專利名稱：Pcsk9疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提供新的免疫原，其包含優(yōu)選與免疫原性載體連接的抗原性PCSK9 肽，用于預(yù)防、治療或者減輕PCSK9相關(guān)疾病。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這些藥物、其免疫原性組合物及藥物組合物的生產(chǎn)方法以及它們在醫(yī)藥學(xué)中的應(yīng)用。背景前蛋白轉(zhuǎn)換酶(Proprotein convertase)枯草桿菌蛋白酶-kexin 9型(后文稱作PCSK9),也稱作神經(jīng)細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)換酶I (neural apoptosis-regulated convertase 1，NARC-I)，其是一種蛋白酶K樣subtilase，被鑒別為哺乳動物PCSK家族第9個成員，見 Seidah et al,2003PNAS 100 :928-933 所述。PCSK9 基因位于人染色體 1ρ33_ρ34· 3。PCSK9 在能增殖和分化的細(xì)胞中表達(dá)，包括例如肝細(xì)胞、腎間充質(zhì)細(xì)胞、回腸和結(jié)腸上皮細(xì)胞以及胚胎端腦神經(jīng)元。PCSK9最初的合成是 72-kDa的無活性酶前體形式或者酶原形式，其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中經(jīng)歷自身催化、分子內(nèi)加工以激活其功能性。人PCSK9的基因序列的長度為 22-kb,具有12個外顯子,編碼692個氨基酸的蛋白質(zhì),所述基因序列可見于例如Deposit No. NP_777596. 2。人、小鼠和大鼠PCSK9核酸序列已經(jīng)保藏，參見例如分別為GenBank Accession No AX127530 (也稱作 AX207686)、AX207688 和 AX207690。人PCSK9是一種分泌蛋白，主要在腎、肝和腸中表達(dá)。其具有三個結(jié)構(gòu)域抑制性前結(jié)構(gòu)域(pro-domain)(第1-152位氨基酸，包括在第1_30位氨基酸的信號序列)、催化結(jié)構(gòu)域(第153-448位氨基酸)以及長度為210個殘基的富含半胱氨酸殘基的C末端結(jié)構(gòu)域(第449-692位氨基酸)。PCSK9作為酶原被合成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)歷在前結(jié)構(gòu)域與催化結(jié)構(gòu)域之間的自身催化裂解。所述前結(jié)構(gòu)域在裂解后保持與成熟蛋白質(zhì)結(jié)合，分泌復(fù)合物。富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域可能發(fā)揮與其它弗林蛋白酶/Kexin/枯草桿菌蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的P-(加工)結(jié)構(gòu)域相似的作用，其似乎是激活的蛋白酶的折疊和調(diào)節(jié)所必需的。 PCSK9中的突變與血漿中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)的異常水平相關(guān)(Horton et al.， 2006Trends. Biochem. Sci. 32(2) :71-77)。PCSK9在肝細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞的分化中起作用(Seidah et al，如前)，在胚胎肝中高表達(dá)，且明顯參與膽固醇穩(wěn)態(tài)。鑒別有效治療心血管疾病的化合物和/或藥劑是高度期望的。在臨床實驗中已經(jīng)證實LDL膽固醇水平的降低與冠狀動脈病癥的比率直接相關(guān)，見Law et al,2003BMJ 326 1423-1427。此外，近來已經(jīng)示出血漿LDL膽固醇水平中等程度終生降低與冠狀動脈病癥發(fā)生率的實質(zhì)降低實質(zhì)相關(guān)，見Cohen et al，如前所述。甚至在具有非脂質(zhì)相關(guān)心血管風(fēng)險因子的高流行性群體中也見到如此狀況，見如前所述。因此，很重要的是鑒別可以控制LDL膽固醇水平的治療劑。因此，很重要的是產(chǎn)生抑制或者拮抗PCSK9活性及PCSK9在各種治療病癥中發(fā)揮的相應(yīng)作用的藥物。PCSK9的表達(dá)或上調(diào)與增高的血漿LDL膽固醇水平相關(guān)，PCSK9的抑制或者表達(dá)缺失與低LDL膽固醇血漿水平相關(guān)。顯然，與PCSK9中序列變異相關(guān)的較低水平的LDL膽固醇賦予針對冠心病的保護作用，見Cohen，2006N. Engl. J. Med. 354 :1264-1272。發(fā)明概述本發(fā)明涉及免疫原，其包含抗原性PCSK9肽及任選存在的免疫原性載體。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生任選地與免疫原性載體連接的這種抗原性PCSK9肽的方法。本發(fā)明還涉及免疫原性組合物，其包含任選地與免疫原性載體連接的這種抗原性 PCSK9肽，任選地包含一或多種佐劑，優(yōu)選一或兩種佐劑。本發(fā)明另一方面涉及藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物，以及涉及這種組合物的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。本發(fā)明特別涉及本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物用作藥物，優(yōu)選用于治療、減輕或預(yù)防PCSK9相關(guān)疾病。本發(fā)明特別涉及本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物用作藥物，優(yōu)選用于治療、減輕或預(yù)防與膽固醇水平增高相關(guān)的疾病。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽特別適于治療患有增高的LDL-膽固醇或者與增高的 LDL-膽固醇相關(guān)的病癥的病人或者處于增高的LDL-膽固醇或者與增高的LDL-膽固醇相關(guān)的病癥的風(fēng)險中的病人，所述病癥如脂質(zhì)失調(diào)(如高脂血癥，I型、II型、III型、IV型或者V型高脂血癥，繼發(fā)高甘油三酯血癥，高膽固醇血癥，家族性高膽固醇血癥，黃瘤病，膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷)。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽也適于治療患有動脈硬化病癥(如動脈硬化)、冠狀動脈疾病、心血管疾病的病人，以及處于這些病癥風(fēng)險中的病人，例如由于存在一或多個風(fēng)險因子(如高血壓、吸煙、糖尿病、肥胖或者高同型半胱氨酸血癥)所致。再一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物在制備治療阿爾茲海默病的藥物中的應(yīng)用。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物與另一種藥劑一起施用。附圖簡述圖I :與LDL-R(3BPS)的EGF-A結(jié)構(gòu)域結(jié)合的人PCSK9的PDB結(jié)構(gòu)，示出PCSK9中的5個肽序列(肽1-5)，它們被選擇是因為參與這兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用。圖2 :使用明礬加CpG作為佐劑，小鼠用綴合于VLP的肽VR_9. I至VR_9. 9免疫， 針對全長重組人PCSK9的抗體應(yīng)答通過在ELISA測定中滴定血清而測量。結(jié)果顯示為每組 6只小鼠每一個的效價倒數(shù)，效價倒數(shù)測量為給出0. 5的光密度讀數(shù)的血清稀釋度。圖3 :如圖2所述的針對全長重組小鼠PCSK9蛋白的抗體應(yīng)答。圖4 :在接種小鼠的血清中測量的血漿膽固醇水平(與用于圖2和圖3中抗體測定相同的樣品)。圖5 :在不同稀釋度測試了圖2和圖4中使用的血漿樣品的抑制重組PCSK9和LDL 受體的胞外結(jié)構(gòu)域之間的相互作用的能力，由FRET測定測量。圖6 :在FRET測定中來自肽VR_9. 5和VR_9. 6免疫接種的血漿樣品的稀釋度，顯示出對PCSK9和LDL受體之間的相互作用的劑量應(yīng)答性抑制。圖7 :來自PDB:3BPS的PCSK9 (條帶(ribbon))和EGF-A(空間填充)的復(fù)合物。 PCSK9的可能與除EGF-A之外的LDLR結(jié)構(gòu)域相互作用的潛在區(qū)域由橢圓形示出。
圖8 :PCSK9(條帶)和EGF-A(空間填充)的復(fù)合物，顯示了相應(yīng)于肽VR_13/14 (A) 和VR_15/16⑶和VR_9. 5 (C)的氨基酸。圖9和

圖10 :用肽VR_9. 5和VR_9. 10至VR_9. 16免疫接種的小鼠的血漿抗體應(yīng)答。針對小鼠PCSK9的抗體通過使用全長小鼠PCSK9蛋白進(jìn)行的系列血漿稀釋液的ELISA 測定而測量。顯示了每組8只小鼠的個體效價曲線，以來自用未綴合的VLP免疫接種小鼠血漿的ELISA應(yīng)答作為對照。圖11 :在用綴合于VLP (使用明礬+/-CpG作為佐劑)或者CRM197 (使用TiterMax 作為佐劑)的肽VR_9. 5或VR_9. 10免疫接種的BALB/c和C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)的針對全長人PCSK9蛋白的血清抗體應(yīng)答。針對人PCSK9的抗體通過在ELISA測定中滴定血清而測量。 結(jié)果顯示為對每組8只小鼠的每一個在I. O光密度確定的效價倒數(shù)的對數(shù)值。圖12 :在如圖11所述免疫接種的BALB/c和C57BL/6小鼠中誘導(dǎo)的針對全長小鼠 PCSK9蛋白的血清抗體應(yīng)答。結(jié)果顯示為對每組8只小鼠的每一個在O. 5光密度確定的效價倒數(shù)的對數(shù)值。圖13 :在取自BALB/c免疫接種小鼠的血清樣品中測量的總膽固醇水平(與用于圖11和12中抗體測定相同的樣品)。圖14 :在取自C57BL/6免疫接種小鼠的血清樣品中測量的總膽固醇水平(與用于圖11和12中抗體測定相同的樣品)。圖15 :在用明礬加CpG作為佐劑用綴合于VLP的肽VR_9. 5或VR_9. 17至VR_9. 35 免疫接種的BALB/c小鼠中誘導(dǎo)的針對全長人PCSK9的抗體應(yīng)答。針對人PCSK9的抗體通過在ELISA測定中滴定血清而測量。結(jié)果顯示為對每組8只小鼠的每一個在I. O光密度確定的效價倒數(shù)的對數(shù)值。圖16 :在如圖15所述免疫接種的BALB/c小鼠中誘導(dǎo)的針對全長小鼠PCSK9的抗體應(yīng)答。針對小鼠PCSK9的抗體通過在ELISA測定中滴定血清而測量。結(jié)果顯示為對每組 8只小鼠的每一個在O. 5光密度確定的效價倒數(shù)的對數(shù)值。圖17 :在取自BALB/c免疫接種小鼠的血清樣品中測量的總膽固醇水平(與用于圖15和16中抗體測定相同的樣品)。圖18 PCSK9 (條帶)和EGF-A (空間填充)的復(fù)合物，含有功能獲得或功能喪失性突變相關(guān)的氨基酸序列和/或蛋白質(zhì)表面暴露表位的PCSK9區(qū)域由橢圓形示出。發(fā)明詳述本發(fā)明的抗原件PCSK9肽本發(fā)明涉及免疫原，其包含任選地與免疫原性載體連接的抗原性PCSK9肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的包含4_20個氨基酸的一部分，當(dāng)將其施用給對象時能降低所述對象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對象是哺乳動物，優(yōu)選人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2 %、5 %、 10%、20%、30%或者 50%。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的參與PCSK9與LDL受體相互作用的部分。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的參與PCSK9與LDL受體相互作用的部分，其包含4-20個氨基酸，且當(dāng)施用給對象時能降低所述對象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對象是哺乳動物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2%、5%、10%、20%、30%或者50%。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、 222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、 260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、 279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、330、331、332、333、
334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、
353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、 372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、 391、392、393、394、395、396、397、398、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、 431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、 450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、 469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、 488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、 507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、 526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、 545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、 564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、 583、584、585、586、587 和 588。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :1-312、330_398、421、 423、424、426 及 428-588。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :1、2、3、4、5、6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 I46、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、 165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、 184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、 222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、 241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、 260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、 279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、 298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、330、331、332、333、 334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、 353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、 372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、 391、392、393、394、395、396、397 和 398。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的可能參與LDL受體的EGF-A 結(jié)構(gòu)域的相互作用的部分。這部分的實例在圖I中示出。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的可能參與與LDL受體的結(jié)構(gòu)域EGF-A的相互作用的部分，包含4-20個氨基酸，且當(dāng)將其施用給對象時能降低所述對象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對象是哺乳動物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性 PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2 %、5 %、10 %、20 %、30 %或者50 %。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No 1所示PCSK9片段的 5-13個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 和 45。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No 46所示PCSK9片段的 5-15個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :46、47、48、49、50、51、 52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100 和 101。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :102所示PCSK9片段的5-14個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No : 102、103、104、105、106、 107、108、109、110、11I、112、113、114、115、116、I17、I18、I19、120、121、122、123、124、125、 126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、 145 和 146。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :147所示PCSK9片段的5-13個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。
11
在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :147、148、149、150、151、
152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、 171、172、173、174、175、176、177、178、179、180 和 181。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :182所示PCSK9片段的5-13個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No : 182、183、184、185、186、 187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、 206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、 225 和 226。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :330所示PCSK9片段的5-13個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :330、331、332、333、334、
335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、
354、355、356、357、358 和 359。在一優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :19、56、63、109、
153、165、184、186、187、188、332和 424。在一優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No : 19、56、63、109、153 和 184。在一優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :56、184、186、187、 188 和 332。在一最優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No 56所示序列的肽。在更優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No 184或187所示序列的肽。在一最優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No :184所示序列的肽。在一最優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No :332所示序列的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽在PCSK9的可能參與與除了 EGF-A結(jié)構(gòu)域之外的LDL受體區(qū)域相互作用的區(qū)域中選擇。這部分的實例在圖7和8中示出。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9的可能參與與除了 EGF-A結(jié)構(gòu)域之外的LDL受體區(qū)域相互作用的部分，包含4-20個氨基酸，且當(dāng)將其施用給對象時能降低所述對象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對象是哺乳動物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2 %、5 %、10 %、20 %、30 %或者50 %。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :227所示PCSK9片段的5-12個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :227、228、229、230、231、 232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、 251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261 和 262。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :263所示PCSK9片段的5-13個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、 287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、 306 和 307。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :360所示PCSK9片段的5-13個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :360、361、362、363、364、 365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、 384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397 和 398。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽在PCSK9前結(jié)構(gòu)域的區(qū)域(SEQ ID No 329)中選擇。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是PCSK9前結(jié)構(gòu)域的一部分，包含4_20 個氨基酸，且當(dāng)將其施用給對象時能降低所述對象血液中LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對象是哺乳動物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少 2%、5%、10%、20%、30% 或者 50%。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :308、309、310、311和 312。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :309所示PCSK9片段的5-12個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :309、429、430、431、432、 433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、 452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462 和 463。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :508所示PCSK9片段的5-12個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :508、509、510、511、512、 513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、 532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542 和 543。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :310所示PCSK9片段的5-13個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :310、464、465、466、467、 468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、 487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、 506 和 507。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是包含SEQ ID No :544所示PCSK9片段的5-13個、優(yōu)選6-8個連續(xù)氨基酸的肽。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :544、545、546、547、548、 549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、 568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、 587 和 588。在一優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :312、421、422、423、426、427、428、445、482、525 和 563。在一更優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽選自SEQ ID No :445、482、525和 563。在一最優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是SEQ ID No :445所示序列的肽。這種抗原性PCSK9肽可以單獨使用或者組合使用，優(yōu)選當(dāng)與免疫原性載體結(jié)合時，以誘導(dǎo)對象體內(nèi)自身抗-PCSK9抗體，用以治療、預(yù)防或者減輕PCSK9-相關(guān)疾病。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然已知哪種技術(shù)可用于證實某特定構(gòu)建體是否落入本發(fā)明范圍內(nèi)。這種技術(shù)包括但不限于在本申請實施例章節(jié)描述的技術(shù)及下文所述技術(shù)。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽誘導(dǎo)自身抗-PCSK9抗體的能力可以使用本申請實施例 3所述測試在小鼠中測量。由本發(fā)明抗原性PCSK9肽誘導(dǎo)的自身抗體降低循環(huán)血漿膽固醇水平的能力可以使用實施例3所述測試在小鼠中測量。本發(fā)明抗原性PCSK9肽誘導(dǎo)的自身抗體抑制PCSK9與LDL受體之間相互作用的能力可以通過使用實施例3所述測試(FRET 測定)直接測量，或者通過測量細(xì)胞表面LDL受體的上調(diào)而間接測量(如相關(guān)文獻(xiàn)中所述， 使用體外細(xì)胞系或者通過測量(例如通過Western印跡)抗體表達(dá)動物的肝活檢組織中的 LDL受體水平進(jìn)行)，所述細(xì)胞表面LDL受體的上調(diào)是阻斷PCSK9介導(dǎo)的下調(diào)的結(jié)果。術(shù)語“抗原性PCSK9肽生物學(xué)活性”當(dāng)在本文使用時是指本發(fā)明的抗原性PCSK9肽在患者體內(nèi)誘導(dǎo)自身抗PCSK9抗體的能力。優(yōu)選地，當(dāng)將所述抗原性PCSK9肽施用給對象時，其能降低所述對象血液中的 LDL-膽固醇水平。優(yōu)選地，所述對象是哺乳動物，優(yōu)選是人。優(yōu)選地，所述抗原性PCSK9肽能使LDL-膽固醇水平降低至少2%、5%、10%、20%、30%或者50%。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽是這樣的大小，由此其模擬選自其中發(fā)現(xiàn)天然表位的整個PCSK9結(jié)構(gòu)域的區(qū)域。在一特定實施方案中，本發(fā)明的抗原性PCSK9 肽長度少于100個氨基酸，優(yōu)選少于75個氨基酸，更優(yōu)選少于50個氨基酸，甚至更優(yōu)選少于40個氨基酸。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽的長度典型為4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、
15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29 或者 30 個氨基酸，優(yōu)選 4-20 個氨基酸， 例如6-12個、6-8個或者9-12個氨基酸。本發(fā)明抗原性PCSK9肽的具體實例在序列表中提供，包括長度范圍為5-17個氨基酸的肽。本發(fā)明的抗原性肽包括衍生自哺乳動物PCSK9、優(yōu)選人PCSK9 (SEQ ID No :399)或小鼠PCSK9 (SEQ ID No :400)、更優(yōu)選人PCSK9的一部分的氨基酸序列，這種衍生的PCSK9 部分相應(yīng)于天然發(fā)生的PCSK9的氨基酸序列或者相應(yīng)于變體PCSK9的氨基酸序列，即其中取代、添加或缺失少數(shù)氨基酸但基本保留相同免疫學(xué)性質(zhì)的天然發(fā)生的PCSK9的氨基酸序列。此外，這種衍生的PCSK9部分可以通過氨基酸、特別是N末端和C末端氨基酸進(jìn)一步修飾，以使得所述抗原性PCSK9肽是構(gòu)象限制的和/或使得所述抗原性PCSK9肽在進(jìn)行適當(dāng)化學(xué)處理后能偶聯(lián)免疫原性載體。本文揭示的抗原性PCSK9肽涵蓋了衍生自PCSK9氨基酸序列的功能活性變體肽， 其中一些氨基酸被缺失、插入或者取代，同時基本上不降低其免疫學(xué)性質(zhì)，即這種功能活性變體肽保留實質(zhì)的抗原性PCSK9肽生物學(xué)活性。典型地，這種功能變體肽與選自SEQ ID No
1-312,330-398及420-588的氨基酸序列具有氨基酸序列同源性，優(yōu)選高度同源。
在一個實施方案中，這種功能活性變體肽與選自SEQ ID No :1-312、330-398及 420-588的氨基酸序列呈現(xiàn)至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或者95%相同性。多肽序列相似性也稱作序列相同性典型是使用序列分析軟件測量的。蛋白質(zhì)分析軟件使用賦予各種取代、缺失及其它修飾包括保守氨基選取代的相似性測量而匹配相似序列。例如，GCG含有程序如“Gap”和“Bestfit”，其可以使用默認(rèn)參數(shù)確定密切相關(guān)多肽如來自不同物種生物體的同源多肽之間或者野生型蛋白質(zhì)與其突變蛋白之間的序列同源性或者序列相同性。見例如GCG Version 6. I。多肽序列也可以使用利用默認(rèn)參數(shù)或者推薦參數(shù)的FASTA進(jìn)行對比，GCG Version 6. I. FASTA (如FASTA2和FASTA3)中的一個程序提供了查詢序列與搜索序列之間最佳重疊區(qū)域的排列對比和序列相同性百分比(Pearson, Methods Enzymo I. 183 :63-98(1990) ；Pearson, Methods Mol. Biol. 132 :185-219 (2000))。當(dāng)將本發(fā)明的序列與含有大量來自不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對比時，另一種算法是使用默認(rèn)參數(shù)的計算機程序BLAST,特別是blastp或tblastn。見例如Altschul et al. , J. Mol. Biol. 215 :403-410(1990)、Altschul et al. , Nucleic Acids Res. 25 :3389-402(1997)所述。功能活性變體包含天然發(fā)生的功能活性變體，如等位基因變體和種變體以及可通過例如誘變技術(shù)或者通過直接合成方法產(chǎn)生的非天然發(fā)生的功能活性變體。功能活性變體與SEQ ID No :1-312、330-398和420-588所示任何肽具有大約如I、
2、3、4或5個氨基酸殘基不同，且仍保留抗原性PCSK9生物學(xué)活性。在這種對比需要排列對比時，以最大同源性排列對比所述序列。變異的位點可以發(fā)生在所述肽中的任何位置，只要所述生物學(xué)活性與SEQ ID No :1-312,330-398和420-588所示肽基本上相似即可。關(guān)于怎樣產(chǎn)生表型沉默氨基酸取代的指導(dǎo)在Bowie et al. , Science, 247 1306-1310(1990)中提供，其教導(dǎo)有兩種主要策略研究氨基酸序列對改變的耐受性。第一種策略采用在進(jìn)化過程期間通過天然選擇的氨基酸取代的耐受性。通過在不同物種中對比氨基酸序列，可以鑒別在物種之間保守的氨基酸位置。這些保守的氨基酸對于蛋白質(zhì)功能可能是重要的。相反，其中取代已經(jīng)被天然選擇耐受的氨基酸位置表示對于蛋白質(zhì)功能不是關(guān)鍵的位置。因此，可以修飾耐受氨基酸取代的位置，同時仍保留所述修飾的肽的特異性免疫原性活性。第二種策略使用遺傳工程以在克隆的基因的特定位置導(dǎo)入氨基酸改變以鑒別對于蛋白質(zhì)功能關(guān)鍵的區(qū)域。例如，可以使用位點定向誘變或者丙氨酸掃描誘變技術(shù) (Cunningham et al. , Science, 244 :1081-1085 (1989))。然后可以檢測所得變體肽的特異性抗原性PCSK9生物學(xué)活性。根據(jù)Bowie et al.所述，這兩種策略已經(jīng)揭示了蛋白質(zhì)對于氨基酸取代是令人驚奇地耐受。該作者進(jìn)一步指出哪些氨基酸改變在該蛋白質(zhì)某些氨基酸位置可能是容許的。 例如，最深藏或內(nèi)部(在蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)內(nèi))的氨基酸殘基需要非極性側(cè)鏈，而少數(shù)表面或外部側(cè)鏈的特征通常是保守的。在蛋白質(zhì)的氨基酸中導(dǎo)入突變的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。見例如 Ausubel (ed. ), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc. (1994) > T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989))所述。
突變也可以通過使用可商購試劑盒如QuikChange 位點定向誘變試劑盒 (Stratagene)或者直接通過肽合成方法導(dǎo)入。通過置換不顯著影響抗原性PCSK9肽功能的氨基酸而產(chǎn)生所述抗原性PCSK9肽的功能活性變體可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員完成。可以在本發(fā)明的肽之一中進(jìn)行的氨基酸取代的類型是保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸殘基由具有相似化學(xué)性質(zhì)(如電荷或疏水性)的側(cè)鏈R基團的另一氨基酸殘基取代。通常，保守氨基酸取代基本上不改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩或多個氨基酸序列由于保守取代而彼此不同的情況中，序列相同性百分比或者相似性程度可以向上調(diào)整以校正取代的保守性質(zhì)。進(jìn)行這種調(diào)整的方式為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。見例如Pearson， Methods Mol. Biol. 243 :307-31(1994)。具有相似化學(xué)性質(zhì)側(cè)鏈的氨基酸組的實例包括1)脂肪族側(cè)鏈甘氨酸、丙氨酸、 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；2)脂肪族-羥基側(cè)鏈絲氨酸和蘇氨酸；3)含有酰胺的側(cè)鏈: 天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族側(cè)鏈苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè)鏈賴氨酸、精氨酸和組氨酸；6)酸性側(cè)鏈天冬氨酸和谷氨酸；及7)含硫側(cè)鏈半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，以及天冬酰胺-谷氨酰胺?；蛘?，保守置換是在PAM2501og似然矩陣(likelihood matrix)中具有正值的任何改變，見Gonnet et al.，Science 256 :1443-45 (1992)揭示?！爸械缺Ｊ亍敝脫Q是在 PAM2501og似然矩陣中具有非負(fù)值的任何改變。功能活性變體肽也可以通過使用雜交技術(shù)分離。簡而言之，使用與編碼感興趣肽如SEQ ID No :1-312、330-398和420-588的完整或部分核酸序列具有高度同源性的DNA制備功能活性肽。因此，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽還包括這樣的肽，其與SEQ ID No =1-312, 330-398及420-588所示一或多個肽功能等價且由與編碼SEQ ID No : 1_312、330_398及 420-588任一的核酸或者其互補體雜交的核酸分子編碼。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用易于獲得的密碼子表而容易地確定編碼本發(fā)明肽的核酸序列。如此，這些核酸序列在本文未示出。編碼是功能活性變體的肽、多肽或蛋白質(zhì)的核酸的雜交嚴(yán)格性是例如10%甲酰 K、5XSSPE、lXDenhart’ s溶液和IX鮭精DNA(低嚴(yán)格條件)。更優(yōu)選的條件是25%甲酰胺、5 X SSPE、I XDenhart’ s溶液和IX鮭精DNA (中等嚴(yán)格條件)，更優(yōu)選的條件是50% 甲酰胺、5X SSPE、I XDenhart’ s溶液及I X鮭精DNA(高嚴(yán)格條件)。然而，除了上述甲酰胺濃度之外還有一些因素影響雜交嚴(yán)格性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可適當(dāng)?shù)剡x擇這些因素實現(xiàn)相似嚴(yán)格性。編碼功能活性變體的核酸分子也可以通過基因擴增方法如PCR方法分離，使用編碼感興趣的肽、多肽或者蛋白質(zhì)如SEQ ID No :1-312,330-398和420-588所示任一肽的核酸分子的一部分作為探針。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的肽衍生自天然來源且分離自哺乳動物如人、靈長類動物、貓、狗、馬、小鼠或者大鼠，優(yōu)選分離自人來源。本發(fā)明的肽因此可通過使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離自細(xì)胞或組織來源。或者，本發(fā)明的肽可以通過化學(xué)合成或者使用重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。例如，本發(fā)明的肽可以通過本領(lǐng)域熟知的固相方法合成。合適的合成可以通過利用T-boc或F-moc程序進(jìn)行。環(huán)肽可以通過固相方法合成，使用本領(lǐng)域熟知的F-moc程序及
16在完全自動化設(shè)備中的聚酰胺樹脂進(jìn)行?；蛘?，本領(lǐng)域技術(shù)人員能獲知手工進(jìn)行這些方法必需的實驗室程序。關(guān)于固相合成方法的技術(shù)和程序在Solid Phase Peptide Synthesis A Practical Approach’by E. Atherton and R. C. Sheppard,published by IRL at Oxford University Press(1989)及,Methods in Molecular Biology,Vol. 35 Peptide Synthesis Protocols (ed. M. ff. Pennington and B. M. Dunn), chapter 7,pp91-171by D. Andreau et al 中描述?；蛘?，可以使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)將編碼本發(fā)明肽的多核苷酸導(dǎo)入可以在合適的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)的表達(dá)載體中，隨后分離或者純化感興趣的表達(dá)的肽、多肽或者蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域可獲得許多細(xì)菌、酵母、植物、哺乳動物和昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，可以使用任何這種表達(dá)系統(tǒng)。 任選地，編碼本發(fā)明肽的多核苷酸可以在無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)中翻譯。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽也可以包含由于存在多個基因、可變轉(zhuǎn)錄事件、選擇性 RNA剪接事件及可變翻譯和翻譯后事件而產(chǎn)生的那些肽。肽可以在這樣的系統(tǒng)如培養(yǎng)的細(xì)胞中表達(dá)，所述系統(tǒng)導(dǎo)致與當(dāng)所述肽在天然細(xì)胞中表達(dá)時所存在的基本上相同的翻譯后修飾，或者在這樣的系統(tǒng)中表達(dá)，所述系統(tǒng)導(dǎo)致當(dāng)在天然細(xì)胞中表達(dá)時存在的翻譯后修飾如糖基化或裂解的改變或喪失。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽可以作為融合蛋白產(chǎn)生，其含有其它非-PCSK9或非-PCSK9-衍生氨基酸序列，如本文定義的氨基酸接頭或者信號序列或者免疫原性載體， 以及可用于蛋白質(zhì)純化的配體，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、組氨酸標(biāo)簽和葡萄球菌A蛋白。在融合蛋白中可存在一種以上本發(fā)明的抗原性PCSK9肽。所述異源多肽可以融合于例如本發(fā)明肽的N末端或C末端。本發(fā)明的肽也可以作為包含同源氨基酸序列即其它PCSK9或 PCSK9-衍生序列的融合蛋白而產(chǎn)生。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽可以是線性的或者是構(gòu)象限制的。如本文在提及肽時所用，術(shù)語“構(gòu)象限制的(conformationalIy constrained) ”是指這樣的肽,其中三維結(jié)構(gòu)在一個空間排列中隨著時間而基本上得以保持。構(gòu)象限制的分子可具有改良的性質(zhì)，如增加的親和性、代謝穩(wěn)定性、膜通透性或者溶解性。此外，預(yù)期這種構(gòu)象限制的肽以與其天然環(huán)狀構(gòu)象相似的構(gòu)象呈遞抗原性PCSK9 表位，從而誘導(dǎo)抗-PCSK9抗體更易于識別完整的天然自身PCSK9分子或者具有識別自身 PCSK9分子的增加的親和性。構(gòu)象限制的方法為本領(lǐng)域熟知，包括但不限于橋連和環(huán)化。現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域已知在線性肽中導(dǎo)入構(gòu)象限制的一些方法。例如，在肽的兩個相鄰氨基酸之間的橋連導(dǎo)致局部構(gòu)象修飾，其柔性與常規(guī)肽相比受限。形成這種橋連的一些可能性包括慘入內(nèi)酸胺和 piperazinones (綜述參見 Giannis and. Kolter, Angew. Chem. Int. Ed.，1993,32 :1244)。如本文在提及肽時所用，術(shù)語“環(huán)狀”是指包括兩個非相鄰氨基酸或氨基酸類似物之間的分子內(nèi)鍵的結(jié)構(gòu)。所述環(huán)化可以通過共價或非共價鍵實現(xiàn)。分子內(nèi)鍵包括但不限于主鏈-主鏈，側(cè)鏈-主鏈，側(cè)鏈-側(cè)鏈，側(cè)鏈-末端基團，末端-末端鍵。環(huán)化方法包括但不限于在肽的N末端殘基與C末端殘基之間形成酰胺鍵，在非相鄰氨基酸或氨基酸類似物之間形成二硫鍵，在Lys和Asp/Glu殘基側(cè)鏈之間形成酰胺鍵，在絲氨酸殘基與Asp/Glu殘基之間形成酯鍵，在例如一個氨基酸或其類似物的側(cè)鏈基團與氨基末端殘基的N末端胺之間形成內(nèi)酰胺鍵，以及形成賴氨酸正亮氨酸和二酪氨酸鍵。也可以使用二硫鍵的碳形式，如乙烯基或乙基鍵(J. P印tide Sc.，2008，U，898-902)以及與適當(dāng)多取代的親電子試劑如二 _、 三-或四鹵代烷進(jìn)行烷化反應(yīng)(PNAS,2008,105(40)，15293-15298 ；ChemBioChem, 2005,6, 821-824)。各種修飾的脯氨酸類似物也可用于在肽中摻入構(gòu)象限制(Zhang et al.，J.Med Chem.，1996,39 :2738-2744 ；Pfeifer and Robinson, Chem. Comm.，1998，1977-1978)?？捎糜诃h(huán)化本發(fā)明肽的化學(xué)方法獲得用包括但不限于內(nèi)酰胺鍵、腙鍵、肟鍵、噻唑烷鍵、硫醚鍵或锍鍵環(huán)化的肽。設(shè)計構(gòu)象限制肽的另一方法在US10/114918中描述，該方法是將感興趣的短氨基酸序列附著于模板，產(chǎn)生環(huán)狀限制的肽。這種環(huán)狀肽不僅通過其模板而結(jié)構(gòu)穩(wěn)定化，并從而呈現(xiàn)出可以模擬天然蛋白質(zhì)如病毒和寄生蟲上或者其自身蛋白質(zhì)(自體同源哺乳動物蛋白質(zhì)如PCSK9)上構(gòu)象表位的三維構(gòu)象，而且其與線性肽相比對于在血清中的蛋白酶降解更具抗性。US10/114918進(jìn)一步揭示了構(gòu)象限制的交聯(lián)肽的合成方法，通過制備合成氨基酸用于主鏈偶聯(lián)至適當(dāng)位置的氨基酸以穩(wěn)定肽的超二級結(jié)構(gòu)。交聯(lián)可以通過正交保護的(2S， 3R)-3-氨基脯氨酸殘基的伯胺基團與適當(dāng)位置的谷氨酸側(cè)鏈羧基基團的酰胺偶聯(lián)而實現(xiàn)。 這種方法已被用于CS蛋白質(zhì)的構(gòu)象限制的四肽重復(fù)序列的制備，其中至少一個脯氨酸被 (2S，3R)-3-氨基脯氨酸置換，以導(dǎo)入側(cè)鏈羧基，谷氨酸已經(jīng)摻入以置換丙氨酸。交聯(lián)策略還包括應(yīng)用Grubbs閉環(huán)復(fù)分解反應(yīng)，以形成設(shè)計為模擬a -螺旋構(gòu)象的 stapled 肽(Angew. Int. Ed. En Engl. ,1998,37,3281 ；JACS, 2000,122, 5891);使用多功能化糖；使用氨基羧乙基硫色氨酸鍵(Chemistry Eu. J. ,2008,24,3404-3409);使用疊氮化物與炔的“click’”反應(yīng)，其可以作為側(cè)鏈氨基酸殘基摻入或者位于肽序列的主鏈內(nèi)(Drug Disc. Today, 2003,8 (24), 1128-1137)。在文獻(xiàn)中也已知金屬離子通過隔離特定殘基如組氨酸(其協(xié)同金屬陽離子)可穩(wěn)定線性肽的限制的構(gòu)象(Angew. Int. Ed. Engl. , 2003,42, 421)。相似地，用非天然酸功能化線性肽序列及胺功能性或者多胺和多酸功能性也可用于在激活及酰胺鍵形成之后實現(xiàn)環(huán)化結(jié)構(gòu)。根據(jù)一個實施方案，所述抗原性PCSK9肽是通過所述抗原性PCSK9肽的兩個非相鄰氨基酸(例如N末端和C末端氨基酸)的彼此分子內(nèi)共價鍵而構(gòu)象限制的。根據(jù)另一實施方案，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽是通過共價結(jié)合支架分子而構(gòu)象限制的。根據(jù)進(jìn)一步的實施方案，所述抗原性PCSK9肽是簡單限制的，即在任一末端(C或N末端)偶聯(lián)于支架分子或者通過未位于任一末端的另一氨基酸偶聯(lián)于支架分子。根據(jù)另一實施方案，所述抗原性 PCSK9肽是雙重限制的，即在C末端和N末端均偶聯(lián)所述支架分子。根據(jù)另一實施方案，所述抗原性肽是通過異手性二脯氨酸單位(D-Pix)-L-Pix))的模板作用環(huán)化而限制的(Spath et al,1998, Helvetica Chimica Acta 81，pl726_1738)。所述支架(也稱作平臺)可以是能通過共價鍵降低所述抗原性PCSK9肽可采取的構(gòu)象數(shù)的任何分子。舉例的構(gòu)象限制支架包括蛋白質(zhì)和肽，例如脂籠蛋白相關(guān)分子，如含有硫氧還蛋白和硫氧還蛋白樣蛋白的￠-桶，核酸酶(例如RNaseA),蛋白酶(例如胰蛋白酶)，蛋白酶抑制劑(例如水蛭蛋白酶抑制劑C)，抗體或其結(jié)構(gòu)剛性片段，熒光蛋白如GFP 或YFP，食魚螺毒素，纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域的環(huán)狀區(qū)域，CTL-A4，以及病毒樣顆粒(VLP)。其它合適的平臺分子包括碳水化合物如瓊脂糖。所述平臺可以是線性或環(huán)狀分子，例如是閉合的以形成環(huán)。所述平臺通常與所述抗原性PCSK9肽是異源的。這種與平臺連接的構(gòu)象限制的肽與線性肽相比被認(rèn)為對于蛋白酶解更具抗性。
根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所述支架是如本申請中定義的免疫原性載體。在進(jìn)一步的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽在免疫原性載體上被簡單限制。在另一實施方案中， 所述抗原性PCSK9肽在免疫原性載體上被雙重限制。在這種方式中，所述抗原性PCSK9肽形成構(gòu)象限制的環(huán)結(jié)構(gòu)，其經(jīng)證實是作為細(xì)胞內(nèi)識別分子的特別合適的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽可以被修飾以便于與平臺綴合，例如通過在一或兩個末端加入末端半胱氨酸和/或通過加入接頭序列如雙甘氨酸頭或尾加末端半胱氨酸，用賴氨酸作為末端的接頭，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的進(jìn)行這種功能的任何其它接頭。關(guān)于這種接頭的詳細(xì)描述在后文揭示。也可以使用生物正交化學(xué)(bioorthogonal chemistry)(如上述click反應(yīng)),其使得全長肽序列與載體偶聯(lián)，因此避免了任何區(qū)域化學(xué)(regiochemical)和化學(xué)選擇性問題。已知且可以使用剛性接頭如Jones et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2002,41 :4241-4244所述接頭激發(fā)改良的免疫學(xué)應(yīng)答。在進(jìn)一步的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽附著于多價模板，其自身與載體偶聯(lián)，因此增加抗原的密度(見下文)。所述多價模板可以是適當(dāng)功能化的聚合物或者寡聚物如(但不限于)寡谷氨酸或者寡殼聚糖(見圖19)。本發(fā)明的免疫原性載體在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽與免疫原性載體分子連接，形成進(jìn)行免疫接種的免疫原，優(yōu)選其中所述載體分子與天然PCSK9分子不相關(guān)。本文所用術(shù)語“免疫原性載體”包括具有在宿主動物體內(nèi)獨立激發(fā)免疫原性應(yīng)答性質(zhì)的那些材料，其能通過肽、多肽或蛋白質(zhì)中游離羧基、氨基或者羥基與所述免疫原性載體材料上相應(yīng)基團之間的肽鍵或酯鍵的形成而直接共價偶聯(lián)于所述肽、多肽或者蛋白質(zhì)， 或者通過常規(guī)雙功能連接基團鍵合，或者是作為融合蛋白。用于本發(fā)明免疫原中的載體的類型為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。舉例的這種免疫原性載體是血清白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA);球蛋白；甲狀腺球蛋白；血紅蛋白；血藍(lán)蛋白 (特別是匙孔血藍(lán)蛋白[KLH]);聚賴氨酸；聚谷氨酸；賴氨酸-谷氨酸共聚物；含有賴氨酸或鳥氨酸的共聚物；脂質(zhì)體載體；結(jié)核菌素的純化蛋白質(zhì)衍生物(pro);失活的細(xì)菌毒素或類毒素，如破傷風(fēng)或白喉毒素(TT和DT)或者TT的片段C，CRM197(白喉毒素的非毒性但是抗原性等同變體)，其它DT點突變體，如CRM176、CRM228、CRM 45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218 ;3838-3844，1973) ；CRM 9,CRM 45、CRM102、CRM 103 和 CRM107，及由 Nicholls 和 Youle 在 Genetically Engineered Toxins,Ed Frankel,Maecel Dekker Inc, 1992 所述其它突變；Glu-148缺失或突變?yōu)锳sp, Gln或Ser和/或Ala 158突變?yōu)镚ly及在US4709017 或US 4950740中揭示的其它突變；Lys 516、Lys 526、Phe 530和/或Lys 534中至少一或多個殘基的突變及在US 5917017或US 6455673中揭示的其它突變；或者在US 5843711 中揭示的片段，肺炎球菌溶血素(Kuo et al (1995) Infect Immun 63 ;2706_13)，包括以某種方式解毒的 ply，例如 dPLY-GMBS (W0 04081515, PCT/EP2005/010258)或者 dPLY-formol， PhtX,包括 PhtA, PhtB, PhtD, PhtE (PhtA, PhtB, PhtD 或 PhtE 的序列在 W000/37105 或 WO 00/39299中揭示)以及Pht蛋白融合體，如PhtDE融合蛋白、PhtBE融合蛋白、Pht A-E (W0 01/98334，WO 03/54007, W02009/000826), OMPC(腦膜炎球菌外膜蛋白-通常從腦膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis)血清組B中提取-EP0372501), PorB(來自腦膜炎奈瑟氏菌)， PD (流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)蛋白D-見例如EP O 594 610B),或者其免疫學(xué)功能等價物，合成肽(EP0378881, EP0427347)，熱激蛋白(W0 93/17712，WO 94/03208)， 百日咳蛋白(W0 98/58668，EP0471177)，細(xì)胞因子，淋巴因子，生長因子或激素(W0 91/01146)，包含來自不同病原體衍生抗原的多個人⑶4+T細(xì)胞表位的人工蛋白質(zhì)(Falugi et al (2001)Eur J TmmunoI 31 ;3816_3824),如 N19 蛋白(Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72 ;4884_7)，肺炎球菌表面蛋白 PspA(W) 02/091998)，鐵吸收蛋白(W0 01/72337)， 艱難梭菌(C. difficile)的毒素 A 或 B(W0 00/61761)。在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的免疫原性載體是CRM197。在另一個實施方案中，所述免疫原性載體是病毒樣顆粒(VLP)，優(yōu)選重組病毒樣顆粒。如本文所用，術(shù)語“病毒樣顆?！笔侵割愃朴诓《镜墙?jīng)證實是非病原性的結(jié)構(gòu)。 通常，病毒樣顆粒缺少至少一部分病毒基因組。病毒樣顆粒也可以通常通過異源表達(dá)而大量產(chǎn)生且是可易于純化的。本發(fā)明的病毒樣顆?？珊信c其基因組不同的核酸。本發(fā)明的病毒樣顆粒的典型及優(yōu)選的實施方案是病毒殼體，如相應(yīng)病毒、曬菌體或者RNA-曬菌體的病毒殼體。如本文所用，術(shù)語“噬菌體病毒樣顆?！笔侵高@樣的病毒樣顆粒，其類似噬菌體結(jié)構(gòu)，是非復(fù)制性和非感染性的，且缺少至少編碼噬菌體復(fù)制機構(gòu)的一或多個基因，及典型也缺少編碼使病毒附著于或者進(jìn)入宿主中的一或多個蛋白質(zhì)的一或多個基因。然而，這個定義應(yīng)也涵蓋這樣的噬菌體病毒樣顆粒，其中前述一或多個基因仍存在，但是是失活的，且因此也產(chǎn)生非復(fù)制性和非感染性噬菌體病毒樣顆粒。從RNA噬菌體外殼蛋白的180個亞基自主裝配形成的及任選地含有宿主RNA的殼體結(jié)構(gòu)在本文稱作“RNA噬菌體外殼蛋白的VLP”。特定實例是Qbeta、MS2、PP7或AP205外殼蛋白的VLP。例如在Qbeta外殼蛋白的特定情況中，所述VLP可只從Qbeta CP亞基裝配 (通過表達(dá)含有例如TAA終止密碼子的Qbeta CP基因而產(chǎn)生，通過阻抑作用排除較長的Al 蛋白的任何表達(dá)，見 Kozlovska, T. M.，et al.，Intervirology 39 :9_15 (1996))，或者在殼體裝配中另外含有Al蛋白亞基。通常限制殼體裝配中Qbeta Al蛋白相對于Qbeta CP的百分比，以保證殼體形成。適合作為本發(fā)明免疫原性載體的舉例的VLP包括但不限于如下蛋白的VLPjP Qbeta, MS2，PP7，AP205，及其它噬菌體外殼蛋白，如下病毒殼體和核心蛋白，乙型肝炎病毒(Ulrich, et al. , Virus Res. 50 :141-182 (1998)),麻疫病毒(Warnes, et al. , Gene 160 :173-178(1995)), Sindbis 病毒，輪狀病毒(美國專利 5，071，651 和 5，374，426)， 口蹄疫病毒(Twomey, et al. , Vaccine 13 1603-1610, (1995)), Norwalk 病毒(Jiang, X., et al. , Science 250 1580-1583(1990) ；Matsui, S. M. , et al. , J Clin. Invest. 87 1456-1461 (1991))，逆轉(zhuǎn)錄病毒GAG蛋白(PCT專利申請WO 96/30523)，逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty蛋白pl，乙型肝炎病毒的表面蛋白(W0 92/11291)，人乳頭瘤病毒(W0 98/15631)，人多瘤病毒(Sasnauskas K.，et al. , Biol. Chem. 380(3) :381-386(1999) ；Sasnauskas K.，et al., Generation of recombinant virus-like particles of different polyomaviruses in yeast. 3rd Interational Workshop" Virus-like particles as vaccines. " Berlin, September 26-29(2001))，RNA 噬菌體，Ty, fr 噬菌體，GA-噬菌體，AP 205-噬菌體，及特別是Qbeta-噬菌體，豇豆褪綠斑駁病毒，豇豆花葉病毒，人乳頭瘤病毒(HPV)，牛乳頭瘤病毒，豬細(xì)小病毒，細(xì)小病毒如B19,豬細(xì)小病毒(PPV)和犬細(xì)小病毒(CPV),杯狀病毒(例如 Norwalk病毒，兔出血病病毒[RHDV])，動物嗜肝DNA病毒核心抗原VLP，絲狀/桿狀植物病毒，包括但不限于煙草花葉病毒(TMV)，馬鈴薯X病毒(PVX)，番木瓜花葉病毒(PapMV)，苜蓿花葉病毒(AlMV)，及石茅聞粱花葉病毒(JGMV),昆蟲病毒如禽獸棚病毒(FHV)和四病毒，多瘤病毒如鼠多瘤病毒(MPyV)，鼠親肺病毒(MPtV)，BK病毒(BKV)，以及JC病毒(JCV)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，用作本發(fā)明免疫原性載體的VLP不限于任何特定形式。所述顆?？梢允腔瘜W(xué)合成的或者通過生物方法合成，其可以是天然或者非天然的。例如，這種類型的實施方案包括病毒樣顆?；蛘咂渲亟M形式。在更特別的實施方案中，所述 VLP可包含或者由已知形成VLP的任何病毒的重組多肽組成。所述病毒樣顆粒可進(jìn)一步包含或者另外由這種多肽的一或多個片段以及這種多肽的變體組成。多肽的變體與其野生型相應(yīng)物相比在氨基酸水平具有例如至少80%、85%、90%、95%、97%或者99%相同性。適用于本發(fā)明中的變體VLP可衍生自任何生物體，只要其能形成如本文定義的“病毒樣顆?！?及可用作“免疫原性載體”即可。本發(fā)明優(yōu)選的VLP包括HBV的殼體蛋白或者表面抗原(分別為HBcAg和HBsAg)或者其重組蛋白或片段，及RNA-噬菌體的外殼蛋白或者其重組蛋白或片段，更優(yōu)選Qbeta的外殼蛋白或者其重組蛋白或片段。在一個實施方案中，與本發(fā)明的抗原性PCSK9肽組合使用的免疫原性載體是 HBcAg蛋白?？捎糜诒景l(fā)明中的舉例的HBcAg蛋白可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。例如包括但不限于 HBV 核心蛋白，如 Yuan et al.，(J. Virol. 73 :10122-10128 (1999))所述，及在 W000/198333、WO 00/177158、WO 00/214478、W000/32227、W001/85208、W002/056905, W003/024480和W003/024481中描述。適用于本發(fā)明中的HBcAg可衍生自任何生物體，只要其能形成如本文定義的“病毒樣顆?！奔翱捎米鳌懊庖咴暂d體”即可。可用于本發(fā)明中的特別感興趣的HBcAg變體是其中一或多個天然存在的半胱氨酸殘基已經(jīng)被缺失或取代的那些變體。本領(lǐng)域熟知游離半胱氨酸殘基可涉及許多化學(xué)副反應(yīng)中，包括二硫化物置換，與例如在與其它物質(zhì)的組合治療中注射的或形成的化學(xué)物質(zhì)或代謝物反應(yīng)，或者在暴露于UV光時直接氧化反應(yīng)及與核苷酸反應(yīng)。因此可以產(chǎn)生毒性加合物，特別是考慮到HBcAg具有結(jié)合核酸的強烈傾向的事實。所述毒性加合物因此分布在物種多樣性之間，其可單獨以低濃度存在，但是當(dāng)總和在一起時達(dá)到毒性水平。見于上述事實，在已經(jīng)被修飾以除去天然存在的半胱氨酸殘基的疫苗組合物中使用HBcAg的一個優(yōu)勢是當(dāng)抗原或抗原決定簇附著時毒性物質(zhì)可以結(jié)合的位點數(shù)目減少或者完全消除。此外，本發(fā)明也可以使用加工形式的HBcAg，其缺少乙型肝炎核心抗原前體蛋白的 N末端前導(dǎo)序列，特別是當(dāng)HBcAg是在未發(fā)生加工的條件下產(chǎn)生的情況中(例如在細(xì)菌系統(tǒng)中表達(dá))。本發(fā)明的其它HBcAg變體包括i)與野生型HBcAg氨基酸序列之一或者其亞部分 (subportion)具有至少80%、85%、90%、95%、97%或99%相同性的多肽序列，使用常規(guī)的已知計算機程序確定；ii)C-末端截短突變體，包括其中從C末端已經(jīng)除去1、5、10、15、
20、25、30、34或35個氨基酸的突變體；i i) N-末端截短突變體，包括其中從N末端已經(jīng)除去
1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸的突變體；iii)在N末端和C末端均截短的突變體，包括其中在N末端已經(jīng)除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17個氨基酸及在(末端已經(jīng)除去 1、5、10、15、20、25、30、34 或 35 個氨基酸的 HBcAgo在本發(fā)明范圍內(nèi)的其它HBcAg變體蛋白是被修飾以增強外源表位的免疫原性呈遞的那些變體，其中缺失一或多個四精氨酸重復(fù)，但是其中C末端半胱氨酸被保留(見例如 W001/98333)，以及嵌合 C 末端截短 HBcAg，如在 W002/14478、W003/102165 和 W004/053091 中描述的那些。在另一個實施方案中，與本發(fā)明的抗原性PCSK9肽組合使用的免疫原性載體是 HBsAg蛋白。可用于本發(fā)明中的HBsAg蛋白可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如包括但不限于在US5792463、W002/10416和W008/020331中描述的HBV表面蛋白。適用于本發(fā)明中的HBsAg可衍生自任何生物體，只要其能形成如本文定義的“病毒樣顆?！奔翱捎米鳌懊庖咴暂d體”即可。在另一實施方案中，與本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或多肽組合使用的免疫原性載體是Qbeta外殼蛋白。發(fā)現(xiàn)Qbeta外殼蛋白當(dāng)在大腸桿菌中表達(dá)時自主裝配為殼體(Kozlovska TM. et al. , GENE 137:133-137(1993))。獲得的殼體或者病毒樣顆粒示出二十面噬菌體樣殼體結(jié)構(gòu)，直徑為25nm及T = 3準(zhǔn)對稱。進(jìn)一步地，噬菌體Qss的晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解決。所述殼體含有外殼蛋白的180個拷貝，其通過二硫鍵在共價五聚物和六聚物中連接(Golmohammadi,R. et al. , Structure 4 :5435554 (1996)),導(dǎo)致Qbeta外殼蛋白的殼體的顯著穩(wěn)定性。Qbeta殼體蛋白也示出對于有機溶劑和變性劑的非同尋常的抗性。Qbeta外殼蛋白的殼體的高度穩(wěn)定性是一優(yōu)勢特征，特別是用于本發(fā)明哺乳動物和人的免疫和接種中時。可用于本發(fā)明中的舉例的Qbeta外殼蛋白可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。例如在 W002/056905、W003/024480、W003/024481(以其全部內(nèi)容援引加入本文)中已經(jīng)廣泛描述， 包括但不限于在PIR數(shù)據(jù)庫中揭示的氨基酸序列，登記號VCBPQbeta是指Qbeta CP,登記號AAA16663是指Qbeta Al蛋白，及其變體，包括其中N末端甲硫氨酸被裂解的變體蛋白， 缺失100、150或180個氨基酸的C末端截短形式的Qbeta Al，已經(jīng)通過缺失或取代除去賴氨酸殘基或者通過取代或插入添加賴氨酸殘基而修飾的變體蛋白(見例如在W003/024481 中揭示的 Qbeta-240、Qbeta-243、Qbeta-250、Qbeta-251 和 Qbeta-259，所述文獻(xiàn)以其全部內(nèi)容援引加入)，以及與上述任何Qbeta核心蛋白顯示至少80%、85%、90%、95%、97%或 99 %相同性的變體。適用于本發(fā)明的變體Qbeta外殼蛋白可衍生自任何生物體，只要其能形成如本文定義的“病毒樣顆粒”及可用作“免疫原性載體”即可。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽可以通過化學(xué)綴合或者通過遺傳工程化融合配偶體的表達(dá)而與免疫原性載體偶聯(lián)。所述偶聯(lián)非必需是直接偶聯(lián)，而是可以通過接頭序列偶聯(lián)。更通常地，在抗原性肽融合、綴合或另外附著于免疫原性載體的情況中，典型要在所述抗原性肽的一或兩個末端加入間隔或者接頭序列。這種接頭序列通常包含由細(xì)胞的內(nèi)體或者其它小泡區(qū)室的蛋白酶體、蛋白酶識別的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的肽作為與免疫原性載體的融合蛋白被表達(dá)。所述肽的融合可以通過插入在所述免疫原性載體一級序列中而實現(xiàn)，或者通過與所述免疫原性載體的N或C末端融合而實現(xiàn)。在后文當(dāng)提及肽與免疫原性載體的融合蛋白時，涵蓋與亞基序列任一端的融合或者在所述載體序列內(nèi)內(nèi)部插入所述肽。在后文提及融合時，其可以通過所述抗原性肽插入所述載體序列中、用所述抗原性肽取代所述載體的部分序列或者通過組合缺失、取代或插入而實現(xiàn)。當(dāng)所述免疫原性載體是VLP時，嵌合抗原性肽-VLP亞基通常能自主裝配成VLP。 展示與其亞基融合的表位的VLP在后文也稱作嵌合VLP。例如，EP O 421 635B描述了嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原顆粒在病毒樣顆粒中呈遞外源肽序列的應(yīng)用?？梢栽谒隹乖噪男蛄腥我欢思尤雮?cè)翼氨基酸殘基，所述抗原性肽序列與VLP 亞基序列的任一端融合或者將這種肽序列內(nèi)部插入VLP亞基序列中。甘氨酸和絲氨酸殘基是在融合的肽加入側(cè)翼序列中特別優(yōu)選使用的氨基酸。甘氨酸殘基賦予另外的柔性，其可以降低外源序列與VLP亞基序列融合的潛在不穩(wěn)定效應(yīng)。在本發(fā)明一特定實施方案中，所述免疫原性載體是HBcAg VLP。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了所述抗原性肽與HBcAg的N末端的融合蛋白(Neyrinck, S. et al. , Nature Med. 5 11571163(1999))或者插入在所謂的主要免疫顯性區(qū)域(MIR)中(Pumpens，P. and Grens, E. , Intervirology 44 :98114(2001))，WO 01/98333)，這些是本發(fā)明的特異實施方案。 在MIR中有缺失的HBcAg的天然發(fā)生的變體也已經(jīng)有描述(Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44 :98-114(2001)),與N或C末端的融合以及插入在MIR的相應(yīng)于與野生型HBcAg相比是缺失位點的位置是本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案。與C末端的融合也已經(jīng)有描述(Pumpens, P. and Grens, E.，Intervirology 44 :98-114(2001))。本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于發(fā)現(xiàn)關(guān)于怎樣使用傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建融合蛋白的指導(dǎo)。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了編碼 HBcAg和HBcAg融合蛋白及可用于表達(dá)HBcAg和HBcAg融合蛋白的載體和質(zhì)粒(Pumpens, P. and#38 ；Grens, E.Intervirology 44 :98-114(2001), Neyrinck, S. et al. , Nature Med. 5 :1157-1163(1999)),其可用于實施本發(fā)明。優(yōu)化自主裝配效力及展示插入在HBcAg 的MIR中的表位的一個重要因素是插入位點的選擇，以及在插入時從HBcAg序列MIR內(nèi)缺失的氨基酸數(shù)目(Pumpens, P. and Grens, E. , Intervirology 44:98-114(2001) ；EP O 421 635 ;美國專利No. 6，231，864)，或者換句話說，HBcAg的哪些氨基酸用新表位取代。例如，已經(jīng)描述了用外源表位取代HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或者80-81 (Pumpens, P. and Grens, E. , Intervirology 44:98-114(2001) ；EP0421635 ；US 6,231,864， W000/26385) o HBcAg 含有長精氨酸尾(Pumpens, P. and Grens, E. , Intervirology 44: 98-114(2001)),其對于殼體裝配不是必須的并且能結(jié)合核酸(Pumpens, P. and Grens, E., Intervirology 44 :98-114 (2001))。包含或者缺少這個精氨酸尾的HBcAg是本發(fā)明的兩個實施方案。在本發(fā)明另一特異實施方案中，所述免疫原性載體是RNA噬菌體優(yōu)選Qbeta的 VLP。RNA噬菌體的主要外殼蛋白當(dāng)在細(xì)菌及特別是在大腸桿菌中表達(dá)時自發(fā)裝配成VLP。 本領(lǐng)域已經(jīng)描述了融合蛋白構(gòu)建體，其中抗原性肽與截短形式的Qbeta的Al蛋白C末端融合或者插入在所述 Al 蛋白中(Kozlovska, T. M. , et al. , Intervirology, 39 :9_15 (1996))。 所述Al蛋白是通過在UGA終止密碼子的抑制作用產(chǎn)生的，長度為329個氨基酸，或者如果考慮到在N末端甲硫氨酸的裂解則為328個氨基酸。在丙氨酸(由Qbeta CP基因編碼的第二個氨基酸)之前的N末端甲硫氨酸的裂解通常發(fā)生在大腸桿菌中，對于Qbeta外殼蛋白的N末端也是這種情況。所述Al基因的一部分，UGA琥珀密碼子的3’部分編碼所述CP 延伸，其長度為195個氨基酸。所述抗原性肽插入在CP延伸的第72與73位之間是本發(fā)明進(jìn)一步的實施方案(Kozlovska, T. M. , et al. , Intervirology 39 :9-15 (1996)) 所述抗原性肽融合在C末端截短的Qbeta Al蛋白的C末端是本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選的實施方案。例如， Kozlovska et al. , (Intervirology, 39 :9-15(1996))描述了 Qbeta Al 蛋白質(zhì)融合,其中所述表位融合在第19位截短的Qbeta CP延伸的C末端。如Kozlovska et al. (Intervirology, 39 :9_15 (1996))所述,展不融合的表位的顆粒的裝配典型需要存在Al蛋白-抗原融合體及野生型CP以形成嵌合顆粒。然而，本發(fā)明也包括包含病毒樣顆粒及從而特別包含RNA噬菌體Qbeta外殼蛋白的VLP(其只是由具有與其融合的抗原性肽的VLP亞基組成)的實施方案。嵌合顆粒的產(chǎn)生可以通過多種方式實現(xiàn)。Kozlovska et al. , Intervirology, 39 9-15 (1996)描述了三種方法,這三種方法均可用于實施本發(fā)明。在第一種方法中，融合的表位在VLP上的有效展示通過質(zhì)粒在大腸桿菌菌株中的表達(dá)而實現(xiàn)，所述質(zhì)粒編碼在CP與CP 延伸之間具有UGA終止密碼子的Qbeta All蛋白融合體，所述大腸桿菌菌株攜帶編碼克隆的UGA阻抑物tRNA的質(zhì)粒，使得UGA密碼子翻譯成Trp (pISM3001質(zhì)粒(Smiley B. K.，et al. , Gene 134:33-40(1993)))。在另一種方法中，所述CP基因終止密碼子被修飾為UAA， 表達(dá)Al蛋白-抗原融合體的第二質(zhì)粒被共轉(zhuǎn)化。所述第二質(zhì)粒編碼不同的抗生素抗性， 及復(fù)制起點與第一質(zhì)粒相容。在第三種方法中，CP和Al蛋白-抗原融合體以雙順反子形式編碼，與啟動子如Trp啟動子可操縱地連接,如Kozlovska et al. , Intervirology, 39 9-15(1996)的圖I所述。適于抗原或者抗原決定簇的融合的其它VLP在W003/024481中描述，包括噬菌體 fr、RNA phase MS_2、乳頭瘤病毒的殼體蛋白、反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子Ty、酵母以及逆轉(zhuǎn)錄病毒樣顆粒、HIV2Gag、豇豆花葉病毒、細(xì)小病毒VP2VLP、HBsAg(US 4，722，840，EP0020416B1)。適于實施本發(fā)明的嵌合VLP的實例也包括在Intervirology 39 I (1996)中描述的那些。預(yù)期用于本發(fā)明中的 VLP 的其它實例是HPV-l、HPV-6、HPV-ll、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、 CRPV, COPV, HIV GAG、煙草花葉病毒、SV-40的病毒樣顆粒、多瘤病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、輪狀病毒和Norwalk病毒。對于與免疫原性載體偶聯(lián)或者不偶聯(lián)的本發(fā)明的任何重組表達(dá)的抗原性PCSK9 肽，編碼所述肽或蛋白質(zhì)的核酸也是本發(fā)明的一方面，包含所述核酸的表達(dá)載體以及含有所述表達(dá)載體的宿主細(xì)胞(自主或染色體插入的)也是本發(fā)明的一方面。通過將其在上述宿主細(xì)胞中表達(dá)及從中分離免疫原的重組產(chǎn)生所述肽或蛋白質(zhì)的方法是本發(fā)明的另一方面。全長天然PCSK9分子或者編碼其的全長天然DNA序列不包含在本發(fā)明內(nèi)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的肽使用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)與免疫原性載體化學(xué)偶聯(lián)。通過單點綴合(例如N末端或C末端點)或者作為鎖定的結(jié)構(gòu)(locked down structure),其中肽的兩端綴合于免疫原性載體蛋白或者綴合于支架結(jié)構(gòu)如VLP, 可以發(fā)生綴合以使得肽自由運動。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的綴合化學(xué)發(fā)生綴合， 如通過半胱氨酸殘基、賴氨酸殘基或者通常已知作為綴合點的其它羧基部分，如谷氨酸或者天冬氨酸。因此，例如對于直接共價偶聯(lián)而言，可以利用碳二亞胺、戊二醛或者(N-[y_malcimidobutyryloxy]琥拍酰亞胺酯，利用可商購的異雙功能接頭如CDA和 SPDP(根據(jù)廠商指導(dǎo)使用)。肽、特別是環(huán)化肽與蛋白質(zhì)載體通過?；码难苌锞Y合的例子在W003/092714中描述。在偶聯(lián)反應(yīng)之后，所述免疫原可易于通過透析方法、凝膠過濾方法、分級分離方法等分離和純化。以半胱氨酸殘基為末端的肽(優(yōu)選在環(huán)化區(qū)域外面有接頭)可以通過馬來酰亞胺化學(xué)與載體蛋白質(zhì)便利地綴合。當(dāng)所述免疫原性載體是VLP時，具有相同氨基酸序列或者不同氨基酸序列的一些抗原性肽可以與單一 VLP分子偶聯(lián)，優(yōu)選獲得以定向方式呈遞一些抗原決定簇的重復(fù)及有序結(jié)構(gòu)，如 W000/32227、W003/024481、W002/056905 和 W004/007538 所述。在優(yōu)選的實施方案中，所述抗原性PCSK9肽通過化學(xué)交聯(lián)、典型及優(yōu)選通過使用異雙功能交聯(lián)劑結(jié)合VLP。本領(lǐng)域已知一些異雙功能交聯(lián)劑。在一些實施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑含有可與第一附著位點反應(yīng)的官能團，即與VLP或VLP亞基的賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基基團反應(yīng)，另一官能團可與優(yōu)選的第二附著位點反應(yīng)，即與所述抗原性肽融合的半胱氨酸殘基反應(yīng)，任選地也通過還原用于反應(yīng)。所述方法的第一個步驟典型被稱作衍生化， 是VLP與交聯(lián)劑的反應(yīng)。這個反應(yīng)的產(chǎn)物是激活的VLP，也稱作激活的載體。在第二個步驟中，使用常規(guī)方法如凝膠過濾或者透析方法，未反應(yīng)的交聯(lián)劑被除去。在第三個步驟中，所述抗原性肽與激活的VLP反應(yīng)，這個步驟典型被稱作偶聯(lián)步驟。未反應(yīng)的抗原性肽可以在第四個步驟中任選地除去，例如通過透析。一些異雙功能交聯(lián)劑為本領(lǐng)域已知。這些包括優(yōu)選的交聯(lián)劑 SMPH(Pierce) ,Sulfo-MBS,Sulfo-EMCS,Sulfo-GMBS,SuIfo-SIAB,SuIfo-SMPB, Sulfo-SMCC、SVSB、SIA 及其它交聯(lián)劑,例如得自 Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA)并具有一個與氨基反應(yīng)的官能團及一個與半胱氨酸殘基反應(yīng)的官能團。上述交聯(lián)劑均導(dǎo)致硫醚鍵形成。適用于實施本發(fā)明的另一類交聯(lián)劑特征在于在偶聯(lián)時在所述抗原性肽與VLP之間導(dǎo)入二硫鍵。屬于這個類別的優(yōu)選交聯(lián)劑包括例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP (Pierce)。VLP 與交聯(lián)劑的衍生化程度可以通過改變實驗條件而影響，所述實驗條件如每種反應(yīng)配偶體的濃度、一種試劑相對于另一種的過量、pH、溫度和離子強度。偶聯(lián)度，即抗原性肽/VLP亞基的量可以通過改變上述實驗條件而調(diào)節(jié)，以符合疫苗的要求。抗原性肽與VLP結(jié)合的另一種方法是VLP表面上賴氨酸殘基與抗原性肽上半胱氨酸殘基的連接。在一些實施方案中，可需要含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點或者作為其一部分的氨基酸接頭與抗原性肽融合以偶聯(lián)VLP。通常，優(yōu)選柔性氨基酸接頭。所述氨基酸接頭的例子選自(a) CGG ； (b) N-末端Y I-接頭；(c) N-末端Y 3-接頭；(d) Ig鉸鏈區(qū)；(e)N-末端甘氨酸接頭；(f) (G) kC (G) η, η = 0-12及k = 0_5 ; (g) N-末端甘氨酸-絲氨酸接頭；(h) (G) kC (G)m(S) i (GGGGS) η, η = 0-3, k = 0-5, m = 0-10, i = 0-2 ；(i)GGC ； (k) GGC-NH2 ； (I) C-末端Y 1_接頭；(m) C-末端Y 3-接頭；(n) C-末端甘氨酸接頭；(o) (G) nC (G) k, η = 0-12 及 k = 0-5 ; (p) C-末端甘氨酸 _ 絲氨酸接頭；(q) (G) m (S) t (GGGGS) n (G) oC(G)k, η = 0-3, k = 0-5, m = 0-10,1 = 0-2 及 ο = 0-8。氨基酸接頭的進(jìn)一步實例是免疫球蛋白的鉸鏈區(qū)，甘氨酸-絲氨酸接頭(GGGGS)n，及甘氨酸接頭(G)n，所有均進(jìn)一步含有半胱氨酸殘基作為第二附著位點及任選地含有進(jìn)一步的甘氨酸殘基。所述氨基酸接頭的典型優(yōu)選實例是N-末端Y I :C⑶KTHTSPP，C-末端Y I DKTHTSPPCG, N-末端Y 3 CGGPKPSTPPGSSGGAP, C-末端 Y 3 PKPSTPPGSSGGAPGGCG, N-末端甘氨酸接頭GCGGGG 及 C-末％5甘氣Ife接頭GGGGCG。當(dāng)疏水性抗原性肽與VLP結(jié)合時，特別適用于本發(fā)明中的其它氨基酸接頭是對于N末端接頭是CGKKGG或CGDEGG，對于C末端接頭是GGKKGC和GGEDGC。對于C末端接頭， 所述末端半胱氨酸任選地是C末端酰胺化的。
25
在本發(fā)明的一些實施方案中，在所述肽C末端的GGCG、GGC或GGC-NH2 (NH2表示酰胺化)接頭或者在N末端的CGG是優(yōu)選的氨基酸接頭。通常，甘氨酸殘基被插入在較大 (bulky)氨基酸與用作第二附著位點的半胱氨酸之間，以避免在偶聯(lián)反應(yīng)中所述較大氨基酸的潛在位阻現(xiàn)象。在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案中，氨基酸接頭GGC-NH2與所述抗原性肽的C末端融合。抗原性肽上存在的半胱氨酸殘基需要以其還原狀態(tài)與激活的VLP上的異雙功能交聯(lián)劑反應(yīng)，即需要利用游離的半胱氨酸或者具有游離巰基的半胱氨酸殘基。在作為結(jié)合位點的半胱氨酸殘基是氧化形式的情況中，例如其形成二硫鍵，需要用例如DTT、TCEP或者對-巰基乙醇還原這個二硫鍵。低濃度的還原劑與偶聯(lián)反應(yīng)相容，如WO 02/05690所述，而較高濃度則抑制偶聯(lián)反應(yīng)，如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在這種情況中，在偶聯(lián)之前需要除去還原劑或者降低其濃度，例如通過透析、凝膠過濾或者反相HPLC進(jìn)行。通過使用上述方法的異-雙功能交聯(lián)劑使所述抗原性肽與VLP結(jié)合，使得所述抗原性肽與VLP以定向方式偶聯(lián)。使所述抗原性肽與VLP結(jié)合的其它方法包括使用碳二亞胺 EDC和NHS使所述抗原性肽與VLP交聯(lián)的方法。在其它方法中，使用同-雙功能交聯(lián)劑如戊二醛、DSGBM[PE0] 4, BS3 (Pierce Chemical Company, Rockford, IL, USA)或者具有與VLP的胺基或羧基反應(yīng)的官能團的其它已知的同-雙功能交聯(lián)劑使所述抗原性肽附著于VLP。VLP與抗原性肽結(jié)合的其它方法包括其中VLP是生物素化的及所述抗原性肽作為鏈霉抗生物素蛋白-融合蛋白表達(dá)的方法，或者其中抗原性肽與VLP均是生物素化的方法， 例如WO 00/23955所述。在這種情況中，通過調(diào)節(jié)抗原性肽與鏈霉抗生物素蛋白的比率而使所述抗原性肽可以首先結(jié)合鏈霉抗生物素蛋白或者抗生物素蛋白，以便仍有游離結(jié)合位點可用于與在下一步驟中加入的VLP結(jié)合?；蛘?，所有成分可以在“一鍋”反應(yīng)中混合?？梢允褂闷渌潴w-受體對作為結(jié)合劑以使抗原性肽與VLP結(jié)合，其中利用可溶形式的受體和配體，其能與VLP或抗原性肽交聯(lián)?；蛘?，所述配體或受體可以與抗原性肽融合，由此介導(dǎo)與分別與所述受體或配體化學(xué)結(jié)合或者融合的VLP的結(jié)合。融合也可以通過插入或取代而實現(xiàn)。如果空間排列允許，一或幾個抗原分子可以附著于RNA噬菌體外殼蛋白的殼體或 VLP的一個亞基，優(yōu)選通過RNA噬菌體的VLP的暴露的賴氨酸殘基進(jìn)行。RNA噬菌體的外殼蛋白VLP及特別是QP外殼蛋白VLP的一個特異特征因此是每個亞基可以偶聯(lián)若干抗原。這樣可以產(chǎn)生密度抗原陣列。Q外殼蛋白的VLP或者殼體在其表面上展示限定數(shù)目的賴氨酸殘基，具有限定拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，即三個賴氨酸殘基指向殼體內(nèi)部并與RNA相互作用，以及四個其它賴氨酸殘基暴露于殼體外面。這些限定性質(zhì)有益于抗原附著于其中賴氨酸殘基與RNA相互作用的所述顆粒的外面而不是所述顆粒的內(nèi)部。其它RNA噬菌體外殼蛋白的VLP在其表面上也具有限定數(shù)目的賴氨酸殘基以及這些賴氨酸殘基的限定拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案中，第一附著位點是賴氨酸殘基和/或第二附著位點包含巰基或者半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的更進(jìn)一步的實施方案中，第一附著位點是賴氨酸殘基，第二附著位點是半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的進(jìn)一步實施方案中，所述抗原或抗原決定簇通過半胱氨酸殘基與RNA噬菌體外殼蛋白VLP的賴氨酸殘基結(jié)合，特別是與Qbeta外殼蛋白的VLP結(jié)合。衍生自RNA噬菌體的VLP的另一優(yōu)勢是其在細(xì)菌中的高表達(dá)產(chǎn)量，使得可以低成本產(chǎn)生大量材料。此外，VLP作為載體的使用使得可以形成具有可變抗原密度的大型抗原陣列和綴合物。特別地，RNA噬菌體的VLP的使用及從而RNA噬菌體Qbeta外殼蛋白的VLP 的使用可以實現(xiàn)非常高的表位密度。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本文揭示的抗原性PCSK9肽與CRM197直接或者通過本文揭示的肽接頭之一連接，優(yōu)選化學(xué)交聯(lián)，以產(chǎn)生免疫原。在一個實施方案中，本文揭示的抗原性PCSK9肽與CRM197通過如本文所述化學(xué)交聯(lián)方式及優(yōu)選通過使用如上述異雙功能交聯(lián)劑連接。與CRM197 —起使用的優(yōu)選的異雙功能交聯(lián)劑是BAANS(溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)、SMPH(琥珀酰亞氨基-6-[β -馬來酰亞氨基丙酰氨基]己酸酯)、Sulfo-MBS、 Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB、SIA 以及得自例如 Pierce Chemical Company (Rockford, IL, USA)的其它交聯(lián)劑。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑是BAANS或SMPH。或者，在本發(fā)明中也可以使用適合在所述抗原性肽與CRM197之間導(dǎo)入二硫鍵的交聯(lián)劑。屬于這個類別的優(yōu)選交聯(lián)劑包括例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。在一個具體的實施方案中，當(dāng)本文揭示的抗原性PCSK9肽序列包含半胱氨酸時， 所述抗原性PCSK9肽可以通過所述半胱氨酸直接與CRM197共價連接。在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物可包含免疫原性綴合物的混合物，即偶聯(lián)于一或若干個本發(fā)明的抗原性PCSK9肽的免疫原性載體。因此，這些免疫原性組合物可以由氨基酸序列不同的免疫原性載體組成。例如，可以制備這樣的疫苗組合物， 其包含“野生型”VLP和其中一或多個氨基酸殘基已經(jīng)被改變(例如缺失、插入或取代)的修飾的VLP蛋白。或者，可以使用相同免疫原性載體，但是偶聯(lián)于不同氨基酸序列的抗原性 PCSK9 肽。本發(fā)明因此還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的免疫原的方法，所述方法包括i)提供本發(fā)明的抗原性PCSK9肽，ii)提供本發(fā)明的免疫原性載體，優(yōu)選VLP，及iii)組合所述抗原性PCSK9 肽及所述免疫原性載體。在一個實施方案中，所述組合步驟通過化學(xué)交聯(lián)、優(yōu)選通過異雙功能交聯(lián)劑進(jìn)行。在本發(fā)明的一個實施方案中，本文揭示的抗原性PCSK9肽與免疫原性載體分子連接。在一個實施方案中，所述免疫原性載體選自本文所述任何免疫原性載體。在另一實施方案中，所述免疫原性載體選自血清白蛋白，如牛血清白蛋白(BSA)，球蛋白，甲狀腺球蛋白，血紅蛋白，血藍(lán)蛋白(特別是匙孔血藍(lán)蛋白[KLH])以及病毒樣顆粒(VLP)。在優(yōu)選的實施方案中，所述免疫原性載體是白喉類毒素，白喉毒素的CRM197突變體，破傷風(fēng)類毒素， 匙孔血藍(lán)蛋白或者病毒樣顆粒(VLP)。在更優(yōu)選的實施方案中，所述免疫原性載體是DT、 CRM197 或者 VLP，所述VLP選自 HBcAg VLP,HBsAg VLP,Qbeta VLP,PP7VLP,PPV VLP,Norwalk 病毒VLP或者本文揭示的任何變體。在更優(yōu)選的實施方案中，所述免疫原性載體是噬菌體 VLP,如Qbeta VLP,選自 Qbeta CP ；Qbeta Al, Qbeta-240, Qbeta-243, Qbeta-250, Qbeta-251 及 Qbeta-259 (在 W003/024481 中揭示)或者 PP7。在另一優(yōu)選的實施方案中，所述免疫原性載體是CRM197。
在一個實施方案中，所述免疫原性載體與本文揭示的抗原性PCSK9肽直接或者通過接頭共價連接。在一個實施方案中，所述免疫原性載體通過如本文所述表達(dá)融合蛋白與本文揭示的所述抗原性PCSK9肽連接。在另一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽通過如本文所述化學(xué)交聯(lián)方式及優(yōu)選通過使用異雙功能交聯(lián)劑與免疫原性載體優(yōu)選VLP連接。本領(lǐng)域已知一些異雙功能交聯(lián)劑。在一些實施方案中，所述異雙功能交聯(lián)劑含有可以與第一附著位點反應(yīng)的官能團，即與VLP或VLP亞基的賴氨酸殘基的側(cè)鏈氨基反應(yīng)，以及含有另一個官能團，該官能團可與優(yōu)選的第二附著位點反應(yīng)，即與所述抗原性肽融合的半胱氨酸殘基反應(yīng)，所述半胱氨酸殘基經(jīng)還原反應(yīng)而可用于反應(yīng)。
_9] 包含接頭的本發(fā)明抗原性PCSK9肽在本發(fā)明的一個實施方案中，本文揭示的抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端或者在其C末端或者在N和C兩個末端的接頭，所述接頭在化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)中能與所述免疫原性載體的附著位點反應(yīng)。在一個實施方案中，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的接頭，所述接頭化學(xué)式為(G)nC、(G)nSC或者(G)nK，優(yōu)選(G)nC，其中n是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)，優(yōu)選選自0、1、2、3、4和5，更優(yōu)選選自0、1、2和3， 最優(yōu)選n是0或1(在n等于0時，該化學(xué)式代表半胱氨酸)。優(yōu)選本文揭示的所述抗原性 PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的具有化學(xué)式GGGC、GGC、GC或C的接頭。在本發(fā)明另一實施方案中，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的接頭，所述接頭的化學(xué)式是C(G)n、CS (G)n或者K(G)n，優(yōu)選C(G)n，其中n是選自O(shè)、I、2、
3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)，優(yōu)選選自O(shè)、1、2、3、4和5，更優(yōu)選選自O(shè)、1、2和3，最優(yōu)選n是 0或I (在n等于0時，該化學(xué)式代表半胱氨酸)。優(yōu)選本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的具有化學(xué)式CGGG、CGG、CG或C的接頭。在另一實施方案中，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的接頭，該接頭的化學(xué)式是(G)nC、(G)nSC或者(G)nK，優(yōu)選(G)nC，其中n是選自0、1、2、3、4、5、
6、7、8、9和10的整數(shù)，優(yōu)選選自0、1、2、3、4和5，更優(yōu)選選自O(shè)、1、2和3，最優(yōu)選n是0或 I (在n等于0時，該化學(xué)式代表半胱氨酸)以及包含在其N末端的接頭，該接頭的化學(xué)式是 C (G)n、CS (G)n 或者 K (G)n，優(yōu)選 C (G)n，其中 n 是選自 O、1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 的整數(shù)，優(yōu)選0、1、2、3、4和5，更優(yōu)選0、1、2和3，最優(yōu)選n是0或1(在n等于0時，該化學(xué)式代表半胱氨酸)。優(yōu)選本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的具有化學(xué)式CGGG、 CGG,CG或C的接頭以及在其C末端的具有化學(xué)式GGGC、GGC、GC或C的接頭。優(yōu)選地，本文揭示的所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的半胱氨酸及在其C末端的半胱氨酸。進(jìn)一步包含這種接頭的代表性的抗原性PCSK9肽如SEQ ID NO :313、314、315、 316、317、322、323、324、325、326、327、328、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、 411、412、413、414、415、416、417、418 和 419 所示。進(jìn)一步包含這種接頭的代表性的抗原性PCSK9肽如SEQ ID NO :313、314、315、 316、317、322、323、324、325、326、327 和 328 所示。優(yōu)選的包含接頭的抗原性PCSK9 肽如 SEQ ID No :317、322、323、324、401、402、 403、413、414、415 和 416 所示。優(yōu)選的包含接頭的抗原性PCSK9肽如SEQ ID No :317、322、323和324所示。最優(yōu)選的包含接頭的抗原性PCSK9肽如SEQ ID No :317、322、402和413所示。
在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是環(huán)化的。在一個實施方案中，所述環(huán)化的抗原性PCSK9肽附著于免疫原性載體。在一個實施方案中，所述環(huán)化的抗原性PCSK9肽通過共價結(jié)合附著于免疫原性載體。在一個實施方案中，所述環(huán)化的抗原性PCSK9肽通過其氨基酸側(cè)鏈之一與載體的共價結(jié)合而附著于免疫原性載體。在一個實施方案中，在環(huán)化的PCSK9肽中加入包含可變數(shù)目甘氨酸殘基和一個半胱氨酸殘基的半胱氨酸、GC或CC片段以使得可以通過加入的半胱氨酸與所述免疫原性載體共價結(jié)合。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽是環(huán)化的，且包含半胱氨酸、(G)nC* C(G)n片段，其中η是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)，優(yōu)選選自0、1、2、3、4和5， 更優(yōu)選選自O(shè)、1、2和3，最優(yōu)選η是O或1(在η等于O時，該化學(xué)式代表半胱氨酸)。這種構(gòu)象限制的抗原性PCSK9肽的非限制性實例是SEQ ID No :318、319、320和 321所示肽。優(yōu)選的環(huán)化的肽是SEQ ID No :318所示肽。使用各種接頭使抗原性pCSK9肽與上述載體或支架綴合的實例均在本發(fā)明范圍內(nèi)且組成了本發(fā)明的各個實施方案，這些實例在下文提供肽-GGGGGC-支架，肽-GGGGC-支架，肽-GGGC-支架，肽-GGC-支架，肽-GC-支架，肽-C-支架，肽-GGGGGK-支架，肽-GGGGK-支架，肽-GGGK-支架，肽-GGK-支架， 肽-GK-支架，肽-K-支架，肽-GGGGSC-支架，肽-GGGSC-支架，肽-GGSC-支架，肽-GSC-支架，肽-SC-支架，支架-CSGGGG-肽，支架-CSGGG-肽，支架-CSGG-肽，支架-CSG-肽，支架-CS-肽，支架-KGGGG-肽，支架-KGGG-肽，支架-KGG-肽，支架-KG-肽，支架-K-肽。在一個實施方案中，所述肽由本文揭示的任何抗原性PCSK9肽組成，所述支架由本文揭示的任何免疫原性載體、優(yōu)選VLP組成。下文提供了使用各種接頭與雙重限制的(doubly constrained)肽的綴合的組合的實例，其中所述載體可以是相同的載體單體或者不同的載體單體。(在下文的實例中，所述GC接頭可以由上文舉例的任何GK接頭或者GSC接頭或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它接頭取代)載體-CGGGGG-肽-GGGGGC-載體，載體-CGGGG-肽-GGGGC-載體，載體-CGGGG-肽-GGGGC-載體，載體-CGGG-肽-GGGC-載體，載體-CG-肽-GC-載體，載體-CG-肽-C-載體，載體-C-肽-C-載體。在一個實施方案中，所述肽由本文揭示的任何抗原性PCSK9肽組成，所述載體由本文揭示的任何免疫原性載體優(yōu)選VLP組成。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含抗原性PCSK9肽的免疫原，所述肽由選自SEQ ID No :1-312,330-398及420-588的氨基酸序列組成或者基本上由其組成，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端或者在其N末端的半胱氨酸，其通過硫醚鍵與免疫原性載體化學(xué)交聯(lián)。在一優(yōu)選的實施方案中，所述免疫原性載體選自DT (白喉毒素)、TT (破傷風(fēng)類毒素)或者TT的片段C、ro (流感嗜血桿菌蛋白D)、CRM197，其它DT點突變體，如CRM176、 CRM228.CRM 45、CRM 9、CRM102、CRM 103 和 CRM107。優(yōu)選所述免疫原性載體是 CRM197。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含抗原性PCSK9肽的免疫原，所述肽由選自SEQ ID No :1-312,330-398及420-588的氨基酸序列組成或者基本上由其組成，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端或者在其N末端的半胱氨酸，其通過硫醚鍵與免疫原性載體化學(xué)交聯(lián)，使用SMPH(琥珀酰亞氨基-6-[ β -馬來酰亞氨基丙酰氨基]己酸酯)或者BAANS (溴乙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯)作為交聯(lián)劑。在一優(yōu)選的實施方案中，所述免疫原性載體選自DT (白喉毒素)、TT (破傷風(fēng)類毒素)或者TT的片段C、H)(流感嗜血桿菌蛋白D、 CRM197，其它 DT 點突變體，如 CRM176、CRM228、CRM 45、CRM 9、CRM102、CRM103 及 CRM107。 優(yōu)選所述免疫原性載體是CRM197。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含抗原性PCSK9肽的免疫原，所述肽由選自SEQ ID No :1-312,330-398及420-588的氨基酸序列組成或者基本上由其組成，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的半胱氨酸，其通過硫醚鍵與免疫原性載體化學(xué)交聯(lián)， 使用SMPH(琥珀酰亞氨基-6-[ P -馬來酰亞氨基丙酰氨基]己酸酯)或者BAANS (溴乙酸 N-羥基琥珀酰亞胺酯)作為交聯(lián)劑，所述鍵在CRM197的賴氨酸殘基與所述抗原性肽的半胱氨酸殘基之間。包含本發(fā)明的抗原性PCSK9肽的組合物本發(fā)明進(jìn)一步涉及組合物，特別是免疫原性組合物，也稱作“主題(subject)免疫原性組合物”，其包含本發(fā)明的抗原性PCSK9肽，優(yōu)選與免疫原性載體連接，及任選地包含至少一種佐劑。這種免疫原性組合物，特別是當(dāng)作為藥物組合物配制時，被認(rèn)為可用于預(yù)防、 治療或者減輕PCSK9-相關(guān)疾病。在一些實施方案中，本發(fā)明的主題免疫原性組合物包含抗原性PCSK9肽，任選地包含接頭，所述肽包含選自SEQ ID No :1-328、330-398及401-588的氨基酸序列及其功能活性變體。在一些實施方案中，所述抗原性PCSK9肽與免疫原性載體連接，優(yōu)選與DT、 CRM197 或 VLP 連接，更優(yōu)選與 HBcAg、HBsAg, Qbeta、PP7、PPV 或者 Norwalk 病毒 VLP 連接。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的主題免疫原性組合物包含抗原性PCSK9肽，任選地包含接頭，所述肽包含與VLP、優(yōu)選Qbeta VLP連接的選自SEQ ID No : 1_328、330_398及 401-588的氨基酸序列及其功能活性變體。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的主題免疫原性組合物包含抗原性PCSK9肽，任選地包含接頭，所述肽包含與CRM197連接的選自SEQ ID No :1_328、330_398及401-588的氨基酸序列及其功能活性變體。本發(fā)明的包含抗原性PCSK9肽的主題免疫原性組合物可以通過多種方式制備，如在下文詳細(xì)描述。在一些實施方案中，主題免疫原性組合物包含單一物種的抗原性PCSK9肽，如所述免疫原性組合物包含一群抗原性PCSK9肽，其基本上均具有相同氨基酸序列。在其它實施方案中，主題免疫原性組合物包含兩或多個不同抗原性PCSK9肽，如所述免疫原性組合物包含一群抗原性PCSK9肽，該群成員的氨基酸序列可不同。主題免疫原性組合物可包含
2-大約20個不同的抗原性PCSK9肽，如主題免疫原性組合物可包含2，3，4，5，6，7，8，9，10，
11-15或者15-20個不同的抗原性PCSK9肽，所述肽均具有與其它抗原性PCSK9肽氨基酸序列不同的氨基酸序列。在其它實施方案中，主題免疫原性組合物包含多聚體化的抗原性PCSK9多肽。如本文所用，術(shù)語“包含抗原性PCSK9肽的免疫原性組合物”或者“本發(fā)明的免疫原性組合物” 或者“主題免疫原性組合物”是指包含偶聯(lián)或者不偶聯(lián)于免疫原性載體的單一物種(多聚體化或否)或者多物種的抗原性PCSK9肽的免疫原性組合物。在使用兩或多種肽偶聯(lián)載體的情況中，所述肽可以偶聯(lián)于相同載體分子或者各自偶聯(lián)于載體分子，然后組合產(chǎn)生免疫原性組合物。本發(fā)明另一方面涉及產(chǎn)生本發(fā)明免疫原的方法，所述方法包括將抗原性PCSK9肽與免疫原性載體偶聯(lián)。在一個實施方案中，所述偶聯(lián)是化學(xué)偶聯(lián)。佐逝在一些實施方案中，主題免疫原性組合物包含至少一種佐劑。合適的佐劑包括適用于哺乳動物優(yōu)選人的那些。可用于人的已知合適佐劑的例子包括但不限于明礬，磷酸鋁， 氫氧化招，MF59 (4. 3 % w/v 角 S烯、O. 5 % w/v 聚山梨醇酯 80 (Tween 80)、0· 5 % w/v 三油酸山梨坦(Span 85))，含有CpG的核酸(其中胞嘧啶是未甲基化的)，QS21(皂苷佐劑)， MPL (單磷酰脂質(zhì) A)，3DMPL (3-0-去?；?MPL)，Aquilla 提取物，ISCOMS (見例如Sj0lander et al. (1998)J.Leukocyte Biol. 64 713 ；W090/03184, W096/11711, WO 00/48630， W098/36772, W000/41720, W006/134423 和 W007/026190)，LT/CT 突變體，聚(D, L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，Quil A, TiterMax classic, TiterMax Gold,白細(xì)胞介素等。 對于包括但不限于動物實驗的獸醫(yī)應(yīng)用，可以使用弗氏佐劑，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP 11637， 稱作正-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2- (Γ -2’ - 二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-乙胺(CGP 19835A，稱作MTP-PE)及RIBI，其含有從細(xì)菌中提取的三種成分，單磷酰脂質(zhì)A，海藻糖二霉菌酸酯以及細(xì)胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)，于2% 角鯊烯/Tween 80乳狀液中。增強所述組合物效力的其它舉例的佐劑包括但不限于(I)水包油乳狀液配制物(有或無其它特定免疫刺激劑，如胞壁酰肽(見下文)或者細(xì)菌細(xì)胞壁成分)，例如(a) MF59 (W090/14837, Vaccine design the subunit and adjuvant approach 第 10 章， eds. Powell & Newman, Plenum Press 1995),含有 5%角藍(lán)烯、0. 5% Tween 80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)和0.5% Span85(三油酸山梨坦)(任選地含有與二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)共價連接的胞壁酰三肽)，使用微流化儀(microfluidizer)配制成亞微米粒子，(b) SAF,含有10 %角藍(lán)燒、0. 4 % Tween 80、5 % pluronic阻斷聚合物 (pluronic-blocked polymer) L121及thr-MDP,微流體化為亞微米粒子或者旋動以產(chǎn)生較大顆粒大小的乳狀液，以及(c)RIBI 佐劑系統(tǒng)(RAS) (Ribi Immunochem，Hamilton，MT)，含有2 %角鯊烯，0. 2 % Tween 80及一或多種細(xì)菌細(xì)胞壁成分如單磷酰脂質(zhì)A (MPL)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，以及細(xì)胞壁骨架(CWS)，優(yōu)選MPL+CWS (DET0X ) ； (2)可以使用皂苷佐劑，如 QS21, STIMUL0N (Cambridge Bioscience, Worcester, MA)，Abisco (Isconova, Sweden)， 或者Iscomatrix (Commonwealth Serum Laboratories, Australia),或者從中產(chǎn)生的粒子如ISCOMs (免疫刺激復(fù)合物)，所述ISCOMS可以不具有另外的洗滌劑，如W000/07621所述；(3)完全弗氏佐劑(CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA) ；(4)細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(例如 IL-I、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12 (W099/44636)等)，干擾素(例如 Y _ 干擾素)，巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)，腫瘤壞死因子(TNF)等；(5)單磷酰脂質(zhì)A (MPL)或者3-0-去?；疢PL(3dMPL)，例如GB-2220221，EP-A-0689454所述，當(dāng)與肺炎球菌糖一起使用時任選地基本上沒有明礬，例如W000/56358所述；(6) 3dMPL與例如QS21和/或水包油乳狀液的組合，如 EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231 所述；(7)包含 CpG 基序的寡核苷酸[見 Krieg Vaccine 2000,19,618-622 ；Krieg Curr opin Mol Ther20013 15-24 ；Roman et al.，Nat. Med.，1997，3，849-854 ；ffeiner et a I.，PNAS USA,1997,94, 10833-10837 ；Davis et al, J. Immunol,1998,160, 870-876 ；Chu et a i. , J.Exp. Med, 1997,186,1623-1631 ；Lipford et al, Ear. J. Immunol. ,1997,27, 2340-2344 ；Moldoveami e/al. ， Vaccine,1988，16，1216-1224， Krieg etal. ， Nature,1995,374,546-549 ；Klinman et al.，PNAS USA，1996，93，2879-2883 ；Ballas et al, J. Immunol，1996，157，1840-1845 ； Cowdery et al, J. Immunol,1996,156,4570-4575 ；Halpern et al, Cell Immunol,1996, 167,72-78 ;Yamamoto et al, Jpn. J. Cancer Res. ,1988,79,866-873 ;Stacey et al, J. Immunol. ,1996,157,2116-2122 ；Messina et al, J. Immunol,1991,147,1759-1764 ；Yi et al, J. Immunol,1996,157,4918-4925 ；Yi et al, J. Immunol,1996,157, 5394-5402 ；Yi et al，J. Immunol,1998，160，4755-4761 及 Yi et al，J. Immunol,1998，160，5898-5906 ;國際專利申請 W096/02555、TO98/16247、TO98/18810、W098/40100、TO98/55495、W098/37919 和TO98/52581]，即含有至少一個CG 二核苷酸，其中胞嘧啶是未甲基化的；(8)聚氧乙烯醚或者聚氧乙烯酯，如W099/52549所述；(9)聚氧乙烯山梨聚糖酯表面活性劑組合辛苯昔醇(W001/21207)或者聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑組合至少一種額外的非離子表面活性劑如辛苯昔醇(W001/21152) ；(10)皂苷與免疫刺激性寡核苷酸(例如CpG寡核苷酸)(W000/62800) ； (11)免疫刺激劑與金屬鹽顆粒，如W000/23105所述；(12)皂苷與水包油乳狀液，如W099/11241所述；(13)皂苷(例如QS21)+3dMPL+IM2(任選地+固醇)，如 W098/57659所述；(14)發(fā)揮免疫刺激劑作用以增強組合物效力的其它物質(zhì)，如胞壁酰肽， 包括N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-MDP)，N-25-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(正-MDP)，N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(I，-2，-二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧)-ZKMTP-PE) ; (15) toll-樣受體 (TLR)的配體，天然或者合成的(例如 Kanzler et al 2007, Nature Medicine 13,pl552_9 所述)，包括TLR3配體如polyl :C及相似的化合物如Hiltonol和安普利更(Ampligen)。在特定實施方案中，所述佐劑是免疫刺激性寡核苷酸，優(yōu)選CpG寡核苷酸。如本文所用，CpG寡核苷酸是指免疫刺激性CpG寡脫氧核苷酸(CpGODN)，由此除非特別指出則這些術(shù)語可互換使用。免疫刺激性CpG寡脫氧核苷酸含有一或多個免疫刺激性CpG基序，其是未甲基化的胞嘧啶-鳥嘌呤二核苷酸，任選地在某些優(yōu)選的堿基中。CpG免疫刺激性基序的甲基化狀態(tài)通常是指二核苷酸內(nèi)胞嘧啶殘基。含有至少一個未甲基化CpG 二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸是這樣的寡核苷酸，其含有5’未甲基化胞嘧啶，通過磷酸鍵與3’鳥嘌呤連接，其通過結(jié)合Toll-樣受體9(TLR-9)激活免疫系統(tǒng)。在另一實施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸可含有一或多個甲基化CpG 二核苷酸，其通過TLR9激活免疫系統(tǒng)，但是不如在 CpG是未甲基化的情況的作用強。CpG免疫刺激性寡核苷酸可包含一或多個回文結(jié)構(gòu)，其反過來可包含CpG 二核苷酸。CpG寡核苷酸已經(jīng)在許多授權(quán)的專利、公開的專利申請及其它出版物中描述，包括美國專利 6，194，388,6, 207，646,6, 214，806,6, 218，371,6, 239，116 和 6，339，068。已經(jīng)鑒別了不同類別的CpG免疫刺激性寡核苷酸。這些類別被稱作A、B、C和P 類，在下文更詳細(xì)描述。本發(fā)明的方法包括這些不同類別的CpG免疫刺激性寡核苷酸的應(yīng)用。任何類別均可進(jìn)行E修飾，增強其效力。E修飾可以是用鹵素取代5’末端核苷酸；舉例的這種取代包括但不限于溴-尿苷或者碘-尿苷取代。E修飾也可包括乙基-尿苷取代5’末端核苷酸?！癆類” CpG免疫刺激性寡核苷酸通過其從漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC)中誘導(dǎo)高水平干擾素- a (IFN- α )及誘導(dǎo)NK細(xì)胞激活同時對B細(xì)胞激活具有最小作用的能力而功能性鑒定。從結(jié)構(gòu)上說，這個類別在5’和3’末端典型具有穩(wěn)定的聚-G序列。其還具有至少6個核苷酸的含有回文結(jié)構(gòu)的磷酸二酯CpG 二核苷酸序列，例如但非必需含有如下六聚體回文結(jié)構(gòu)之一 GACGTC、AGCGCT或者AACGTT,由Yamamoto及同事所述，Yamamoto S et al. J. Immunol 148 :4072-6(1992)。A類CpG免疫刺激性寡核苷酸及這個類別的舉例序列已經(jīng)在美國非臨時專利申請系列號09/672，126和公開的PCT申請PCT/US00/26527 (TO 01/22990)中描述，這兩個專利均在2000年9月27日提交。在一個實施方案中，本發(fā)明的“A類” CpG寡核苷酸具有如下核酸序列 5，GGGGACGACGTCGTGGGGGGG 3'A類寡核苷酸的一些非限制性實例包括5’ GiGiG_G_A_C_G_A_C_G_T_C_G_T_G_GiGiGiGiGiG 3’，其中表不硫代憐0 酷
鍵，“_”表示磷酸二酯鍵。本發(fā)明的B類CpG寡核苷酸序列是在上文大體描述以及在公開的PCT專利申請 PCT/US95/01570和 PCT/US97/19791 及 USP 6，194，388,6, 207，646,6, 214，806,6,218，371、 6，239，116和6，339，068中揭示的那些序列。舉例的序列包括但不限于在這些申請和專利中揭示的那些。在一個實施方案中，本發(fā)明的“B類” CpG寡核苷酸具有如下核酸序列5，TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3，(SEQ ID No :589)，或者5，TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3，(SEQ ID No :590)，或者5，TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3，(SEQ ID No :591)，或者5，TCGTCGTTTCGTCGTTTTGTCGTT 3，(SEQ ID No :592)，或者5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTTTTCGA 3’ (SEQ ID No :593)。在任何這些序列中，所有鍵可以全是硫代磷酸酯鍵。在另一個實施方案中，在任何這些序列中，一或多個鍵可以是磷酸二酯鍵，優(yōu)選在CpG基序的“C”和“G”之間，產(chǎn)生半軟的CpG寡核苷酸。在任何這些序列中，乙基-尿苷或者鹵素可以取代5’T ;舉例的鹵素取代包括但不限于溴-尿苷或者碘-尿苷取代。B類寡核苷酸的一些非限制性例子包括5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*G*C*T*T*T*T 3’，或者5’ T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*C*G*G*T*C*G*T*T*T*T 3’，或者5，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3，，或者5，T*C*G*T*C*G*T*T*T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T 3，，或者5J T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C*G*A 3’，其中“ ”是指硫代磷酸酯鍵?！癈類” CpG免疫刺激性寡核苷酸通過其激活B細(xì)胞和NK細(xì)胞及誘導(dǎo)IFN- α的能力而功能性鑒定。在結(jié)構(gòu)上，這個類別典型包括具有一或多個B類免疫刺激性CpG基序的區(qū)域，及GC富集的回文或者近回文區(qū)域，使得所述分子能形成二級(如莖環(huán))或者三級(如二聚體)類型結(jié)構(gòu)。一些這些寡核苷酸具有傳統(tǒng)的“刺激性” CpG序列以及“GC富集的”或者“B細(xì)胞中和”基序。這些組合基序寡核苷酸具有免疫刺激作用處于傳統(tǒng)的B類CpG寡核苷酸相關(guān)的作用(即強力誘導(dǎo)B細(xì)胞激活和樹突狀細(xì)胞(DC)激活)與A類CpG ODN(即強力誘導(dǎo)IFN- a和NK細(xì)胞激活，但相對弱誘導(dǎo)B細(xì)胞和DC激活)相關(guān)的作用之間。Krieg AM et al. (1995)Nature 374 :546-9 ;Ballas ZK et al. (1996)J Immunol 157 :1840-5; Yamamoto S et al. (1992)J Tmmuno1148 4072-6o所述C類組合基序免疫刺激性寡核苷酸可具有完全穩(wěn)定的(如所有硫代磷酸酯)、 嵌合的(磷酸二酯中心區(qū))或者半軟(如CpG基序內(nèi)磷酸二酯)主鏈。這個類別已經(jīng)在 2002年8月19日提請的美國專利申請US 10/224,523中描述。C類CpG寡核苷酸的一個刺激性結(jié)構(gòu)域或基序由如下化學(xué)式定義5’ X1DCGHX2S 。 D是除了 C之外的核苷酸。C是胞嘧啶。G是鳥嘌呤。H是除了 G之外的核苷酸。乂1和乂2 是0-10個核苷酸長的任何核酸序列。X1可包括CG，在這種情況中優(yōu)選T就在這個CG的前面。在一些實施方案中，DCG是TCG。X1優(yōu)選長度為0-6個核苷酸。在一些實施方案中，X2 不含有任何聚G或聚A基序。在其它實施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸在5’末端或3’ 末端具有聚-T序列。如本文所用，“聚-A”或者“聚-T”應(yīng)是指分別具有4或更多個連續(xù)A 或T的一段序列，如5’ AAAA 3’或者5’ TTTT 3’。如本文所用，“聚-G末端”應(yīng)是指在核酸的5’端或3’端具有4或更多個連續(xù)G的一段序列，如5’GGGG 3’。如本文所用，“聚-G寡核苷酸”應(yīng)是指具有化學(xué)式5’ X1X2GGGX3X4S 的寡核苷酸，其中Xp X2、X3和X4是核苷酸，優(yōu)選X3和X4中至少一個是G。在此化學(xué)式基礎(chǔ)上設(shè)計的一些優(yōu)選的B細(xì)胞刺激性結(jié)構(gòu)域包含 TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、TTCGT、TTTCGT、TCGTCGT。C類CpG寡核苷酸的第二個基序被稱作P或N，其位于緊鄰X1的5’端或者緊鄰X2 的3’端。N是B細(xì)胞中和序列，其以CGG三核苷酸開始，長度為至少10個核苷酸。B細(xì)胞中和基序包括至少一個CpG序列，其中CG前面是C或者后面是G (Krieg AM et al. (1998) Proc Natl Acad Sd USA 95 :12631-12636)或者 CG 是含有 DNA 序列的 CG，其中 CG 的 C 是甲基化的。當(dāng)存在于其它非刺激性基序中時，中和基序或序列具有某些程度的免疫刺激能力，但是當(dāng)存在于其它免疫刺激性基序中時，其降低所述其它基序的免疫刺激潛力。P是GC富集的回文結(jié)構(gòu)，含有至少10個核苷酸長的序列。如本文所用，“回文結(jié)構(gòu)”和等同的“回文序列”應(yīng)是指反向重復(fù)，即序列如 ABCDEE，D’ C，B，A’，其中A和A’、B和B，等是能形成通常的Watson-Crick堿基對的堿基。如本文所用，“GC-富集的回文結(jié)構(gòu)”應(yīng)是指具有至少三分之二 G和C堿基組成的回文結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，GC富集的結(jié)構(gòu)域優(yōu)選是“B細(xì)胞刺激性結(jié)構(gòu)域”的3’。在 10個堿基長的GC富集的回文結(jié)構(gòu)中，所述回文結(jié)構(gòu)因此含有至少8個G和C。在12個堿基長的GC富集的回文結(jié)構(gòu)的情況中，所述回文結(jié)構(gòu)也含有至少8個G和C。在14聚體GC 富集回文結(jié)構(gòu)的情況中，所述回文結(jié)構(gòu)的至少10個堿基是G和C。在一些實施方案中，GC 富集的回文結(jié)構(gòu)只由G和C組成。在一些實施方案中，GC富集的回文結(jié)構(gòu)具有至少81% G和C的堿基組成。在這種 10個堿基長的GC富集的回文結(jié)構(gòu)的情況中，所述回文結(jié)構(gòu)因此只由G和C組成。在這種 12個堿基長的GC富集的回文結(jié)構(gòu)的情況中，優(yōu)選所述回文結(jié)構(gòu)的至少10個堿基(83% )是G和C。在一些優(yōu)選的實施方案中，12個堿基長的GC富集的回文結(jié)構(gòu)只由G和C組成。 在14聚體GC富集的回文結(jié)構(gòu)的情況中，所述回文結(jié)構(gòu)的至少12個堿基(86%)是G和C。 在一些優(yōu)選的實施方案中，14個堿基長的GC富集的回文結(jié)構(gòu)只由G和C組成。GC富集的回文結(jié)構(gòu)的C可以是未甲基化的，或者其可以是甲基化的。通常，這個結(jié)構(gòu)域具有至少3個C和G，優(yōu)選每種4個，更優(yōu)選每種5或更多個。這個結(jié)構(gòu)域中C和G的數(shù)目不需要相同。優(yōu)選C和G如此排列，以便其能形成自身互補雙鏈體或者回文結(jié)構(gòu)，如CCGCGCGG。其可以由A或T中斷，但優(yōu)選所述自身互補是至少部分保守的，如在基序CGACGTTCGTCG或者CGGCGCCGTGCCG中。當(dāng)互補不是保守的時，優(yōu)選非互補堿基對是TG。在優(yōu)選的實施方案中，存在不超過3個的連續(xù)堿基不是回文的一部分，優(yōu)選不超過2個，最優(yōu)選僅是I個。在一些實施方案中，GC富集的回文結(jié)構(gòu)包括至少一個CGG三聯(lián)體，至少一個CCG三聯(lián)體，或者至少一個CGCG四聯(lián)體。在其它實施方案中，GC富集的回文結(jié)構(gòu)不是 CCCCCCGGGGGG 或 GGGGGGCCCCCC、CCCCCGGGGG 或 GGGGGCCCCC。GC富集區(qū)域的至少一個G可以用肌苷(I)取代。在一些實施方案中，P包括一個以上的I。在某些實施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸具有如下化學(xué)式之一 5，NX1DCGHX2S ’，5 ’ X1DCGHX2N3 ’，5 ’ PX1DCGHX2S ’，5 ’ X1DCGHX2P 3 ’，5 ’ X1DCGHX2PX3S，， 5，X1DcgHPXJ,, 5’ DCGHX2PX33，，5，TCGHX2PX33，，5，DCGHPX33，或者 5，DCGHP 3，。本發(fā)明提供了其它免疫刺激性寡核苷酸，由化學(xué)式5’N1PyGN2P 3’定義。N1是1_6 個核苷酸長的任何序列。Py是嘧啶。G是鳥嘌呤。N2是0-30個核苷酸長的任何序列。P是 GC-富集的回文結(jié)構(gòu)，含有至少10個核苷酸長的序列。N1和N2可含有50%以上的嘧唆，更優(yōu)選50%以上的T。N1可包括CG，在這種情況中優(yōu)選T緊鄰這個CG前面。在一些實施方案中，NlPyG是TCG，最優(yōu)選TCGN2，其中N2不是 G0N1PyGN2P可包括一或多個肌苷(I)核苷酸。N1中的C或G均可以由肌苷置換，但是CpI比IpG優(yōu)選。對于肌苷取代如IpG,最佳活性可以通過使用“半軟(semi-soft) ”或者嵌合主鏈實現(xiàn)，其中IG或者Cl之間的鍵是磷酸二酯鍵。NI可包括至少一個CI、TCI、IG 或者TIG基序。在某些實施方案中，N1PyGN2是選自 TTTTTCG、TCG、TTCG、TTTCG、TTTTCG、TCGT、 TTCGT、TTTCGT 和 TCGTCGT 的序列。在一個實施方案中，本發(fā)明的“C類” CpG寡核苷酸具有如下核酸序列5，TCGCGTCGTTCGGCGCGCGCCG 3，(SEQ ID No :594)，或者5，TCGTCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3，(SEQ ID No :595)，或者5，TCGGACGTTCGGCGCGCGCCG 3，(SEQ ID No :596)，或者5，TCGGACGTTCGGCGCGCCG 3，(SEQ ID No :597)，或者5，TCGCGTCGTTCGGCGCGCCG 3，(SEQ ID No :598)，或者5，TCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3，(SEQ ID No :599)，或者5’ TCGACGTTCGGCGCGCCG 3’ (SEQ ID No :600)，或者5，TCGCGTCGTTCGGCGCCG 3，(SEQ ID No :601)，或者5，TCGCGACGTTCGGCGCGCGCCG 3，(SEQ ID No :602)，或者
5，TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG 3，(SEQ ID No :603)，或者5，TCGTCGTTTTCGGCGGCCGCCG 3，(SEQ ID No :604)，或者5，TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG 3，(SEQ ID No :605)，或者5，TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCGT 3，(SEQ ID No :606)。在任何這些序列中，所有鍵可以全是硫代磷酸酯鍵。在另一個實施方案中，在任何這些序列中，一或多個鍵可以是磷酸二酯鍵，優(yōu)選在CpG基序的“C”和“G”之間，產(chǎn)生半軟 CpG寡核苷酸。C類寡核苷酸的一些非限制性實例包括5，T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*OG*C_G*OG*OC*G 3，，或者5’T*C_G*T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*OG*C_G*OG*OOG 3’，或者5，T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*OG*C_G*OG*OC*G 3，，或者5，T*C_G*G*A*C_G*T*T*C_G*G*OG*OG*OOG 3，，或者5，T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*OG*OG*OC*G 3，，或者
5，T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*OG*C_G*OG*OC*G 3，，或者5，T*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*OG*OG*OC*G 3，，或者5，T*C_G*C_G*T*C_G*T*T*C_G*G*C*G*C*C*G 3，，或者5，T*C_G*C_G*A*C_G*T*T*C_G*G*OG*C_G*OG*OC*G 3，，或者5，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G 3，，或者5，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*C*C*G*C*C*G 3，，或者5，T*C*G*T*C G*T*T*T*T*A*C_G*G*OG*OC_G*T*G*OOG 3，，或者5J T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*C*G*C*G*C*C*G*T 3’，其中是指硫代磷酸酯鍵，是指磷酸二酯鍵。在任何這些序列中，乙基-尿苷或者鹵素可以取代5’T，舉例的鹵素取代包括但不限于溴-尿苷或者碘-尿苷取代?！癙類”CpG免疫刺激性寡核苷酸已經(jīng)在W02007/095316中描述，通過其含有雙鏈形成區(qū)的事實鑒定，如在5’和3’末端或者在其附近的完整或不完整的回文結(jié)構(gòu)，使其具有形成更高級別結(jié)構(gòu)如多聯(lián)體(concatamers)的潛力。被稱作P類寡核苷酸的這些寡核苷酸在一些情況中與C類寡核苷酸相比具有誘導(dǎo)高得多水平的IFN-a分泌的能力。所述P-類寡核苷酸具有在體外和/或在體內(nèi)自發(fā)自主裝配成多聯(lián)體的能力。不受這些分子作用方法的任何特定理論的限制，一個潛在的假說是這個性質(zhì)使得P類寡核苷酸具有更高地交聯(lián)某些免疫細(xì)胞內(nèi)TLR9的能力，誘導(dǎo)與先前所述類別的CpG寡核苷酸相比不同的免疫激活模式。在一個實施方案中，用于本發(fā)明中的CpG寡核苷酸是P類CpG寡核苷酸，其含有 5’ TLR激活結(jié)構(gòu)域及至少兩個回文區(qū)，一個回文區(qū)是長度為至少6個核苷酸的5’回文區(qū)， 與長度為至少8個核苷酸的3’回文區(qū)直接連接或者通過間隔基連接，其中所述寡核苷酸包括至少一個YpR 二核苷酸。在一個實施方案中，所述寡核苷酸不是T*C_G*T*C_G*A*C_ G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*G*C*C*G。在一個實施方案中，P類CpG寡核苷酸包括至少一個未甲基化CpG 二核苷酸。在另一實施方案中，所述TLR激活結(jié)構(gòu)域是TCG、TTCG、TTTCG、TYpR、 TTYpR、TTTYpR、UCG、UUCG、UUUCG、TTT或者TTTT。在再一個實施方案中，所述TLR激活結(jié)構(gòu)域在5’回文區(qū)內(nèi)。在另一實施方案中，所述TLR激活結(jié)構(gòu)域緊鄰5’回文區(qū)的5’端。在再一個實施方案中，所述5’回文區(qū)長度為至少8個核苷酸。在另一實施方案中，所述3’回文區(qū)長度為至少10個核苷酸。在另一實施方案中，所述5’回文區(qū)長度為至少10個核苷酸。 在再一個實施方案中，所述3’回文區(qū)包括一個未甲基化的CpG 二核苷酸。在另一實施方案中，所述3’回文區(qū)包括兩個未甲基化的CpG 二核苷酸。在另一實施方案中，所述5’回文區(qū)包括一個未甲基化的CpG 二核苷酸。在再一個實施方案中，所述5’回文區(qū)包括兩個未甲基化的CpG 二核苷酸。在另一實施方案中，所述5’和3’回文區(qū)具有至少25的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述5’和3’回文區(qū)具有至少30的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述5’和3’回文區(qū)具有至少35的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述5’ 和3’回文區(qū)具有至少40的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述5’和3’回文區(qū)具有至少45的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述5’和3’回文區(qū)具有至少50的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述5’和3’回文區(qū)具有至少55的雙鏈體穩(wěn)定性值。 在另一實施方案中，所述5’和3’回文區(qū)具有至少60的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述5’和3’回文區(qū)具有至少65的雙鏈體穩(wěn)定性值。在一個實施方案中，所述兩個回文區(qū)是直接連接的。在另一實施方案中，所述兩個回文區(qū)是通過3’ -3’鍵連接的。在另一實施方案中，所述兩個回文區(qū)重疊一個核苷酸。在再一個實施方案中，所述兩個回文區(qū)重疊兩個核苷酸。在另一實施方案中，所述兩個回文區(qū)不重疊。在另一實施方案中，所述兩個回文區(qū)通過間隔基連接。在一個實施方案中，所述間隔基是具有長度為1-50個核苷酸的核酸。在另一實施方案中，所述間隔基是具有長度為I 個核苷酸的核酸。在另一實施方案中，所述間隔基是非核苷酸間隔基。在一個實施方案中， 所述非核苷酸間隔基是D-間隔基。在另一實施方案中，所述非核苷酸間隔基是接頭。在一個實施方案中，所述寡核苷酸具有化學(xué)式5’ XP1SP2T 3’，其中X是TLR激活結(jié)構(gòu)域，P1是回文結(jié)構(gòu)，S是間隔基，P2是回文結(jié)構(gòu)，T是長度為0-100個核苷酸的3’尾部。在一個實施方案中，X是TCG、TTCG或TTTCG。在另一實施方案中，T是長度為5_50個核苷酸。在再一個實施方案中，T是長度為5-10個核苷酸。在一個實施方案中，S是具有長度為1-50個核苷酸的核酸。在另一實施方案中，S是具有長度為I個核苷酸的核酸。在另一實施方案中，S 是非核苷酸間隔基。在一個實施方案中，所述非核苷酸間隔基是D-間隔基。在另一實施方案中，所述非核苷酸間隔基是接頭。在另一實施方案中，所述寡核苷酸不是反義寡核苷酸或核酶。在一個實施方案中，P1是A和T富集的。在另一實施方案中，P1包括至少4個T。在另一實施方案中，P2是完整回文結(jié)構(gòu)。在另一實施方案中，P2是G-C富集的。在再一個實施方案中，P2是CGGCGCXfCGCCG，其中X1是T或沒有。在一個實施方案中，所述寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵。在另一實施方案中，所述寡核苷酸的所有核苷酸間鍵均是硫代磷酸酯鍵。在另一實施方案中，所述寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯樣鍵。在另一實施方案中，所述磷酸二酯樣鍵是磷酸二酯鍵。在另一實施方案中，親脂性基團與所述寡核苷酸綴合。在一個實施方案中，所述親脂性基團是膽固醇。在一個實施方案中，用于本發(fā)明中的TLR-9激動劑是P類CpG寡核苷酸，具有 5’ TLR激活結(jié)構(gòu)域和至少兩個含有互補性的區(qū)域，即5’和3’含有互補性的區(qū)域，每個含有互補性的區(qū)域的長度均為至少8個核苷酸且彼此直接連接或者通過間隔基連接，其中所述寡核苷酸包括至少一個嘧啶-嘌呤(YpR) 二核苷酸，及其中至少一個含有互補性的區(qū)域不是完整回文結(jié)構(gòu)。在一個實施方案中，所述寡核苷酸包括至少一個未甲基化的CpG 二核苷酸。在另一實施方案中，所述TLR激活結(jié)構(gòu)域是TCG、TTCG, TTTCG, TYpR, TTYpR, TTTYpR, UCG、UUCG、UUUCG、TTT或者TTTT。在另一實施方案中，所述TLR激活結(jié)構(gòu)域在5’含有互補性的區(qū)域中。在另一實施方案中，所述TLR激活結(jié)構(gòu)域緊鄰5’含有互補性的區(qū)域的5’端。 在另一實施方案中，所述3’含有互補性的區(qū)域的長度為至少10個核苷酸。在再一個實施方案中，所述5’含有互補性的區(qū)域的長度為至少10個核苷酸。在一個實施方案中，所述3’ 含有互補性的區(qū)域包括一個未甲基化的CpG 二核苷酸。在另一實施方案中，所述3’含有互補性的區(qū)域包括兩個未甲基化的CpG核苷酸。在再一個實施方案中，所述5’含有互補性的區(qū)域包括一個未甲基化的CpG 二核苷酸。在另一實施方案中，所述5’含有互補性的區(qū)域包括兩個未甲基化的CpG 二核苷酸。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域包括至少一個核苷酸類似物。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域形成分子內(nèi)雙鏈體。在一個實施方案中，所述分子內(nèi)雙鏈體包括至少一個非-Watson Crick堿基對。在另一實施方案中， 所述非-Watson Crick堿基對是G_T、G_A、G-G或者C-A。在一個實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域形成分子間雙鏈體。在另一實施方案中，至少一個分子間雙鏈體包括至少一個非-Watson Crick堿基對。在另一實施方案中，所述非-Watson Crick堿基對是G-T、G-A、 G-G或者C-A。在再一個實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域含有一個錯配。在又一個實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域含有兩個錯配。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域含有間插核苷酸。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域含有兩個間插核苷酸。在一個實施方案中，所述5’和3’含有互補性的區(qū)域具有至少25的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述5’和3’含有互補性的區(qū)域具有至少30的雙鏈體穩(wěn)定性值。 在另一實施方案中，所述5’和3’含有互補性的區(qū)域具有至少35的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域具有至少40的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域具有至少45的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域具有至少50的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域具有至少55的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域具有至少60 的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述含有互補性的區(qū)域具有至少65的雙鏈體穩(wěn)定性值。在另一實施方案中，所述兩個含有互補性的區(qū)域是直接連接的。在另一實施方案中，所述兩個回文區(qū)域通過3’_3’鍵連接。在另一實施方案中，所述兩個含有互補性的區(qū)域重疊一個核苷酸。在另一實施方案中，所述兩個含有互補性的區(qū)域重疊兩個核苷酸。在另一實施方案中，所述兩個含有互補性的區(qū)域不重疊。在另一實施方案中，所述兩個含有互補性的區(qū)域通過間隔基連接。在另一實施方案中，所述間隔基是具有長度為1-50個核苷酸的核酸。在另一實施方案中，所述間隔基是具有長度為I個核苷酸的核酸。在一個實施方案中，所述間隔基是非核苷酸間隔基。在另一實施方案中，所述非核苷酸間隔基是D-間隔基。 在再一個實施方案中，所述非核苷酸間隔基是接頭。在一個實施方案中，P類寡核苷酸具有化學(xué)式5’XNSPT 3’，其中X是TLR激活結(jié)構(gòu)域，N是不完整回文結(jié)構(gòu)，P是回文結(jié)構(gòu)，S是間隔基，T是長度為0-100個核苷酸的3’尾部。在另一實施方案中，X是TCG、TTCG或者TTTCG。在另一實施方案中，T是長度為5_50個核苷酸。在另一實施方案中，T是長度為5-10個核苷酸。在另一實施方案中，S是具有長度
38為1-50個核苷酸的核酸。在另一實施方案中，S是具有長度為I個核苷酸的核酸。在另一實施方案中，S是非核苷酸間隔基。在另一實施方案中，所述非核苷酸間隔基是D-間隔基。 在另一實施方案中，所述非核苷酸間隔基是接頭。在另一實施方案中，所述寡核苷酸不是反義寡核苷酸或者核酶。在另一實施方案中，N是A及T富集的。在另一實施方案中，N包括至少4個T。在另一實施方案中，P是完整回文結(jié)構(gòu)。在另一實施方案中，P是G-C富集的。 在另一實施方案中，P是CGGCGCXPCGCCG，其中X1是T或者沒有。在另一實施方案中，所述寡核苷酸包括至少一個硫代磷酸酯鍵。在另一實施方案中，所述寡核苷酸的所有核苷酸間鍵是硫代磷酸酯鍵。在另一實施方案中，所述寡核苷酸包括至少一個磷酸二酯樣鍵。在另一實施方案中，所述磷酸二酯樣鍵是磷酸二酯鍵。在另一實施方案中，親脂性基團與所述寡核苷酸綴合。在一個實施方案中，所述親脂性基團是膽固醇。在一個實施方案中，本發(fā)明的“P類” CpG寡核苷酸具有如下核酸序列 5’ TCGTCGACGATCGGCGCGCGCCG 3’ (SEQ ID No :607)。在所述序列中，所有鍵可以全是硫代磷酸酯鍵。在另一個實施方案中，一或多個鍵可以是磷酸二酯鍵，優(yōu)選在CpG基序的“C”與“G”之間，產(chǎn)生半軟CpG寡核苷酸。在任何這些序列中，乙基-尿苷或者鹵素可以取代5 ’ T ;鹵素取代的例子包括但不限于溴-尿苷或者碘-尿苷取代。P類寡核苷酸的一個非限制性實例包括5’ T*C_G*T*C_G*A*C_G*A*T*C_G*G*OG*C_G*OG*OOG 3’其中表示硫代磷酸酯鍵，表示磷酸二酯鍵。在一個實施方案中，本文揭示的CpG寡核苷酸的所有核苷酸間鍵均是磷酸二酯鍵 (“軟”寡核苷酸，如在PCT申請W02007/026190中描述)。在另一個實施方案中，本發(fā)明的CpG寡核苷酸具有降解抗性(例如是穩(wěn)定化的)?！胺€(wěn)定化的寡核苷酸”是指對體內(nèi)降解 (例如由外切或者內(nèi)切核酸酶降解)相對抗性的寡核苷酸。核酸穩(wěn)定化可以通過主鏈修飾實現(xiàn)。具有硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸提供了最大活性及保護該寡核苷酸免于細(xì)胞內(nèi)外切和內(nèi)切核酸酶降解。所述免疫刺激性寡核苷酸可具有嵌合主鏈，其具有磷酸二酯鍵和硫代磷酸酯鍵的組合。對于本發(fā)明，嵌合主鏈?zhǔn)侵覆糠址€(wěn)定化的主鏈，其中至少一個核苷酸間鍵是磷酸二酯鍵或者磷酸二酯樣鍵，及其中至少一個其它核苷酸間鍵是穩(wěn)定化的核苷酸間鍵，其中至少一個磷酸二酯鍵或磷酸二酯樣鍵及至少一個穩(wěn)定化的鍵是不同的。當(dāng)磷酸二酯鍵優(yōu)先位于 CpG基序內(nèi)時，這種分子被稱作“半軟”的，如PCT申請W02007/026190所述。其它修飾的寡核苷酸包括磷酸二酯、硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、甲基硫代磷酸酯、 二硫代磷酸酯和/或P-乙氧基鍵的組合。由于已經(jīng)報道了 boranophosphonate鍵相對于磷酸二酯鍵是穩(wěn)定的，因此對于主鏈的嵌合性質(zhì)而言，boranophosphonate鍵根據(jù)情況可以分類為磷酸二酯樣鍵或者穩(wěn)定的鍵。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的嵌合主鏈包括至少一個磷酸二酯鍵(磷酸二酯鍵或者磷酸二酯樣鍵)及至少一個boranophosphonate (穩(wěn)定的)鍵。在其它實施方案中，本發(fā)明的嵌合主鏈可包括boranophosphonate (磷酸二酯鍵或者磷酸二酯樣鍵)及硫代磷酸酯鍵(穩(wěn)定的)?！胺€(wěn)定的核苷酸間鍵”應(yīng)是指與核苷酸間磷酸二酯鍵相比對于體內(nèi)降解(如通過外切或內(nèi)切核酸酶降解)相對抗性的核苷酸間鍵。優(yōu)選的穩(wěn)定的核苷酸間鍵包括但不限于硫代磷酸酯鍵、二硫代磷酸酯鍵、甲基磷酸酯鍵以及甲基硫代磷酸酯鍵。其它穩(wěn)定的核苷酸間鍵包括但不限于肽、烷基、去磷酸(cbphospho)及如上述其它鍵。修飾的主鏈如硫代磷酸酯可以是使用自動化技術(shù)利用氨基磷酸酯或者H-磷酸酯化學(xué)合成的。芳基-和烷基-磷酸酯可以如美國專利4，469，863所述制備，烷基磷酸三酯 (其中帶電荷的氧部分是烷化的，如美國專利5，023，243和歐洲專利092，574所述)可以通過自動固相合成方法使用可商購試劑制備。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了產(chǎn)生其他DNA主鏈修飾和取代的方法。Uhlmann E et al. (1990)Chem Rev 90 544 ；Goodchild J(1990)Bioconjugate Chem I :165。本領(lǐng)域也已知制備嵌合寡核苷酸的方法。例如授予Uhlmann等的專利已經(jīng)描述了這種技術(shù)。混合主鏈修飾的ODN可以如PCT申請W02007/026190所述合成。本發(fā)明的寡核苷酸也可以包括其它修飾。這些修飾包括非離子DNA類似物， 如燒基和芳基憐酸酷(其中帶電荷的憐酸酷氧由燒基或芳基置換)，憐酸_■酷和燒基磷酸三酯，其中帶電荷的氧部分是烷化的。在一端或者兩個末端含有二醇如四甘醇 (tetraethyIeneglycol)或者六甘醇(hexaethyleneglycol)的核酸也已經(jīng)示出是基本上對核酸酶降解具有抗性的。所述CpG寡核苷酸的大小(即沿著寡核苷酸長度的核苷酸數(shù)目)也可能有助于所述寡核苷酸的刺激活性。為了促進(jìn)吸收進(jìn)細(xì)胞中，本發(fā)明的CpG寡核苷酸優(yōu)選具有6個核苷酸殘基的最小長度。如果存在足夠的免疫刺激性基序，任何大小超過6個核苷酸(甚至為很多kb長)的寡核苷酸均能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，因為較大的寡核苷酸在細(xì)胞內(nèi)部被降解。在某些實施方案中，所述CpG寡核苷酸為6-100個核苷酸長,優(yōu)選8-30個核苷酸長。在重要的實施方案中，本發(fā)明的核酸和寡核苷酸不是質(zhì)粒或表達(dá)載體。在一個實施方案中，本文揭示的CpG寡核苷酸包含取代或修飾，如在 W02007/026190中第134-147段描述的堿基和/或糖中。在一個實施方案中，本發(fā)明的CpG寡核苷酸是化學(xué)修飾的?；瘜W(xué)修飾的例子為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知，在例如 Uhlmann E. et al. (1990), Chem. Rev. 90 :543, S. Agrawal, Ed. , Humana Press, Totowa, USA 1993 ；Crooke, S.T.et al. (1996)Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36 :107-129 及 Hunziker J. et al.，(1995)，Mod. Synth. Methods 7 :331-417 中描述。本發(fā)明的寡核苷酸可具有一或多個修飾，其中與由天然DNA或RNA組成的相同序列的寡核苷酸相比，每個修飾均位于特定的核苷間磷酸二酯鍵和/或位于特定的3 -D-核糖單位和/或位于特定的天然核苷堿基位置。在本發(fā)明的一些實施方案中，可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將含有CpG的核酸簡單地與免疫原性載體混合(見例如W003/024480)。在本發(fā)明的特定實施方案中，本文揭示的任何疫苗均包含20 ii g_20mg的CpG寡核苷酸，優(yōu)選0. Img-IOmg CpG寡核苷酸,優(yōu)選0. 2mg-5mg CpG寡核苷酸,優(yōu)選0. 3mg-3mg CpG 寡核苷酸，更優(yōu)選0. 4-2mg CpG寡核苷酸,更優(yōu)選0. 5-1. 5mg CpG寡核苷酸。在優(yōu)選的實施方案中，本文揭示的任何疫苗均包含大約0. 5-lmg CpG寡核苷酸。用于本發(fā)明中的優(yōu)選佐劑是明帆、QS21、CpG ODN>明帆組合CpGODN、Iscomatrix及 Iscomatrix 組合 CpG ODN。本發(fā)明的藥物組合物
本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物，與一或多種藥物可接受的賦形劑及任選地組合一或多種佐劑(如上述佐劑)一起配制。如本文所用，術(shù)語“賦形劑”描述了除了活性成分即本發(fā)明的最終偶聯(lián)免疫原性載體及任選組合一或多種佐劑的抗原性PCSK9肽之外的任何成分。賦形劑的選擇在很大程度上依賴于如特定施用方式、賦形劑對于溶解性和穩(wěn)定性的作用以及劑型性質(zhì)等因素。如本文所用，“藥物可接受的賦形劑”包括任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等，其是生理學(xué)相容的。一些藥物可接受的賦形劑的實例是水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及其組合。在許多情況中，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑， 例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇或者氯化鈉。藥物可接受物質(zhì)的其它實例是增濕劑或者微量輔助物質(zhì)如增濕劑或乳化劑、防腐劑或者緩沖劑，其增強所述活性成分的貯存期或者效力。本發(fā)明的藥物組合物和制備其的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。這種組合物和制備其的方法可見于例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences, 19th Edition (Mack Publishing Company, 1995)。藥物組合物優(yōu)選在GMP條件下生產(chǎn)。本發(fā)明的藥物組合物可以作為單一單位劑量或者多個單一單位劑量形式大批量制備、包裝或者銷售。如本文所用，“單位劑量”是指包含預(yù)定量活性成分的藥物組合物的個別量。所述活性成分的量通常等于施用給對象的活性成分的劑量或者這種劑量的方便分?jǐn)?shù)，例如這種劑量的一半或1/3。 本領(lǐng)域接受的施用肽或蛋白質(zhì)的任何方法均可適用于本發(fā)明的肽或蛋白質(zhì)。本發(fā)明的藥物組合物典型適于腸胃外施用。如本文所用，藥物組合物的“腸胃外施用”包括特征在于物理性裂開(physical breaching)對象組織并且通過組織裂口施用所述藥物組合物的任何施用途徑，因此通常導(dǎo)致直接施用進(jìn)入血流中、進(jìn)入肌肉中或者進(jìn)入內(nèi)臟器官中。腸胃外施用因此包括但不限于通過注射所述組合物施用藥物組合物、通過手術(shù)切口應(yīng)用所述組合物、通過組織穿透非手術(shù)創(chuàng)口應(yīng)用所述組合物等。特別地，腸胃外施用包括但不限于皮下、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、胸骨內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、尿道內(nèi)、顱內(nèi)、滑膜內(nèi)注射或者輸注；以及腎透析灌注技術(shù)。優(yōu)選的實施方案包括靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)和肌內(nèi)途徑，更優(yōu)選的實施方案是肌內(nèi)或皮下途徑。適于腸胃外施用的藥物組合物的配制典型通常包含所述活性成分組合藥物可接受的載體，如無菌水或無菌等滲鹽水。這種配制物可以適于推注施用或者連續(xù)施用的形式制備、包裝或者銷售。注射用配制物可以單位劑量形式如在含有防腐劑的安瓿或在多劑量容器中制備、包裝或銷售。腸胃外施用的配制物包括但不限于懸浮液、溶液、在油或水性載體中的乳狀液、糊劑等。這種配制物可進(jìn)一步包含一或多種其它成分，包括但不限于懸浮劑、穩(wěn)定劑或者分散劑。在腸胃外施用的配制物的一個實施方案中，所述活性成分以干燥形式提供(即粉末或顆粒)，在腸胃外施用之前用合適的載體(如無菌無熱原水)重建之后腸胃外施用所述重建的組合物。腸胃外施用的配制物也包括水溶液，其可含有賦形劑如鹽、碳水化合物和緩沖劑(優(yōu)選pH為3-9)，但是對于一些應(yīng)用而言，其可以更適當(dāng)?shù)嘏渲茷闊o菌非水溶液或者干燥形式，與合適的載體如無菌無熱原水聯(lián)合使用。舉例的腸胃外施用形式包括在無菌水溶液中的溶液或者懸浮液，如在丙二醇水溶液或者葡萄糖水溶液中。如果需要，這種劑量形式可適當(dāng)?shù)乇痪彌_。其它有用的可腸胃外施用的配制物包括以微晶體形式、微?；蛘咴谥|(zhì)體制備物中包含活性成分的那些。腸胃外施用的配制物可以配制成立即和/或修飾的釋放形式。修飾釋放的配制物包括緩釋、持續(xù)、脈沖、控制、靶向以及程序化釋放。例如，一方面，無菌注射溶液可以通過將抗-PCSK9肽以需要量摻入在具有上述成分之一或組合的合適的溶劑中、隨后通過過濾滅菌而制備，所述肽優(yōu)選偶聯(lián)免疫原性載體， 任選地組合一或多種佐劑。通常，通過將所述活性化合物摻入無菌載體中制備分散劑，所述無菌載體含有基本分散介質(zhì)和上述需要的其它成分。在制備無菌注射溶液的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性成分加上來自其預(yù)先滅菌過濾的溶液的任何另外的希望成分的粉末。可以通過例如使用包衣如卵磷脂、通過在分散情況中維持需要的顆粒大小以及通過使用表面活性劑而保持溶液的適當(dāng)流動性。注射組合物的延長吸收可以通過在所述組合物中包含延遲吸收的物質(zhì)如單硬脂酸鹽和凝膠而實現(xiàn)。一個舉例的非限制性的本發(fā)明藥物組合物是這樣的配制物，其是無菌水溶液，pH 范圍在大約5. 0-6. 5,包含大約0. lmg/mL至大約20mg/mL本發(fā)明的肽、大約I毫摩爾至大約 100毫摩爾的組氨酸緩沖液，大約0. 01mg/mL至大約10mg/mL聚山梨酯80、大約100毫摩爾至大約400毫摩爾海藻糖，以及大約0. 01毫摩爾至大約I. 0毫摩爾的EDTA 二鈉二水合物。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽也可以通過鼻內(nèi)或者通過吸入施用，典型是置于干粉吸入器中的干粉形式(單獨或者是混合物，或者是混合成分顆粒，例如與合適的藥物可接受的賦形劑混合)，或者是置于氣壓式容器、泵、噴霧(spray)、噴霧器(atomiser)(優(yōu)選使用電流體力學(xué)產(chǎn)生細(xì)霧的噴霧器)或者霧化器中氣霧噴霧劑形式，使用或不使用合適的推進(jìn)劑，或者作為滴鼻劑形式。所述氣壓式容器、泵、噴霧、噴霧器或者霧化器通常含有本發(fā)明抗體的溶液或懸浮液，包含例如適于分散、溶解或者延長活性成分釋放的物質(zhì)，推進(jìn)劑作為溶劑。在干粉或懸浮液配制物使用之前，所述藥物通常被微粉化為適合通過吸入輸送的大小(典型低于5微米)。這可以通過任何適當(dāng)?shù)姆鬯榉椒ㄈ缏菪龂娚溲心?、流化床噴射研磨、超臨界流體加工以形成納米顆粒、高壓均質(zhì)或者噴霧干燥實現(xiàn)。用于吸入器或者吹藥器中的膠囊、泡罩(blister)和藥筒(cartridge)可以配制成含有本發(fā)明化合物、合適的粉末基質(zhì)及性能修飾物的粉末混合物。用于使用電流體力學(xué)產(chǎn)生細(xì)霧的噴霧器中的合適的溶液配制物可每活化容積 (actuation volume)含有合適劑量的本發(fā)明抗原性PCSK9肽，所述活化容積可例如是 I u L-100 u L0可以在用于吸入和/鼻內(nèi)施用的本發(fā)明的這些配制物中加入合適的調(diào)味劑如薄荷腦和左薄荷腦或者甜味劑如糖精或糖精鈉。用于吸入/鼻內(nèi)施用的配制物可以配制成立即和/或修飾釋放形式。修飾釋放的配制物包括緩釋、持續(xù)釋放、脈沖釋放、控制釋放、靶向釋放和程序化釋放。在干粉吸入和氣霧劑的情況中，劑量單位通過計量輸送的閥門確定。本發(fā)明的劑量單位典型計劃為計量施用或者“吹入”本發(fā)明的抗體。全部的每日劑量典型以全天單一劑量或者通常以多次分開劑量施用。包含抗原性PCSK9肽的藥物組合物也可以配制為口服途徑施用?？诜砂ㄍ萄?，由此所述化合物進(jìn)入胃腸道，和/或經(jīng)口腔、舌或舌下施用，由此所述化合物直接從口進(jìn)入血流。適于口服施用的配制物包括固體、半固體和液體系統(tǒng)，如片劑；含有多粒子或納米粒子、液體或粉末的軟膠囊或硬膠囊；錠劑(包括充填液體的錠劑)；咀嚼片；凝膠；快速分散劑型；膜；珠(ovule);氣霧劑；以及口腔/粘膜粘著片劑。液體配制物包括懸浮液、溶液、糖漿和酏劑。這種配制物可用作軟膠囊或硬膠囊 (由例如明膠或者羥丙基甲基纖維素制成)中的充填物，及典型包含載體如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纖維素，或者合適的油，及一或多種乳化劑和/或懸浮劑。液體配制物也可以通過例如從囊劑重建固體而制備。本發(fā)明的組合物可用于處于PCSK9-介導(dǎo)的疾病或癥狀風(fēng)險或患有這種疾病或癥狀的對象中治療、減輕或預(yù)防這種疾病或癥狀，通過免疫治療刺激所述對象的免疫應(yīng)答而進(jìn)行。免疫治療可包括初始免疫及隨后另外的如1、2、3或多次加強免疫。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或其組合物的“免疫學(xué)有效量”是以單一劑量或一系列的一部分輸送給哺乳動物對象的量，其在所述對象體內(nèi)有效誘導(dǎo)針對PCSK9的免疫應(yīng)答。 這個量根據(jù)治療個體的健康和生理狀況、治療個體的分類群、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、疫苗的配制及其它相關(guān)因素而改變。預(yù)期所述量在可以通過常規(guī)實驗確定的相對廣泛的范圍內(nèi)?！八幬镉行┝俊被蛘摺爸委熡行┝俊笔侵委熁蝾A(yù)防或減輕對象的一或多種 PCSK9-相關(guān)疾病或癥狀需要的劑量。所述藥物有效劑量依賴于施用的特定化合物、癥狀的嚴(yán)重性、對象對于副作用的易感性、疾病的類型、使用的組合物、施用途徑、治療的哺乳動物類型、特定哺乳動物的生理特性如健康和生理狀況、同時服藥情況、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、希望的保護作用程度以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。出于預(yù)防目的，選擇的每個劑量中肽的量是在典型的疫苗接種個體中誘導(dǎo)免疫保護性應(yīng)答且無明顯不利副作用的量。在最初的免疫接種之后，所述對象可以接受一或多次足夠間隔時間的加強免疫。應(yīng)理解對于任何特定患者的特定劑量水平根據(jù)各種因素確定，包括應(yīng)用的特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時間、施用途徑及排泄率，藥物組合及進(jìn)行治療的特定疾病的嚴(yán)重性。例如，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者藥物組合物可以以如下劑量施用給對象大約O. I μ g至大約5mg,如大約O. I μ g至大約5 μ g,大約5 μ g至大約10 μ g,大約IOyg至大約25 μ g,大約25 μ g至大約50 μ g,大約50 μ g至大約100 μ g,大約100 μ g至大約500 μ g, 大約500 μ g至大約Img,大約Img至大約2mg,任選地加強劑量在例如I周、2周、3周、4周、 2個月、3個月、6個月和/或I年之后。在一些實施方案中，施用單一劑量的本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者藥物組合物。 在其它實施方案中，施用多劑量的本發(fā)明抗原性PCSK9肽或者藥物組合物。施用頻率可以根據(jù)許多因素改變，如癥狀的嚴(yán)重性、希望的免疫保護作用的程度等，無論所述組合物是用于預(yù)防還是治療目的。例如，在一些實施方案中，本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者藥物組合物每月施用I次，每月2次,每月3次,隔周I次(qow), I周I次(qw), I周2次(biw), I周3 次(tiw), I周4次，I周5次，I周6次,隔天I次(qod),每日一次(qd), I日2次(qid)或者I日3次(tid)。當(dāng)本發(fā)明的組合物用于預(yù)防目的時，通常施用激發(fā)劑量和加強劑量。預(yù)期加強劑量以間隔足夠時間間隔給予，或者優(yōu)選每年給予一次或者在循環(huán)抗體水平低于希望水平時給予。加強劑量可以由所述抗原性PCSK9肽在不存在原始免疫原性載體分子的條件下組成。這種加強構(gòu)建體可包含另一種免疫原性載體或者不含任何載體。這種加強組合物可以與佐劑一起配制或者不含佐劑。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽的施用持續(xù)時間，即施用抗原性PCSK9肽的時間可以根據(jù)許多因素如患者反應(yīng)等任何因素改變。例如，抗原性PCSK9肽可以施用大約I天至大約 I周，大約2周至大約4周，大約I個月至大約2個月，大約2個月至大約4個月，大約4個月至大約6個月，大約6個月至大約8個月，大約8個月至大約I年，大約I年至大約2年， 或者大約2年至大約4年或更長時間。本發(fā)明還涵蓋了許多治療方法，所述方法包括施用本發(fā)明的抗原性PCSK9肽。主題治療方法包括在個體內(nèi)誘導(dǎo)對自身-PCSK9免疫應(yīng)答的方法，以及預(yù)防、減輕或治療個體內(nèi)PCSK9-相關(guān)疾病或癥狀的方法。—方面，本發(fā)明提供了治療、預(yù)防或減輕對象中PCSK9相關(guān)疾病或癥狀方法，包括給所述對象施用治療有效量的本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供了在對象體內(nèi)誘導(dǎo)針對自身PCSK9免疫應(yīng)答的方法，包括給所述對象施用治療或免疫學(xué)有效量的本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物。PCSK9相關(guān)疾病或者PCSK9介導(dǎo)的疾病是例如其中PCSK9活性被抑制或者PCSK9 與LDL受體相互作用被抑制是有益的疾病?！爸委煛笔侵笢p輕或消除一種生物學(xué)疾病和/或至少一種其伴隨癥狀的方法。如本文所用，“減輕”疾病、失調(diào)或病癥是指降低疾病、失調(diào)或病癥癥狀的嚴(yán)重性和/或發(fā)生頻率。 進(jìn)一步地，本文提及“治療”時包括治療性、緩解性及預(yù)防性治療。所述對象可以是任何年齡的人，可以是男性或女性。本發(fā)明的其它方面涉及本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物用作藥物，優(yōu)選治療、減輕或預(yù)防PCSK9相關(guān)疾病。再一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物在生產(chǎn)藥物、優(yōu)選治療PCSK9相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。特別地，本發(fā)明涉及本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或者藥物組合物用作藥物，優(yōu)選治療、減輕或預(yù)防膽固醇水平增高相關(guān)疾病。再一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物在生產(chǎn)藥物、優(yōu)選降低需要其的對象的血液中LDL-膽固醇水平的藥物中的應(yīng)用。在本發(fā)明的應(yīng)用或方法的一些方面中，所述PCSK9-相關(guān)疾病選自膽固醇增高，與 LD-L-膽固醇增高相關(guān)的病癥，如脂質(zhì)失調(diào)(如高脂血癥，I、II、III、IV或V型高脂血癥， 繼發(fā)高甘油三酯血癥，高膽固醇血癥，家族性高膽固醇血癥，黃瘤病，膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷)，動脈硬化性病癥(如動脈硬化)，冠心病及心血管疾病。再一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或者藥物組合物在生產(chǎn)治療或減輕疾病的藥物中的應(yīng)用，所述疾病是LDL受體的上調(diào)或者PCSK9 與LDL受體之間的相互作用被抑制是有益的疾病。再一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或者藥物組合物在生產(chǎn)治療阿爾茲海默病的藥物中應(yīng)用。在本發(fā)明的應(yīng)用或方法的其他方面，所述對象是哺乳動物，優(yōu)選人。在本發(fā)明的應(yīng)用或方法的其他方面，所述對象患有所述PSCK9-相關(guān)疾病?；蛘?， 所述對象處于患有所述PCSK9-相關(guān)疾病的風(fēng)險中，如由于存在一或多種風(fēng)險因素(如高血壓、吸煙、糖尿病、肥胖或者高同型半胱氨酸血癥)。本發(fā)明的抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或藥物組合物可用于不耐受另一種降低膽固醇藥劑治療的對象，或者用于另一種降低膽固醇藥劑治療結(jié)果不足的對象 (如經(jīng)歷抑制素治療而LDL-c降低不足的對象)。本文描述的本發(fā)明的抗原性PCSK9肽可以施用給LDL-膽固醇增加的對象。優(yōu)選膽固醇增加的對象是人，其總血漿膽固醇水平為200mg/dl或更高。優(yōu)選膽固醇增加的對象是人，其LDL-膽固醇水平為160mg/dl或更高。使用標(biāo)準(zhǔn)方法對在合適禁食后獲得的血液樣品測量總血漿膽固醇水平和LDL-膽固醇水平。測量總血漿膽固醇水平和LDL-膽固醇水平的方案為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。在一個實施方案中，所述抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或者藥物組合物與另一藥物一起施用，兩者可以以一定順序相繼施用或者同時施用。在一些實施方案中，抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或者藥物組合物施用給也接受另一種藥物(如另一種降低膽固醇藥物)治療的對象。降低膽固醇的藥物包括他汀類藥物、膽酸螯合劑、煙酸、 纖維酸衍生物，及長鏈α、ω-二羧酸。他汀類藥物通過阻斷HMGCoA而抑制膽固醇合成， HMGCoA是膽固醇生物合成中的關(guān)鍵酶。舉例的他汀類藥物是洛伐他汀、普伐他汀、阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀和辛伐他汀。膽酸螯合劑中斷膽汁酸從腸至肝的再循環(huán)。這些藥物的例子是考來烯胺(cholestyramine)和考來替泊(colestipol)氫氯化物。纖維酸衍生物的例子是氯貝丁酯(clofibrate)和吉非貝齊(gemfibrozil)。長鏈α、ω-二羧酸在例如 Bisgaier et al.，1998，J. Lipid Res. 39 17-30 ；W0 98/30530 ;美國專利 4，689，344 ; W099/00116 ;美國專利5，756，344 ;美國專利3，773,946 ;美國專利4，689，344 ;美國專利4，689，344 ;美國專利4，689，344 ;和美國專利3, 930, 024)中描述；醚(見例如美國專利4，711，896 ;美國專利5，756，544 ;美國專利6，506，799)。多萜醇的磷酸酯(美國專利 4，613，593)及azolidinedione衍生物(美國專利4，287，200)也可用于降低膽固醇水平。 組合治療方案可以是加合的，或者其可以產(chǎn)生協(xié)同結(jié)果(如膽固醇降低高于組合使用這兩種藥物的預(yù)期水平)。在一些實施方案中，抗原性PCSK9肽或者其免疫原性組合物或者藥物組合物與他汀類藥物的組合治療產(chǎn)生協(xié)同結(jié)果(如膽固醇協(xié)同降低)。在一些對象中，這可以減少他汀類藥物劑量以達(dá)到希望的膽固醇水平。
實施例提出如下實施例用以為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供關(guān)于怎樣準(zhǔn)備和實施本發(fā)明的全部揭示和描述，但是所述實施例不意圖限制本發(fā)明的范圍，也不代表下文的實驗是所有實驗或僅進(jìn)行如下實驗。已經(jīng)進(jìn)行嘗試保證使用數(shù)目的精確性(例如量、溫度等)，但是應(yīng)考慮到一些實驗誤差和偏差。除非特別指出，部分是指重量部分，分子量是重量平均分子量，溫度是攝氏度，壓力是在大氣壓或接近大氣壓?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)縮寫，如bp，堿基對；kb，千堿基；pl，皮升；s或sec,秒；min,分鐘;h或111·,小時；aa,氨基酸；kb,千堿基；bp,堿基對；nt,核苷酸；i. m.,肌內(nèi)；i. p.,腹膜內(nèi)；s. c,皮下等。實施例I :在LDL等體界面的PCSK9-EGF-A結(jié)構(gòu)域詵擇杭原件PCSK9 At結(jié)合LDL受體的EGF-A結(jié)構(gòu)域的人PCSK9的結(jié)構(gòu)已經(jīng)揭示及公開(Kwon et al, PNAS 105，1820-1825,2008)。這種結(jié)構(gòu)信息(PDB:3BPS)與來自游離 PCSK9 的結(jié)構(gòu) PDB: 2P4E 的信息(Cunningham et al,Nature Structural Molecular Biology, 14,413-419, 2007) 一起使用以設(shè)計如下肽，其相應(yīng)于對于PCSK9-LDL受體相互作用重要的區(qū)域(見圖I)。肽I. ASSDCSTCFV(SEQ ID No :19)肽2. GTRFHRQASK (SEQ ID No :63)肽3. IQSDHREIEGRV(SEQ ID No :109)肽4. SGRDAGVAKGA (SEQ ID No :153)肽5. SIPffNLERITP (SEQ ID No :184)由于肽1-4在PCSK9結(jié)構(gòu)中呈現(xiàn)環(huán)狀，因此制備各個序列(SEQ ID No :19、63、109 和153)加入Cys、Cys-Gly或Lys接頭以使得通過兩個末端與VLP載體偶聯(lián),提供天然環(huán)狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)象模擬物(表I中VR_9. I至VR_9. 4)。此外，也制備環(huán)化形式的肽2-4(表I 中VR_9. 6至VR_9. 9)，提供Cys殘基以與VLP偶聯(lián)。所制備的肽I具有用于綴合目的的 Lys-Gly-Gly N末端接頭，以便兩個Cys殘基自由形成二硫鍵,就像它們在天然PCSK9結(jié)構(gòu)中那樣。肽5表示人PCSK9的N末端成熟加工形式，其通過C末端添加的半胱氨酸殘基偶聯(lián)，以使得N末端是自由的以用于抗體識別(表I中VR_9.5)。下表(表I)描述了對作為疫苗候選物進(jìn)行評估產(chǎn)生的9種肽。表I.肽序列
權(quán)利要求
1.一種免疫原，其包含與免疫原性載體連接的至少一種抗原性PCSK9肽或者其功能活性變體。
2.權(quán)利要求I的免疫原，其中所述免疫原性載體選自白喉類毒素、CRM197或者VLP，所述 VLP 選自 HBcAg、HBsAg, Qbeta, PP7、PPV 或者 Norwalk 病毒 VLP。
3.權(quán)利要求I的免疫原，其中所述免疫原性載體選自CRM197或者QbetaVLP。
4.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自PCSK9的一部分，其參與PCSK9與LDL受體的相互作用。
5.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自PCSK9的一部分，其參與PCSK9與LDL受體的EGF-A結(jié)構(gòu)域的相互作用。
6.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自PCSK9的前結(jié)構(gòu)域。
7.權(quán)利要求1-6任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽包含4-20個氨基酸。
8.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :182,183, 184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、 203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、 222、223、224、225 和 226。
9.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :1、2、3、 4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、 56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、 105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、 124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、 143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、 162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、 181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、 200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、 219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、 238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、 257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、 276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、 295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、330、 331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、 350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、 369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、 388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、420、421、422、423、424、425、426、427、 428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、 447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、 466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、 485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、.504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、 523、524、525、526、527、528、.529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、 542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、 561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、 580、581、582、583、584、585、586、587 和 588。
10.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、.19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、 30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、 55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、 80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、 104、105、106、107、108、109、110、11I、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、 123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、 161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、 180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、 199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、 218、219、220、221、222、223、224、225、226、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、 340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358 和 359。
11.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、 32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44 和 45。
12.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :46、47、 48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、 73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、 98、99、100 和 101。
13.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :102,103, 104、105、106、107、108、109、I10、I11、I12、I13、114、115、116、117、118、119、120、121、122、 123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、 142、143、144、145 和 146。
14.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、 168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180 和 181。
15.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :330、331、 332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、 351、352、353、354、355、356、357、358 和 359。
16.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :19、56、 63、109、153、165、184、186、187、188、332 和 424。
17.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :184、186、、187、188 和 332。
18.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽是SEQID No :56。
19.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID No :308、309、 310、311、312、421-424 和 426-588。
20.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID :445、482、 525 和 563。
21.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID :420和425。
22.權(quán)利要求1-21任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含如下任一項-在其C末端的接頭，所述接頭具有化學(xué)式(G)nC、(G)nSC或者(G)nK，其中η是選自O(shè)、 1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 的整數(shù)，-在其N末端的接頭，所述接頭具有化學(xué)式C (G) n、CS (G) η或者K (G) η，其中η是選自O(shè)、1、2、3、4、5、6、7、8、9 和 10 的整數(shù)，-在其C末端的接頭，其具有化學(xué)式(G)nC、(G)nSC或者(G)nK，其中η是選自O(shè)、I、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)，及在其N末端的接頭，其具有化學(xué)式C (G)n、CS(G)n或者K(G)n, 其中η是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)。
23.權(quán)利要求1-21任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含如下任一項-在其C末端的接頭，其具有化學(xué)式(G) nC、(G)nSC或者(G)nK，其中η是選自0、1或2 的整數(shù)，-在其N末端的接頭，其具有化學(xué)式C(G) n、CS(G)n或者K(G)n，其中η是選自0、1或2 的整數(shù)，-在其C末端的接頭，其具有化學(xué)式(G)nC、(G)nSC或者(G)nK，其中η是選自0、1或2 的整數(shù)，及在其N末端的接頭，其具有化學(xué)式C (G) n、CS (G) η或K (G) η，其中η是選自O(shè)、I或2 的整數(shù)。
24.權(quán)利要求1-21任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的半胱氨酸。
25.權(quán)利要求24的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的CG基團或者半胱氨酸。
26.權(quán)利要求1-21任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的 CGG。
27.權(quán)利要求1-21任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其C末端的 GGC。
28.權(quán)利要求1-21任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽是環(huán)化的，且包含半胱氨酸、(G)nC*C(G)n片段，其中η是選自0、1、2、3、4、5、6、7、8、9和10的整數(shù)。
29.權(quán)利要求1-21任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽是環(huán)化的，且包含半胱氨酸、GC或CG片段。
30.權(quán)利要求1-21任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽進(jìn)一步包含在其N末端的KG或KGG。
31.權(quán)利要求1-3任一項的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽是構(gòu)象限制的。
32.權(quán)利要求31的免疫原，其中所述抗原性PCSK9肽選自SEQID NO :313、314、315、 316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、401、402、403、404、405、406、 407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418 和 419。
33.權(quán)利要求1-32任一項的免疫原，其中所述免疫原當(dāng)施用給對象時能使所述對象血液中LDL-膽固醇水平降低至少2%、5%、10%、20%、30%或者50%。
34.權(quán)利要求33的免疫原，其中所述免疫原當(dāng)施用給對象時能使所述對象血液中 LDL-膽固醇水平降低至少10%。
35.包含至少兩種權(quán)利要求1-34任一項的免疫原的組合物。
36.免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求1-33任一項的免疫原或者權(quán)利要求35的免疫原的組合物，進(jìn)一步包含至少一種佐劑。
37.權(quán)利要求36的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自明礬、CpGODN,QS21及 Iscomatrix0
38.權(quán)利要求36的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自QS21，明礬組合CpGODN或者 Iscomatrix 組合 CpG 0DN。
39.權(quán)利要求36的免疫原性組合物，其中所述佐劑選自明礬組合CpGODN。
40.權(quán)利要求37、38或39的免疫原性組合物，其中所述CpGODN選自5’ TCGTCGTTTTTCGGTGCTTTT 3’，或者5’ TCGTCGTTTTTCGGTCGTTTT 3’，或者5’ TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT 3’。
41.藥物組合物，其包含權(quán)利要求1-34任一項的免疫原，或者權(quán)利要求35的免疫原的組合物，或者權(quán)利要求36-40任一項的免疫原性組合物，及藥物可接受的賦形劑。
42.權(quán)利要求1-34任一項的免疫原，或者權(quán)利要求35的免疫原的組合物，或者權(quán)利要求36-40任一項的免疫原性組合物，或者權(quán)利要求41的藥物組合物，其用作藥物。
43.權(quán)利要求1-34任一項的免疫原，或者權(quán)利要求35的免疫原的組合物，或者權(quán)利要求36-40任一項的免疫原性組合物，或者權(quán)利要求41的藥物組合物，其用于預(yù)防、減輕或者治療PCSK9-相關(guān)疾病。
44.權(quán)利要求43的免疫原、免疫原性組合物或者藥物組合物，其中所述PCSK9相關(guān)疾病是增高的LDL-膽固醇或者與增高的LDL-膽固醇相關(guān)的病癥。
45.權(quán)利要求43的免疫原、免疫原性組合物或者藥物組合物，其中所述PCSK9相關(guān)疾病選自脂質(zhì)失調(diào)如高脂血癥，I型、II型、III型、IV型或者V型高脂血癥，繼發(fā)高甘油三酯血癥,高膽固醇血癥,家族型高膽固醇血癥,黃瘤病,膽固醇乙酰轉(zhuǎn)移酶缺陷；動脈硬化疾病 (例如動脈硬化)、冠心病以及心血管疾病。
46.權(quán)利要求1-34任一項的免疫原、或者權(quán)利要求35的免疫原的組合物、或者權(quán)利要求36-40任一項的免疫原性組合物，用于預(yù)防、減輕或者治療阿爾茲海默病。
47.預(yù)防、減輕或者治療個體中PCSK9相關(guān)疾病的方法，所述方法包括施用治療有效量的權(quán)利要求1-34任一項的免疫原、或者權(quán)利要求35的免疫原的組合物、或者權(quán)利要求 36-40任一項的免疫原性組合物或者權(quán)利要求41的藥物組合物。
48.編碼權(quán)利要求1-34任一項的免疫原的核酸。
49.包含權(quán)利要求48的核酸的表達(dá)載體。
50.包含權(quán)利要求49的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及提供新的免疫原，其包含與免疫原性載體連接的抗原性PCSK9肽，用以預(yù)防、治療或者減輕PCSK9介導(dǎo)的疾病。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)這些藥物、其免疫原性組合物及藥物組合物的方法以及它們在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。
文檔編號A61K38/10GK102612558SQ201080049440
公開日2012年7月25日 申請日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者B·G·皮爾斯, B·R·錢皮恩, D·M·懷亞特, J·D·弗雷澤, J·H·烏拉, J·J·L·霍金斯, J·R·默森, L·G·小孔蒂洛, M·D·艾森布勞恩, X·邱 申請人:輝瑞疫苗有限責(zé)任公司