專利名稱：錐蟲病疫苗和診斷的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及編碼非洲錐蟲寄生蟲的唾液酸轉移酶樣蛋白的新的遺傳物質(zhì)，并涉及所述基因和蛋白在疫苗、治療學和診斷學中的應用。本發(fā)明還涉及針對錐蟲病和錐體蟲病的人類和/或非人類動物的免疫接種。
背景技術：
錐蟲病和錐體蟲病由錐蟲屬(Trypanosoma)的幾種寄生性原生動物物種引起，并且非洲錐蟲一般是指屬于唾傳錐蟲(Salivaria)類的錐蟲，其本身包括三個主要亞屬錐蟲亞屬(Trypanozoon)、達氏錐蟲亞屬(Duttonella)和短小錐蟲亞屬(Nannomonas)。只有錐蟲亞屬在感染動物的物種之外，還包含感染人類的兩個物種，它們在人類 中引起昏睡病。其他亞屬包含的物種感染野生和馴養(yǎng)動物并且從不感染人類，但是可能具有重要的間接健康后果。錐蟲亞屬由多種形態(tài)的非洲錐蟲組成(長和短或短粗形)，在接近末端(后端)位置中具有任選的游離鞭毛和小的動質(zhì)體。該亞屬的物種是布氏錐蟲(Trypanosoma(T.)brucei)、伊氏錐蟲(Τ· evansi)和馬疫錐蟲(Τ· equiperdum)。布氏錐蟲包括三個亞種布氏錐蟲布氏亞種(T. b. brucei)、布氏錐蟲岡比亞亞種(T. b. gambiense)和布氏錐蟲羅德西亞亞種(T. b. rhodesiense),它們在形態(tài)、抗原性和生物化學方面非常相似，由它們的感染性質(zhì)、它們的致病性和它們的地理分布來區(qū)分。布氏錐蟲及其亞種通過舌蠅傳播。伊氏錐蟲在非洲、南美洲和東南亞通過舌蠅之外的螫蠅(蛇科(Tabanidae))傳播到牛、馬和駱駝。馬疫錐蟲沒有無脊椎動物宿主(在馬中性傳播)。后兩個物種的分布遠超舌蠅的區(qū)域，并且是世界種。它們的形態(tài)與布氏錐蟲類似，但是是單形的(只有長形)。屬于達氏錐蟲亞屬的錐蟲為棒狀，具有圓且寬的后端和朝向前端變窄的身體。動質(zhì)體體態(tài)大、圓形并位于端位；波動膜相對不發(fā)達、狹窄并終止于游離鞭毛。活潑錐蟲(T. vivax)和活動錐蟲(T. uniforme)是野生和馴養(yǎng)反芻動物的寄生物種。它們可以機械或通過舌蠅傳播，它們在舌蠅中專門定居于吻和前胃。短小錐蟲亞屬的錐蟲小(8_24μπι)，并且它們在其發(fā)育的任何階段都沒有游離鞭毛。在接近末端或邊緣位置生有平均尺寸的動質(zhì)體。后部圓形，并且波動膜窄。在非洲它們的致病性主要針對牛、豬和狗。它們在舌蠅中的發(fā)育專門發(fā)生在胃和吻中。主要物種是剛果錐蟲(Τ. congolense)和猿猴錐蟲(T. simiae)。這些錐蟲小,具有圓形后端,動質(zhì)體位于邊緣位置，并具有窄波動膜。在非洲，馴養(yǎng)的反芻動物主要受到三種致病性非洲錐蟲的感染，即剛果錐蟲、活潑錐蟲和布氏錐蟲，其造成被稱為那加那病的病變。其他動物受到另一種致病性錐蟲物種——伊氏錐蟲的感染，它造成被稱為蘇拉病的病變。錐蟲的特征在于大的遺傳多樣性，這與它們的侵染性、毒力、致病性、傳播性和對殺錐蟲產(chǎn)品的敏感性有關。在非洲，以其頻率和致病性來說，剛果錐蟲是牛錐蟲病的首要病因。它也適應于各種非人類動物物種，因此能夠無差異地寄生牛科動物、豬科動物、OVids、羊科動物、馬科動物和犬科動物。布氏錐蟲、尤其是布氏錐蟲網(wǎng)比亞亞種(Trypanosoma brucei gambiense),可能是最廣為人知的，因為它在西部和中部非洲造成人類慢性形式的昏睡病。布氏錐蟲布氏亞種(Trypanosoma brucei brucei)是整個非洲馴養(yǎng)和野生動物的寄生蟲,但是由于人類血清中存在的載脂蛋白L對這些錐蟲的血液型的裂解效應，它不感染人類。第三個亞種是布氏錐蟲羅德西亞亞種(Trypanosoma brucei rhodesiense),其在非洲是急性形式的昏睡病的病因。此外，伊氏錐蟲亞種傳播到?？苿游?、馬和駱駝，并在非洲具有重要的經(jīng)濟影響，尤其是對于牛和水牛的飼養(yǎng)來說。最后，活潑錐蟲是熱帶非洲有蹄類動物的主要寄生蟲，并通過馬蠅和牛虻傳播。錐蟲具有復雜的生命周期，其包括各種形態(tài)形式。它們一般具有紡錘形身體和通過波動膜與身體相連的鞭毛。它們通過二分裂無性繁殖。在感染期間，舌蠅(Glossina sp.) 在穿刺位點處將口器中存在的感染性后循環(huán)型錐蟲注入宿主真皮內(nèi)。寄生蟲在接種點處的真皮中繁殖。在真皮中發(fā)生與寄生蟲繁殖相關的局部反應，并且寄生蟲產(chǎn)生血液型。在例如剛果錐蟲的情況下，這個階段可能持續(xù)1-3周。然后寄生蟲侵入血液、淋巴系統(tǒng)特別是淋巴結、和各種器官例如肝、脾、心、腎和睪丸，它們?nèi)缓蟊憩F(xiàn)出顯著病變。舌蠅被生有寄生蟲的動物感染并在所述動物上進食。在被感染后，它終其一生保持傳染性。在布氏錐蟲和剛果錐蟲的情形中，錐蟲在昆蟲中經(jīng)歷復雜周期，包括在腸中去分化成無感染性前循環(huán)形式。在唾液腺或口器中，錐蟲轉變成活躍繁殖的附著性上鞭毛體型。它們的分化產(chǎn)生了表現(xiàn)為不再分裂的后循環(huán)型的傳染性階段?；顫婂F蟲的周期不包含前循環(huán)階段。它從通過舌蠅導入的血液型中的鞭毛附著開始。它們分化成上鞭毛體型，其增殖并然后分化成感染性后循環(huán)型。在舌蠅中周期的整個持續(xù)時間對于活潑錐蟲來說約為5-10天，對剛果錐蟲來說為18天，對布氏錐蟲來說為30天。馴養(yǎng)動物的傳染源是患病或作為健康攜帶者的其他馴養(yǎng)動物或野生動物。儲源的存在是由某些物種相對不感受感染并且對疾病相對不敏感這一事實造成的?？赡艿膫鞑∶浇殡S錐蟲物種而變。剛果錐蟲和布氏錐蟲專一地通過生物媒介例如舌蠅傳播，但是活潑錐蟲也能通過機械媒介例如螫蠅(牛虻或廄蠅)傳播。伊氏錐蟲專一地通過機械媒介傳播。傳播效率取決于舌蠅傳染率和宿主-媒介相互作用。一般來說,感染動物的錐蟲比感染人類的錐蟲具有更高的傳染率，其造成了動物錐蟲病的非常廣泛的分布。通過電子顯微術對錐蟲進行的分析顯示，存在約15nm的外殼覆蓋著寄生蟲的整個細胞體。該外殼只存在于血液和后循環(huán)型的表面上。它基本上由可變的表面糖蛋白(VSG)和少量其他膜蛋白構成。VSG形成非常致密的結構，構成質(zhì)膜與宿主之間的物理屏障。3-D結構預測只有少部分蛋白暴露于寄生蟲表面上。因此，外殼的主要作用是通過向宿主的免疫防御呈遞幾種免疫顯性基序來掩蔽寄生蟲不變的膜抗原。外殼還保護血液型抵抗由補體旁路途徑的活化引起的裂解。對抗動物錐蟲病的戰(zhàn)斗依賴于在成本回收基礎上的動物篩查和治療。用于治療錐蟲病的主要化學化合物是重氮氨苯脒乙酰甘氨酸鹽、乙菲啶溴化物或氯化物、氯化氮氨菲啶、喹匹拉明、蘇拉明和美拉索明。但是，至少30年來沒有新分子上市，而在過去幾年中看到了由于殺錐蟲劑耐藥性的出現(xiàn)以及藥物的廣泛和偶然的不適當使用所引起的疾病的新爆發(fā)，所述不適當使用引起了耐藥性選擇和放大的報道，尤其是在受該疾病影響的非洲所有地區(qū)。發(fā)明概述本申請人鑒定并獲得了一種新的遺傳物質(zhì)，其編碼被稱為TcoTS樣蛋白1、2和3的被抗非洲錐蟲抗血清識別的新的唾液酸轉移酶樣蛋白。所述遺傳物質(zhì)能夠用于生產(chǎn)蛋白和多肽，其目的是用于開發(fā)診斷化驗和制備對抗非洲錐蟲感染的疫苗或藥物組合物。同樣，所述蛋白和任何相應的多肽片段可用于生產(chǎn)針對寄生蟲的特異性抗體，用于診斷學或被動免疫的目的。附圖簡述圖I :顯示了編碼唾液酸轉移酶樣蛋白TcoTS樣I的核苷酸序列；圖2 :顯示了編碼唾液酸轉移酶樣蛋白TcoTS樣2的核苷酸序列； 圖3 :顯示了編碼唾液酸轉移酶樣蛋白TcoTS樣3的核苷酸序列；圖4 :顯示了對應于唾液酸轉移酶樣蛋白TcoTS樣I的肽序列；圖5 :顯不了對應于唾液酸轉移酶樣蛋白TcoTS樣2的肽序列；圖6 :顯不了對應于唾液酸轉移酶樣蛋白TcoTS樣3的肽序列；圖7 :顯示了唾液酸轉移酶樣蛋白TcoTS樣2與寄生蟲克氏錐蟲(Trypanosomacruzi (T. cruzi TS))的唾液酸轉移酶蛋白之間的序列比對；圖8A和8B :顯示了寄生蟲剛果錐蟲的唾液酸轉移酶相關蛋白的5個亞家族的圖；顯示了相同亞家族的基因之間的百分同一性(圖8A)，并用表顯示了所述蛋白之間的百分同一性(圖8B)；圖9 :顯示了編碼TcoTS-Al蛋白的核苷酸序列；

圖10 :顯示了編碼TcoTS_A2蛋白的核苷酸序列；圖11 :顯示了編碼TcoTS_A3蛋白的核苷酸序列；圖12 :顯示了編碼TcoTS-Bl蛋白的核苷酸序列；圖13 :顯示了編碼TcoTS_B2蛋白的核苷酸序列；圖14 :顯示了編碼TcoTS-C蛋白的核苷酸序列；圖15 :顯示了編碼TcoTS-Dl蛋白的核苷酸序列；圖16 :顯示了編碼TcoTS_D2蛋白的核苷酸序列；圖17 :顯示了對應于TcoTS-Al蛋白的肽序列；圖18 :顯示了對應于TcoTS_A2蛋白的肽序列；圖19 :顯示了對應于TcoTS_A3蛋白的肽序列；圖20 :顯示了對應于TcoTS-Bl蛋白的肽序列；圖21 :顯示了對應于TcoTS_B2蛋白的肽序列；圖22 :顯示了對應于TcoTS-C蛋白的肽序列；圖23 :顯示了對應于TcoTS-Dl蛋白的肽序列；圖24 :顯示了對應于TcoTS_D2蛋白的肽序列；圖25A和25B :顯示了寄生蟲剛果錐蟲的11種唾液酸轉移酶相關蛋白之間的序列比對；
圖26 :顯示了表格，其顯示了寄生蟲剛果錐蟲和布氏錐蟲的唾液酸轉移酶相關蛋白之間的百分同一性；圖27 :顯示了在使用抗TcoTS-AI血清的免疫沉淀實驗中鑒定到的各種肽、它們與蛋白 TcoTS-Al、TcoTS-A2 或 TcoTS_A3 (A)、TcoTS 樣 2 (B)和 TcoTS_D2 (C)的親緣性的表;圖28 :顯示了在包含剛果錐蟲血液型膜制備物的實驗中鑒定到的各種肽的表CA),它們與TcoTS-Al、TcoTS-A2或TcoTS-A3蛋白的親緣性用加號(+ )表示；以及在使用抗肽I、抗肽2或抗肽3血清的免疫沉淀實驗期間鑒定到的與TcoTS樣2蛋白相關的肽的表(B)；圖29A和29B :顯示了在用TcoTS樣2、TcoTS-Al和TcoTS-ΒΙ蛋白或用BSA免疫接種后，小鼠中的血細胞比容(A)和平均存活(B)的測量值。標出了在各種免疫接種期間使
用的小鼠數(shù)量U)。定義“非洲錐蟲”是指屬于唾傳錐蟲(Salivaria)類的錐蟲屬(Trypanosoma)寄生性原生動物，其本身包括三個主要亞屬錐蟲亞屬(Trypanozoon)、達氏錐蟲亞屬(Duttonella)和短小錐蟲亞屬(Nannomonas),例如上面所定義的。它們被描述為非洲錐蟲，但是目前在亞洲和南美以及非洲大陸上發(fā)現(xiàn)。最常見的非洲錐蟲是剛果錐蟲(Trypanosomacongolense)、活潑維蟲(Trypanosoma vivax)、伊氏維蟲(Trypanosoma evansi)和布氏維蟲(Trypanosoma evansi) 術語“錐蟲病”和“非洲動物錐蟲病”(AAT) —般是指由非洲錐蟲引起的非人類動物的感染，而術語“錐體蟲病”或“非洲錐體蟲病”用于指稱也由非洲錐蟲引起的人類感染。出于簡化的目的，術語錐蟲病和錐體蟲病在本文中無差異地使用。發(fā)明詳述本發(fā)明以編碼屬于非洲錐蟲并被稱為TcoTS樣1、2和3的新唾液酸轉移酶樣的DNA或RNA分子為目的。這些新的DNA或RNA分子包含的至少一條鏈包含選自下列的核苷酸序列序列SEQ ID N0:l-3，與SEQ ID NO :1_3互補、反義或等同的序列，尤其是與序列SEQ IDNO :1-3之一具有至少70%同一性的序列，或在100個連續(xù)核苷酸的序列上與所述序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%、或至少70%、或至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%或95%同源性的序列，或能夠在嚴緊雜交條件下與序列SEQ ID NO :1-3之一雜交的核苷酸序列。嚴緊雜交條件是指在含有O. 1% SDS,O. 7%脫脂奶粉和6X SSC的溶液中在65°C的溫度下雜交過夜，然后在2X SSC-0. 1% SDS中在室溫清洗并在O. 2X SSC-0. 1% SDS中在65°C下清洗。本發(fā)明還涉及核苷酸序列與下列序列的任一個同一、互補、反義或等同的DNA或RNA片段SEQ ID NO: USEQ ID N0:2或SEQ ID NO:3，尤其是在任何30個連續(xù)單體的序列上與所述序列的任一個至少50%、優(yōu)選至少60%、或至少85%、90%、91%、92%、93%、94%或95%同源的DNA或RNA片段。核苷酸序列是指DNA的至少一條鏈或其互補鏈，或RNA的一條鏈或其反義鏈，或它們的相應互補DNA。在序列SEQ ID NO 1-3之一中顯不的DNA序列對應于信使RNA序列，只要將DNA中的胸腺嘧啶(T)用RNA中的尿嘧啶(U)代替即可。
根據(jù)本發(fā)明，兩個核苷酸序列作為鑒定到它們的物種的自然變異尤其是自發(fā)突變或誘導變異的結果、以及具有下面所定義的同源性的同源序列的結果，被稱為是彼此等同的。變異是指序列的任何自發(fā)或誘導的修飾，尤其是通過核苷酸和/或核苷酸片段的取代和/或插入和/或缺失、和/或序列在至少一端的延伸和/或縮短獲得的修飾，或可以從所使用的遺傳工程技術得到的非天然變異。這種變異可以通過被視為參比的任何起始序列的修飾來表示，并可以用相對于所述參比序列的同源性程度來表示。同源性表征了兩個被比較的核苷酸(或肽)片段的同一性程度；它由百分同一性來度量，百分同一性尤其是通過核苷酸(或肽)序列與參比核苷酸(或肽)序列的直接比較來確定。本發(fā)明的另一個目的涉及被稱為TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3的蛋白，其表觀分子量對于TcoTS樣I蛋白來說約為85kDa，對于TcoTS樣2蛋白來說約為76kDa，對于TcoTS樣3蛋白來說約為78kDa，并被抗非洲錐蟲抗血清識別，還涉及所述蛋白的抗原性肽片段或所述蛋白或片段的免疫等同物。所述蛋白的氨基酸序列顯示在序列SEQ ID NO 4-6中，并且還包含至少70%、75%、80%、85%、90%或至少95%同源的蛋白序列。由本申請人新表征的蛋白在C-端具有旨在允許與被感染動物的唾液酸結合的保守凝集素部分，并在N-端具有與唾液酸轉移酶相似的催化部分，因此被本申請人稱為唾液酸轉移酶樣。免疫等同物是指能夠被針對所述TcoTS樣I、2和3蛋白的抗體免疫識別的任何多肽或肽。本發(fā)明還涉及TcoTS樣1、2和3蛋白的任何片段，更具體來說涉及被抗非洲錐蟲抗血清特異性識別的任何抗原性肽片段。本發(fā)明的所述蛋白和蛋白片段可以包含修飾，尤其是不改變其免疫原性的化學修飾。因此，本發(fā)明還涉及其氨基酸序列對應于TcoTS樣I、TcoTS樣2和/或TcoTS樣3蛋白的部分序列，單獨或在混合物中與被非洲錐蟲感染的非人類動物和/或人類的完全血清表現(xiàn)出反應性的一種或多種肽。所述肽可以通過化學合成，通過TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白的裂解，或通過遺傳重組技術來獲得。根據(jù)第二方面，本發(fā)明的目的在于，在尤其是在來自于原核或真核生物的細胞中，能夠表達處于表達所需的元件的控制之下的編碼上述TcoTS樣UTcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白的全部或片段的DNA、特別是如上所述的DNA片段的功能性表達盒。由此表達的所述蛋白或蛋白片段被抗非洲錐蟲抗血清識別。總的來說，來自于原核或真核生物體的任何細胞都可用于本發(fā)明的情形。這樣的細胞對于本技術領域的專業(yè)人員來說是已知的。例如，可以提到的是來自于真核生物體的細胞，例如哺乳動物細胞，尤其是中華倉鼠卵巢(CHO)細胞、昆蟲細胞或真菌細胞尤其是單細胞或酵母細胞，尤其是來自于畢赤酵母(Pichia)、酵母(Saccharomyces)、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)屬的酵母細胞，特別是選自釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解蘋果酸裂殖酵母(Schizosaccharomyces malidevorans)、斯洛菲裂殖酵母(Schizosaccharomycessloofiae)和八抱裂殖酵母(Schizosaccharomyces octosporus)的酵母細胞。同樣地，在來自于原核生物體的細胞中，可以提到但不以任何方式構成限制的是大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli (E. coli))菌株的細胞或腸細菌細胞。細胞可以是野生型或突變體。突變描述在本技術領域的專業(yè)人員可以獲得的文獻中。優(yōu)選使用大腸桿菌細胞，例如BL21(DE3)。本發(fā)明的表達盒打算用于在例如大腸桿菌中生產(chǎn)TcoTS樣UTcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白或所述蛋白被抗非洲錐蟲抗血清識別的片段。這樣的抗血清來自于最近或以前受到錐蟲物種剛果錐蟲、布氏錐蟲、伊氏錐蟲和/或活潑錐蟲感染并含有特異性識別TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白的免疫球蛋白的動物。此外，TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白能夠被其他抗體識別，例如通過用前述天然蛋白、重組蛋白或其片段或肽免疫接種各種不同物種而獲得的單克隆或多克隆抗體。TcoTS樣UTcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白或其片段，是指屬于剛果錐蟲、布氏錐蟲、伊氏錐蟲和/或活潑錐蟲種的天然非洲錐蟲的、尤其是通過本申請中描述的遺傳重組技術產(chǎn)生的抗原或抗原性片段，或者是所述抗原的任何片段或突變體，前提是所述片段或突變體與針對所述寄生蟲的TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白的抗體具有免疫反應性。 有利地，所述蛋白具有相對于序列SEQ ID NO :4_6具有至少70%、75%、80%、85%、90%或至少95%的同源性程度的氨基酸序列。在實踐中，一種這樣的等同物可以通過天然或重組蛋白的一個或多個氨基酸的缺失、取代和/或添加來獲得。本技術領域的專業(yè)人員能夠通過已知技術執(zhí)行這些修飾而不影響免疫識別。在本發(fā)明的情形中，TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白可以在體外進行修飾，尤其是通過化學基團例如磷酸、糖或肉豆蘧酸的缺失或添加，以便提高其穩(wěn)定性或一個或多個表位的呈遞。本發(fā)明的表達盒能夠生產(chǎn)TcoTS蛋白TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3或具有上面指定的氨基酸序列的所述蛋白的抗原性片段，以及可以有利地與能夠有助于其穩(wěn)定性、純化、生產(chǎn)或識別的外源元件融合的所述蛋白的片段。一種這樣的外源元件的選擇在本技術領域的專業(yè)人員的技藝范圍內(nèi)之內(nèi)。它尤其可以是半抗原或外源肽。本發(fā)明的表達盒包含在所研究的細胞中表達所述DNA片段所需的元件?！氨磉_所需元件”是指能夠將DNA片段轉錄成信使RNA (mRNA)的所有元件,例如轉錄啟動子序列(例如CMV啟動子)和終止子序列，以及能夠將mRNA翻譯成蛋白的兀件。本發(fā)明擴展到包含本發(fā)明的表達盒的載體。它也可以是能夠自主復制并特別是增殖的質(zhì)粒載體。它可以是病毒載體，尤其是桿狀病毒來源的載體，更特別是用于在昆蟲細胞中表達的桿狀病毒來源的載體，或用于在哺乳動物細胞中表達的腺病毒來源的載體。本發(fā)明還涉及來自于原核或真核生物體的包含表達盒的細胞，所述表達盒整合在細胞基因組中或插入到載體中。本發(fā)明的另一個目的是選自于TcoTS樣UTcoTS樣2和TcoTS樣3的一種或多種蛋白或所述蛋白的抗原性片段的制備方法，在所述方法中(i)將來自于原核或真核生物體的包含本發(fā)明的表達盒的細胞，在適合條件下進行培養(yǎng)；以及(ii)回收由所述生物體表達的蛋白。根據(jù)第三方面，本發(fā)明涉及通過非人類動物生物體與免疫原性劑的免疫反應獲得的單克隆或多克隆抗體，所述免疫原性劑包含如上所定義的一種或多種天然或重組的TcoTS樣l、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白和/或其抗原性肽片段。例如，可以通過使用TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白(SEQ ID NO :4_6)，如實施例2中所述將其注射到兔中以對它們進行免疫接種，來產(chǎn)生本發(fā)明的多克隆抗體。由此獲得的兔多克隆血清分別被命名為抗肽抗體I、抗肽抗體2和抗肽抗體3，它們也是本發(fā)明的一部分，前提是它們在間接ELISA中針對它們的本發(fā)明的肽表現(xiàn)出反應性。根據(jù)第四方面，本發(fā)明的目的是一種活性免疫治療組合物，尤其是疫苗制劑，其包含如上所定義的一種或多種天然或重組的TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白、和/或其抗原性肽片段、和/或一種或多種TcoTS樣UTcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白的混合物、和/或一種或多種肽片段的混合物，以及任選適合的賦形劑和/或佐劑。本發(fā)明的疫苗或獸醫(yī)組合物打算用于在人類和/或非人類動物中治療和/或預防由非洲錐蟲引起的感染，特別是對抗由剛果錐蟲、布氏錐蟲、伊氏錐蟲和/或活潑錐蟲物種所引起的感染。非洲錐蟲病引起不同嚴重性的癥狀，其范圍從在3至4周內(nèi)死亡的急性感染到持 續(xù)數(shù)月或甚至數(shù)年的慢性感染。以間歇性寄生蟲血癥為特征的慢性發(fā)展，在牛中最常見。該疾病以高熱階段開始，然后在感染性叮咬后2至3周紅細胞數(shù)量以及血紅蛋白和血細胞比容水平下降，反映出作為錐蟲病主要癥狀的貧血癥。觀察到受到慢性感染的動物進食飼料減少，變得瘦弱，它們的生長減緩，和對生殖的不利影響。錐蟲性貧血癥在兩個階段中建立。在初始階段中，貧血癥伴有寄生蟲血癥，并主要由血管外溶血引起紅細胞被脾臟、肝臟、循環(huán)血液和骨髓中的吞噬細胞系統(tǒng)破壞。最終，貧血癥引起骨髓機能障礙。所述疫苗組合物可以提供成抗原性疫苗的形式，并因此包含治療有效量的如上所述的一種或多種天然或重組的TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白，和/或其抗原性肽片段。疫苗組合物可以提供成DNA疫苗的形式，并因此可以包含如上所定義的表達盒、載體、來自于原核或真核生物體的細胞，它們能夠表達一種或多種TcoTS樣UTcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白，和/或其抗原性肽片段，和/或其組合。DNA疫苗可以含有DNA或RNA、修飾的核苷酸序列，并優(yōu)選包含在真核啟動子序列控制下編碼抗原性肽或片段的一種或多種表達載體。本發(fā)明的疫苗可以是單價疫苗，其包含治療有效量的如上所述的一種或多種天然或重組的TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白和/或其抗原性肽片段，和/或編碼所述肽或片段的核苷酸序列。所述單價疫苗預防感染并因此防止疾病表現(xiàn)。如果所述疫苗不預防感染而是只防止疾病表現(xiàn)，它可以被稱為“抗病”疫苗。在這種情況下，并且由于與其他血液寄生物病的差別診斷當前不是系統(tǒng)性的，使用將所謂的“抗病”疫苗與其他錐蟲的抗原和/或其他治療活性劑和/或在疾病預防中常用的其他疫苗相組合的多價疫苗，根據(jù)本發(fā)明是特別有利的。因此，本發(fā)明的疫苗可以是單價疫苗，其組合了一種或多種錐蟲物種、優(yōu)選為源自于一種或多種相似或不同錐蟲物種的一種或多種天然或重組的蛋白和/或肽片段和/或編碼所述肽和肽片段的核苷酸序列。所述錐蟲來源的抗原性肽、片段或抗原性肽的混合物，是例如其他唾液酸酶或唾液酸轉移酶、微管蛋白、蛋白酶、脂肪酶和/或鞭毛蛋白。作為能夠摻入到多價疫苗中的唾液酸轉移酶的實例，可以提到的是克氏錐蟲、剛果錐蟲、活潑錐蟲、伊氏錐蟲、布氏錐蟲、布氏錐蟲、羅得西亞錐蟲和/或網(wǎng)比亞錐蟲的唾液酸轉移酶。其中，剛果錐蟲的某些唾液酸轉移酶描述在國際申請W02004/55176或Tiralongo E.等(JBC vol. 278, No. 26, pp 23301-10，2003)中。更準確來說，可以提到的是克氏錐蟲唾液酸轉移酶A和B鏈，其以編號GI: 29726491、GI: 29726490、GI :29726489和GI :29726488保藏于GenBank。使用無活性的突變形式的唾液酸轉移酶也是有利的。在這方面，可以提到的是例如在國際申請W02007/107488中描述的突變的克氏錐蟲唾液酸轉移酶，其保留了不到20%的唾液酸酶和轉移酶酶活性。作為錐蟲來源的微管蛋白的實例，可以提到的是布氏錐蟲α-微管蛋白(保藏在GenBank登記號ΑΑΑ30262. I下)、布氏錐蟲β -微管蛋白(保藏在GenBank登記號ΑΑΑ30261. I下)、布氏錐蟲ε -微管蛋白(保藏在GenBank登記號ΕΑΝ77544. I下)、布氏錐蟲TREU927 ε -微管蛋白(參考NCBI編號ΧΡ_822372. I和ΧΡ_829157· I)、布氏錐蟲δ-微 管蛋白(保藏在GenBank登記號ΕΑΝ80045. I下)、布氏錐蟲ζ -微管蛋白(參考NCBI編號ΧΡ_001218818. I)或國際申請WO 2008/134643中描述的布氏錐蟲微管蛋白。作為錐蟲來源的鞭毛蛋白的實例，可以提到的是在國際申請W02002/19960中描述的布氏錐蟲鞭毛蛋白或在本申請人2009年11月13日提交的編號FR09/58035下的法國申請中描述的剛果錐蟲鞭毛蛋白。還可以提到的是布氏錐蟲TREU927鞭毛蛋白或鞭毛樣蛋白(參考 NCBI 編號 ΧΡ_847376· 1、ΧΡ_847374· 1、ΧΡ_847295· 1、ΧΡ_843961· 1、ΧΡ_847377· I)、布氏錐蟲鞭毛蛋白ΤΒ-44Α (保藏在GenBank登記號ΑΑΖ13310. I下)、布氏錐蟲鞭毛蛋白ΤΒ-24 (保藏在GenBank登記號ΑΑΖ13308. I下)和保藏在GenBank登記號ΑΑΖ13311. I下的布氏錐蟲鞭毛蛋白。作為蛋白酶的實例，可以提到的是錐蟲半胱氨酸蛋白酶例如剛果錐蟲的congopain或trypanopain-Tc、羅得西亞維蟲的rhodesain和克氏維蟲的chagasin或Cruzipain0本發(fā)明的疫苗，不論是單價還是多價的，還可以包含佐劑以增加抗原性應答。佐劑對于本技術領域的專業(yè)人員來說是公知的。作為佐劑的實例，可以提到的是維生素E、鋁凝膠或鹽例如氫氧化鋁或磷酸鋁、金屬鹽、皂苷類、聚丙烯酸聚合物例如Carbopol'非離子型嵌段聚合物、脂肪酸胺類例如阿夫立定和DDA、基于葡聚糖的聚合物例如硫酸葡聚糖和DEAE-葡聚糖、脂質(zhì)體、細菌免疫原例如LPS、肽聚糖或MDP?？梢灾委煹姆侨祟悇游锇ɡ缗？苿游?、ovids、貓科動物、豬科動物、駱駝科動物和/或犬科動物?；蛘撸呙缈梢园委熡行Я康南率鰡慰寺』蚨嗫寺】贵w。本發(fā)明的多價疫苗還可以包含其他血液寄生蟲病的抗原，所述其他寄生蟲病源自于例如小泰勒蟲(Theileria parva)、環(huán)形泰勒蟲(T. annulata)、雙芽巴貝斯蟲(Babesiabigemina)和分歧巴貝斯蟲(B. divergens)的原生動物，以治療和/或預防錐蟲和泰勒蟲病、無形體病和/或巴貝斯蟲病。它們可以與用于預防和/或治療目標區(qū)域中的寄生蟲病、即對抗口啼疫、梭菌病、鼠疫、卡他熱、牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)、黑脛病、巴氏桿菌病和/或綿羊痘的其他標準疫苗組合。本發(fā)明的疫苗對于在人類或非人類動物中治療和/或預防錐蟲病誘導的疾病發(fā)生例如貧血癥、總體健康下降、體重減輕和/或免疫抑制，特別有用。單價或多價疫苗也可以與抗寄生蟲劑、抗感染劑和/或對癥劑組合給藥?？辜纳x劑包括例如殺錐蟲藥物例如雙脒類(噴他脒或甲磺酸噴他脒、二脒那嗪或乙酰甘氨酸二脒那嗪)、砷衍生物例如美拉胂醇 、美拉索明、依洛尼塞(DMF0)、阿蘇波、MelBdm、硝基呋喃衍生物例如硝呋替莫(5-硝基呋喃)、鳥氨酸類似物(依氟鳥氨酸 或二氟甲基鳥氨酸)、菲啶(氮氨菲啶或乙菲啶β)、多磺化石腦油-尿素例如蘇拉明 、抗惡性腫瘤藥劑例如喹匹拉明、丁硫氨酸亞砜亞胺(BS0)、氮絲氨酸、6-重氮-5-氧雜-正亮氨酸(DON)和/或阿西維辛。當疫苗與抗寄生蟲劑組合給藥時，后者優(yōu)選在上述的單價或多價疫苗之前和/或同時和/或之后給藥。用于錐蟲的其他非特異性抗寄生蟲劑在本技術領域中是公知的，并且在本發(fā)明的疫苗之前和/或同時和/或之后給藥。其中，可以提到的是阿維菌素類(伊維菌素、阿巴美丁、多拉菌素、依普菌素和西拉菌素)、除蟲菊素類(溴氰菊酯 等)和/或驅蟲性抗寄生蟲劑(奧苯達唑、哌嗪、氟苯達唑)。作為抗感染劑的實例，可以提到的是抗生素例如β -內(nèi)酰胺類、磷霉素、糖肽類或具有抗生素活性的多肽、桿菌肽、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、鏈陽性菌素類、四環(huán)素類、氯霉素類、夫西地酸或喹諾酮類。對癥劑是例如抗貧血劑例如鐵、維生素Β12、葉酸或左亞葉酸鈣；或肝保護劑例如類黃酮復合物(西利馬林，水飛薊素等)、姜黃、疏果山螞幢(Desmodium adscendens)和/或美洲洋甘菊(Chrysanthellum americanum)(碳)。在非留類抗炎藥(NSAID)中可以包括昔康類(美洛昔康、吡羅昔康和/或替諾昔康)、水楊酸衍生物(水楊酸甲酯和乙?；嚢彼?、2_芳基丙酸類(普魯芬類)、吲哚磺酰胺衍生物、選擇性COX-2 NSAID (塞來昔布、依托昔布等)、苯丁唑酮、尼氟酸和/或滅酸類。根據(jù)第五方面，本發(fā)明涉及對非洲錐蟲特異性的探針或引物及其在診斷化驗中的應用。當在本發(fā)明中使用時，術語“探針”是指包含至少一條鏈的DNA或RNA，其核苷酸序列能夠與具有諸如下列所顯示的至少一種核苷酸序列的核酸雜交序列SEQ ID N0:l-3，或與所述序列互補、反義或等同的序列，尤其是具有與序列SEQ ID NO :1-3至少50%、優(yōu)選至少60%或至少85%同源的5至100個連續(xù)核苷酸的序列，或是指能夠進行這種雜交的未修飾或包含一個或多個修飾堿基的合成的寡核苷酸，所述修飾堿基例如次黃苷、甲基-5-脫氧胞苷、脫氧尿苷、二甲基氨基-5-脫氧尿苷、二氨基_2，6-嘌呤、溴-5-脫氧尿苷或任何其他修飾堿基。同樣，這些探針可以在糖上進行修飾，即用聚酰胺取代至少一個脫氧核糖，或在磷酸基團上進行修飾，例如將其用酯、尤其是選自二磷酸酯、二烷基和芳基膦酸酯和硫代磷酸酯的酯代替。探針可以比在序列SEQ ID NO :1-3中鑒定的序列短得多。在實踐中，這樣的探針包含至少5個核苷酸，有利地在5至50個核苷酸，優(yōu)選20個左右的核苷酸，其在已建立的與具有上面定義的核苷酸序列的DNA或RNA形成雜交復合物的條件下具有雜交特異性。本發(fā)明的探針可作為捕獲和/或檢測探針用于診斷目的。本發(fā)明的引物包含選自序列SEQ ID NO :1-3的5至30個單體的序列，并且在例如擴增技術例如聚合酶鏈反應(PCR)、在延伸過程例如測序、在反轉錄方法等中，在引發(fā)酶聚合反應的預定條件下具有雜交特異性。根據(jù)第六方面，本發(fā)明涉及檢測和/或監(jiān)測試劑，以及用于診斷由非洲錐蟲、尤其是由剛果錐蟲、布氏錐蟲、伊氏錐蟲和/或活潑錐蟲引起的感染的方法和試劑盒。錐蟲檢測試劑或診斷試劑盒包含如上所述的至少一種單克隆或多克隆抗體作為反應性物質(zhì)?；蛘?，錐蟲檢測試劑或診斷試劑盒可以包含如上定義的探針和/或引物以在生物樣品中檢測和/或鑒定非洲錐蟲，尤其是捕獲探針和檢測探針，其中一種和/或另一種如上所定義。上述試劑可以直接或間接結合于適合的固相載體。固相載體尤其可以采取錐、管、孔、珠子等的形式。當在本文中使用時，術語“固相載體”包括可以將試劑固定化在其上用于診斷化驗的所有材料?？梢允褂没瘜W改性或未改性的天然或合成材料作為固相載體，尤其是基于多糖例如纖維素的材料例如紙、纖維素衍生物例如硝酸纖維素和乙酸纖維素，聚合物例如聚氯乙烯、聚乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯或共聚物例如氯乙烯和丙烯聚合物、氯乙烯和乙酸乙烯酯聚合物、基于苯乙烯的共聚物，天然纖維例如棉以及合成纖維例如尼龍。
試劑可以直接或間接結合于固相載體。直接方式可以采取兩種方法將試劑吸附在固相載體上，即通過非共價鍵合(主要是氫鍵、范德華力或離子鍵)，或者在試劑與載體之間建立共價鍵。在間接方式中，可以將能夠與試劑相互作用以便將復合物固定在固相載體上的“抗試劑”化合物事先(通過吸附或共價)結合到固相載體上。作為實例，可以提到的是抗TcoTS樣1、2和3抗體，條件是它與所述蛋白不同部分的免疫反應性強于參與血清抗體識別反應的抗體；配體-受體系統(tǒng)，例如通過在TcoTS樣1、2和3蛋白上嫁接分子例如維生素，并通過將相應的受體固定化在固相載體上(例如生物素-鏈親和素系統(tǒng))。間接方法還包括首先通過遺傳重組將蛋白或所述蛋白的片段或多肽嫁接或融合在TcoTS樣I、TcoTS樣2和TcoTS樣3蛋白的一端，并通過被嫁接或融合的蛋白或多肽的被動吸附或共價結合將后者固定化在固相載體上?？梢酝ㄟ^任何適合的手段、即通過例如共價結合或被動吸附，直接或間接地將捕獲探針固定化在固相載體上。將檢測探針用標記物標記，所述標記物選自放射性同位素、酶尤其是選自過氧化物酶和堿性磷酸酶以及能夠水解產(chǎn)色、產(chǎn)熒光或發(fā)光底物的酶、化學發(fā)色團、產(chǎn)色、產(chǎn)熒光或發(fā)光化合物、核苷酸堿基類似物和生物素。用于診斷目的的本發(fā)明的探針可以在任何已知的雜交技術中工作，尤其是所謂的“斑點印跡”技術；Southern印跡！northern印跡,其是與Southern印跡技術相同的技術，但是使用RNA作為靶；以及夾心技術。用于在生物樣品、例如來自于能夠被非洲錐蟲感染的非人類動物的血液樣品中檢測和/或監(jiān)測非洲錐蟲感染的方法，包括將所述樣品與如上定義的試劑在能夠發(fā)生可能的免疫反應的條件下放在一起，然后用所述試劑檢測免疫復合物的存在。作為非限制性實例，可以提到的是一步或多步ELISA檢測技術，其包括將結合于固相載體的、針對所查找抗原的特異性第一單克隆或多克隆抗體與樣品進行反應，并通過本技術領域的專業(yè)人員公知的所謂的競爭技術，用第二抗體揭示由此形成的免疫復合物的可能存在，所述第二抗體用本技術領域的專業(yè)人員已知的任何適合的標記物、尤其是放射性同位素、酶例如過氧化物酶或堿性磷酸酶等進行標記?；蛘撸糜谠谏飿悠分羞x擇性檢測非洲錐蟲和診斷錐蟲病的方法，包括獲取血樣，將從樣品提取的DNA暴露并任選將所述DNA與如上定義的至少一種探針變性，并檢測所述探針的雜交。最后，本發(fā)明的另一方面涉及用于在生物樣品中診斷錐體蟲病的獸醫(yī)用試劑盒，所述試劑盒包含如上所述的探針或引物、或如上所述的抗體，以及用于檢測免疫反應的試劑。本發(fā)明的試劑盒包含至少一個用于任選無菌包裝的格，其包含治療有效量的如上所述的試劑，以及與用于執(zhí)行本發(fā)明的獸醫(yī)診斷的方案相關的說明書。根據(jù)另一方面，本發(fā)明涉及與剛果錐蟲中的唾液酸轉移酶樣蛋白相關的序列。更準確來說，表征了編碼唾液酸酶相關序列的11個基因，并按照它們的序列同源性將其分類到5個亞家族中(圖8A和8B)。第一個唾液酸轉移酶樣蛋白亞家族包含上述被命名為TcoTS樣I、2和3的三個基因，它們之間具有17-24%的同一性(圖I至6)。 第二個亞家族被命名為亞家族A，包含被命名為Al、A2和A3的三個基因，其核苷酸序列分別提供在SEQ ID NO :7、8和9中。A1、A2和A3基因在其之間具有94-97%的同一性(圖9至11)，并分別編碼三個蛋白TcoTS-Al、TcoTS-A2和TcoTS_A3，其氨基酸序列分別提供在 SEQ ID NO : 15、16 和 17 中(圖 17 至 19)。被稱為亞家族B的第三個亞家族包含在后文中命名為BI和B2的兩個基因，其核苷酸序列分別提供在SEQ ID NO :10和11中，它們之間具有76%的同一性(圖12和13)。BI和B2兩個基因編碼唾液酸轉移酶TcoTS-Bl和TcoTS-B2，其肽序列顯示在SEQ ID N0:18和19中(圖20和21)。被稱為亞家族C的第四個亞家族只包含一個被命名為C的基因，其核苷酸序列顯示在SEQ ID NO: 12中(圖14)，它編碼TcoTS-C蛋白，其肽序列提供在SEQ ID NO: 20中(圖22)。最后，被稱為亞家族D的第五個亞家族包含名為Dl和D2的兩個基因，其核苷酸序列提供在SEQ ID NO 13和14中(圖15和16)。這兩個基因Dl和D2在其之間事實上具有96%的同一性。它們編碼蛋白TcoTS-Dl和TcoTS-D2，其氨基酸序列提供在SEQ ID NO 21和22中(圖23和24)。由如上所述本發(fā)明的這11個基因編碼的蛋白之間的百分同一性，顯示在圖8A和8B中。序列比對提供在圖25A和25B中。唾液酸轉移酶樣I至3相對于其他基因高度趨
巳根據(jù)這個方面，因此，本發(fā)明的目的在于新的核苷酸序列，其編碼屬于非洲錐蟲的被稱為 TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS_A3、TcoTS-BU TcoTS_B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和TcoTS-D2的新的唾液酸轉移酶樣蛋白。這些新的DNA或RNA分子包含的至少一條鏈所包含的核苷酸序列選自序列SEQ ID NO :7-14，與序列SEQ ID NO :7_14之一互補、反義或等同的序列，尤其是與序列SEQ ID NO 7-14之一具有至少70%同一性的序列，或在100個連續(xù)核苷酸的序列上與所述序列具有至少50%、優(yōu)選至少60%或至少70%或至少80%同源性的序列，或能夠在如上定義的嚴緊雜交條件下與序列SEQ ID NO :7-14之一雜交的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及DNA或RNA片段，其核苷酸序列與序列SEQ IDNO :7_14的任一個同一、互補、反義或等同，尤其是在任何30個連續(xù)單體的序列上與任一個所述序列至少50%、優(yōu)選至少60%或至少85%同源的DNA或RNA片段。此外，在這個方面，本發(fā)明涉及被稱為TcoTS-Al、TcoTS_A2、TcoTS_A3、TcoTS-BUTcoTS-B2、TcoTS-C、TcoTS-D I 和 TcoTS_D2 的蛋白，以及分別顯示在序列 SEQ ID NO 15-22中的所述蛋白的肽序列，以及與肽序列SEQ ID NO 15-22具有至少70%、75%、80%、85%、90%或至少95%同源性的所有氨基酸序列。本發(fā)明的目的還在于蛋白TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS-A3、TcoTS-B I、TcoTS_B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和 TcoTS_D2 的被抗非洲錐蟲抗血清特異性識別的所有抗原性肽片段，以及所述蛋白的可能被針對本發(fā)明的蛋白TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS-A3、TcoTS-BU TcoTS_B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和 TcoTS_D2 的抗體免疫識別的所有免疫功能性等同物。本發(fā)明的所述蛋白和抗原性肽片段可以包含修飾，尤其是不損害它們的免疫原性的化學修飾。例如，本發(fā)明的抗原性肽片段可以是屬于TcoTS-ΒΙ蛋白的肽PKNIKGSffHRDRLQLffLTD (SEQ ID NO: 24)，或與所述片段至少 70%、75%、80%、85%、90% 或至少95%同源的肽。
本發(fā)明還涉及選自TcoTS 樣 I、TcoTS 樣 2、TcoTS 樣 3、TcoTS-AU TcoTS_A2、TcoTS-A3、TcoTS-Bl、TcoTS_B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和 TcoTS_D2 的一種或多種蛋白、和 /或所述蛋白的一種或多種抗原性肽片段、和/或所述蛋白的一種或多種免疫功能性等同物的組合或混合物。此外，本發(fā)明的目的還在于選自TcoTS樣I、TcoTS樣2、TcoTS樣3、TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS-A3、TcoTS-Bl、TcoTS-B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和 TcoTS_D2 的一種或多種蛋白或所述蛋白的混合物、和/或所述蛋白的一種或多種抗原性肽片段、和/或所述蛋白的一種或多種免疫功能性等同物的制備方法。這些用于生產(chǎn)蛋白、片段、功能性等同物和組合的技術，通過化學合成、蛋白裂解或遺傳重組來執(zhí)行。它們對于本技術領域的專業(yè)人員來說是公知的，并已在上面另外討論。在這個方面，本發(fā)明涉及通過非人類動物生物體與免疫原性劑的免疫反應獲得的單克隆或多克隆抗體，所述免疫原性劑包含如上所述的一種或多種天然或重組的TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS_A3、TcoTS-BU TcoTS_B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和 TcoTS_D2 蛋白及其肽片段。本發(fā)明的另一個目的在于疫苗組合物，其包含選自TcoTS樣I、TcoTS樣2、TcoTS樣 3、TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS_A3、TcoTS-Bl、TcoTS_B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl和TcoTS-D2的一種或多種蛋白、和/或所述蛋白的一種或多種抗原性肽片段、和/或所述蛋白的一種或多種免疫功能性等同物的混合物，和/或所述蛋白、片段或功能性等同物的組合。到目前為止，還沒有在剛果錐蟲的血液型中鑒定到這11種蛋白的任一種。事實上，Tiralongo 等((2003)J. Biol. Chem 278 (26):23301-10)以及國際公布 W02004/055176描述了在昆蟲媒介中存在的前循環(huán)形式中克隆了兩種剛果錐蟲唾液酸轉移酶TS I和TS2。所述蛋白僅僅被描述為在昆蟲媒介中存在的前循環(huán)形式中表達。此外，在布氏錐蟲中進行了唾液酸酶相關基因的研究(Montagna 等(2006) J. Biol. Chem. 281 (45) :33949-58)。Montagna等描述了布氏錐蟲TbTS基因家族(AF310231. I)的幾種蛋白序列的鑒定。它尤其描述了被稱為TbTS基因、即TbTSsh的截短形式，編碼布氏錐蟲唾液酸轉移酶TbSA B和TbSA C的B和C基因，以及最后編碼布氏錐蟲唾液酸轉移酶的Dl、D2和E基因。在剛果錐蟲和布氏錐蟲中鑒定到的序列之間的百分同一性顯示在圖26中。Montagna等公開了這些唾液酸轉移酶在體內(nèi)在前循環(huán)或昆蟲形式中表達，并可能在唾液酸轉移到寄生蟲膜上發(fā)揮重要作用，從而確保了寄生蟲在由昆蟲媒介傳輸時的保護及其存活。然而，Montagna等沒有描述在寄生蟲的血液型、即在被感染的動物中檢測足夠量的這些唾液酸轉移酶、以及因此將它們用作疫苗或診斷試劑的可能性。此外，到目前為止，沒有描述過這11種蛋白在血液型中的唾液酸酶活性。相反，文獻描述了剛果錐蟲血液型中不存在唾液酸酶活性(Engstler等(1995) ActaTrop. 59:117-29)。雖然尚未在剛果錐蟲血液型中鑒定到這11種蛋白的任一種，并且沒有描述在這些形式中的唾液酸酶活性，但本申請人以意外的方式證實了剛果錐蟲血液型中的唾液酸酶活性，并通過免疫沉淀繼以質(zhì)譜術分析顯示了 TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS-A3和TcoTS樣2蛋白在剛果錐蟲血液型中的表達(實施例3和圖27)。通過剛果錐蟲血液型膜制備物的質(zhì)譜術分析，也顯示了同樣的這些蛋白以及TcoTS-D2蛋白的表達(實施例4和圖28)。本申請人在鼠類模型上的疫苗接種保護實驗(實施例5，圖29A和29B)期間，根據(jù)動物的平均存活并根據(jù)血細胞比容，進一步證實抗原性蛋白TcoTS-Al、TcoTS-Bl和TS樣2產(chǎn)生更高的保護效 果。在某些情況下，這種保護作用甚至是完全的(不發(fā)生寄生蟲血癥并且血細胞比容正常)在TcoTS樣2的情況下12只小鼠中的3只，以及在TcoTS-ΒΙ的情況下9只小鼠中的I只。因此，本發(fā)明的目的在于打算用于在非人類動物中治療和/或預防非洲錐蟲感染，特別是對抗由剛果錐蟲、布氏錐蟲、伊氏錐蟲和/或活潑錐蟲物種引起的感染的疫苗或獸醫(yī)組合物。所述獸醫(yī)疫苗組合物可以提供成抗原性疫苗的形式，因此包含治療有效量的選自 TcoTS 樣 I、TcoTS 樣 2、TcoTS 樣 3、TcoTS-Al、TcoTS_A2、TcoTS_A3、TcoTS-BUTcoTS-B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl和TcoTS_D2的一種或多種蛋白，和/或所述蛋白的一種或多種抗原性肽片段，和/或所述蛋白的一種或多種免疫功能性等同物，和/或所述蛋白、片段或功能性等同物的組合。優(yōu)選，所述疫苗或獸醫(yī)組合物包含選自TcoTS-Al、TcoTS-Bl和TcoTS樣2的至少一種蛋白。更優(yōu)選，所述疫苗或獸醫(yī)組合物至少包含TcoTS樣2蛋白和/或TcoTS樣2的抗原性肽片段和/或免疫功能性等同物。或者，疫苗組合物可以包含治療有效量的單克隆或多克隆抗體，所述抗體針對選自TcoTS樣I、TcoTS樣2、TcoTS樣3、TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS-A3、TcoTS-Bl、TcoTS-B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和 TcoTS_D2 的一種或多種蛋白。它們對于在非人類動物中治療和/或預防錐蟲病誘導的疾病發(fā)生，尤其是例如貧血癥、總體健康下降、體重減輕和/或免疫抑制，特別有用。此外，在這個方面，本發(fā)明涉及用于檢測和/或診斷非洲錐蟲感染、尤其是由剛果錐蟲、布氏錐蟲、伊氏錐蟲和/或活潑錐蟲引起的感染的試劑以及用于診斷所述感染的方法和試劑盒。錐蟲檢測試劑或診斷試劑盒包含針對一種或多種TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS-A3、TcoTS-Bl、TcoTS-B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和 TcoTS_D2 蛋白的至少一種單克隆或多克隆抗體作為反應性物質(zhì)。優(yōu)選，錐蟲檢測試劑或診斷試劑盒包含針對選自TcoTS-Al、TcoTS-A2,TcoTS-A3和TcoTS樣2的一種或多種蛋白的至少一種單克隆或多克隆抗體作為反應性物質(zhì)。用于在生物樣品、例如來自于能夠被非洲錐蟲感染的非人類動物的血液樣品中檢測和/或監(jiān)測非洲錐蟲感染的方法，包括將所述樣品與如上定義的試劑在能夠發(fā)生可能的免疫反應的條件下放在一起，然后使用所述試劑檢測免疫復合物的存在。作為非限制性實例，可以提到的是一步或多步ELISA檢測技術，其包括將結合于固相載體的、針對所查找抗原的特異性第一單克隆或多克隆抗體與樣品進行反應，并通過本技術領域的專業(yè)人員公知的所謂競爭技術，用第二抗體揭示由此形成的免疫復合物的可能的存在，所述第二抗體用本技術領域的專業(yè)人員已知的任何適合的標記物、尤其是放射性同位素、酶例如過氧化物酶或堿性磷酸酶等進行標記。最后，在這個方面，本發(fā)明的目的在于用于在生物樣品中診斷錐蟲病的獸醫(yī)用試劑盒，所述試劑盒包含如上所述的抗體以及用于檢測免疫反應的試劑。本發(fā)明的試劑盒包含供任選無菌包裝的至少一個格，其包含治療有效量的如上所述的試劑，以及與用于執(zhí)行本發(fā)明的獸醫(yī)診斷的方案相關的說明書。
實施例實施例I :產(chǎn)生針對TcoTS-Al蛋白的多克隆抗體在巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)中生產(chǎn)TcoTS-Al蛋白。為此，將X33菌株 用含有編碼缺少前29個氨基酸的TcoTS-AI蛋白的序列的PICZ載體(Invitrogen)轉化。在甲醇中表達誘導4天后，將分泌到培養(yǎng)上清液中的蛋白通過連續(xù)的離子交換層析進行純化。首先，將培養(yǎng)上清液針對20mM乙酸鈉緩沖液(pH 4. 5)透析16小時，以10，OOOg離心30分鐘，然后在一根Iml HiTrap SP HP柱(GE Healthcare)上進行層析。按照0-1M NaCl的線性梯度進行洗脫。將含有唾液酸酶活性(使用底物2’ -(4-甲基傘形酮基)-a -D-N-乙?；窠?jīng)氨酸，如Montagna等(2006)J. Biol. Chem. 281 (45):33949-58中所述進行熒光測量術測試)的級份合并，并針對20mM Tris-HCl緩沖液(pH 8)透析16小時。在以10，OOOg離心30分鐘后,將上清液在一根Iml HiTrap Q HP柱(GE Healthcare)上進行第二次層析。按照O-IM NaCl的線性梯度進行洗脫。將含有唾液酸酶活性的級份合并，并用內(nèi)切糖苷酶Endo Hf (Biolabs)按照制造商的推薦進行處理。將脫糖基化樣品再次在一根Iml HiTrapQ HP柱(GE Healthcare)上如上所述進行層析。蛋白完整性通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色來驗證。然后使用該純化的重組蛋白免疫接種BALB/c小鼠或兔。以每15天一次的日程安排將20 μ g重組蛋白注射到小鼠中，總共進行四次注射，或者以每15天一次的日程安排將100 yg重組蛋白注射到兔中，總共進行四次注射。對第一次注射來說，將重組蛋白以乳液形式與弗氏完全佐劑混合，對于后續(xù)注射來說，與弗氏不完全佐劑混合。在實驗結束時收集被免疫動物的血清(抗TcoTS-AI血清)，并通過間接ELISA驗證它針對重組蛋白的反應性。實施例2 :針對來自于唾液酸酶相關序列的肽的多克隆抗體的生產(chǎn)將分別命名為肽1、2 和 3 的下列肽C-RTSIDYHLIDTVAKYSADDG (SEQ ID NO 23), C-PKNIKGSffHRDRLQLffLTDCSEQ ID NO :24)和C_PVSAQGQDHRYEAANAEHT(SEQ ID N0:25),通過N-端半胱氨酸與用馬來酰亞胺官能團活化的載體蛋白(KLH)偶聯(lián)，并以每20天一次100 μ g注射的日程安排用于免疫接種兔，總共進行5次注射。對第一次注射來說，將重組蛋白以乳液形式與弗氏完全佐劑混合，對于后續(xù)注射來說，與弗氏不完全佐劑混合。在實驗結束時收集獲得的被分別命名為抗肽I抗體、抗肽2抗體和抗肽3抗體的多克隆血清，并通過間接ELISA驗證它們針對其相應肽的反應性。實施例3 :TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS-A3和TcoTS樣2蛋白在剛果錐蟲血液型中的表達的證實
將3ml兔血清或Iml小鼠血清針對11 20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)透析16小時。將透析后的血清以5，OOOg離心20分鐘，然后通過一根按照制造商的指示事先準備好的蛋白G瓊脂糖凝膠Fast Flow柱(GE healthcare)。在用20mM磷酸鹽緩沖液(pH 7)洗漆后,用O. IM甘氨酸-HCl緩沖液(pH 2. 6)洗脫結合于柱的IgG。將由此純化的IgG針對11 O. IMNaHCO3 (pH 8.3)/0. 5M NaCl緩沖液透析16小時。然后將IgG與按照制造商的推薦事先準備好的CNBr活化的瓊脂糖凝膠(Sigma)在室溫下溫育2小時。在以1，OOOg離心I分鐘后，用前述緩沖液清洗樹脂，然后通過加入O. IM Tris-HCKpH 8)在室溫下飽和2小時。在以I, OOOg離心I分鐘后，將樹脂用Tris-HCl (pH 8)/0. 5M NaCl緩沖液、然后用O. IM乙酸鈉(pH 4)/0. 5M NaCl緩沖液順序清洗。為了進行免疫沉淀實驗，將由此制備的樹脂用OLB(IOOmMKCl, 17% 甘油，ImM MgCl2, 2. 25mM CaCl2,0. 5% NP40, IOmMTris-HCl, pH 8)平衡。將IO9個IL3000株的細胞在OLB中、在4°C下裂解I小時，然后以20，OOOg離心10分鐘。將上清液與事先制備好的樹脂在4°C溫育16小時。然后將樹脂以1，OOOg離心I分鐘，然后用OLB漂洗。將與IgG結合的抗原用2%的沸騰SDS洗脫。將洗脫液針對水進行透析，然后冷凍干燥。然后將冷凍干燥物加到Laemmli緩沖液(50mM Tris-HCl (pH 6. 8)，10%甘油，1%SDS, 2. 5% y -巰基乙醇，O. 01%溴酚藍)中，然后進行SDS PAGE。然后將凝膠用硝酸銀染 色，切下這樣顯示出的條帶，并使用串聯(lián)質(zhì)譜術(MS/MS)進行分析。使用抗TcoTS-Al、抗肽I、抗肽2和抗肽3多克隆血清，對剛果錐蟲IL3000株的前循環(huán)型和血液型執(zhí)行該方案。血液型的結果顯示在圖27中。使用抗TcoTS-Al血清的免疫沉淀在剛果錐蟲的前循環(huán)型和血液型中鑒定到TcoTS-Al、TcoTS-A2和TcoTS-A3蛋白。使用抗肽I、抗肽2和抗肽3血清的免疫沉淀在剛果錐蟲的血液型中只鑒定到TcoTS樣2蛋白。這些結果第一次證實了 TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS-A3和TcoTS樣2蛋白在寄生蟲血液型中的表達。實施例4 =TcoTS-AU TcoTS_A2、TcoTS_A3、TcoTS 樣 2 和 TcoTS_D2 蛋白在剛果錐蟲血液型膜制備物中的表達的證實將IL3000 株的 IO9 個細胞在 Iml 低滲緩沖液(5mM Na2HPO4, O. 3mM KH2PO4)中、在4°C下裂解30分鐘，然后以20，OOOg離心10分鐘。連續(xù)地對沉淀物進行三次相同的處理。將最后的沉淀物在4°C下放到100 μ I該同樣的低滲裂解緩沖液中，然后向其加入O. 5ml下列緩沖液2mM EDTA, 15. 4mM NaOH, O. 2mM二硫蘇糖醇。在溫育10分鐘后，將混合物以20，OOOg離心10分鐘?；厥丈锨逡?可溶性級份)并將沉淀物(不溶性級份)放到50 μ I水中，然后向其加入50 μ I 2% SDS。將這兩種級份中的每種50 μ I與在100°C加熱的15 μ I 4Χ Laemmli緩沖液(200mM Tris-HCl pH 6.8，40%甘油，4% SDS，10% Y -巰基乙醇，O. 04%溴酚藍)混合10分鐘，然后進行SDS-PAGE。然后將凝膠用硝酸銀染色，切下由此顯示出的條帶，并使用串聯(lián)質(zhì)譜術(MS/MS)進行分析。實施例5 :在鼠類模型上的疫苗接種試驗實施例5. I :使用TcoTS樣I的疫苗接種試驗以每15天一次注射的日程安排，用20 μ g BSA (陰性對照組)或重組TcoTS樣I蛋白(免疫接種小鼠組)對兩組BALB/c小鼠進行腹膜內(nèi)注射，總共進行4次注射。然后，用剛果錐蟲IL3000株的IO4個寄生蟲感染小鼠。對于兩組小鼠，每2天測量血細胞比容和寄生蟲血癥。
實施例5. 2 :使用TcoTS樣2的疫苗接種試驗以每15天一次注射的日程安排，用20yg BSA (7只陰性對照小鼠)或重組TcoTS樣2蛋白(7只小鼠)對14只BALB/c型小鼠進行腹膜內(nèi)注射，總共進行4次注射。然后，用剛果錐蟲IL3000株的IO4個寄生蟲感染小鼠。每2天測量血細胞比容和寄生蟲血癥。計算了在寄生蟲血癥的整個持續(xù)時間內(nèi)的平均血細胞比容對于用TcoTS樣2免疫接種的小鼠來說，它是43. 3±1. 2%，對于用BSA免疫接種的小鼠來說為37. 0±0. 7% (圖28)。也確定了小鼠的平均存活對于用TcoTS樣2免疫接種的小鼠來說，它是453±81小時，對于用BSA免疫接種的對照小鼠來說為267±23小時。實施例5. 3 :使用TcoTS樣3的疫苗接種試驗以每15天一次注射的日程安排，用20 μ g BSA (陰性對照組)或重組TcoTS樣3蛋 白(免疫接種小鼠組)對兩組BALB/c小鼠進行腹膜內(nèi)注射，總共進行4次注射。然后，用剛果錐蟲IL3000株的IO4個寄生蟲感染小鼠。對于兩組小鼠，每2天測量血細胞比容和寄生蟲血癥。實施例5. 4 :使用TcoTS-AI的疫苗接種試驗以每15天一次注射的日程安排，用20yg BSA (8只陰性對照小鼠)或重組蛋白TcoTS-Al (5只小鼠)對13只BALB/c小鼠進行腹膜內(nèi)注射，總共進行4次注射。然后，用剛果錐蟲IL3000株的IO4個寄生蟲感染小鼠。每2天測量血細胞比容和寄生蟲血癥。計算了在寄生蟲血癥的整個持續(xù)時間內(nèi)的平均血細胞比容對于用TcoTS-Al免疫接種的小鼠來說，它是41. 4±0. 9%，對于用BSA免疫接種的對照小鼠來說為37. 0±0. 7%(圖 28)。也確定了小鼠的平均存活對于用TcoTS-AI免疫接種的小鼠來說，它是299±14小時，對于用BSA免疫接種的對照小鼠來說為267±23小時。實施例5. 5 :使用TcoTS-ΒΙ的疫苗接種試驗以每15天一次注射的日程安排，用20yg BSA (8只陰性對照小鼠)或重組蛋白TcoTS-Bl (4只小鼠)對12只BALB/c小鼠進行腹膜內(nèi)注射，總共進行4次注射。接下來，用剛果錐蟲IL3000株的IO4個寄生蟲感染小鼠。每2天測量血細胞比容和寄生蟲血癥。計算了在寄生蟲血癥的整個持續(xù)時間內(nèi)的平均血細胞比容對于用TcoTS-Bl免疫接種的小鼠來說，它是41. 4±0. 5%，對于用BSA免疫接種的對照小鼠來說為37. 0±0. 7%(圖 28)。也確定了小鼠的平均存活對于用TcoTS-ΒΙ免疫接種的小鼠來說，它是463±94小時，對于用BSA免疫接種的對照小鼠來說為267±23小時。實施例5. 6 :使用選自 TcoTS_A2、TcoTS_A3、TcoTS_B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和TcoTS-D2的一種或多種蛋白的疫苗接種試驗以每15天一次注射的日程安排，用20 μ g BSA(陰性對照組)或選自蛋白TcoTS_A2、TcoTS-A3、TcoTS-B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl和TcoTS_D2的一種或多種重組蛋白(免疫接種小鼠組)對兩組BALB/c小鼠進行腹膜內(nèi)注射，總共進行4次注射。接下來，用剛果錐蟲IL3000株的IO4個寄生蟲感染小鼠。對于兩組小鼠，每2天測量血細胞比容和寄生蟲血癥。實施例6 :在牛上進行的疫苗接種試驗
將一種或多種抗原例如TcoTS 樣 I、TcoTS 樣 2、TcoTS 樣 3、TcoTS-Al、TcoTS_A2、TcoTS-A3、TcoTS-Bl、TcoTS-B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl 和 TcoTS_D2 與兩種類型的佐劑 lmg/mlQuil A (皂苷)和AdjuPhos (膠體磷酸鋁)等體積混合至終體積為lml，用該混合物或僅使用佐劑混合物(對照)對兩組牛進行皮下注射。每3周進行一次注射，總共進行三次注射，分別為100 μ g、50 μ g和25 μ g抗原。在最后一次注射三周后，以每只動物1，000個寄生蟲的比例，用剛果錐蟲IL3000株真皮內(nèi)感染動物。每日獲取血樣，直至所有動物被識別為感染，寄生蟲血癥通過棕黃層分析來確定。隨后每周獲取血樣以監(jiān)測寄生蟲血癥和貧血癥,并每月對動物稱重。通過對各種免疫接種抗原進行ELISA來監(jiān)測對免疫接種和感染的響應動力學。
在該免疫接種實驗期間使用的抗原是TcoTS樣I、2或3或TcoTS-Al或TcoTS-ΒΙ，單獨或其所有可能組合之一。實施例7 :對被感染動物血液進行的診斷化驗實例該試驗通過使用夾心ELISA方法檢測循環(huán)抗原例如TcoTS-Al、TcoTS_A2、TcoTS-A3和TcoTS樣2來進行。通過將在100 μ I 50mMNaHC03緩沖液(pH 9. 6)中稀釋的l-10yg/ml的所謂捕獲抗體在4°C溫育過夜，將捕獲抗體吸附在96孔板的孔中。然后將板倒空，用每孔 200 μ I PBS-Tween 溶液(3. 2mM Na2HPO4,0. 5mM KH2PO4,1. 3mMKCl, 135mM NaCl(pH 7. 4),0. 05%Tween 20)清洗三次。接下來，向每個孔加入100 μ I阻斷溶液(含O. 2%明膠的PBS-Tween)，并在室溫下溫育30分鐘。將板倒空，然后將100 μ I待測動物血清沉積在孔中，并在37°C溫育2小時。然后將板倒空，然后用每孔200 μ I PBS-Tween溶液清洗三次。向每個孔加入100 μ I含有與生物素偶聯(lián)的第二抗體的溶液(含l-ΙΟμ g/ml生物素化抗體的PBS-Tween)，并在37°C溫育I小時。然后將板倒空，接著用每孔200 μ I PBS-Tween溶液清洗四次。按照制造商的推薦加入100 μ I含有與過氧化物酶偶聯(lián)的鏈親和素(Sigma)的PBS-Tween。然后將板倒空，接著用每孔200 μ I PBS-Tween溶液清洗四次。最后，按照制造商的推薦加入過氧化物酶底物以觀察反應(可以使用的顯色底物的實例ABTS(Sigma))。使用讀板器或熒光計按照制造商的推薦方法來讀取結果。使用的捕獲抗體可以是免疫純化的針對一種剛果錐蟲唾液酸酶蛋白或剛果錐蟲唾液酸酶蛋白例如 TcoTS 樣 I、TcoTS 樣 2、TcoTS 樣 3、TcoTS-Al、TcoTS_A2、TcoTS_A3、TcoTS-BU TcoTS-B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl和TcoTS_D2的混合物的多克隆血清，或者是識別這些剛果錐蟲唾液酸酶蛋白的一種或多種上存在的表位的單克隆抗體。第二抗體是與捕獲抗體不同的單克隆抗體，其識別一種或多種剛果錐蟲唾液酸酶蛋白TcoTS樣I、TcoTS樣2、TcoTS樣 3、TcoTS-Al、TcoTS-A2、TcoTS_A3、TcoTS-Bl、TcoTS_B2、TcoTS-C、TcoTS-Dl和TcoTS-D2的不同表位。
權利要求
1.一種DNA或RNA分子，其特征在于其包含選自序列SEQ ID NOs :1_3的至少一個編碼非洲錐蟲唾液酸轉移酶樣的分離核苷酸序列、與選自序列SEQ ID NOs :1-3之一的序列互補的序列、與序列SEQ ID NO :1-3之一具有至少70%同一性的序列、所述序列的片段、或能夠在嚴緊雜交條件下與序列SEQ ID NOs :1-3之一雜交的核苷酸序列。
2.一種蛋白，其由權利要求I的核苷酸序列編碼。
3.權利要求2的蛋白，其特征在于其包含選自SEQID NOs :4-6的、分別被命名為TcoTS樣1、2和3的序列，或所述蛋白的抗原性肽片段。
4.一種表達盒，其特征在于其包含權利要求I的DNA分子。
5.一種重組載體，其包含權利要求4的表達盒。
6.權利要求5的重組載體，其特征在于所述載體是真核或原核來源的。
7.—種重組宿主細胞，其包含權利要求I的核酸、權利要求4的表達盒、或者權利要求5或權利要求6的重組載體。
8.權利要求7的宿主細胞，其特征在于所述細胞是真核來源的，例如尤其是哺乳動物細胞、昆蟲細胞、真菌細胞或酵母細胞，或者所述細胞是原核來源的，例如尤其是大腸桿菌(E. coli)細胞或腸細菌細胞。
9.權利要求2或權利要求3的蛋白、或抗原性肽片段，其特征在于所述蛋白或所述片段表現(xiàn)出與被非洲錐蟲感染的動物血清的反應性。
10.權利要求9的蛋白，其特征在于其表現(xiàn)出與被選自剛果錐蟲(Trypanosomacongolense)、活潑維蟲(Trypanosoma vivax)、伊氏維蟲(Trypanosoma evansi)和 / 或布氏錐蟲(Trypanosoma evansi)的非洲錐蟲感染的動物血清的反應性。
11.一種疫苗，所述疫苗用于預防和/或治療非人類動物的錐蟲病和由錐蟲病誘導的疾病發(fā)生，其特征在于所述疫苗包含有效量的權利要求2、3、9和10任一項的一種或多種蛋白。
12.—種疫苗，所述疫苗用于預防和/或治療人類的錐體蟲病和由錐體蟲病誘導的疾病發(fā)生，其特征在于所述疫苗包含有效量的權利要求2、3、9和10任一項的一種或多種蛋白。
13.權利要求11或12的疫苗，所述疫苗用于防御剛果錐蟲(Trypanosomacongolense)、活潑維蟲(Trypanosoma vivax)、伊氏維蟲(Trypanosoma evansi)和 / 或布氏錐蟲(Trypanosoma evansi)的感染。
14.權利要求11至13任一項的疫苗，其特征在于所述誘導的疾病發(fā)生包括所述動物和/或人類的貧血癥、總體健康下降、體重減輕和/或免疫抑制。
15.權利要求11、13和14任一項的疫苗，其特征在于所述非人類動物選自?？苿游?、ovids、貓科動物、豬科動物、駱駝科動物和/或犬科動物。
16.權利要求11至15任一項的多價疫苗，其特征在于其還包含源自于一種或多種非洲錐蟲物種的一種或多種抗原性肽和/或抗原性片段和/或編碼所述肽的核苷酸序列。
17.權利要求11至16任一項的多價疫苗，其特征在于所述肽和/或片段和/或核苷酸序列源自于鞭毛蛋白、唾液酸酶、唾液酸轉移酶、脂肪酶、蛋白酶和/或微管蛋白。
18.權利要求11至17任一項的疫苗，其特征在于其還包含至少一種抗寄生蟲劑、至少一種抗感染劑和/或至少一種對癥劑。
19.權利要求18的疫苗，其特征在于抗寄生蟲劑是殺錐蟲劑和/或針對錐蟲的非特異性抗寄生蟲劑。
20.權利要求18的疫苗，其特征在于抗感染劑選自β_內(nèi)酰胺類、磷霉素、糖肽類或具有抗生素活性的多肽、桿菌肽、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類、鏈陽性菌素類、四環(huán)素類、氯霉素類、夫西地酸或喹諾酮類。
21.權利要求18的疫苗，其特征在于對癥劑是抗貧血劑、肝保護劑和/或非留類抗炎藥。
22.權利要求18至21任一項的疫苗，其特征在于抗寄生蟲劑和/或抗感染劑和/或對癥劑在所述疫苗之前和/或同時和/或之后給藥。
23.權利要求11至22任一項的疫苗，其特征在于其還包含佐劑。
24.一種疫苗，所述疫苗包含權利要求11至23任一項的疫苗和針對泰勒蟲病、無形體病和/或巴貝斯蟲病的疫苗和/或抗原。
25.一種疫苗，所述疫苗包含權利要求11至23任一項的疫苗和針對口啼疫、梭菌病、鼠疫、卡他熱、牛傳染性胸膜肺炎(CBPP)、黑脛病、巴氏桿菌病和/或綿羊痘的疫苗和/或抗原。
26.一種單克隆或多克隆抗體，其特征在于其通過非人類動物生物體和/或人類與權利要求2、3、9和10任一項的至少一種蛋白或抗原性肽片段的免疫反應來獲得。
27.一種用于鑒定非洲錐蟲寄生蟲的探針，其特征在于其包含能夠與權利要求I的核酸雜交的核苷酸序列。
28.一種用于在生物樣品中檢測錐蟲病的試劑，其特征在于其包含權利要求26的抗體或權利要求27的探針。
29.一種用于在生物樣品、例如能夠被非洲錐蟲感染的非人類動物和/或人類的血液中檢測錐蟲病的方法，其特征在于將所述樣品與權利要求26的抗體在能夠發(fā)生可能的免疫反應的條件下放在一起，然后檢測免疫復合物的存在。
30.一種用于在生物樣品中診斷錐蟲病的試劑盒，所述試劑盒包含權利要求26的抗體或權利要求27的探針。
全文摘要
本發(fā)明以編碼非洲錐蟲的唾液酸轉移酶樣蛋白的新遺傳物質(zhì)為目的，并涉及所述基因和蛋白在疫苗、治療學和診斷學中的應用。本發(fā)明還涉及針對錐蟲病的人類和/或非人類動物的免疫接種。
文檔編號A61K39/395GK102858963SQ201080050947
公開日2013年1月2日 申請日期2010年11月10日 優(yōu)先權日2009年11月10日
發(fā)明者維爾日妮·柯思圖利納雷斯, 西奧·巴茨, 尼古拉斯·普拉佐雷斯 申請人:波爾多第二大學, 法國國家科學研究中心