專利名稱：人源化抗il-22ra抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人源化抗IL-22RA抗體及其在治療銀屑病和其他免疫-介導(dǎo)疾病如銀屑病關(guān)節(jié)炎和特發(fā)性皮炎中的應(yīng)用。
_2]
背景技術(shù)：
IL-22RA(也稱為 IL22R、IL22R1、IL22RA1、CRF2_9 和 Zcytorll)屬于 II 型細(xì)胞因子受體家族，是IL-20、IL-22和IL-24受體的一種組分。由于它們的結(jié)構(gòu)相似，IL-20、IL-22和IL-24與IL-19和IL-26 一起加上IL-IO都屬于所謂的“ IL-10家族”(Kunz S等· 2006)。IL-10是免疫應(yīng)答反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)劑，可介導(dǎo)巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和免疫系統(tǒng)其他細(xì)胞促炎癥 細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)(Moore Kff等.2001)。在體外，不僅活化的免疫細(xì)胞而且角質(zhì)形成細(xì)胞均能程度相似地產(chǎn)生IL-20和IL-24。在體內(nèi)，發(fā)炎組織優(yōu)先表達(dá)這些細(xì)胞因子。IL-20和IL-24可通過二種受體復(fù)合體IL-20RA/IL-20RB和 IL-22RA/IL-20RB傳遞信號(Langer JA等.2004)。幾種組織，特別是皮膚、生殖和呼吸系統(tǒng)組織及各種腺體，看來是這些介導(dǎo)因子的主要靶標(biāo)(Kunz S等，2006)。發(fā)現(xiàn)⑶4+T細(xì)胞在激活時(shí)上調(diào)IL-22基因的表達(dá)，它與IL-10的氨基酸序列有22 %相同，因此，它最初的名字稱為IL-10相關(guān)的T細(xì)胞產(chǎn)生的可誘導(dǎo)因子(IL-TIF) (DumoutierL等.2000)。不象IL-10能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，IL-22可調(diào)控組織對免疫系統(tǒng)的應(yīng)答反應(yīng)。IL-22通過在各種組織中高表達(dá)但在免疫細(xì)胞中不可檢測的IL-22RA和IL-10RB所形成的異質(zhì)二聚體受體來傳遞信號。最初認(rèn)為，IL-22系通過其IL-22RA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合于IL-22RA的胞外結(jié)構(gòu)域，后來發(fā)現(xiàn)，IL-10RB結(jié)合于IL-22與IL-22RA相互反應(yīng)所產(chǎn)生的區(qū)域，形成對IL-22有高親和力的細(xì)胞因子受體復(fù)合體(Li J等.2004)。由于許多不同類型的細(xì)胞能廣泛表達(dá)IL-10RB，而IL-22RA表達(dá)是決定細(xì)胞IL-22應(yīng)答反應(yīng)的限制性組分。IL-22RA在肝臟以及皮膚、肺、胰腺和其他外周組織中強(qiáng)表達(dá)(Wolk K等.2004 ；Aggarwal S等.2001)。不同細(xì)胞系的廣泛篩選揭示了只有表達(dá)IL-22RA的細(xì)胞才對IL-22應(yīng)答，提示沒有能介導(dǎo)IL-22信號傳遞的可替代受體。稱為IL-22結(jié)合蛋白的可溶性受體(IL-22BP ;也稱為IL22BP、IL22RA2、IL-22R- a 2、CRF2X、CRF2_S1和CRF2-10)也能結(jié)合IL-22，作為天然的蛋白拮抗劑從而提供IL-22活性的全面調(diào)節(jié)(Kotenko SV等.2003)。在包含浸潤性活化T細(xì)胞的各種慢性炎癥疾病(例如銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎和特發(fā)性皮炎)病人的患病組織中發(fā)現(xiàn)了 IL-22。最常將IL-22描述為促-炎癥細(xì)胞因子，因?yàn)樗诼匝装Y疾病病人的病灶中表達(dá)，誘生了促炎細(xì)胞因子，如 IL-6、IL-8 和 TNF-α (W0Ik K 等· 2004 ；Andoh A 等· 2005 ; Ikeuchi H 等· 2005 ;Nograles KE等· 2009a. ；Nograles KE等· 2009b)。最近Zheng等人證明，在銀屑病小鼠模型中IL-22對介導(dǎo)IL-23-誘導(dǎo)的皮炎至關(guān)重要，表明其有促炎癥作用(Zheng Y等.2007)。鑒于IL-22的生物學(xué)作用包括誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞增生，誘導(dǎo)某些組織產(chǎn)生趨化因子和促炎細(xì)胞因子，可采用能阻斷、抑制、降低或中和IL-22活性的拮抗劑，例如通過干擾其與受體的結(jié)合，而防止病原性細(xì)胞滲入炎癥部位。在2005年10月21日提交的PCT專利申請WO2006/047249中已描述了小鼠抗人IL-22RA單克降抗體。然而，小鼠抗體可有免疫原性，故需要人源化的抗人IL-22RA抗體。用于人類治療時(shí)人源化抗體通常至少有三個(gè)潛在的優(yōu)點(diǎn)優(yōu)于小鼠抗體(I)由于需要其發(fā)揮效應(yīng)的是人，故人源化抗人IL-22RA抗體能與人免疫系統(tǒng)的其他部分更好地相互作用(例如，通過補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒(CDC)或抗體依賴的細(xì)胞毒(ADCC))更有效地摧毀靶細(xì)胞；(2)人免疫系統(tǒng)應(yīng)不會識別人源化抗體的框架區(qū)或恒定區(qū)為異物，因此對注入抗體的抗體應(yīng)答反應(yīng)應(yīng)低于對完全異源的小鼠抗體的抗體應(yīng)答反應(yīng)；和(3)已報(bào)導(dǎo)注入的小鼠抗體在人體循環(huán)中的半衰期比人抗體的半衰期短得多。推測注入的人源化抗體半衰期與天然的人抗體更相似，故可給予較少劑量和較少次數(shù)。因此，鑒于以上所述，治療IL-22介導(dǎo)的炎癥，如銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎和特發(fā)性皮炎，需要人源化的抗人IL-22RA抗體。發(fā)明概沭第一方面，本發(fā)明提供結(jié)合人IL-22RA的人源化抗體。本發(fā)明的人源化抗體包含a)含有分別由氨基酸序列SEQ ID NO :1、2和3組成的H-CDR1、H_CDR2和H-CDR3的重鏈可 變區(qū)，和b)含有分別由氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和6或分別由氨基酸序列SEQ I D NO 4、5和7組成的L-⑶R1、L-⑶R2和L-⑶R3的輕鏈可變區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供本說明書所述的抗體，此抗體中a)所述重鏈可變區(qū)包含分別由氨基酸序列SEQ ID NO :8、9、10和11組成的框架區(qū)H-FRl、H-FR2、H-FR3和H-FR4 ;和b)所述輕鏈可變區(qū)包含分別由氨基酸序列SEQ ID N0:12、13、14 和 15 組成的框架區(qū) L-FR1、L-FR2、L-FR3 和 L-FR4。在另一方面，本發(fā)明提供本說明書所述的抗體，此抗體中a)所述重鏈可變區(qū)由氨基酸序列SEQ ID NO 16組成山)所述輕鏈可變區(qū)由氨基酸序列SEQ ID N0:17組成。在另一方面，本發(fā)明提供本說明書所述的抗體，此抗體包含a)由氨基酸序列SEQ ID NO 18組成的重鏈恒定區(qū)；和b)由氨基酸序列SEQ ID NO 19組成的輕鏈恒定區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供結(jié)合人IL-22RA的人源化抗體，其包含由氨基酸序列SEQ IDNO 20組成的重鏈和氨基酸序列SEQ ID NO 21組成的輕鏈。另一方面，本發(fā)明提供一種多聚核苷酸，如DNA，其編碼本發(fā)明人源化抗體的重鏈。優(yōu)選所述多聚核苷酸包含或由序列SEQ ID NO 22組成。另一方面，本發(fā)明提供一種多聚核苷酸，如DNA，其編碼本發(fā)明人源化抗體的輕鏈。優(yōu)選所述多聚核苷酸包含或由序列SEQ ID NO 23組成。另一方面，本發(fā)明提供一種多聚核苷酸，如DNA，其編碼本發(fā)明人源化抗體的重鏈和輕鏈。另一方面，本發(fā)明提供一種載體，更具體地說，一種表達(dá)載體，其包含a)編碼本發(fā)明人源化抗體重鏈的多聚核苷酸，和b)編碼本發(fā)明人源化抗體輕鏈的多聚核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供一種載體，更具體地說，一種表達(dá)載體，其包含編碼本發(fā)明人源化抗體重鏈和輕鏈的多聚核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞，其包含轉(zhuǎn)染的本發(fā)明載體，具體說，本發(fā)明的表達(dá)載體。另一方面，本發(fā)明提供制備本發(fā)明人源化抗體的方法，該方法包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞，優(yōu)選CHO細(xì)胞，和分離本發(fā)明的人源化抗體。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的人源化抗體作為藥物的應(yīng)用，具體用于治療銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎或特發(fā)性皮炎。
另一方面，本發(fā)明提供一種包含本發(fā)明的人源化抗體的藥物組合物及其作為藥物的應(yīng)用，具體用于治療銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎或特發(fā)性皮炎。另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的人源化抗體或含有所述抗體的藥物組合物在制備治療銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎或特發(fā)性皮炎藥物中的應(yīng)用。


圖I報(bào)告了人免疫球蛋白K輕鏈可變區(qū)基因4-1 (IGKV4-1)與小鼠280. 46. 3. 4VL(280. 46. 3. 4)之間的排列對比。圖2報(bào)告了人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因3-66 (IGHV3-66)與小鼠280. 46. 3. 4VH(280. 46. 3. 4)之間的排列對比。圖3報(bào)告了人免疫球蛋白K輕鏈可變區(qū)基因4-l(IGKV4-l)與第I版人源化280. 46. 3. 4VL(280. VK4-1-C)之間的排列對比。圖4報(bào)告了第一版人源化280. 46. 3. 4VH(280. VH3-66. I)與人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因3-66 (IGHV3-66)之間的排列對比。圖5報(bào)告了用蛋白A-純化的人源化280. 46. 3. 4抗體在非變性條件下SDS凝膠電泳的考馬斯蘭染色結(jié)果?！癏umira”(阿達(dá)木單抗)，一種商品化抗-TNFa單克隆抗體，此處用作標(biāo)準(zhǔn)參比品。圖左側(cè)“Marker”是標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量(MW)標(biāo)志?！癇efore”(前)指A蛋白純化的人源化280. 46. 3. 4抗體，其包含與280. VK4-1-C配對的280. VH3-66-1，因此其輕鏈含有未配對的半胱氨酸。“After” (后)指A蛋白純化的人源化280. 46. 3. 4抗體，其包含與 280. VK4-1-S 配對的 280. VH3-66-1。圖6報(bào)告了人H印G2肝細(xì)胞瘤細(xì)胞STAT3磷酸化試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人IgGl/K 鏈(包含與 280. VK4-1-S 配對的 280. VH3-66-1，■ 280. VH3-66-1/VK4-1-S)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體的效價(jià)比含有游離半胱氨酸的親代小鼠抗體高I. 4倍，IC50值分別為257. 5pM和370. 5pM。圖7報(bào)告了人IL-22受體轉(zhuǎn)染的BaF3穩(wěn)定細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人IgGl/ K 鏈(包含與 280. VK4-1-S 配對的 280. VH3-66-1，■ 280. VH3-66-1/VK4-1-S)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體的效價(jià)比含有游離半胱氨酸的親代小鼠抗體高I. 7倍，IC50值分別為340pM和587pM。圖8報(bào)告了小鼠IL-22受體轉(zhuǎn)染的BaF3穩(wěn)定細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人IgGl/ K 鏈(包含與 280. VK4-1-S 配對的 280. VH3-66-1，■ 280. VH3-66-1/VK4-1-S)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體的效價(jià)比含有游離半胱氨酸的親代小鼠抗體高2. I倍，IC50值分別為693pM和1473pM。圖9報(bào)告了人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因3-66(IGHV3_66)與第四版人源化280. 46. 3. 4VH(280. VH3-66-4)之間的排列對比。圖10報(bào)告了人H印G2肝細(xì)胞瘤細(xì)胞STAT3磷酸化試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人IgGl/ K 鏈(包含與 280. VK4-1-T 配對的 280. VH3-66-4， 280. VH3-66-4/VK4-1-T)的人 源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體的效價(jià)比親代小鼠抗體高I. 8倍，IC50值分別為183. 2pM和333. OpM0圖11報(bào)告了人IL-22受體轉(zhuǎn)染的BaF3穩(wěn)定細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人IgGl/ κ 鏈(包含與 280. VK4-1-T 配對的 280. VH3-66-4， 280. VH3-66-4/VK4-1-T)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體的效價(jià)比親代小鼠抗體高I. 75倍，IC50值分別為334pM和587pM。圖12報(bào)告了小鼠IL-22受體轉(zhuǎn)染的BaF3穩(wěn)定細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告，比較了表達(dá)為人 IgGl/ κ 鏈(包含與 280. VK4-1-T 配對的 280. VH3-66-4， 280. VH3-66-4/VK4-1-T)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體的效價(jià)比親代小鼠抗體高2. I倍，IC50值分別為687pM和1473pM。圖13報(bào)告了目的在于測定對人IL-22RA —組突變體的結(jié)合親和力的Biacore分析280. VH3-66-4中單個(gè)地產(chǎn)生H- CDRl區(qū)Asp 32突變和H-CDR3區(qū)Asp 96突變。將這些單一突變體與人源化輕鏈可變區(qū)280. VK4-1-T配對，然后檢測親和力。D32E :280. VH3-66-4的32 位 Asp 突變?yōu)?Glu，產(chǎn)生版本 280. VH3-66-18 ；D32 :親代版本 280-VH3-66-4 ；D32N :280.VH3-66-4 的 32 位 Asp 突變?yōu)?Asn ；D96E :280. VH3-66-4 的 96 位 Asp 突變?yōu)?Glu ；D96N :280.VH3-66-4 的 96 位 Asp 突變?yōu)?Asn。此圖報(bào)告的結(jié)果表明，與親代未突變的D32(280. VH3_66_4)相比，D32E突變提高了結(jié)合率約2倍，降低了解離率約5倍。另一方面，D96E突變有負(fù)面影響，降低了親和力約500 倍。圖14報(bào)告了用示差掃描量熱法(DSC)檢測D32E突變體與親代未突變D32的熱穩(wěn)定性結(jié)果。D32E突變體(淡灰色線)比親代D32(深灰色線)穩(wěn)定，相差I(lǐng)度。圖15報(bào)告了人H印G2肝細(xì)胞瘤細(xì)胞STAT3磷酸化試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人IgGl/ κ 鏈(包含與 280. VK4-1-T 配對的 280. VH3-66-18， 280. VH3-66-18/VK4-1-T)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體的效價(jià)比親代小鼠抗體幾乎高3倍，IC50值分別為32. 5pM和370. 5pM。圖16報(bào)告了最終的人源化VH版本280. VH3_66_46與人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因3-66 (IGHV3-66)之間的排列對比。圖17報(bào)告了人免疫球蛋白κ輕鏈可變區(qū)基因4-l(IGKV4-l)與最終的人源化VL版本280. VK4-1-TSY之間的排列對比。圖18報(bào)告了正常人角質(zhì)形成細(xì)胞STAT3磷酸化試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人IgGl/κ 鏈(包含與 280. VK4-1-TSY 配對的 280. VH3-66-46， 280. VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體(280. 346. TSY,參見實(shí)施例7)的效價(jià)比親代小鼠抗體幾乎高9倍，IC5tl值分別為60. 95pM和 541. 9pM。圖19報(bào)告了人H印G2肝細(xì)胞瘤細(xì)胞STAT3磷酸化試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人IgGl/ κ 鏈(包含與 280. VK4-1-TSY 配對的 280. VH3-66-46, 280. VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體(280. 346. TSY，見實(shí)施例7)的效價(jià)比親代小鼠抗體幾乎高5倍，IC50值分別為55. 16pM和 266. 3pM。圖20報(bào)告了人IL-22受體轉(zhuǎn)染的BaF3穩(wěn)定細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人IgGl/ κ 鏈(包含與 280. VK4-1-TSY 配對的 280. VH3-66-46, 280. VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體(280. 346. TSY，參見實(shí)施例7)的效價(jià)比親代小鼠抗體高I. 7倍，IC50值分別為317pM和545pM0圖21報(bào)告了小鼠HEPA1-6肝細(xì)胞瘤細(xì)胞STAT3磷酸化試驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算出表達(dá)為人IgGl/ K 鏈(包含與 280. VK4-1-TSY 配對的 280. VH3-66-46, · 280. VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗體的效價(jià)，用人IgGl作為陰性對照(對照hlgGl)。結(jié)果顯示該人源化抗體能抑制小鼠IL-22的活性，其IC5tl在納摩爾范圍(2. InM)。圖22報(bào)告了小鼠IL-22受體轉(zhuǎn)染的BaF3穩(wěn)定細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果，比較了表達(dá)為人 IgGl/ K 鏈(包含與 280. VK4-1-TSY 配對的 280. VH3-66-46， 280. VH3-66-46/VK4-1-TSY)的人源化抗體與親代小鼠抗體280. 46. 3. 4( · 280. 46. 3. 4)的效價(jià)。結(jié)果顯示該人源化抗體(280. 346. TSY，參見實(shí)施例7)的效價(jià)比親代小鼠抗體高6. 2倍，IC50值分別為 137pM 和 849pM。圖23報(bào)告了為測定280. 346. TSY對人IL-22RA的特異性所作的競爭性ELISA 的結(jié)果。用人IL-22RA-E⑶(即IL-22RA-胞外區(qū))包被微孔板。在競爭劑人白介素22受體 a (hIL-22RA)、人 IL-22 結(jié)合蛋白(hIL_22BP)、小鼠 IL-22 受體 a (mIL-22RA)、人IL-10受體a (hi L-1 OR)和人IL-20受體a (hIL_20R)存在下，在微孔板中加入生物素化280-346-TSY抗體。加入過氧化物酶偶聯(lián)的鏈霉親和素，顯示與板上包被的hIL_22RA的結(jié)合。測得的人(· hIL-22RA)和小鼠( mIL-22RA) IL-22RA的IC50值分別為18. 25pM和 149·3ρΜ。280. 346. TSY 未顯示與人 IL-22BP( ■ hIL-22BP)、IL-IORa (AhIL-IOR)和IL-20Ra (VhIL-20R)的交叉反應(yīng)。圖24報(bào)告了 280-346-TSY對IL-22-誘導(dǎo)小鼠血清淀粉樣蛋白A的藥效學(xué)活性結(jié)果。皮下給予不同劑量的280. 346. TSY, 22小時(shí)后靜脈注射重組小鼠IL-22。運(yùn)載體對照為皮下給予PBS。給予IL-22后6小時(shí)采集血樣品。用人IgG作為陰性對照(同種型對照)。用ELISA測定血清淀粉樣蛋白A。在此模型中280-346-TSY顯示有效，其ED5tl值為O. 5mg/kg ο用Mann Whitney檢驗(yàn)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析*p < O. 05,與同種型對照組相比；***p < O. 001,與同種型對照組相比。圖25報(bào)告了小鼠銀屑病模型中280-346-TSY的藥效學(xué)活性結(jié)果。檢測了280-346-TSY對IL-23-誘導(dǎo)的耳朵增厚的治療效應(yīng)。隔天一次給小鼠注射500ng重組人IL-23或PBS共14天。皮下給予不同劑量280. 346. TSY進(jìn)行全治療覆蓋。運(yùn)載體對照為皮下給予PBS。采用地塞米松為陽性對照。計(jì)算出第9天(對應(yīng)于耳朵腫脹峰)的百分抑制率。在此模型中280-346-TSY顯示有效，其ED5tl值為I. 8mg/kg。發(fā)明詳述在開始詳述本發(fā)明之前，定義以下術(shù)語可能有助于理解本發(fā)明。本說明書所用的術(shù)語“抗體”及其復(fù)數(shù)形式，除了別的以外，包括多克隆抗體、親和純化的多克隆抗體、單克隆抗體、納米體(nanobodies)和抗原結(jié)合片段,如F (ab' ) 2> Fab蛋白水解片段和單鏈可變區(qū)片段(scFvs)。還包括遺傳工程改造的完整抗體或片段，如嵌合抗體、Fv片段、單鏈抗體等，以及合成的抗原結(jié)合肽或多肽?？赏ㄟ^在人框架區(qū)和恒定區(qū)中植入非人抗體的CDR，或摻入非人抗體的整個(gè)可變區(qū)而使非人抗體人源化。在某些情況下，人源化抗體的人框架區(qū)可包含非人殘基以提高其本身的結(jié)合特性?？贵w人源化后可延長其生物學(xué)半衰期和給予人體后降低其引起不良免疫反應(yīng)的可能性。
本說明書所用術(shù)語“免疫球蛋白”(Ig)指基本上由免疫球蛋白基因編碼的一條或多條多肽組成的蛋白質(zhì)。一種類型的免疫球蛋白構(gòu)成了一類抗體的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)單元。其型狀是一種四聚體，由二對相同的免疫球蛋白鏈組成，每對有一條輕鏈和一條重鏈。輕鏈有兩部分可變結(jié)構(gòu)域(VL)和恒定結(jié)構(gòu)域(CL)，后者也可稱為恒定區(qū)。重鏈也有兩部分可變結(jié)構(gòu)域(VH)和恒定區(qū)(CH)。在每對中，輕鏈和重鏈的可變區(qū)共同負(fù)責(zé)結(jié)合抗原，恒定區(qū)負(fù)責(zé)抗體的效應(yīng)器功能。免疫球蛋白的全長“輕鏈”(約25Kd)由N-末端的可變區(qū)(約110個(gè)氨基酸)基因和C-末端的K或λ恒定區(qū)(分別為C K和CA)基因編碼產(chǎn)生。類似地，如下文所述，免疫球蛋白的全長“重鏈”(約50Kd)由可變區(qū)(約116個(gè)氨基酸)基因和其他恒定區(qū)(約 330個(gè)氨基酸)基因之一編碼產(chǎn)生。哺乳動(dòng)物的重鏈分為五類，用希臘字母α、δ、ε、Υ和μ表示。重鏈的類型確定了抗體的同種型，分別為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。同種型相同的所有抗體其恒定區(qū)相同，而同種型不同的抗體恒定區(qū)不相同。重鏈Υ、α和δ的恒定區(qū)有三個(gè)Ig恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、CH2和Ch3)和一個(gè)增加可屈曲性的絞鏈區(qū)；重鏈μ和ε的恒定區(qū)有4個(gè)Ig恒定結(jié)構(gòu)域(CH1、Ch2、Ch3和Ch4)和一個(gè)絞鏈區(qū)。免疫球蛋白輕鏈或重鏈可變結(jié)構(gòu)域由間插3個(gè)超變區(qū)的“框架”區(qū)組成。因此，術(shù)語“超變區(qū)”指抗體中負(fù)責(zé)抗原結(jié)合的氨基酸殘基。超變區(qū)包含“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”即輕鏈可變結(jié)構(gòu)域中的L-CDRl、L-CDR2和L-CDR3和重鏈可變結(jié)構(gòu)域中的H-CDRl、H-CDR2和H-CDR3的氨基酸殘基(Kabat等· 1991)和/或“超變環(huán)”的殘基(Chothia和Lesk, 1987)。“框架區(qū)”或“FR”殘基如本說明書定義，是除了超變區(qū)殘基之外的可變區(qū)殘基。一種種族內(nèi)不同輕鏈的框架區(qū)(即L-FRl、L-FR2、L-FR3和L-FR4)或重鏈的框架區(qū)(即H-FRl、H_FR2、H-FR3和H-FR4)的序列相對保守。因此，“人框架區(qū)”是與天然的人免疫球蛋白框架區(qū)基本上(約85%或更高，通常90-95%或更高)相同的框架區(qū)。抗體的框架區(qū)，即由結(jié)構(gòu)性輕鏈和重鏈聯(lián)合組成的框架區(qū)，其功能是定位和對齊CDR。CDR主要負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的表位。因此，術(shù)語“人源化的”免疫球蛋白指含有人框架區(qū)和非人(常為小鼠或大鼠)免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白稱為“供者”，而提供框架的人免疫球蛋白稱為“受者”。不需要存在恒定區(qū)，但如果存在，它們必須與人免疫球蛋白的恒定區(qū)基本上相同，即至少約85-90 %，優(yōu)選約95 %或更高相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分，除了 CDR和重鏈恒定區(qū)的少許殘基外(如果需要修飾其效應(yīng)器功能)，與天然人免疫球蛋白序列相對應(yīng)的各部分基本上相同?！叭嗽椿贵w”是包含人源化輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和人源化重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體。在某些情況下，人源化抗體的人框架區(qū)中可保留非人殘基以提高其本身的結(jié)合特性，和/或在CDR中可引入某些氨基酸突變以改善其結(jié)合親和力和/或降低其免疫原性，和/或提高其人性度。術(shù)語“重組抗體”指其氨基酸序列與天然抗體有所不同的抗體。由于產(chǎn)生這種抗體時(shí)采用了重組DNA相關(guān)技術(shù)，不必局限于天然抗體的氨基酸序列；可重新設(shè)計(jì)抗體以獲得所需特性。有許多可能的變化，其范圍從例如只改變可變區(qū)或恒定區(qū)的一個(gè)或幾個(gè)氨基酸到完全重新設(shè)計(jì)。通常恒定區(qū)中的改變可促進(jìn)、降低或改變其特性，如固定補(bǔ)體(如補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性CDC)、與膜相互作用和其他效應(yīng)器功能(如抗體依賴的細(xì)胞毒性ADCC)。可變區(qū)中的改變可以改善抗原的結(jié)合特性。除抗體外，免疫球蛋白還有多種其他形態(tài)，包括例如單鏈或Fv、Fab和(Fab’ )2以及雙抗體、線性抗體、多價(jià)或多特異性雜交抗體。本說明書所用的術(shù)語“單鏈Fv”，“單鏈抗體”，“Fv”或“scFv”指在一條多肽鏈中含有重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域但缺乏恒定區(qū)的抗體片段。通常單鏈抗體還包含VH與VL結(jié)構(gòu)域之間的多肽接頭，使其能形成所需構(gòu)型與抗原結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，單鏈抗體也可以是雙特異性抗體和/或人源化抗體?！癋ab片段”由一條輕鏈與一條重鏈的可變區(qū)和C0I區(qū)組成。Fab分子的重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫鍵?！癋ab'片段”包含一條輕鏈和一條含恒定區(qū)ChI與(^2結(jié)構(gòu)域的重鏈，其二條重鏈之間可形成鏈間二硫鍵從而形成F(ab' )2分子?！癋(ab' )2”含有二條輕鏈和二條含恒定區(qū)ChI與Ch2結(jié)構(gòu)域的重鏈，因此其二條重鏈之間可形成鏈間二硫鍵。前面已定義了某些重要的術(shù)語，現(xiàn)在可將敘述的重點(diǎn)放在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
上。本發(fā)明基于人源化抗人IL-22RA抗體的發(fā)現(xiàn)。利用這些抗體作為IL-22RA的拮抗劑可抑制炎癥，因而可用于治療涉及浸潤性活化T細(xì)胞的慢性炎癥疾病，如銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎和特發(fā)性皮炎。本發(fā)明提供利用人源化抗體來識別、結(jié)合、調(diào)節(jié)和/或中和IL-22RA。特別是，本發(fā)明提供利用人源化的輕鏈和重鏈可變區(qū)來識別、結(jié)合、調(diào)節(jié)和/或中 和IL-22RA。這種人源化輕鏈和重鏈的可變區(qū)可分別與K或λ的恒定區(qū)，和選自任一同種型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)重鏈的恒定區(qū)融合，并在多種宿主細(xì)胞中表達(dá)。所選的恒定區(qū)較佳為IgG的恒定區(qū)，更佳為IgGl的恒定區(qū)。制備本說明書所述的人源化抗-IL-22RA抗體所用的人源化加工的起始點(diǎn)，為2005年10月21日提交的PCT專利申請WO 2006/047249中描述的小鼠抗人IL-22RA單克隆抗體的氨基酸序列。IL-22RA是1998年7月30日提交的PCT專利申請WO 99/07848中第一次描述的II型細(xì)胞因子受體Zcytorll。人IL-22RA的氨基酸序列見SEQ ID NO :24。本發(fā)明也提供能結(jié)合含IL-22RA多肽的表位攜帶部分、或免疫原性表位、或抗原表位的多肽片段或肽的人源化IL-22RA抗體?？贵w與這些表位的結(jié)合可導(dǎo)致抑制、阻斷、中和和/或降低IL-22RA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如本說明書所述，檢測抗體的活性可采用檢測表達(dá)IL-22RA受體的細(xì)胞的增殖和/或結(jié)合的各種試驗(yàn)，檢測它們抑制或降低增殖的能力。特別感興趣的是IL-22依賴細(xì)胞中的變化?？蓪ζ溥M(jìn)行工程改造的合適細(xì)胞系包括BaF3細(xì)胞系。也可采用BaF3增殖試驗(yàn)、人HepG2肝細(xì)胞瘤細(xì)胞或小鼠HEPA1-6肝細(xì)胞瘤細(xì)胞的STAT3磷酸化試驗(yàn)、Biacore試驗(yàn)或下文所述的正常人角質(zhì)形成細(xì)胞試驗(yàn)來檢測人源化抗-IL-22RA抗體的活性。在一實(shí)施方式中，本發(fā)明的人源化抗體包括a)含有分別由氨基酸序列SEQ ID NO:1、2和3組成的H-⑶R1、H-⑶R2和H-⑶R3的重鏈可變區(qū)，和b)含有分別由氨基酸序列SEQID NO :4、5和6組成的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3的輕鏈可變區(qū)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供此處所述的抗體，其中a)所述重鏈可變區(qū)包含分別由氨基酸序列SEQ ID NO :8、9、10和11所組成的框架區(qū)H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4，和b)所述輕鏈可變區(qū)包含分別由氨基酸序列SEQ ID勵(lì)12、13、14和15組成的框架區(qū)1^41 1、L-FR2、L-FR3 和 L-FR4。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供此處所述的抗體，其中a)所述重鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO :16，和b)所述輕鏈可變區(qū)包含氨基酸序列SEQ ID NO :17。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供此處所述的抗體，其中a)所述重鏈可變區(qū)與選自人IgA、IgG、IgM、IgD、IgE或任何亞類(優(yōu)選IgGl亞類)恒定區(qū)的重鏈恒定區(qū)相融合，和b)所述輕鏈可變區(qū)與人免疫球蛋白K或λ輕鏈(優(yōu)選K輕鏈)的恒定區(qū)相融合。在另一實(shí)施方式中，所述重鏈恒定區(qū)包含能調(diào)節(jié)、降低或抑制該抗體效應(yīng)器功能(如抗體依賴的細(xì)胞毒性(ADCC)和補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性(CDC))的氨基酸突變。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供此處所述的抗體，其中所述抗體包含a)由氨基酸序列SEQ ID NO : 18組成的重鏈恒定區(qū)和b)由氨基酸序列SEQ ID NO: 19組成的輕鏈恒定區(qū)。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供能結(jié)合人IL-22RA的人源化抗體，其包含由氨基酸序列SEQ ID NO 20組成的重鏈和由氨基酸序列SEQ ID NO 21組成的輕鏈。本領(lǐng)域熟知制備編碼本說明書所述抗體的多聚核苷酸(包括DNA和RNA)的方法。可用異硫氰酸胍提取然后用氯化銫梯度離心分離來制備總RNA (Chirgwin JM等.1979)。可采用Aviv和Leder的方法從總RNA制備Poly (A) +RNA (Aviv H等· 1972)。用已知方法從poly (A)+RNA制備互補(bǔ)的DNA(cDNA)?；蛘?，可分離得到基因組DNA。然后鑒定編碼IL-22RA抗體的多聚核苷酸，并通過例如雜交或PCR進(jìn)行分離?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的任何技術(shù)，如重組技術(shù)、化學(xué)合成、克隆、連接或它們的組合，來制備本說明書所述的抗體。在一實(shí)施方式中，用重組技術(shù)制備本發(fā)明的抗體，例如通過在合適的宿主細(xì)胞中表達(dá)相應(yīng)的核酸。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞類型，產(chǎn)生的多肽可被糖基化，或不含或可含某些其他翻譯后修飾。許多書藉和綜述對如何利用載體和原核或真核宿主細(xì)胞克隆和制備重組蛋白提供了說明。因此本發(fā)明另一種實(shí)施方式是編碼上述或下面所述任何抗體或其一部分的分離的核酸分子，或其互補(bǔ)鏈或其簡并序列。在這方面，術(shù)語“核酸分子”包括所有不同類型的核酸，包括但不限于脫氧核糖核酸(如DNA、cDNA、gDNA、合成的DNA等)、核糖核酸(如RNA)和肽核酸(PNA)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸分子是DNA分子，如雙鏈DNA分子或cDNA分子。術(shù)語“分離的”指經(jīng)過鑒定與通常天然來源中相關(guān)的至少一種污染性核酸分子已分開的核酸分子。分離的核酸分子是自然界中所見形式以外的核酸分子。因此分離的核酸分子與天然細(xì)胞中存在的特定核酸分子有所區(qū)別。簡并序列指編碼同一氨基酸序列的任何核苷酸序列，可作為參比核苷酸序列，但因遺傳密碼子的簡并性而可能包括不同的核苷酸序列。在另一實(shí)施方式中，一種核酸分子(也稱為多聚核苷酸)編碼本發(fā)明人源化抗體的重鏈；另一種多聚核苷酸編碼本發(fā)明人源化抗體的輕鏈。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明人源化抗體重鏈的多聚核苷酸的序列包括或由SEQ ID NO 22 組成。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明人源化抗體輕鏈的多聚核苷酸的序列包括或由SEQ ID NO 23 組成。在一優(yōu)選實(shí)施方式中，編碼本發(fā)明人源化抗體重鏈和輕鏈的是唯一的多聚核苷酸。本發(fā)明的另一實(shí)施方式是包含編碼上述或下文所述抗體或其一部分的DNA的載體。該載體可以是在任何原核或真核細(xì)胞中的整合或自主復(fù)制和功能化的任何克隆載體或 表達(dá)載體。具體說，該載體可以是質(zhì)粒、粘粒、病毒、曬菌體、游尚體、人造染色體等等。該載體可包含重鏈和輕鏈二者的編碼序列，或重鏈和輕鏈之一的編碼序列。如果該載體包含重鏈和輕鏈二者的編碼序列，重鏈和輕鏈二者各自可操作地連接于啟動(dòng)子。重鏈和輕鏈的啟動(dòng)子可以相同或不同。重鏈和輕鏈也可操作性地連接于一個(gè)啟動(dòng)子，此時(shí)重鏈和輕鏈的編碼序列可優(yōu)選地用一個(gè)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)分開。真核基因表達(dá)的合適啟動(dòng)子為例如本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的衍生于病毒的啟動(dòng)子，如小鼠或人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、小鼠雙向CMV啟動(dòng)子或羅斯肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子。該載體可包含調(diào)控元件,如啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記、復(fù)制起點(diǎn)、絕緣子(insulator)等?？捎酶鞣N方法將合適的核酸序列插入到該載體中。一般來說，用本領(lǐng)域已知技術(shù)將DNA插入到合適的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)中?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)構(gòu)建包含一種或多種這些組分的合適載體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是重組宿主細(xì)胞，所述細(xì)胞包含上述核酸分子/多聚核苷酸或載體。宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。原核細(xì)胞的例子包括細(xì)菌，如大腸桿菌。真核細(xì)胞的例子有酵母菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞，包括任何原代細(xì)胞培養(yǎng)物或已建立的細(xì)胞系(如3T3、Vera、HEK293、TN5細(xì)胞系等)。合適的可表達(dá)糖基化蛋白的宿主細(xì)胞來自多細(xì)胞生物體。有用的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞和COS細(xì)胞。本發(fā)明特別優(yōu)選的哺乳動(dòng)物細(xì)胞是CHO細(xì)胞。如上所述，可用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)，如重組技術(shù)、化學(xué)合成、克隆、連接或它們的組合來產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式是制備本發(fā)明抗體的方法，該方法包括在可表達(dá)所述核酸分子的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細(xì)胞，和回收/分離產(chǎn)生的多肽。產(chǎn)生的多肽可以是糖基化或非糖基化多肽，或可含有其他翻譯后修飾，這取決于所用宿主細(xì)胞的類型。制備本發(fā)明抗體的方法可進(jìn)一步包括將該抗體配制成藥物組合物的步驟。本發(fā)明另一實(shí)施方式是包含本發(fā)明人源化抗體的藥物組合物。較佳為，所述藥物組合物還包含添加的賦形劑，如緩沖劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑等。本發(fā)明的藥物組合物可用于診斷、預(yù)防和/或治療(局部或全身性)銀屑病和其他免疫介導(dǎo)疾病，如銀屑病關(guān)節(jié)炎和特發(fā)性皮炎。本發(fā)明上下文中的術(shù)語“治療”指對疾病進(jìn)程的任何有益作用，包括減弱、減輕、減少或縮減疾病發(fā)作后的病理發(fā)展?？衫盟帉W(xué)上可接受的運(yùn)載體給予本發(fā)明的藥物組合物。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”意指包括不會干擾活性成分的生物學(xué)活性效應(yīng)而且對給予的宿主無毒性的任何運(yùn)載體。例如，對于胃腸道外給藥，可將活性蛋白質(zhì)用運(yùn)載體(如鹽水、葡萄糖溶液、血清白蛋白和林格液)配制成注射用的單位劑量形式。另一方面，本發(fā)明提供用作藥劑的本發(fā)明的藥物組合物。另一方面，本發(fā)明提供治療病人的方法，包括給予病人本發(fā)明的藥物組合物。較佳為所述疾病選自銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎和特發(fā)性皮炎。在另一方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的人源化抗體在制備治療銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎和特發(fā)性皮炎藥劑上的應(yīng)用。本發(fā)明的第一種用法是肺內(nèi)給予本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的第二種用法是鼻內(nèi)給予本發(fā)明的藥物組合物。本發(fā)明的第三種用法是吸入給予本發(fā)明的藥物組合物。 本發(fā)明的第四種用法是口服給予本發(fā)明的藥物組合物。
本發(fā)明的第五種用法是靜脈內(nèi)或肌肉內(nèi)給予本發(fā)明的藥物組合物。在本發(fā)明用法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的藥物組合物是皮下給予的。每天或每隔一天通過上述途徑之一給予本發(fā)明的藥物組合物。對于胃腸道外(如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))給藥，可聯(lián)用藥學(xué)上可接受的胃腸道外運(yùn)載體(如水、鹽水、葡萄糖液)和維持等滲的添加劑(如甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定劑(如防腐劑和緩沖劑)，將本發(fā)明的藥物組合物配制成溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末。可用普遍采用的技術(shù)將這種制劑滅菌。本發(fā)明藥物組合物中的活性成分可以各種方式給予個(gè)體。給藥途徑可包括皮內(nèi)、透皮(如用緩釋劑)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、硬膜外、局部、口服途徑和氣溶膠給藥、鼻內(nèi)途徑或吸入?？刹捎闷渌魏沃委熡行У慕o藥途徑，如通過上皮或內(nèi)皮組織吸收，或通過基因治療將編碼活性劑的DNA分子給予病人(如通過載體)使該活性劑在體內(nèi)表達(dá)和分泌。此外，可將本發(fā)明的藥物組合物與生物學(xué)活性劑的其他組分如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、運(yùn)載體、稀釋劑等一起給予。給予個(gè)體的劑量視各種因素而不同，這些因素包括藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)、給藥途徑、病人的狀況和特征(性別、年齡、體重、健康狀況、塊頭大小)、癥狀的程度、同時(shí)進(jìn)行的治療、治療頻率和所需效果?？筛鶕?jù)所需的使用和/或制備方法優(yōu)選的其他替代形式制備、配制、給予或使用本發(fā)明的抗體。也可將其制備成有用的偶聯(lián)物或復(fù)合物以改善藥物的遞送效率。為此目的，可用例如聚乙二醇和其他天然或合成的聚合物分子將本說明書所述的抗體配制成活性偶聯(lián)物或復(fù)合物形式(Harris JM等.2003)。在這方面，本發(fā)明考慮了化學(xué)修飾的抗體，使該抗體與聚合物相連。這種聚合物通常是水溶性聚合物，因此在水環(huán)境如生理環(huán)境中該偶聯(lián)物不會沉淀。而且可采用混合的聚合物來制備偶聯(lián)物。用于治療的偶聯(lián)物可包含藥物上可接受的水溶性聚合物。合適的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、單甲氧基-PEG、芳氧基-PEG、碳酸雙琥珀酰亞胺PEG、丙二醇均聚物、聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纖維素或其他碳水化合物基聚合物。合適的PEG分子量為約600至約60，000，例如包括5，000、12，000,20, 000和25，000。偶聯(lián)物還可包含水溶性聚合物的混合物。偶聯(lián)物的例子包括上述任何抗體與附著在其N-末端的氧化聚烷基部分。PEG是一種合適的多烷氧化物。如圖解說明，本說明書所述的任何抗體均可用PEG修飾，此過程稱為“PEG化”?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何PEG化反應(yīng)進(jìn)行PEG化(Francis GE等.1998)。例如,利用反應(yīng)活性的聚乙二醇分子通過酰化反應(yīng)或燒化反應(yīng)進(jìn)行PEG化。較佳為，所有這些修飾不顯著影響抗體結(jié)合人IL-22RA的能力。本發(fā)明還包括功能上與上述抗體等價(jià)的、重組人源化抗人IL-22RA抗體。還包括提供改善的穩(wěn)定性和/或治療效果的經(jīng)修飾的人源化抗體。經(jīng)修飾的抗體的例子包括不會顯著有害地改變抗原結(jié)合用途的含有保守性氨基酸殘基置換和一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失或添加的抗體。置換的范圍從一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的改變或修飾到完全重新設(shè)計(jì)一個(gè)區(qū)域，只要能維持其治療用途。本發(fā)明的人源化抗體可在翻譯后修飾(如乙酰化和磷酸化)或可合成修飾(如附著標(biāo)記基團(tuán))。應(yīng)明白，本方法設(shè)計(jì)的人源化抗體可含有不會實(shí)質(zhì)性影響其抗原結(jié)合或其他免疫球蛋白功能的額外保守性氨基酸置換。本發(fā)明的人源化抗體可包括經(jīng)修飾的衍生物，例如但不限于經(jīng)糖基化、乙?；EG化、磷酸化、酰胺化、用已知的保護(hù)/封閉基團(tuán)、蛋白水解切割、連接于細(xì)胞配體或其他蛋白等衍生化修飾的人源化抗體的衍生物。此外，這種衍生物可包含一個(gè)或多個(gè)非經(jīng)典和/或非天然的氨基酸?？赏ㄟ^修飾(如置換、刪除或添加)經(jīng)鑒定參與Fe區(qū)與FcRn受體之間相互作用的氨基酸殘基來延長本發(fā)明人源化抗體的體內(nèi)半衰期。本說明書引用的所有參考文獻(xiàn)，包括雜志的文章或摘要、公布或未公布的美國或外國專利申請、審定的美國或外國專利或任何其他參考文獻(xiàn)均整體引用納入本說明書，包括引用參考文獻(xiàn)的所有數(shù)據(jù)、表格、附圖和正文。此 外，所引參考文獻(xiàn)中引用文獻(xiàn)的全部內(nèi)容也納入本說明書作為參考。以上所述的具體實(shí)施方式
將非常全面地揭示本發(fā)明的總體實(shí)質(zhì)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可運(yùn)用本領(lǐng)域的知識(包括本說明書所引參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)，無需過多實(shí)驗(yàn)，即可容易地修改和/或改編具體實(shí)施方式
用于各種用途而不背離本發(fā)明的總概念。因此，基于本說明書的教導(dǎo)和指引，這樣的改編和修改意味著仍在與本說明書公開的實(shí)施方式等同的含義和范圍內(nèi)。應(yīng)理解，本說明書的用語或術(shù)語目的在于說明而非限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例I :選擇作人源化加工的起始抗體比較了在2005年10月21日提交的PCT專利申請WO 2006/047249實(shí)施例18中描述的5個(gè)雜交瘤所表達(dá)的小鼠抗-人IL-22RA單克隆抗體，以選出一個(gè)用作人源化加工的起始點(diǎn)。最重要的選擇標(biāo)準(zhǔn)是對人IL-22RA親和力高，與小鼠IL-22RA有交叉反應(yīng)，與IL-22BP無交叉反應(yīng)和對人IL-22RA無激動(dòng)活性。只有一種抗體符合上述所有標(biāo)準(zhǔn)(資料未顯示)，即稱為280. 46. 3. 4 (ATCC專利保藏登錄號PTA-6284)的雜交瘤所表達(dá)的抗體，它是小鼠IgGl/K抗體。SEQ ID NO 25和26分別為此小鼠抗-人IL-22RA單克隆抗體(下文稱為“小鼠280. 46. 3. 4”)的重鏈和輕鏈(分別稱為VH和VL)可變區(qū)的特定氨基酸序列。實(shí)施例2 :重新整形的人源化280. 46. 3. 4可變區(qū)的設(shè)計(jì)A.同源人框架序列的詵擇利用MGT-GENE數(shù)據(jù)庫(Giudicelli V.等.2005)，通過比較氨基酸序列鑒定人種系系K輕鏈可變區(qū)，其整個(gè)序列(框架和⑶R)顯示與小鼠280. 46. 3. 4VL序列具有高百分比的相同。小鼠280. 46. 3. 4VL與人免疫球蛋白κ輕鏈可變區(qū)基因4_1 (IGKV4-1)最同源，顯示相同性為82.2% (101個(gè)氨基酸殘基有83個(gè)相同；圖I)。因此選擇IGKV4-1 (其序列為SEQ ID NO :27)作為CDR-移植用的受者人框架序列。對于小鼠280. 46. 3. 4VH，利用IMGT-GENE數(shù)據(jù)庫未鑒定到與人種系系有高百分比相同。人種系系免疫球蛋白的重鏈可變區(qū)基因1-46 (IGHV1-46)經(jīng)鑒定有最高的同源性，60. 2%相同(98個(gè)氨基酸殘基有59個(gè)相同)。然而，有效選出IGHV3-66(其序列為SEQ ID NO 28)作為受者人框架序列，盡管其同源性最低(50.0%相同，98個(gè)氨基酸殘基有49個(gè)相同；圖2)，因?yàn)樵谠S多重要的框架位置它的序列接近小鼠280. 46. 3. 4VH的序列，從而可能提供良好的穩(wěn)定性。B.框架區(qū)的氨基酸置換B. I 輕鏈人源化280. 46. 3. 4VL抗體設(shè)計(jì)的下一步是將小鼠280. 46. 3. 4VL的⑶R連入人種系IGKV4-1的框架區(qū)(FR)內(nèi)。用連接免疫球蛋白K鏈I的人種系基因(IGKJl)代替小鼠J基因。在第一版改形的人源化280. 46. 3. 4VL(280.VK4-1-C，其序列為SEQ ID NO 29)中，人的FR中沒有改變，即該FR中沒有小鼠的殘基被認(rèn)為對于結(jié)構(gòu)至關(guān)重要。IGKV4-1與第一版人源化280. 46. 3. 4VL(280. VK4-1-C)之間的序列排列對比見圖3。B. 2 重鏈人源化280. 46. 3. 4VH設(shè)計(jì)加工的下一步是將小鼠280. 46. 3. 4VH中的⑶R連入人種系IGHV3-66的FR中。在第一版改形的 人源化280. 46. 3. 4VH(280. VH3-66. 1，其序列為SEQ ID NO :30)中，人框架區(qū)中有12處改變(圖4)。人FR中的這12處改變是27、28、29、30、48、49、67、69、70、71、73和78位氨基酸(見表I中的編號)。表I.導(dǎo)致人源化280. 46. 3. 4VH設(shè)計(jì)的氨基酸序列對比第一行(Kabat編號)給出了按照Kabat規(guī)定的殘基號碼(Kabat等· 1991)。FR和CDR分別標(biāo)識重鏈可變區(qū)的框架區(qū)(H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4)和互補(bǔ)決定區(qū)(H-CDR1、H-⑶R2和H-⑶R3)，三個(gè)⑶R分開4個(gè)FR。第二欄(Chothia編號)給出了按照Chothia的CDR定義的殘基號碼(Al-Lazikani等· 1997)。第三欄(小鼠280. 46. 3. 4VH)給出了小鼠280. 46. 3. 4的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。第四欄(IGHV3-66)給出了人種系免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因3-66(登錄號MGT X92218)用作CDR移植的受者人框架。第五欄(人源化280. VH3-66-46)給出了小鼠280. 46. 3. 4VH的最終人源化版本的氨基酸序列；有下劃線的殘基表不不同于人種系IGHV3-66的氨基酸。
Kabat 編號 Chothia 編號小鼠 280.46.3.4 VH IGHV3-66 OQft_
280.VH3-66-46
11 EEE
22 VVV_3__3__Q__Q__Q_
44LLL
55 _Q__V__V_
66__Q__E__E_
77SSS
88GG__G_
99PGG
1010EG _G_
1111LLL
1212VV__V_
1313__R__Q__Q_
1414PPP
1515GGG
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合人IL-22RA的人源化抗體，包含 a)含有分別由氨基酸序列SEQID NO :1、2和3組成的H-CDR1、H_CDR2和H-CDR3的重鏈可變區(qū)，和 b)含有分別由氨基酸序列SEQID NO :4、5和6或分別由氨基酸序列SEQ ID NO :4、5和7組成的L-CDRl、L-CDR2和L-CDR3的輕鏈可變區(qū)。
2.如權(quán)利要求I所述的人源化抗體，其中 a)所述重鏈可變區(qū)包含分別由氨基酸序列SEQID NO :8、9、10和11組成的框架區(qū)H-FRl、H-FR2、H-FR3 和 H-FR4 ;和 b)所述輕鏈可變區(qū)包含分別由氨基酸序列SEQID NO : 12、13、14和15組成的框架區(qū)L-FRl、L-FR2、L-FR3 和 L-FR4。
3.如權(quán)利要求I或2所述的人源化抗體，其中 a)所述重鏈可變區(qū)由氨基酸序列SEQID NO 16組成； b)所述輕鏈可變區(qū)由氨基酸序列SEQID NO 17組成。
4.如權(quán)利要求1-3中任何一項(xiàng)所述的人源化抗體，其中所述抗體包含 a)由氨基酸序列SEQID NO 18組成的重鏈恒定區(qū)；和 b)由氨基酸序列SEQID NO 19組成的輕鏈恒定區(qū)。
5.一種結(jié)合人IL-22RA的人源化抗體，其包含由氨基酸序列SEQ ID NO :20組成或包括氨基酸序列SEQ ID NO :20的重鏈和由氨基酸序列SEQ ID NO :21組成或包括氨基酸序列SEQ ID NO 21 的輕鏈。
6.ー種編碼權(quán)利要求5所述人源化抗體的重鏈的多聚核苷酸。
7.如權(quán)利要求6所述的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸的包括序列SEQID NO:22或由序列SEQ ID NO 22組成。
8.ー種編碼權(quán)利要求5所述人源化抗體的輕鏈的多聚核苷酸。
9.如權(quán)利要求8所述的多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包括序列SEQID NO:23或由序列SEQ ID NO 23組成。
10.ー種編碼權(quán)利要求5所述人源化抗體的重鏈和輕鏈的多聚核苷酸。
11.ー種表達(dá)載體,包含 a)權(quán)利要求6或7所述的多聚核苷酸,和 b)權(quán)利要求8或9所述的多聚核苷酸。
12.—種包含權(quán)利要求10所述多聚核苷酸的表達(dá)載體。
13.一種用權(quán)利要求11或12所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求13所述的宿主細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是CHO細(xì)胞。
15.—種制備權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的人源化抗體的方法，其中所述方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求13或14所述的宿主細(xì)胞，和分離所述抗體。
16.ー種藥物組合物，包含權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的人源化抗體，或按權(quán)利要求15所述方法制備的人源化抗體。
17.用作藥物的權(quán)利要求1-5任何一項(xiàng)所述的人源化抗體或按權(quán)利要求15所述方法制備的人源化抗體。
18.用于治療銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎或特發(fā)性皮炎的如權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的人源化抗體或按權(quán)利要求15所述方法制備的人源化抗體。
19.權(quán)利要求1-5中任何一項(xiàng)所述的人源化抗體或按權(quán)利要求15所述方法制備的人源化抗體在制備治療銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎或特發(fā)性皮炎的藥物上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人IL-22RA的人源化抗體及它們在治療銀屑病和其他免疫-介導(dǎo)疾病如銀屑病關(guān)節(jié)炎和特發(fā)性皮炎中的應(yīng)用。
文檔編號A61P37/00GK102665759SQ201080052724
公開日2012年9月12日 申請日期2010年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月19日
發(fā)明者C·約翰遜-萊杰, R·貝克曼 申請人:默克雪蘭諾有限公司