺組織胞漿菌??；復(fù)發(fā)性多軟骨炎；酒糟鼻；肉瘤樣?。挥财げ?；膿毒性休克綜合征；肩部腱炎或滑膜炎；斯耶格倫(Sjogren)氏綜合征；斯提耳(Still)氏??；Sweet氏??；系統(tǒng)性硬化病；高安氏動脈炎；顳動脈炎；中毒性表皮壞死松懈癥；移植排斥和移植排斥相關(guān)綜合征；肺結(jié)核；1型糖尿??；脈管炎；伏-小柳-原田三氏(VKH)病；和韋格納氏肉芽腫病?！胺蛛x的”或“純化的”意指“通過人工”由天然狀態(tài)改變的。如果分子或組合物在自然界中出現(xiàn)，如果它已從其起源環(huán)境中改變或取出或改變且取出，那么它已是“分離的”或“純化的”。例如，天然存在于活植物或動物中的多核苷酸或多肽不是“分離的”或“純化的”，但從其天然狀態(tài)的共存材料中分離的相同多核苷酸或多肽是“分離的”或“純化的”，如該術(shù)語在本文中采用的。術(shù)語“可操作地連接的”或“可操作地插入的”意指將編碼序列表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列置于核酸分子中相對于編碼序列的合適位置中，以便使得編碼序列的表達(dá)成為可能。例如，當(dāng)啟動子能夠控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)時，啟動子與那種編碼序列可操作地連接。編碼序列可以在有義或反義方向與啟動子或調(diào)節(jié)序列可操作地連接。術(shù)語“可操作地連接的”有時應(yīng)用于在表達(dá)載體中其他轉(zhuǎn)錄控制元件(例如增強(qiáng)子)的排列?！岸嗪塑账帷蓖x地稱為“核酸分子”，指任何多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸，其可以是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。“多核苷酸”包括但不限于單和雙鏈的DNA,其為單和雙鏈區(qū)的混合物的DNA，單和雙鏈RNA，和其為單和雙鏈區(qū)的混合物的RNA，包含其可以是單鏈或更一般地雙鏈或單和雙鏈區(qū)的混合物的DNA和RNA的雜交分子。此外，“多核苷酸”指包含RNA或DNA或RNA和DNA的三鏈區(qū)。術(shù)語多核苷酸還包括含有一個或多個修飾堿基的DNA或RNA和具有由于穩(wěn)定性或其他原因修飾的主鏈的DNA或RNA?！靶揎棥眽A基包括例如三苯甲基化堿基和稀有堿基例如肌苷?？梢詫τ贒NA和RNA做出多種修飾；因此，“多核苷酸”涵蓋如在自然界中一般發(fā)現(xiàn)的多核苷酸的化學(xué)、酶促或代謝修飾形式，以及病毒和細(xì)胞特有的DNA和RNA的化學(xué)形式?！岸嗪塑账帷边€涵蓋相對短的核酸鏈，通常稱為寡核苷酸。“多肽”指短鏈，通常稱為肽、寡肽或寡聚物，并且指更長的鏈，一般稱為蛋白質(zhì)。多肽可以含有除20種基因編碼的氨基酸外的氨基酸?！岸嚯摹卑ㄍㄟ^天然過程例如翻譯后加工或通過本領(lǐng)域眾所周知的化學(xué)修飾技術(shù)修飾的氨基酸序列。此類修飾在基本課本和更詳細(xì)的專題論文以及長篇研究文獻(xiàn)中充分描述。修飾可以在多肽中的任何地方出現(xiàn)，包括肽主鏈、氨基酸側(cè)鏈、和氨基或羧基末端。應(yīng)當(dāng)理解相同類型的修飾可以以相同或不同程度存在于給定多肽中的幾個位點(diǎn)上。此外，給定多肽可以含有許多類型的修飾。多肽可以由于遍在蛋白化而是分支的，并且它們可以是環(huán)狀的，含或不含分支。環(huán)狀、分支和分支環(huán)狀多肽可以起因于天然翻譯后過程或可以通過合成法制備。修飾包括例如乙?；?、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價附著、血紅素部分的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、共價交聯(lián)的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸鹽的形成、甲?； -羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、豆蔻?；⒀趸?、蛋白酶解加工、磷酸化、異戊烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、和轉(zhuǎn)移RNA介導(dǎo)的氨基酸對蛋白質(zhì)的添加例如精氨酰和遍在蛋白化。參見例如，Proteins - Structure and Molecular Properties,第2版，Τ· Ε. Creighton,W. H. Freeman and Company, New York,1993 禾口 Wold, F. ,Posttranslational ProteinModifications -Perspectives and Prospects, 第 1-12 頁 in PosttranslationalCovalent Modification of Proteins,B. C. Johnson,編輯,Academic Press,New York,1983 ；Seifter等人,Analysis for Protein Modifications and Nonprotein Cofactors,Meth Enzymol( 1990)182:626-646禾口Rattan等人，Protein Synthesis :PosttranslationalModifications and Aging, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48—62?！疤禺愋越Y(jié)合”意指抗體或其片段識別且結(jié)合抗原(例如FKN或其片段)，但基本上不識別且結(jié)合樣品(例如生物學(xué)樣品)中的其他分子?！疤禺愋浴币庥麉^(qū)分有時可以在例如具有暴露的親水結(jié)構(gòu)域的隨機(jī)蛋白質(zhì)之間發(fā)生的低水平、非特異性粘稠度。它不意欲暗示抗體將不與除本發(fā)明的抗原外的任何蛋白質(zhì)結(jié)合?？贵w可以與包括有關(guān)表位的任何蛋白質(zhì)交叉反應(yīng)(和“特異性結(jié)合”)?！笆茉囌摺币庵敢庵溉魏蝿游?，例如哺乳動物(例如人)。待就例如炎性病癥治療的受試者是已通過醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)從業(yè)者診斷為情況可能是具有此類狀況的受試者。診斷可以通過任何合適方式執(zhí)行。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明的受試者可以已實施標(biāo)準(zhǔn)測試或可以無需檢查而由于一種或多種危險因素例如年齡、遺傳學(xué)或家族史的存在已鑒定為處于高危的受試者。當(dāng)此類DNA已引入細(xì)胞內(nèi)時，細(xì)胞已通過外源或異源核酸例如DNA “轉(zhuǎn)化”或“轉(zhuǎn)染”。轉(zhuǎn)化DNA可以整合或不整合(例如共價連接)到細(xì)胞的基因組內(nèi)。在原核生物、酵母和哺乳動物細(xì)胞中，例如轉(zhuǎn)化DNA可以維持在附加型元件例如質(zhì)粒上。就真核細(xì)胞而言，穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或“穩(wěn)定細(xì)胞”是這樣的細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)化DNA已變得整合到染色體內(nèi)，從而使得它通過染色體復(fù)制由子細(xì)胞繼承。這種穩(wěn)定性通過真核細(xì)胞建立由含有轉(zhuǎn)化DNA的子細(xì)胞群體組成的細(xì)胞系或克隆的能力證實?！翱寺　笔峭ㄟ^有絲分裂衍生自單細(xì)胞或共同祖先的細(xì)胞群體?！凹?xì)胞系”是能夠在體外穩(wěn)定生長多代的原代細(xì)胞克隆?！爸委煛币庵甘┯弥委熆贵w或其藥物組合物用于預(yù)防和/或治療目的?！爸委熂膊』虿“Y”或用于“治療性處理”的用途指將治療施用于已患有疾病的受試者，以改善受試者的病狀?；谌魏翁卣餍园Y狀的鑒定或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的診斷法的使用，受試者可以診斷有炎性病癥?！邦A(yù)防疾病或病癥”指受試者的預(yù)防性處理，所述受試者還不是有病的，但對發(fā)展特定疾病敏感或另外處于發(fā)展特定疾病的危險中。受試者使用本領(lǐng)域已知的診斷法測定為處于發(fā)展炎性病癥的危險中。“載體”是復(fù)制子，例如質(zhì)粒、噬菌體、粘?；虿《?，其中另一個核酸區(qū)段可以可操作地插入，以便達(dá)到區(qū)段的復(fù)制或表達(dá)。如本說明書和附加權(quán)利要求中使用的，單數(shù)形式“一(a、an)”和“該(the)”包括復(fù)數(shù)參考，除非上下文另有說明。因此，例如提及“細(xì)胞”包括2種或更多種細(xì)胞的組合等。本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)由于詳述和權(quán)利要求將是顯而易見的。附圖簡述
圖1是人FKN的氨基酸序列。圖2是顯示抗FKN單克隆抗體的結(jié)合特征(即中和活性、結(jié)合親和力和物種交叉反應(yīng)性)的表。圖3是人源化抗FKN mAb序列(以出現(xiàn)的次序，分別為SEQ ID NOS 36-37和42-43)、m3A5-2 序列(SEQ ID NO :26)、種系 Ig 序列(SEQ ID NO 40)和 AAA68427. 1 序列(SEQ ID NO :34)的重鏈可變區(qū)比對。
圖4是人源化抗Π(Ν mAb序列(以出現(xiàn)的次序，分別為SEQ ID NOS 38和44_45)、m3A5-2 序列(SEQ ID NO :27)、種系 Ig 序列(SEQ ID NO :41)和 ABU90602. 1 序列(SEQ IDNO 35)的輕鏈可變區(qū)比對。圖5是概括來自3個獨(dú)立趨化性測定結(jié)果的表。人源化抗hFKN mAb的中和活性使用趨化性測定進(jìn)行分析。成功地人源化H3和H3-2與L2和L4的所有組合，因為這些mAb顯示與嵌合mAb的相似中和活性。然而，通過使用縮小關(guān)鍵殘基制備的HK2顯示與L2或L4組合減少的中和活性。圖6A和6B描述了顯示m3A5-2 mAb和嵌合mAb的中和活性的一系列曲線圖。圖6A是顯示如通過趨化性測定來測定的m3A5-2 mAb的中和活性的曲線圖。圖6B是顯示如通過趨化性測定來測定的嵌合mAb的中和活性的曲線圖。圖7A-7D描述了顯示如通過趨化性測定來測定的人源化抗hFKN抗體的中和活性的一系列曲線圖。圖7A顯示了 H3L2-IgG2的中和活性。圖7B顯示了 H3_L4_IgG2的中和活性。圖7C顯示了 HK2L2-IgG2的中和活性。圖7D顯示了 HK2L4_IgG2的中和活性。圖8A-8F描述了顯示如通過趨化性測定來測定的人源化抗hFKN抗體的中和活性的一系列曲線圖。圖8A顯示了 H3-2L2-IgG2的中和活性。圖8B顯示了 H3_2L4_IgG2的中和活性。圖8C顯示了 H3-2L5-IgG2的中和活性。圖8D顯示了 HK3L2_IgG2的中和活性。圖8E顯示了 HK3L4-IgG2的中和活性。圖8F顯示了 HK3L5_IgG2的中和活性。圖9是概括來自用于測量mAb與hFKN和食蟹猴FKN的結(jié)合親和力的BIAC0RE 測定結(jié)果的表。圖10A-10C描述了顯示如通過BIAC0RE 測定來測定的，嵌合和人源化抗hFKN抗體(H3L2、H3-2L2、H3L4、H3-2L4 和 HK2L4)與 hFKN-SEAP 和食蟹猴 FKN-SEAP 的結(jié)合親和力的一系列曲線圖。圖IOA是顯示Ka值(Ι/Ms)的條形圖。圖IOB是顯示Kd值(Ι/s)的條形圖。圖IOC是顯示KD值(M)的條形圖。圖11描述了使用來自FKN趨化因子結(jié)構(gòu)域的重疊合成肽文庫(以出現(xiàn)的次序，分別為SEQ ID NOS 115-135)的表位作圖結(jié)果。圖12描述了使用ELISA的hFKN的表位作圖結(jié)果。圖13描述了使用BIAC0RE 的hFKN的表位作圖結(jié)果。圖14顯示了鑒定在CXXXC趨化分子上的Fab結(jié)合位點(diǎn)的交叉飽和實驗結(jié)果。該曲線顯示了 FKN的E66-Q69、W81-Q87、H70-F73和H88-D90區(qū)包括在與Fab的最低限度界面中。發(fā)明詳述
我們已設(shè)計且分離了嵌合抗FKN抗體、人源化抗FKN抗體及其FKN結(jié)合片段。本文表征的人源化抗FKN抗體及其FKN結(jié)合片段可以用于治療炎性病癥。此類抗體還可以用于抑制白細(xì)胞召募至炎癥部位?？梢愿鶕?jù)本發(fā)明治療的炎性病癥包括潰瘍性結(jié)腸炎，克羅恩病，炎性腸病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，肌炎，多發(fā)性硬化，視神經(jīng)脊髓炎，動脈粥樣硬化，牛皮癬，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(例如中樞神經(jīng)系統(tǒng)的狼瘡或狼瘡性腎炎)，腎炎，腎小球腎炎，自身免疫性肝膽疾病(例如自身免疫性肝炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化或原發(fā)性硬化性膽管炎)，移植物抗宿主病，特應(yīng)性皮炎，哮喘，神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默氏病)，脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根病(例如格-巴二氏綜合征或慢性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根病)，神經(jīng)病性疼痛，癌癥的內(nèi)臟痛，動脈粥樣硬化，年齡相關(guān)性黃斑變性，糖尿病性腎病，肉瘤樣病起源的葡萄膜炎，糖尿病，淋巴瘤氣管支氣管炎，變應(yīng)性超敏反應(yīng)或分泌過多狀況例如慢性支氣管炎和囊性纖維化，不同病因?qū)W的肺纖維化(例如特發(fā)性肺纖維化)，慢性阻塞性肺疾病(C0PD)，肉瘤樣病，變應(yīng)性和非變應(yīng)性鼻炎，變應(yīng)性或非變應(yīng)性蕁麻疹，特征在于失調(diào)的炎癥、組織重塑、血管發(fā)生和贅生物的皮膚相關(guān)疾病，胃腸道的疾病例如赫希施普龍氏病、腹瀉、吸收不良狀況和炎性狀況，中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的病癥例如抑郁、焦慮狀態(tài)、帕金森氏病、偏頭痛和其他形式的顱疼痛、中風(fēng)和嘔吐，免疫系統(tǒng)例如在脾和淋巴組織中的疾病，自身免疫疾病或其他免疫相關(guān)疾病，心血管系統(tǒng)的疾病例如肺水腫、高血壓、先兆子癇、復(fù)雜區(qū)域性疼痛綜合征2型和中風(fēng)，慢性炎性疾病例如關(guān)節(jié)炎，骨相關(guān)疾病，慢性疼痛例如纖維肌痛，尋常座瘡，急性呼吸窘迫綜合征，阿狄森氏病、變應(yīng)性眼內(nèi)炎性疾病，ANCA相關(guān)小血管脈管炎，強(qiáng)直性脊柱炎，自身免疫性溶血性貧血，貝切特氏病，貝爾氏麻痹，大皰性類天皰瘡，腦缺血癥，肝硬化，寇甘氏綜合征，接觸性皮炎，庫興氏綜合征，皮肌炎，盤狀紅斑狼瘡，嗜酸性粒細(xì)胞筋膜炎，結(jié)節(jié)性紅斑，剝落性皮炎，局灶性腎小球硬化，局灶性節(jié)段性腎小球硬化，節(jié)段性腎小球硬化，巨細(xì)胞動脈炎，痛風(fēng)，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，手部濕疹，亨諾-許蘭二氏紫癜，妊娠皰疹，多毛癥，特發(fā)性角膜鞏膜炎，特發(fā)性血小板減少性紫癜，免疫性血小板減少性紫癜，炎性腸或胃腸病癥，炎性皮膚病，扁平苔蘚，淋巴瘤氣管支氣管炎，黃斑水腫，重癥肌無力，非特異性纖維肺病，骨關(guān)節(jié)炎，胰腺炎，妊娠性類天皰瘡，尋常天皰瘡，牙周炎，結(jié)節(jié)性多發(fā)性動脈炎，風(fēng)濕性多肌痛，陰囊瘙癢，瘙癢(pruritis) /炎癥，牛皮癬關(guān)節(jié)炎，肺組織胞漿菌病，復(fù)發(fā)性多軟骨炎，酒糟鼻，肉瘤樣病，硬皮病，膿毒性休克綜合征，肩部腱炎或滑膜炎，斯耶格倫(Sjogren)氏綜合征；斯提耳(Still)氏病，Sweet氏病，系統(tǒng)性硬化病，高安氏動脈炎，顳動脈炎，中毒性表皮壞死松懈癥，移植排斥和移植排斥相關(guān)綜合征，肺結(jié)核，1型糖尿病，脈管炎，伏-小柳-原田三氏(VKH)病，和韋格納氏肉芽腫病?？贵w
用于制備且純化抗體或其FKN結(jié)合片段的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如，Kohler 等人，^Vatore 256:495-497 (Λ9 5、識ongo 等Jk，Hybridoma 14:253-260 (1995)；Harlow 等人，Antibodies :A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor LaboratoryPress),第2版(1988);Hammerling等人,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas(Elsevier),563-681 (1981) ;Ni, Xiandai Mianyixue, 26:265-268 (2006)；美國專禾Ij 號 7，189，826 ；7，078，492 ；禾Π 7，153，507 ；Vollmers 禾Π Brandlein, Histology andHistopathology 20:927—937 (2005) ;VolImers 禾口 Brandlein，ifeiAotfe and Findings inExperimental and Clinical Pharmacology 27:185-191 (2005) ；US 2006/258841 ；US2006/183887 ；US 2006/059575 ；US 2005/287149 ；US 2005/100546 ；和 US 2005/026229。嵌合抗體
嵌合抗體和產(chǎn)生其的方法是本領(lǐng)域眾所周知和確定的。如本文使用的，術(shù)語“嵌合抗體”意指抗體或其FKN結(jié)合片段具有衍生自非人哺乳動物、嚙齒類動物或爬行類動物的抗體氨基酸序列的至少一個可變結(jié)構(gòu)域的至少某些部分，而抗體或其FKN結(jié)合片段的其余部分衍生自人。例如，嵌合抗體可以包含具有人Fc或其他此類結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)域的小鼠抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。人源化抗體本發(fā)明涵蓋人源化抗FKN抗體及其FKN結(jié)合片段，其例如調(diào)節(jié)FKN和CX3CR1之間的相互作用。人源化可以借助于互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)嫁接法執(zhí)行(Kontermann和Dilbel,AntibodyEngineering, Springer Lab Manual (2001)禾口 Tsurushita 等 Α Methods 36:69-83(2005))。人源化還可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法通過用高變區(qū)序列取代人抗體的相應(yīng)序列執(zhí)行(參見例如，Jones 等人，胸tore 321:522-525 (1986) ;Riechmann 等人，^Vaiare332:323-327 (1988)；和 Verhoeyen 等人，239:1534-1536 (1988))。人源化抗體一般是人抗體，其中某些高變區(qū)殘基和可能地某些FR殘基通過來自非人抗體中的類似位點(diǎn)的殘基取代。在制備人源化抗體中使用的輕和重鏈人可變結(jié)構(gòu)域的選擇對于減少抗原性可以是重要的。根據(jù)“最佳擬合”法，嚙齒類動物抗體的可變結(jié)構(gòu)域的序列針對已知人可變結(jié)構(gòu)域序列的整個文庫進(jìn)行篩選。最接近于嚙齒類動物那種的人序列隨后接受為用于人源化抗體的人構(gòu)架。參見例如，Sims 等人，7； Immunol. 151 2296-2308 (1993)和 Chothia 等人，J. MoL Biol. 196:901-917 (1987)。另一種方法使用衍生自輕或重鏈特定亞組的所有人抗體的共有序列的特定構(gòu)架。相同構(gòu)架可以用于幾種不同人源化抗體。參見例如，Carter等人，Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289 (1992)和 Presta 等人，7； Immunol.151:2623-2632 (1993)。一般進(jìn)一步希望抗體是人源化的，保留對于抗原的高親和力和其他有利的生物學(xué)性質(zhì)。為了達(dá)到這個目標(biāo)，根據(jù)一個方法，使用親本和人源化序列的三維模型，通過分析親本序列和多種概念人源化產(chǎn)物的過程制備人源化抗體。三維免疫球蛋白模型是商購可得的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的。舉例說明且展示出所選的候選免疫球蛋白序列的可能三維構(gòu)象結(jié)構(gòu)的計算機(jī)程序是可獲得的。這些展示的檢查允許分析殘基在候選免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即分析影響候選免疫球蛋白結(jié)合其抗原的能力的殘基。以這種方式，F(xiàn)R殘基可以選擇且從受體和輸入序列組合，從而使得達(dá)到所需抗體特征，例如對于一種或多種靶抗原(例如FKN或其片段)增加的親和力。一般而言，CDR殘基直接且最實質(zhì)地涉及影響抗原結(jié)合。FKN結(jié)合片段
在本發(fā)明的特定實施方案中，提供了調(diào)節(jié)FKN和CX3CR1之間的相互作用的FKN結(jié)合片段。此類片段可以是完整、人源化和/或嵌合抗體的功能抗原結(jié)合片段，例如Fab、Fab'、F(ab’)2、？￥或^^￥ 片段(參見例如，Bird 等人，242:423-426 (1998))。此類片段通過直接來自重組轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的完整抗體的蛋白酶解消化通過例如木瓜蛋白酶消化(參見例如，WO 94Λ9348)產(chǎn)生。FKN結(jié)合片段可以使用下文描述的多種改造技術(shù)產(chǎn)生。Fv片段在其2條鏈之間具有比Fab片段更低的相互作用能量。為了穩(wěn)定VH和VL結(jié)構(gòu)域的結(jié)合，F(xiàn)v片段已與肽(參見例如，Bird等)κ,Science 242 423-426 (1998)和Huston等k, PNAS 85:5879-5883 (1998))、二硫橋(參見例如，Glockshuber 等人，SiocAewi1Siir29:1362-1367 (1990))、和“結(jié)進(jìn)孔(knob in hole)” 突變(參見例如，Zhu 等人，
Sci. 6:781-788 (1997))連接。kFv片段可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法產(chǎn)生(參見例如，Whitlow 等人，ifeiAoife入 2:97-105 (1991)和 Huston 等人，Rev.
Immunol. 10:195-217 (1993))。kFv可以在細(xì)菌細(xì)胞例如大腸桿菌(五co/i)中產(chǎn)生，但還可以在真核細(xì)胞中產(chǎn)生。^Fv的一個缺點(diǎn)是產(chǎn)物的單價，這排除由于多價結(jié)合增加的親合力，和kFv片段的短半衰期?？朔@些問題的嘗試包括通過化學(xué)偶聯(lián)(參見例如，Adams等Cancer Res. 53:4026-4034 (1993)和 McCartney 等人，Eng. 8:301-314(1995))或通過含有不成對C末端半胱氨酸殘基的kFv的自發(fā)性位點(diǎn)特異性二聚化(參見例如，Kipriyanov等人，CWi Biophys. 26:187-204(1995)),由含有另外C末端半胱氨酸WkFv產(chǎn)生的二價(ScFv')2?？商娲?，通過將肽接頭縮短至3 - 12個殘基，ScFv可以被迫形成多聚體，以形成“雙抗體”(參見例如，Holliger等人，/WA 90:6444-6448(1993))。減少接頭進(jìn)一步可以導(dǎo)致^Fv三聚體，以形成“三抗體”(參見例如，Kortt等人，ProteinEng. 10:423-433 (1997))，和四聚體，以形成“四抗體”(參見例如，Le (kill等人，/ Letters 453:164-168 (1999))。二價kFv分子的構(gòu)建還可以通過與蛋白質(zhì)二聚化基序的基因融合來達(dá)到，以形成“微型抗體”(參見例如，Vack等K, Biochemistry 31:1579-1584(1992))和“微體”(參見例如，Hu 等人，Career Tfes. 56:3055-3061 (1996))。ScFv-Sc-Fv串聯(lián)(GcFV) 2)還可以通過經(jīng)由第三個肽接頭連接2個kFv單位產(chǎn)生(參見例如，Kurucz等人，7； Immunol. 154:4576-4582 (1995))。經(jīng)由2個單鏈融合產(chǎn)物的非共價結(jié)合可以產(chǎn)生雙特異性抗體，所述融合產(chǎn)物含有通過短接頭與另一個抗體的VL結(jié)構(gòu)域連接的來自一個抗體的 VH 結(jié)構(gòu)域(參見例如，Kipriyanov 等人，J. Can. 77:763-772 (1998))。通過引入二硫橋或“結(jié)進(jìn)孔”突變或通過形成單鏈雙抗體(ScDb)，可以增強(qiáng)此類雙特異性抗體的穩(wěn)定性，其中2個雜交kFv片段通過肽接頭連接(參見例如，Kontermann等人，J.Immunol. Methods 226:179-188 (1999))。通過經(jīng)由鉸鏈區(qū)例如使kFv片段與IgG分子的CH3結(jié)構(gòu)域或Fab片段融合(參見例如，Coloma等人，Nature Biotechno 1. 15:159-163(1997))，四價雙特異性分子是獲得的?？商娲?，通過雙特異性單鏈雙抗體的融合(參見例如，Alt等人，/Zeiter1S 454:90-94 (1999))，四價雙特異性抗體是可獲得的。通過具有含有螺旋-環(huán)-螺旋基序的接頭的kFv-ScFv串聯(lián)(DiBi微型抗體)(參見例如，HYer等)κ, FEBS Letters 432:45-49 (1998))，或包含以阻止分子內(nèi)配對方向的4個抗體可變結(jié)構(gòu)域(VH和VL)的單鏈分子(串聯(lián)雙抗體)(參見例如，Kipriyanov等人，7； MoLBiol. 293:41-56 (1999))的二聚化，也可以形成較小的四價雙特異性分子。通過Fab’片段的化學(xué)偶聯(lián)或通過經(jīng)由亮氨酸拉鏈的異二聚化(參見例如，Sialaby等人，7； Exp. Med.175:217-225 (1992)和 Kostelny 等人，7； Immunol. 148:1547-1553 (1992))，可以制備雙特異性F (ab’)2片段。還可獲得的是分離的VH和VL結(jié)構(gòu)域(參見例如，在此引入作為參考的美國專利號 6，248，516 ；6，291，158 ；和 6，172，197)。藥物制劑
包含本發(fā)明的抗體或其FKN結(jié)合片段的治療制劑可以以水性或干燥制劑形式與生理學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑組合?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑包括例如鹽水；緩沖劑例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白)；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA ；糖醇例如甘露醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子例如鈉；或非離子型表面活性劑例如TWEEN 、PLUR0NICS 或PEG。本發(fā)明的抗體或其FKN結(jié)合片段可以陷入微膠囊、膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳液、納米顆粒或納米膠囊)或粗乳液中。當(dāng)抗體的持續(xù)釋放施用在具有適合于治療需要抗體施用的任何病癥的釋放特征的制劑中是需要的時，可以考慮抗體的微膠囊封裝。持續(xù)釋放基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚乳酸酯(參見例如，美國專利號3，773，919)、L-谷氨酸和、乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物例如LUPRONDEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的可注射微球體)和聚-D- (-)-3-羥丁酸。待用于體內(nèi)施用的制劑必須是無菌的。這通過經(jīng)由無菌濾膜過濾容易地完成。組合治療
本發(fā)明的治療抗體或其FKN結(jié)合片段可以單獨(dú)或與其他組合物組合在治療中使用。例如，本發(fā)明的抗體可以與下述中的一種或多種共施用另一種抗體、抗炎劑、細(xì)胞毒劑、抗血管生成因子、細(xì)胞因子、生長抑制試劑或抗TNF-α治療。此類組合治療包括組合施用(其中2種或更多種試劑包括在相同或分開的制劑中)和分開施用(例如同時或序貫地)。當(dāng)2種或更多種試劑分開施用時，本發(fā)明的抗體的施用可以在附加治療的施用前或后發(fā)生。與抗FKN抗體或其FKN結(jié)合片段組合施用的治療試劑的有效量將根據(jù)醫(yī)生的判斷。劑量測定計算為達(dá)到待治療狀況的最大限度管理。劑量將另外取決于此類因素，如待使用的治療試劑的類型和待治療的特定受試者。由于另外治療試劑和抗FKN抗體或其FKN結(jié)合片段的組合作用(協(xié)同作用)，合適劑量可以降低?？寡讋?br> 抗炎化合物可以與本發(fā)明的抗體或FKN結(jié)合片段組合施用。示例性抗炎劑包括類固醇例如糖皮質(zhì)激素、非留體抗炎藥(例如布洛芬或他克莫司)、環(huán)加氧酶-2-特異性抑制劑例如羅非昔布(Vioxx )和塞來昔布(Celebrex )、皮質(zhì)類固醇(例如潑尼松或氫化可的松)、針對T淋巴細(xì)胞功能的特異性細(xì)胞因子、氟比洛芬、雙氯芬酸和酮咯酸(ketarolac)。參見例如，在此引入作為參考的美國專利號7，112，578和7，199，119。其他試劑
可以施用的其他治療試劑包括例如氨基水楊酸鹽(例如5-氨基水楊酸)、柳氮磺胺吡啶(例如柳氮磺吡啶(azulfadine)、美沙拉嗪(例如Asaco?；騊entasa )、硫唑嘌呤(例如ImurarO、6-巰嘌呤(例如PurinethoΓ)、環(huán)孢菌素、氨甲蝶呤、英夫利昔單抗(例如Remicade )、干擾素(例如干擾素-β )、乙酸格拉默(例如Copaxone )、那他珠單抗(Tysabri )、抗整聯(lián)蛋白α 4、熊去氧膽酸、鹽酸他克林、HMG CoA還原酶抑制劑、利多卡因、磺酰脲、環(huán)磷酰胺、靜脈內(nèi)免疫球蛋白、阿米替林、阿片類(例如嗎啡)、地芬諾酯、阿托品、維生素D、鈣、拉莫三嗪、喹硫平、前列腺素Ε1、硝酸甘油、培加尼布、雷珠單抗、二硝酸異山梨酯、哌羅匹隆、托吡酯、奧卡西平、多巴胺、霉酚酸酯、咪唑立賓、左乙拉西坦、芬太尼、曲馬多、洋地黃、辣椒辣素、利鈉肽、羥氯喹、-dronates (例如阿屈膦酸鹽)、苯扎貝特、美西律、格列奈類(例如那格列奈或瑞格列奈)、鹽酸多奈哌齊、來氟米特、普瑞巴林、酒石酸卡巴拉汀、芬太尼、前列腺環(huán)素、普魯卡因胺、秋水仙堿、α -葡糖苷酶抑制劑、利尿劑(例如噻嗪類利尿劑或抗醛固酮利尿劑)、他克莫司、鹽酸美金剛、噴他佐辛、氯吡格雷、組織型纖溶酶原激活物、沙立度胺、血管收縮素受體阻斷劑、噻唑烷二酮、甲硝唑、螺內(nèi)酯、度洛西汀、帕羅西汀、可樂定、噻氯匹定、肝素、鈣通道阻斷劑、胰島素、白蛋白、布西拉明、卡馬西平、利培酮、利馬前列素、華法林、維替泊芬、加巴噴丁、氫溴酸加蘭他敏、阿司匹林、尿激酶、苯丁酸氮芥、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、雙胍、β -腎上腺素能受體抑制劑或激動劑、羥氯喹和米托蒽醌。
本文描述的病癥(例如炎性病癥)的治療可以另外涉及其他治療的施用。例如，血漿去除術(shù)(例如血漿交換治療)可以用于治療例如格-巴二氏綜合征、脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根病(例如慢性炎性脫髓鞘多發(fā)性神經(jīng)根病)、特發(fā)性血小板減少性紫癜(TTP)、貝切特氏病或多發(fā)性硬化。劑量和施用
炎性病癥的減輕或治療一般涉及與病癥有關(guān)的一種或多種癥狀或并發(fā)癥的減少。在炎性病癥的情況下，治療抗體、其FKN結(jié)合片段或藥物組合物的治療有效量可以完成下述中的一種或組合減少炎癥；減少腹痛或絞痛(cramping)；減少胃氣脹；減少或消除腹瀉；減少消化道的潰瘍形成；減少發(fā)熱；減少或緩解惡心；減少疲乏；使重量減輕降到最低；緩和關(guān)節(jié)疼痛；減少腫脹；止癢或皮疹；消除黃疸；和/或緩解與炎性病癥相關(guān)的一種或多種癥狀。待施用的抗體的“治療有效量”是阻止、改善或治療炎性病癥所需的最低限度量。本文描述的抗體、FKN結(jié)合片段和藥物組合物依照已知方法施用于受試者，例如作為推注劑或通過經(jīng)過一段時間的連續(xù)輸注的靜脈內(nèi)施用、局部、經(jīng)口、皮下、通過支氣管注射、腦內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、肺內(nèi)、經(jīng)陰道、經(jīng)直腸、關(guān)節(jié)內(nèi)、動脈內(nèi)、損傷內(nèi)、腸胃外、在腦中的腦室內(nèi)或眼內(nèi)。如果廣泛副作用或毒性與治療相關(guān)，那么局部施用可以是特別需要的。用于經(jīng)口使用的制劑還可以作為咀嚼片，或作為其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合的硬明膠膠囊，或作為其中活性成分與水或油介質(zhì)混合的軟明膠膠囊提供。先體外后體內(nèi)策略也可以用于治療應(yīng)用。先體外后體內(nèi)策略涉及用編碼抗體或抗體片段的多核苷酸轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)得自受試者的細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞隨后送回受試者。細(xì)胞可以是廣泛范圍類型中的任何，包括但不限于造血細(xì)胞(例如骨髓細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、T細(xì)胞或B細(xì)胞)、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、角化細(xì)胞或肌細(xì)胞。本發(fā)明的組合物的施用劑量和時機(jī)取決于多種臨床因素，包括受試者的總體健康和炎性病癥癥狀的嚴(yán)重性。治療可以繼續(xù)范圍為1天-4年、1天-3年、1天-2年、1天-1年、1 - 100天、1 - 60天、1 - 20天、1 - 10天的時間段，或直至炎性病癥或炎性病癥的癥狀被治療或緩和。本發(fā)明的組合物可以每天4次、每天3次、每天2次、每天1次、每周1次、每月2次、每月1次、每2月、每3月或每年施用。劑量取決于狀況的嚴(yán)重性改變，并且逐步增加至達(dá)到范圍為約1 ng/mL - 10 μ g/mL或1 - 500 ng/mL的穩(wěn)態(tài)血液血清濃度。施用的抗體量一般在約0.001 -約30 mg/kg受試者重量(例如0.01 -約10 mg/kg受試者重量)范圍中。
實施例本發(fā)明通過下述實施例舉例說明，所述實施例決不預(yù)期是本發(fā)明的限制。實施例1.小鼠抗人CXXXC趨化分子(hFKN)單克隆抗體的制備
如先前所述生成小鼠抗hFKN單克隆抗體(mAb)(參見例如，在此引入作為參考的美國專利號 7, 390，490)。獲得中禾口 mAb 克隆 1F3_1、3A5_2、1F3、1G1、2B2、3D5、3H7、6D1、7F6 和5H7-6。實施例2.用于人源化的候選mAb的選擇
使用用于測量中和活性的趨化性測定，用于測量與hFKN的結(jié)合親和力的BIAC0RE 測
17定，和用于測量與食蟹猴FKN的物種交叉反應(yīng)性的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，分析克隆1F3-U3A5-2和5H7-6。中和活性、結(jié)合親和力和與食蟹猴FKN的物種交叉反應(yīng)性概括于圖2中?？寺?A5-2顯示最高中和活性和對于hFKN的最高結(jié)合親和力。克隆3A5-2顯示與食蟹猴FKN和hFKN的相等反應(yīng)性。因此，克隆3A5-2選擇為用于人源化的候選物。趨化性測定如下執(zhí)行。將細(xì)胞置于transwell培養(yǎng)板(MultiScreen-MIC Plate,5.0 ym，Millipore，目錄號MAMIC 5S10)的上層孔中，而在下層孔中具有配體。首先，使重組人FKN (R&D Systems,目錄號362-CX/CF) (33 ng/ml終濃度)(圖1)與不同濃度(0 - 10μ g/ml)的純化抗體在室溫預(yù)溫育。組合物含有下述組分IOx趨化因子溶液，15 μ 1/孔；IOx純化的mAb, 15 μ 1/孔；禾口 Ix趨化性緩沖液(溶于RPMI1640 Gnvitrogen)中的0. 5%BSA,0. 5% FBS,20 mM HEPES(pH 7. 4),50 μ M 2-巰基乙醇)，120 μ 1/孔。在 30 分鐘后，將由CX3CR1 (2χ105細(xì)胞/75 μ 1)轉(zhuǎn)染的Β300. 19細(xì)胞應(yīng)用于上層孔，并且在5%-CO2溫箱中在37°C溫育4小時。在溫育后，收集下層孔的150 μ 1溶液，用50 μ 4% PFA/PBS固定，并且將30 μ 1樣品應(yīng)用于FACSCantoII細(xì)胞分析儀，以計數(shù)遷移的細(xì)胞。BIAC0RE 測定如下執(zhí)行。將重組蛋白質(zhì)A/G (Pierce Chemical)固定在BIAC0RE 傳感器芯片(CM5)上，所述傳感器芯片用胺偶聯(lián)試劑(GE Healthcare)預(yù)活化。將純化的mAb以0. 2 μ g/ml的濃度加入傳感器芯片內(nèi)。將可溶性抗原(與分泌型堿性磷酸酶(SEAP)或?qū)φ誗EAP蛋白質(zhì)綴合的可溶性FKN)以不同濃度(0 - 200 nM)加入傳感器芯片內(nèi)。連續(xù)監(jiān)控在傳感器芯片上捕獲的加入抗原與mAb的結(jié)合，并且使用BIACORE AlOO系統(tǒng)(GEHealthcare)測定抗原的相對結(jié)合應(yīng)答。ELISA 如下執(zhí)行。將多克隆抗兔 IgG 抗體(Jackson ImmunoResearchLaboratories,目錄號711-005-152)包被在96孔板(Nunc，目錄號44M02)的孔上。在4°C過夜溫育后，將孔用Ix Block-Ace (DainipponPharma)在室溫封閉1小時。在用0.05%Tween 20/PBS洗滌3次后，將10 nM兔多克隆抗PLAP抗體(Biomeda)加入孔中(50 μ 1/孔)。在室溫溫育1小時且如上所述洗滌3次后，將含有hFKN-SEAP或食蟹猴FKN-SEAP的培養(yǎng)上清液加入(1 nM終濃度)孔中，并且在室溫溫育1小時。在洗滌3次后，將純化的抗hFKN mAb以不同濃度(0 - 10 μ g/ml)加入孔中。在溫育1小時且洗滌3次后，將辣根過氧化物酶綴合的抗小鼠IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories,目錄號715-036-151)以0. 16 μ g/ml (50 μ 1/孔)加入，并且在室溫溫育1小時。在洗滌3次后，將TMB (3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)溶液加入孔中，并且允許溫育15-30分鐘。將等體積的停止液(2 M &S04)加入孔中，并且通過微板閱讀器(Arvo，PerkinElmer)讀出在450 nm的光密度?？扇苄詇FKN-SEAP如下制備。編碼hFKN的細(xì)胞外區(qū)域的cDNA用5，-Sall-hFKN引物(CGCGTCGACGCCACCAT-GGCTCCGATATCTCTGTC ；SEQ ID NO :2)和 3，-Notl-hFKN 引物(GCGGGCG-GCCGCCCTCCGGGTGGCAGCCTGGG ；SEQ ID NO :3)擴(kuò)增，并且亞克隆到含有 SEAP cDNA 的pcDNA3. l( + )dSalI SEAP 載體內(nèi)。將 hFKN-SEAP 的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到 HEI^93EBNA(HEI^93E)細(xì)胞(Invitrogen)內(nèi)。在轉(zhuǎn)染前一天，用HEK293E細(xì)胞接種補(bǔ)充有10%胎牛血清的DMEM(Invitrogen)。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，將培養(yǎng)基更換為0ΡΤΙ-ΜΕΜ II無血清培養(yǎng)基(Invitrogen)。根據(jù)制造商的說明書，用TransIT LTl (TAKARA)轉(zhuǎn)染表達(dá)載體。在溫育(5% CO2在37°C )3天后，收獲培養(yǎng)上清液。使用Great EscAPe SEAP化學(xué)發(fā)光試劑盒2. 0 (Clontech)測量SEAP蛋白質(zhì)的濃度?？扇苄允承泛颋KN-SEAP如下制備。編碼食蟹猴FKN的細(xì)胞外區(qū)域的cDNA用5，-XhoI-食蟹猴!7KN 引物(GCGCTCGAGGCCACCATGGCTCCGATA-TCTCTGTCGTGG ；SEQ ID NO 4)和 3，-NotI-食蟹猴 FKN 引物(CGCGGCGGCCGCGGTGGCAGCCTGGGAGTCAGGGAC ；SEQ ID NO 5)擴(kuò)增，并且亞克隆到含有SEAP cDNA的pENTRIA (Invitrogen)內(nèi)。通過使用GATEWAY系統(tǒng)anvitrogen)，將編碼食蟹猴FKN和SEAP的片段轉(zhuǎn)移至含有盒B的pcDNA3. 1。如上所述制備含有食蟹猴FKN-SEAP的培養(yǎng)上清液。實施例3.克隆3A5-2小鼠抗hFKN mAb的重和輕鏈的可變區(qū)的cDNA克隆通過RT-PCR擴(kuò)增克隆3A5-2的重和輕鏈的cDNA。用RNeasy Mini Kit (QIAGEN)
從克隆3A5-2的雜交瘤中提取總RNA。通過使用總RNA，使用cDNA合成試劑盒(TAKARA)合成cDNA，并且分別地對于重鏈用下述擴(kuò)增5’ -Mm-HC-前導(dǎo)區(qū)1引物(GGGATGGRATGSAG-CTGKGTMATSCTCTT ；SEQ ID NO 6),5' - Mm-HC-前導(dǎo)區(qū) 2 弓丨物(GGGATGRA-CTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT ；SEQ ID NO 7)或 5，- Mm-HC-前導(dǎo)區(qū) 3 引物(GGGATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT ；SEQ ID N0:8)和 3，- Mm-IgG^i-CH3-R 引物(TCATTTACCCGGAGTCCGGGAGAAGCTCTTAGTC ；SEQ ID NO :9)，并且對于輕鏈用下述擴(kuò)增5，- Mm-LC-前導(dǎo)區(qū) 1 弓丨物(GGGATGGAGACAGACACA-CTCCTGCTAT ；SEQ ID NO 10)或 5，- Mm-LC-前導(dǎo)區(qū) 2 弓丨物(GGGATGGATTTT-CAGGTGCAGATTTTCAG ;SEQ ID NO :11)或 5，- Mm-LC-前導(dǎo)區(qū) 3 弓丨物(GGGATGRAGTCACAKACYCAGGTCTTYRTA ;SEQ ID NO :12)或 5，- Mm-LC-前導(dǎo)區(qū) 4 弓丨物(GGGATGAGGKCCCCWGCTCAGYTYCTKGGR ;SEQ ID NO :13)或 5，- Mm-LC-前導(dǎo)區(qū) 5 弓I *(GGGATGAAGTTGGCTGTTAGGCTGTTG;SEQ ID NO :14)禾口 3，- Mm-C κ -R 弓| 物(CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTC ；SEQ ID NO :15)。將擴(kuò)增的 cDNA 亞克隆到 pCR2. 1 載體(Invitrogen)內(nèi)。使用ABI3130XL分析序列。獲得全長重鏈和L鏈的5’截短形式。為了擴(kuò)增L鏈的截短區(qū)域，并且鑒定精確的前導(dǎo)序列，執(zhí)行cDNA末端的5’快速擴(kuò)增(5，-RACE)。使用cDNA合成試劑盒(TAKARA)制備雙鏈cDNA，并且加入5，銜接子(使ad29S ；ACATCACTC-CGT (SEQ ID NO: 16)和 as29AS ;ACGGAGTGATGTCCGTCGACGTATCTCTGC_GTTGATACTTCAGCGTAGCT (SEQ ID NO :17)退火)。分別地，對于第一個 PCR，用 5，-PCRl 引*(GTATCAACGCAGAGATACGTCGACGG;SEQ ID NO :18)，并且對于第二個 PCR，5，-PCR4 引物(AGCTACGCTGAAGTATCAACGC-AG-AG ；SEQ ID NO 19)，并且對于第一個 PCR，3，HC RACE 引物_1 (GTACGGA-GTACTCCAAAAATGTTG ；SEQ ID NO :20)，或?qū)τ诘诙€ PCR，3，HC RACE 弓丨物 _2(TCTTCAGGCTGCAGGCTGATGATC ；SEQ ID NO :21)用于 H 鏈，對于第一個 PCR，3，LC RACE 引物_3 (AAATCTTCAGGCTGCAGGCTGTTG ；SEQ ID NO :22)，或?qū)τ诘诙€ PCR，3，LC RACE 弓丨物 _4(CTGTTGATCTTGAGAGAATAT-TGTG ；SEQ ID NO 23)用于 L 鏈，擴(kuò)增 cDNA。如上所述亞克隆且測序擴(kuò)增的cDNA。鑒定的可變區(qū)序列如下。重(H)鏈可變區(qū)的核苷酸序列CTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGCGC5GAATATTCACAATTTTTTAGCATGG
TATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCMnrCCTGGTCTATAATGAAAAAA
CCTTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACA
ATAWCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTWGGGATTTATTTCT
GTCAACAGWTTGOAGTACTCCGTATACGWCGGAGGGGGGACCAAGCTGGA
重(H)鏈可變區(qū)的氨基酸序列
實施例4.來自克隆3A5-2的人源化抗FKN mAb的設(shè)計
小鼠抗hFKN mAb克隆3A5-2借助于互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)嫁接法進(jìn)行人源化(Kontermann 禾口 Diibel, Antibody Engineering, Springer Lab Manual (2001)禾口 Tsurushita 等人, Methods 36:69-83 (2005))。CDR 的氨基酸序列如下。
在人可變區(qū)區(qū)段中選擇人受體構(gòu)架。將3A5-2的鑒定CDR移植到所選人受體構(gòu)架內(nèi)。設(shè)計的人源化序列如下。H 鏈(指定為 H3 :SEQ ID NO :36)
QVQLVQSGAEVKiCPGASVKVSCKASGYTFTNYYIHWVICQAPGQGLEWIGWIYP GTCSPKTOERFKGRWLTADKS'TOTAYMLLSSLRSDDTAVYFCATGPTDGDYFD
H 鏈(指定為 H3-2 :SEQ ID NO :37)
H 鏈(指定為 H4:SEQ ID NO :39)
關(guān)于L鏈的種系序列(SEQ ID NO 41)
H 鏈(指定為 HK2 :SEQ ID NO :42)
H 鏈(指定為 HK3 jSEQ ID NO :43)
L 鏈(指定為 L4 :SEQ ID NO :44)L 鏈(指定為 L5 :SEQ ID NO :45)
比對了所有人源化序列(圖3和4)。實施例5.人源化抗hFKN mAb的表達(dá)載體的構(gòu)建
為了選擇用于表達(dá)人源化mAb的前導(dǎo)序列，基于與AAA68427. 1和ABU90602. 1的相似性搜索種系區(qū)段。區(qū)段VH1-1-18和VKI-012分別最類似于AAA68427. 1和ABU90602. 1。它們的前導(dǎo)序列用于表達(dá)人源化mAb。它們的前導(dǎo)序列如下。H 鏈氨基酸序列(SEQ ID NO 46)
H鏈核苷酸序列
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTTTCTTGGTGGCAGCACCAACAGGTGCCCACTCC (對于 H3 和 H3-2 ； SEQ ID NO 47)
ATGGACTGGACATGGTCCATCCTGTTCCTGGTGGCCGCTCCAACTGGCGCACACTCT (對于 HK2 和 HK3 ； SEQ ID NO 48)
L鏈氨基酸序列(SEQ ID NO 49)
L鏈核苷酸序列(SEQ ID NO 50)
atggacatgagggtccccgctc
^ggtgccagatgt
用下述引物通過PCR生成具有上述前導(dǎo)序列加入的設(shè)計人源化抗hFKN mAb的可變區(qū),
對于H3重鏈
h3A5-2_VH3-l 引物(SEQ ID NO :51)
ATGGACTGGACCTGGAGCATCCTTITCTTGGTGGCAGCACCAACAGGTGC h3A5-2_VH3-2R 引物(SEQ ID NO 52)
vvAijAi^ I ijvAl^vAijv I νινΛν,ν 麗 ijljijAAj I UiijljvAvv 1 ij 1 1 IjIJ I IJI | UH/^l
h3A5-2_VH3-3 引物(SEQ ID NO :53): 3TGCAGCTGGTGCAGTCTGGGOC h3A5-2_VH3-4R 引物(SEQ ID NO :54) GTGTATCCAGAAGCCTTGCAGGi h3A5-2_VH3-5 引物(SEQ ID NO :55) TCAlAAGGCTmviGAJ AC ACCTT. h3A5-2_VH3-6R 引物(SEQ ID NO :56): ATCCACTCAAGCCCTTGTCCAGGOGC h3A5-2_VH3-7 引物(SEQ ID NO :57): 〔；GAC AAGGGCTIGAGTGGAr AGG ATCh3A5-2_VH3-8R 引物(SEQ ID NO 58)
h3A5-2_VH3-9 引物(SEQ ID NO 59)
h3A5-2_VH3-10R 引物(SEQ ID NO 60)
h3A5-2_VH3-ll 引物(SEQ ID NO :61)
h3A5-2_VH3-12R 引物(SEQ ID NO :62)
h3A5-2 VH3-13 引物(SEQ ID NO :63)
h3A5-2_R 引物(SEQ ID NO :64)
對于L2輕鏈
h3A5-2_VL2-l 引物(SEQ ID NO :65): GCCACCATGGACATGAGGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGC GCICCGAGGTGCCAGAl
h3A5-2_VL2-2R 引物(SEQ ID NO :66):
TCCTACAGATGCAGACAGGGAGGATGGAGACTGGGTCATCTGGATGTCACAT
h3A5-2_VL2-3 引物(SEQ ID NO :67)
h3A5-2_VL2-4R 引物(SEQ ID NO :68)
h3A5-2_VL2-5 引物(SEQ ID NO :69):
CAGGGAAAGCCCCTAAGWCCI'GGTCTATAATGAAAAAACCTTAGCAGATGG GGTCCCATCAAGG'ITCAG h3A5-2_VL2-6R 引物(SEQ ID NO :70):
h3A5-2_VL2-7 引物(SEQ ID NO :71h3A5-2_VL2-8R 引物(SEQ ID NO 72)
權(quán)利要求
1 .ー種抗CXXXC趨化分子抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段包含28的氨基酸序列的⑶R-Hl 29的氨基酸序列的⑶R-H2 30的氨基酸序列的⑶R-H3 31的氨基酸序列的⑶R-Ll 32的氨基酸序列的⑶R-L2 ;和 33的氨基酸序列的⑶R-L3。
2.權(quán)利要求I的抗體，其中所述抗體是完整抗體。
3.權(quán)利要求I或2的抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述抗體或FKN結(jié)合片段是人源化的。
4.權(quán)利要求3的抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述抗體 或FKN結(jié)合片段的重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 39、 SEQ ID NO: 42或SEQ ID NO: 43的氨基酸序列，并且其中所述抗體或FKN結(jié)合片段的輕鏈 可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: 38、SEQ ID NO: 44或SEQ ID NO: 45的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求1、2、3或4的抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述抗體或FKN結(jié)合片段是嵌 合的。
6.權(quán)利要求5的抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述抗體包含重鏈和輕鏈，其中所述抗體 的重鏈可變結(jié)構(gòu)域包含SEQ ID NO: 26的氨基酸序列，并且其中所述抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu) 域包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求1-6中任ー項的抗體或其FKN結(jié)合片段，其包含人恒定區(qū)。
8.權(quán)利要求7的抗體或其FKN結(jié)合片段，其包含IgG同種型的恒定區(qū)。
9.權(quán)利要求8的抗體或其FKN結(jié)合片段，其包含IgG2同種型的恒定區(qū)。
10.權(quán)利要求1-9中任ー項的抗體或其FKN結(jié)合片段，其包含突變的Fe區(qū)，從而使得所 述抗體具有減少的ADCC和/或補(bǔ)體激活。
11.權(quán)利要求10的抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述Fe區(qū)在V234、G237、C131或C219 中的ー個或多個上是突變的。
12.權(quán)利要求I或3-9中任ー項的抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述FKN結(jié)合片段選 自Fab、Fab’、F(ab’) 2和Fv，并且其中所述FKN結(jié)合片段保留對于CXXXC趨化分子的結(jié)合 特異性。
13.權(quán)利要求1-12中任ー項的抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述抗體抑制CXXXC趨化 分子和CX3CR1之間的結(jié)合。
14.ー種藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-13中任ー項的抗體或其FKN結(jié)合片段。
15.
16.
17.
18.或部分。
19.權(quán)利要求17或18的核酸，其中所述核酸編碼所述抗體或其FKN結(jié)合片段的輕鏈的 全部或部分。Ca)包含 SEQ ID NO(b)包含SEQ ID NO(c)包含SEQ ID NO Cd)包含 SEQ ID NO Ce)包含 SEQ ID NO Cf)包含 SEQ ID NO權(quán)利要求14的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)ー步包含載體。權(quán)利要求14或15的藥物組合物，其中所述組合物進(jìn)ー步包含另外的治療劑。ー種核酸，其編碼權(quán)利要求1-13中任ー項的抗體或其FKN結(jié)合片段。權(quán)利要求17的核酸，其中所述核酸編碼所述抗體或其FKN結(jié)合片段的重鏈的全部
20.一種載體，其包含權(quán)利要求17-19中任一項的核酸。
21.權(quán)利要求20的載體，其中所述載體是表達(dá)載體。
22.—種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求20或21的一種或多種載體。
23.權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞包含第一種和第二種載體，所述第一種載體包含編碼權(quán)利要求1-13中任一項的抗體或其FKN結(jié)合片段的重鏈的核酸，并且所述第二種載體包含編碼權(quán)利要求1-13中任一項的抗體或其FKN結(jié)合片段的輕鏈的核酸。
24.權(quán)利要求23的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞中所述重鏈和輕鏈的表達(dá)產(chǎn)生權(quán)利要求1-13中任一項的抗體或其FKN結(jié)合片段。
25.權(quán)利要求22-24中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是原核的。
26.權(quán)利要求22-24中任一項的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是真核的。
27.權(quán)利要求沈的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是哺乳動物的。
28.權(quán)利要求27的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞或NSO細(xì)胞。
29.一種用于制備抗CXXXC趨化分子抗體或其FKN結(jié)合片段的方法，所述方法包含(a)在合適宿主細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求20或21中任一項的載體，和(b)回收所述抗體或其FKN結(jié)合片段。
30.權(quán)利要求四的方法，其中所述抗體或其FKN結(jié)合片段通過所述宿主細(xì)胞分泌到培養(yǎng)基內(nèi)。
31.權(quán)利要求30的方法，其中所述抗體或其FKN結(jié)合片段純化至就含所述抗體的培養(yǎng)基而言至少95%或更大。
32.一種用于治療炎性病癥的方法，其包含給需要此種治療的受試者施用有效量的權(quán)利要求1-13中任一項的抗體或其FKN結(jié)合片段，由此治療所述炎性病癥。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述炎性病癥是潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、多發(fā)性硬化或神經(jīng)病性疼痛。
34.一種抗CXXXC趨化分子抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述抗體或其片段包括包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的重鏈和包含SEQ ID NO: 44的氨基酸序列的輕鏈。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-13或權(quán)利要求34中任一項的抗體或其FKN結(jié)合片段，其用于在治療炎性病癥中使用。
36.權(quán)利要求35的抗體或其FKN結(jié)合片段，其中所述炎性病癥是潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、多發(fā)性硬化或神經(jīng)病性疼痛。
37.根據(jù)權(quán)利要求1-13或權(quán)利要求34中任一項的抗體或其FKN結(jié)合片段在制備用于在治療炎性病癥中使用的藥物中的用途。
38.權(quán)利要求37的用途，其中所述炎性病癥是潰瘍性結(jié)腸炎、克羅恩病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫性肝炎、多發(fā)性硬化或神經(jīng)病性疼痛。
全文摘要
本發(fā)明的特征在于涉及結(jié)合CXXXC趨化分子的人源化抗體及其FKN結(jié)合片段的組合物和方法。
文檔編號A61P1/04GK102597003SQ201080049138
公開日2012年7月18日 申請日期2010年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月30日
發(fā)明者今井俊夫, 坂本佳正, 河野鐵, 西村美由希 申請人:衛(wèi)材R&D管理有限公司