專利名稱：Pcsk9拮抗劑的制作方法
PCSK9拮抗劑相關(guān)申請的交叉引用本申請要求申請日為2009年12月11日的美國臨時專利申請61/285，942的優(yōu)先權(quán)，并將其為了所有的目的以引用的方式并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及抗PCSK9的抗體拮抗劑。
背景技術(shù)：
低密度脂蛋白受體(LDL-R)通過清除血液中的低密度脂蛋白(LDL)預(yù)防動脈粥樣硬化和高膽固醇血癥。LDL-R在翻譯后水平受蛋白原轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/kexin型9a(subtilisin/kexin type 9a, “PCSK9”)的調(diào)節(jié)。最近，報道了小鼠中 PCSK9 的敲除。這些小鼠表現(xiàn)出血漿膽固醇水平降低了約50%，和表現(xiàn)出對他汀類藥物(statins)在降低血漿膽固醇中增強的敏感性(Rashid S，等(2005)Proc Natl Acad Sci 102:5374-5379)。人類遺傳數(shù)據(jù)也支持PCSK9在LDL體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的作用。最近，鑒定出了兩個突變，其可能是PCSK9 “功能喪失性”突變。具有這些突變的個體中的血漿LDL-C水平降低約40%，這轉(zhuǎn)化為約50-90%的冠心病減少?？傊?，這些研究顯示，PCSK9的抑制劑對于血漿LDL-C濃度的降低和其它由PCSK9介導(dǎo)的疾病是有益的，并可以，例如與用于降低膽固醇的第二藥，共同用藥來增強功效。發(fā)明概述本發(fā)明提供了與蛋白原轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/kexin型9 (PCSK9) H^MnSEQ IDNO:47)結(jié)合并拮抗其功能的抗體，和使用這樣的抗體的方法，例如以治療PCSK9介導(dǎo)的疾病狀況。在一個方面，本發(fā)明提供了與蛋白原轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/kexin型9 (PCSK9)結(jié)合的抗體和抗原結(jié)合分子。在一些實施方案中，所述抗體a)不阻斷PCSK9與低密度脂蛋白受體(LDLR)的結(jié)合，和b)抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解。在一些實施方案中，抗體或抗原結(jié)合分子與人PCSK9的第680-692位殘基中的至少一個氨基酸結(jié)合。例如，在一些實施方案中，抗體或抗原結(jié)合分子與氨基酸序列RSRHLAQASQELQ(SEQ ID NO:49)中的 PCSK9 的表位結(jié)合。在一些實施方案中，抗體或抗原結(jié)合分子與人PCSK9結(jié)合的平衡解離常數(shù)(KD)為約500pM或更低。例如，在一些實施方案中，抗體或抗原結(jié)合分子與人PCSK9結(jié)合的平衡解離常數(shù)(KD)為約 400pM、300pM、250pM、200pM、190pM、180pM、170pM、160pM、150pM、140pM 或更低。在一些實施方案中，抗體或抗原結(jié)合分子的體內(nèi)半衰期為至少約7天。在一些實施方案中，抗體或抗原結(jié)合分子的體內(nèi)半衰期為至少約3、4、5、6、7、8、9、10天。在一些實施方案中，抗體或抗原結(jié)合分子的體內(nèi)降膽固醇功效為至少約2周，例如2、3、4周或更長。優(yōu)選，該體內(nèi)半衰期是在人受試者中確定的。
在一些實施方案中，抗體包括(a)重鏈可變區(qū)，其包括人重鏈V片段、重鏈互補決定區(qū)3(⑶R3)和重鏈構(gòu)架區(qū)4(FR4)，以及(b)輕鏈可變區(qū)，其包括人輕鏈V片段、輕鏈⑶R3和輕鏈FR4，其中i)重鏈 CDR3 包含氨基酸序列 SYYYY (A/N) MD (A/F/S/V/Y) (SEQ IDNO: 14);以及ii)輕鏈CDR3可變區(qū)包含氨基酸序列LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)。
在一些實施方案中，抗體包括(a)重鏈可變區(qū)，其包括人重鏈V片段、重鏈互補決定區(qū)3(⑶R3)和重鏈構(gòu)架區(qū)4(FR4)，以及(b)輕鏈可變區(qū)，其包括人輕鏈V片段、輕鏈⑶R3和輕鏈FR4，其中i)重鏈 CDR3 包含氨基酸序列 SYYYYNMDY(SEQ ID NO: 12);以及ii)輕鏈CDR3可變區(qū)包含氨基酸序列LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)。在一些實施方案中，抗體包括(a)重鏈可變區(qū)，其包括人重鏈V片段、重鏈互補決定區(qū)3(⑶R3)和重鏈構(gòu)架區(qū)4(FR4)，以及(b)輕鏈可變區(qū)，其包括人輕鏈V片段、輕鏈⑶R3和輕鏈FR4，其中i)重鏈 CDR3 包含氨基酸序列 SYYYYAMDY(SEQ ID NO: 13);以及ii)輕鏈CDR3可變區(qū)包含氨基酸序列LQWSSDPPT (SEQ ID NO: 26)。在一些實施方案中，重鏈CDR3包含選自SEQ ID N0:12和SEQ ID N0:13的氨基酸序列；輕鏈⑶R3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在一些實施方案中，重鏈V片段與SEQ ID NO: 28具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性，且其中輕鏈 V 片段與 SEQ ID NO: 31具有至少 85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。在一些實施方案中，重鏈V片段與SEQ ID NO: 27具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，且其中輕鏈V片段與選自SEQ IDNO: 29 和 SEQ ID NO: 30 的氨基酸具有至少 85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施方案中，重鏈FR4為人種系FR4。在一些實施方案中，重鏈FR4為SEQID N0:35。在一些實施方案中，輕鏈FR4為人種系FR4。在一些實施方案中，輕鏈FR4為SEQID N0:39。在一些實施方案中，重鏈V片段和輕鏈V片段各包括互補決定區(qū)I (OTRl)和互補決定區(qū)2(CDR2);其中:i)重鏈V片段的⑶Rl包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；ii)重鏈V片段的⑶R2包含SEQ ID NO: 11的氨基酸序列；iii)輕鏈V片段的CDRl包含SEQ ID NO: 22的氨基酸序列；以及iv)輕鏈V片段的CDR2包含SEQ ID NO: 25的氨基酸序列。在一些實施方案中，重鏈V片段和輕鏈V片段各包括互補決定區(qū)I (OTRl)和互補決定區(qū)2(CDR2);其中:
i)重鏈V片段的⑶Rl包含SEQ ID NO: 7的氨基酸序列；ii)重鏈V片段的⑶R2包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；iii)輕鏈V片段的CDRl包含SEQ ID NO: 21的氨基酸序列；以及iv)輕鏈V片段的CDR2包含SEQ ID NO: 24的氨基酸序列。在一些實施方案中i)重鏈 V 片段的 CDRl 包含 SEQ ID NO: 7 ；ii)重鏈 V 片段的 CDR2 包含 SEQ ID NO: 10 ；iii)重鏈CDR3包含選自SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；iv)輕鏈 V 片段的 CDRl 包含 SEQ ID NO: 21 ；V)輕鏈V片段的CDR2包含SEQ ID NO: 24 ；以及vi)輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:26。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)與SEQ ID勵:40的可變區(qū)具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一1注，輕鏈可變區(qū)與SEQID N0:41的可變區(qū)具有至少90%的氨基酸序列同一性。在一些實施方案中，抗體包括包含SEQ ID NO:40的重鏈和包含SEQ ID N0:41的輕鏈。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)與選自SEQ ID N0:2和SEQ IDN0:4的可變區(qū)具有至少 85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性，輕鏈可變區(qū)與選自SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 18的可變區(qū)具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的氨基酸序列同一性。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID N0:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID N0:16和SEQ ID N0:18的氨基酸序列。在一些實施方案中，抗體為IgG。在一些實施方案中，抗體為IgGl。在一些實施方案中，抗體的重鏈與選自SEQ ID N0:3和SEQ ID NO:5的氨基酸具有至少85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。在一些實施方案中，抗體的輕鏈與選自 SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 19 的氨基酸具有至少 85%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性。在一些實施方案中，抗體為FAb’片段。在一些實施方案中，抗體為單鏈抗體(scFv)。在一些實施方案中，抗體包含人恒定區(qū)。在一些實施方案中，抗體包含人IgGl恒定區(qū)。在一些實施方案中，將人IgGl恒定區(qū)突變，使其對例如細胞上的Fe受體(FcR)(例如Fe Y Rl)等效應(yīng)子配體，或補體的Cl組分具有降低的結(jié)合親和性。見例如美國專利號5，624，821。在一些實施方案中，IgGl恒定區(qū)的氨基酸殘基L234和L235被取代為Ala234和Ala235。重鏈恒定區(qū)中殘基的編號為EU索引(見，Kabat,等，(1983) “Sequences ofProteins of Immunological Interest，，, U. S. Dept. Health and Human Services)中的編號。在一些實施方案中，將抗體與載體蛋白(例如，白蛋白)連接。在一些實施方案中，抗體被聚乙二醇化。
在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了與PCSK9結(jié)合的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)各包含下列3個互補決定區(qū)(⑶Rs):⑶R1、CDR2 和 CDR3 ;其中:i)重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列；ii)重鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQ I D NO: 11的氨基酸序列；iii)重鏈可變區(qū)的⑶R3包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列；iv)輕鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列；V)輕鏈可變區(qū)的CDR2包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列；vi)輕鏈可變區(qū)的⑶R3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；在一些實施方案中i)重鏈可變區(qū)的CDRl包含選自SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列；ii)重鏈可變區(qū)的⑶R2包含選自SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；iii)重鏈可變區(qū)的CDR3包含選自SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；iv)輕鏈可變區(qū)的CDRl包含選自SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列；V)輕鏈可變區(qū)的CDR2包含選自SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列；vi)輕鏈可變區(qū)的CDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了與PCSK9結(jié)合的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)各包含下列3個互補決定區(qū)(⑶Rs):⑶R1、CDR2 和 CDR3 ;其中:i)重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；ii)重鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；iii)重鏈可變區(qū)的CDR3包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；iv)輕鏈可變區(qū)的CDRl包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列；V)輕鏈可變區(qū)的CDR2包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列；vi)輕鏈可變區(qū)的⑶R3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了與PCSK9結(jié)合的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)各包含下列3個互補決定區(qū)(⑶Rs):⑶R1、CDR2 和 CDR3 ;其中:i)重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；ii)重鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；iii)重鏈可變區(qū)的⑶R3包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列；iv)輕鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；V)輕鏈可變區(qū)的CDR2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；vi)輕鏈可變區(qū)的⑶R3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了與PCSK9結(jié)合的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)各包含下列3個互補決定區(qū)(⑶Rs):⑶R1、CDR2 和 CDR3 ;其中:i)重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列；ii)重鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；iii)重鏈可變區(qū)的CDR3包含SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；iv)輕鏈可變區(qū)的CDRl包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列；
v)輕鏈可變區(qū)的CDR2包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列；vi)輕鏈可變區(qū)的⑶R3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在另一方面，本發(fā)明提供了組合物，所述組合物包含如本文中描述的抗體或抗原結(jié)合分子，以及生理相容性賦形劑。在一些實施方案中，組合物還包含降低個體中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平
的第二藥。在一些實施方案中，第二藥為他汀類藥。例如，該他汀類藥可以選自阿托伐他汀(atorvastatin)、西立伐他汀(cerivastatin)、氟伐他汀(fIuvastatin)、洛伐他汀(Iovastatin)、美伐他汀(mevastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀(pravastatin)、瑞舒伐他汀(rosuvastatin)和辛伐他汀(simvastatin)。在一些實施方案中，第二藥選自貝特類藥(fibrates)、煙酸(niacin)及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoBlOO的抑制性核酸。在另一方面，本發(fā)明提供了在有需要的個體中降低LDL-C、非HDL-C和/或總膽固醇的方法，所述方法包括給個體施用治療上有效量的如本文中描述的抗體或抗原結(jié)合分子。在一些實施方案中，個體對他汀類藥治療具有低反應(yīng)性或具有抗性。在一些實施方案中，個體不耐受他汀類藥治療。在一些實施方案中，個體的基線LDL-C水平為至少約 100mg/dL，例如，至少約 110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL 或更高。在一些實施方案中，個體患有家族性高膽固醇血癥。在一些實施方案中，個體患有甘油三酯血癥(triglyceridemia)。在一些實施方案中，個體具有功能獲得性(gain_of-function)PCSK9基因突變。在一些實施方案中，個體患有藥物誘發(fā)性血脂異常。在一些實施方案中，總膽固醇隨LDL-C —起降低。在一些實施方案中，方法還包括給個體以治療上有效的量施用在降低LDL-C上有效的第二藥。在一些實施方案中，第二藥為他汀類藥。例如，該他汀類藥可以選自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。在一些實施方案中，第二藥選自貝特類藥(fibrates)、煙酸(niacin)及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoBlOO的抑制性核酸。在一些實施方案中，將抗體或抗原結(jié)合分子與第二藥作為混合物共施用。在一些實施方案中，將抗體或抗原結(jié)合分子與第二藥以分開的方式共施用。在一些實施方案中，抗體進行靜脈內(nèi)給藥。在一些實施方案中，抗體進行皮下給藥。定義“抗體”指免疫球蛋白家族的多肽或包含免疫球蛋白的片段的多肽，其能夠非共價地、可逆地和以特異性的方式結(jié)合相應(yīng)的抗原。一個示例性的抗體結(jié)構(gòu)單元包括四聚體。每個四聚體由相同的兩對多肽鏈組成，每對具有通過二硫鍵連接的一條“輕”鏈(約25kD)和一條“重”鏈(約50_70kD)。公認的免疫球蛋白基因包括K、入、a、Y、S、e和ii恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈分類為K或V。重鏈分類為Y、ii、a、6或e，它們又分別定義了免疫球蛋白的類別，IgG, IgM, IgA, IgD和IgE。每條鏈的N端定義約100至110個或更多個氨基酸的可變區(qū)，其主要負責(zé)抗原識別。術(shù)語可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指輕鏈和重鏈的這些區(qū)域。如在本申請中使用的，“抗體”包括具有特異于例如PCSK9的特定結(jié)合力的、抗體及其片段的所有變型形式。因此，該概念涵蓋全長抗體、嵌合抗體、人源化抗體、單鏈抗體(ScFv)、Fab、Fab’以及這些片段的具有相同結(jié)合特異性的多聚體形式(例如，F(xiàn)(ab’)2)?！盎パa決定結(jié)構(gòu)域”或“互補決定區(qū)(⑶Rs) ”可互換使用，指VL和VH的超可變區(qū)。CDRs是抗體鏈的靶標蛋白結(jié)合位點，包含對該靶標蛋白的特異性。在每一人的VL或VH中都有3個⑶Rs (⑶R1-3，從N端開始順序編號)，占可變結(jié)構(gòu)域的約15_20%。⑶Rs在結(jié)構(gòu)上與靶標蛋白的表位互補，因此直接負責(zé)結(jié)合的特異性。VL或VH中其余的區(qū)段，即所謂的構(gòu)架區(qū)，在氨基酸序列上顯示出較低的變化性(Kuby, Immunology,第4版，第4章 W. H. Freeman&Co. , New York, 2000)。 可以使用各種本領(lǐng)域公知的定義，確定⑶Rs和構(gòu)架區(qū)的位置，例如Kabat、Chothia、國際 ImMunoGeneTics 數(shù)據(jù)庫(IMGT)(于萬維網(wǎng) imgt. cines. fr/ 上)和 AbM(見，例如,Johnson 等,Nucleic Acids Res. , 29:205-206(2001);Chothia 和 Lesk, J. Mol.Biol.，196:901-917(1987);Chothia 等,Nature, 342:877-883(1989);Chothia 等,J.Mol. Biol.，227:799-817(1992);Al-Lazikani 等，J. Mol. Biol.，273:927-748(1997)).抗原結(jié)合位點的定義也描述于Ruiz等，Nucleic Acids Res. , 28:219 - 221(2000);和 Lefranc, M. P.，Nucleic Acids Res.，29:207-209(2001);MacCalIum 等，J. Mol.Biol. , 262:732-745 (1996);和 Martin 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:9268 -9272(1989);Martin 等，Methods Enzymol. ,203:121 - 153(1991);和 Rees 等，于Sternberg M. J. E.(編輯)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(Protein Structure Prediction),牛津大學(xué)出版社，Oxford, 141 - 172 (1996)中。術(shù)語“結(jié)合特異性決定簇”或“BSD”可互換使用，指決定抗體的結(jié)合特異性所必需的互補決定區(qū)內(nèi)最少的連續(xù)或非連續(xù)的氨基酸序列。最小結(jié)合特異性決定簇可以位于一個或多個CDR序列中。在一些實施方案中，最小結(jié)合特異性決定簇位于抗體重鏈和輕鏈的部分或全長⑶R3序列中(即僅由其決定)。如本文中使用的“抗體輕鏈”或“抗體重鏈”指分別包含VL或VH的多肽。內(nèi)源VL由基因片段V (可變)和J (連接)編碼，內(nèi)源VH由V、D (多樣性)和J編碼。每個VL或VH包括CDRs以及構(gòu)架區(qū)。在本申請中，抗體輕鏈和/或抗體重鏈有時可以統(tǒng)稱為“抗體鏈”。這些術(shù)語涵蓋包含突變的抗體鏈，所述突變，如本領(lǐng)域技術(shù)人員容易明了的，不干擾VL或VH的基本結(jié)構(gòu)?？贵w可以作為完整的免疫球蛋白存在，或作為多種已被充分表征的片段存在，所述片段通過用各種肽酶進行消化而產(chǎn)生。因此，例如，胃蛋白酶在鉸鏈區(qū)中于二硫鍵下方消化抗體，產(chǎn)生F(ab) ’ 2，即Fab’的二聚體，F(xiàn)ab’本身是通過二硫鍵連接到VH-CHl的輕鏈?？梢栽跍睾蜅l件下還原F (ab) ’ 2，以打開鉸鏈區(qū)中的二硫鍵，由此將F(ab) ’ 2 二聚體轉(zhuǎn)化為Fab’單體。Fab’單體本質(zhì)上是具有部分絞鏈區(qū)的Fab。Paul, Fundamental Immunology第3版.(1993)。盡管各種抗體片段是以完整抗體的消化來進行定義的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員明了，這樣的片段可以通過化學(xué)方法或使用重組DNA方法從頭合成。因此，如本文中使用的，術(shù)語“抗體”也包括通過完整抗體的修飾而產(chǎn)生的抗體片段，或使用重組DNA方法從頭合成的抗體片段(例如，單鏈Fv)、或使用噬菌體展示文庫鑒定的抗體片段(見，例如，McCafferty 等，Nature 348:552-554 (1990))。
可以使用本領(lǐng)域已知的任何技術(shù)制備單克隆或多克隆抗體(見，例如，Kohler和Milstein, Nature 256:495-497(1975);Kozbor 等，Immunology Today 4:72(1983);Cole等，單克隆抗體和癌癥治療(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy),第 77-96頁 Alan R. Liss, Inc. 1985)?？梢詫τ糜诋a(chǎn)生單鏈抗體的技術(shù)(美國專利號4，946，778)進行適應(yīng)性調(diào)整，以產(chǎn)生抗本發(fā)明多肽的抗體。也可以使用轉(zhuǎn)基因小鼠或其它生物體(例如其它哺乳動物)來表達人源化抗體。備選地，可以使用噬菌體展示技術(shù)來鑒定與所選擇的抗原特異結(jié)合的抗體和異聚體Fab片段(見，例如，McCafferty等，同上；Marks等，Biotechnology, 10:779-783，(1992))。用于將非人抗體人源化或靈長類化(primatizing)的方法在本領(lǐng)域公知。通常，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常被稱為輸入性殘基，其一般取自輸入性可變結(jié)構(gòu)域?？梢曰旧习凑誛inter及其同事的方法(見，例如，Jones 等，Nature 321:522-525 (1986) ; Riechmann 等，Nature332:323-327(1988);Verhoeyen 等,Science 239:1534-1536 (1988)和 Presta,Curr.Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992))，通過以嚙齒類動物的CDRs或CDR序列替換人抗體的相應(yīng)序列來進行人源化。因此，這樣的人源化抗體是嵌合抗體(美國專利號4，816，567)，其中實質(zhì)性小于完整的人可變結(jié)構(gòu)域被來自非人物種的相應(yīng)序列替代。實踐中，人源化抗體一般是人抗體，其中一些互補決定區(qū)(“⑶R”)殘基和可能地一些構(gòu)架區(qū)(“FR”)殘基被來自嚙齒動物抗體中的類似位點的殘基替代?！扒逗峡贵w”是這樣的抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替代或交換，以致抗原結(jié)合位點(可變區(qū))連接到具有不同的或改變了的類別、效應(yīng)子功能和/或物種的恒定區(qū)上，或連接到完全不同的分子上，所述分子賦予嵌合抗體新的特性，這些分子例如酶、毒素、激素、生長因子和藥物；或(b)可變區(qū)或其部分被改變、替代或交換為具有不同的或改變了的抗原特異性的可變區(qū)。本發(fā)明的抗體或抗原結(jié)合分子還包括與其它蛋白質(zhì)化學(xué)綴合或表達為融合蛋白的一個或多個免疫球蛋白鏈。也包括雙特異性抗體。雙特異性或雙功能抗體是人工雜種抗體，其具有不同的兩對重/輕鏈和兩個不同的結(jié)合位點。本發(fā)明的其它抗原結(jié)合片段或抗體部分包括二價scFv(diabody)、雙特異性scFv抗體(其中該抗體分子識別兩個不同的表位)、單結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dAbs)和微型抗體(minibodies)。本文中描述的各種抗體或抗原結(jié)合片段可以通過對完整抗體的酶促或化學(xué)修飾來產(chǎn)生，或使用重組DNA方法從頭合成(例如，單鏈Fv)，或使用噬菌體展示文庫來鑒定(見，例如，McCafferty等，Nature 348:552-554，1990)。例如，可以使用本領(lǐng)域描述的方法，例如Vaughan和Sollazzo, Comb Chem High Throughput Screen. 4:417-302001,產(chǎn)生微型抗體?？梢酝ㄟ^多種方法產(chǎn)生雙特異性抗體，所述方法包括雜交瘤的融合或Fab’片段的連接。見，例如 Songsivilai 和 Lachmann, Clin. Exp. Tmmuno1. 79:315-321 (1990) ; Kostelny等，J. Immunol. 148，1547-1553(1992)?？梢允褂脮窬w展示文庫、核糖體展示文庫、或基因改組文庫，鑒定單鏈抗體。這樣的文庫可以從合成的、半合成的或天然的具免疫能力的來源構(gòu)建?！扒逗峡贵w”是這樣的抗體分子，其中(a)恒定區(qū)或其部分被改變、替代或交換，以致抗原結(jié)合位點(可變區(qū))連接到具有不同的或改變了的類別、效應(yīng)子功能和/或物種的恒定區(qū)，或連接到完全不同的分子，所述分子賦予嵌合抗體新的特性，這些分子例如酶、毒素、激素、生長因子和藥物等；或(b)可變區(qū)或其部分被改變、替代或交換為具有不同的或改變了的抗原特異性的可變區(qū)。例如，如下文實施例中所示，小鼠抗PCSK9抗體可以通過將用來自人免疫球蛋白的恒定區(qū)替代其恒定區(qū)，進行修飾。由于用人恒定區(qū)進行替代，嵌合抗體能保留其識別人PCSK9的特異性，而與原來的鼠抗體相比較，其在人中的抗原性降低。術(shù)語“抗原結(jié)合分子”或“非抗體配體”指使用非免疫球蛋白的蛋白質(zhì)支架的抗體模擬物，其包括adnectins、avimers、單鏈多肽結(jié)合分子和抗體樣結(jié)合擬肽。術(shù)語“可變區(qū)”或“V區(qū)”可互換使用，指包含F(xiàn)R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的重鏈或輕鏈。見圖I。內(nèi)源可變區(qū)由免疫球蛋白重鏈V-D-J基因或輕鏈V-J基因編碼。V區(qū)可以是天然存在的、重組的或合成的。如本文中使用的，術(shù)語“可變片段”或“V片段”可互換使用，指包括FRl-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3的可變區(qū)子序列。見圖I。內(nèi)源V片段由免疫球蛋白V基因編碼。V片段可以是天然存在的、重組的或合成的。如本文中使用的，術(shù)語“J片段”指編碼的可變區(qū)的子序列，其包含CDR3和FR4的C端部分。內(nèi)源J片段由免疫球蛋白J基因編碼。見圖I。J片段可以是天然存在的、重組的或合成的?！叭嗽椿笨贵w是保留了非人抗體的反應(yīng)性而在人中具有較低的免疫原性的抗體。這可以例如通過保留非人⑶R區(qū)和將抗體的其余部分用它們的人對應(yīng)物進行替代來實現(xiàn)。見,例如,Morrison 等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984) ;Morrison 和
0i,Adv. Immunol. , 44:65-92 (1988) ; Verhoeyen 等,Science, 239:1534-1536 (1988) ; Padlan,Molec. Tmmun. , 28:489-498(1991);Padlan, Molec. Tmmun. , 31(3):169-217(1994)。術(shù)語“相應(yīng)的人種系序列”指編碼人可變區(qū)氨基酸序列或子序列的核酸序列，該編碼的可變區(qū)氨基酸序列或子序列，與所有其它已知的由人種系免疫球蛋白可變區(qū)序列編碼的可變區(qū)氨基酸序列相比，與參考可變區(qū)氨基酸序列或子序列具有最高的確定的氨基酸序列同一性。相應(yīng)的人種系序列也可以指，該人可變區(qū)氨基酸序列或子序列，與所有其它評估的可變區(qū)氨基酸序列相比，與參考可變區(qū)氨基酸序列或子序列具有最高氨基酸序列同一性。相應(yīng)的人種系序列可以是僅構(gòu)架區(qū)，僅互補決定區(qū)，構(gòu)架區(qū)和互補決定區(qū)，可變片段(如上文定義的)，或是包含可變區(qū)的序列或子序列的其它組合。序列同一性可以使用本文中描述的方法來確定，例如使用BLAST、ALIGN或本領(lǐng)域所知的其它比對算法來比對兩條 序列。相應(yīng)的人種系核酸或氨基酸序列可以與參考可變區(qū)核酸或氨基酸序列具有至少約90%、92%、94%、96%、98%、99%的序列同一丨生。相應(yīng)的人種系序列可以通過例如可公開獲取的國際ImMunoGeneTics數(shù)據(jù)庫(IMGT)(在萬維網(wǎng)imgt. cines. fr/上)和V-base (在萬維網(wǎng)vbase. mrc-cpe. cam. ac. uk 上)來石角定。
在描述抗原(例如蛋白質(zhì))和抗體或源自抗體的結(jié)合劑之間的相互作用的上下文中使用時，詞組“特異地(或選擇地)結(jié)合”指，在異質(zhì)性蛋白質(zhì)群體或其它生物制品，例如生物樣品(例如血液、血清、血漿或組織樣品)中，確定抗原存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫測定條件下，具有特定的結(jié)合特異性的抗體或結(jié)合劑與特定的抗原的結(jié)合至少兩倍于背景，并且該抗體或結(jié)合劑基本上不與樣品中存在的其它抗原產(chǎn)生顯著量的結(jié)合。在這樣的條件下與抗體或結(jié)合劑的特異性結(jié)合，可能需要該抗體或結(jié)合劑已經(jīng)針對其對特定蛋白質(zhì)的特異性進行過選擇。如期望的或適當(dāng)?shù)模撨x擇可以通過扣除掉與例如來自其它物種(例如小鼠)的PCSK9分子或其它的PCSK亞型交叉反應(yīng)的抗體來實現(xiàn)?？梢允褂枚喾N免疫測定方式來選擇與特定蛋白質(zhì)產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測定被常規(guī)用于選擇與特定蛋白質(zhì)產(chǎn)生特異免疫反應(yīng)的抗體(關(guān)于可用來確定特異性免疫反應(yīng)的免疫測定方式和條件的描述，見例如，Harlow和Lane, Using Antibodies, A LaboratoryManual (1998))。典型地，特異性或選擇性結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生的信號將至少兩倍于背景信號，更典型地至少10至100倍于背景。術(shù)語“平衡解離常數(shù)(Kd，M) ”指解離速率常數(shù)(kd，時間―1)除以結(jié)合速率常數(shù)(ka，時間'M—1)?？梢允褂帽绢I(lǐng)域任何已知的方法來測定平衡解離常數(shù)。本發(fā)明的抗體的平衡解離常數(shù)通常小于約10_7或10_8M，例如小于約10_9M或KTkiM,在一些實施方案中，小于約l(TnM、l(T12M 或 1(T13M。如本文中使用的，術(shù)語“抗原結(jié)合區(qū)”指本發(fā)明的PCSK9結(jié)合分子中負責(zé)該分子和PCSK9之間的特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。抗原結(jié)合區(qū)包括至少一個抗體重鏈可變區(qū)和至少一個抗體輕鏈可變區(qū)。在本發(fā)明的每個PCSK9結(jié)合分子中都存在至少一個這樣的抗原結(jié)合區(qū)，每一個抗原結(jié)合區(qū)可以與其它抗原結(jié)合區(qū)相同或不同。在一些實施方案中，本發(fā)明的PCSK9結(jié)合分子的至少一個抗原結(jié)合區(qū)起PCSK9的拮抗劑的作用。如本文中使用的，術(shù)語“拮抗劑”指能夠特異地與靶標分子結(jié)合和抑制其活性的試齊U。例如，PCSK9的拮抗劑特異地與PCSK9結(jié)合，完全或部分地抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解。抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解可以干擾或可以不干擾PCSK9與LDLR的結(jié)合。在某些情況下，可以通過其與PCSK9結(jié)合和抑制PCSK9與LDLR結(jié)合的能力來鑒定PCSK9拮抗劑。當(dāng)暴露于本發(fā)明的拮抗劑時，如果PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解，與存在對照或缺乏拮抗劑時的PCSK9介導(dǎo)的降解相比，低至少約10%，例如低至少約25%、50%、75%或完全被抑制，則發(fā)生了抑制。可以使對照不暴露于抗體或抗原結(jié)合分子、或暴露于特異結(jié)合另一抗原的抗體或抗原結(jié)合分子、或已知不起拮抗劑作用的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子?！翱贵w拮抗劑”指拮抗劑是抑制性抗體的情況。術(shù)語“PCSK9”或“蛋白原轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/kexin型9a”可互換使用，指天然存在的、屬于分泌型枯草桿菌酶(subtilase)家族的蛋白酶K亞家族的人蛋白原轉(zhuǎn)化酶(proprotein convertase)。PCSK9作為可溶性酶原合成,其在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中經(jīng)歷自催化的分子內(nèi)加工，被認為作為蛋白原轉(zhuǎn)化酶發(fā)揮功能。PCSK9在膽固醇的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起作用，并可能 在皮層神經(jīng)元的分化中起作用。PCSK9基因的突變已經(jīng)與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥相關(guān)。見，例如，Burnett 和 Hooper, Cl in Biochem Rev (2008) 29 (I) : 11-26。已知 PCSK9的核酸和氨基酸序列，其分別以GenBank登錄號NM_174936. 2和NP_777596. 2公布。如本文中使用的，PCSK9多肽功能性地與LDLR結(jié)合和促進LDLR降解。在結(jié)構(gòu)上，PCSK9的氨基酸序列與GenBank登錄號NP 777596. 2的氨基酸序列具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性。在結(jié)構(gòu)上，PCSK9的核酸序列與GenBank登錄號 NM_174936. 2 的核酸序列具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的序列同一性。詞組“PCSK9功能獲得性突變”指存在于PCSK9基因中的天然突變，該突變，例如由于增強的LDLR降解和LDLR水平的降低，與家族性高膽固醇血癥表型、加速的動脈粥樣硬化和早發(fā)冠心病(premature coronary heart disease)相關(guān)和/或是其產(chǎn)生的原因。PCSK9功能獲得性突變的等位基因頻率極低。見，Burnett和Hooper, Clin Biochem Rev.(2008)29(1) : 11-26。示例性 PCSK9 功能獲得性突變包括 D129N、D374H、N425S 和 R496W。見，F(xiàn)asano,等，Atherosclerosis (2009) 203 (I) : 166-71。在例如 Burnett 和 Hooper,同上；Fasano,等，同上；Abifadel,等，J Med Genet (2008)45 (12):780-6;Abifadel, 等，Hum Mutat (2009) 30 (4) :520-9;和 Li,等，Recent Pat DNA Gene Seq (2009) Nov. I (PMID19601924)中，對PCSK9功能獲得性突變進行了綜述。 本發(fā)明的多肽的“活性”指多肽在其天然細胞或組織中的結(jié)構(gòu)性、調(diào)節(jié)性或生化的功能。多肽活性的實例包括直接活性和間接活性。示例性的PCSK9直接活性是與該多肽直接相互作用的結(jié)果，包括與LDLR結(jié)合和PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解。在PCSK9的情況中，觀察到的示例性間接活性可以為細胞、組織、器官或個體中對多肽的直接活性的反應(yīng)或表型的改變，例如，降低增加了的肝臟LDLR、降低的血漿HDL-C、降低的血漿膽固醇、增強對他汀類藥的敏感性。當(dāng)用于核酸或蛋白質(zhì)時，術(shù)語“分離的”表示核酸或蛋白質(zhì)基本上沒有在天然狀態(tài)下與其相關(guān)的其它細胞組分。其優(yōu)選處于同質(zhì)狀態(tài)。它可以是干燥的或水溶液的形式。通常使用分析化學(xué)技術(shù)，例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色譜法來測定純度和同質(zhì)性。在存于制劑中的物類中占絕大多數(shù)的蛋白質(zhì)是基本上純化的。特別地，分離的基因是與位于基因側(cè)翼、編碼非目的基因的蛋白質(zhì)的開放閱讀框分開的。術(shù)語“純化的”表示核酸或蛋白質(zhì)在電泳凝膠中形成基本上一條帶。特別地，它意味著核酸或蛋白質(zhì)的純度為至少85%，更優(yōu)選為至少95%，和最優(yōu)選為至少99%。術(shù)語“核酸”或“多核苷酸”指脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其聚合物，以單鏈或雙鏈形式存在。除非特地加以限定，該術(shù)語涵蓋包含天然核苷酸的已知類似物的核酸，所述類似物具有與參考核酸類似的結(jié)合特性，并且以與天然存在的核苷酸類似的方式代謝。除非另有說明，特定的核酸序列也隱含地包括其保守性修飾變體(例如，簡并密碼子替代)、等位基因、直向同源物、SNPs和互補序列，以及明確指出的序列。特別地，可以通過產(chǎn)生其中一個或多個選擇的(或所有)密碼子的第3位被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基替代的序列，實現(xiàn)簡并密碼子替代(Batzer等，Nucleic AcidRes. 19:5081 (1991);Ohtsuka 等，J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985);和 Rossolini等，Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指氨基酸殘基的聚合體。這些術(shù)語適用于其中一個或多個氨基酸殘基為相應(yīng)的天然存在的氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合體，以及適用于天然存在的氨基酸聚合體和非天然存在的氨基酸聚合體。術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是那些由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及那些其后經(jīng)過修飾的氨基酸，例如羥脯氨酸、Y-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指具有與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)(即，與氫、羧基、氨基、和R基團結(jié)合的a-碳)的化合物，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。這樣的類似物具有經(jīng)修飾的R基團(例如，正亮氨酸)或經(jīng)修飾的肽主鏈，但保留了和天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指具有與氨基酸的常規(guī)化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的化合物?！氨Ｊ匦孕揎椬凅w”適用于氨基酸和核酸序列。就特定的核酸序列而言，保守性修飾變體指那些編碼相同或基本相同氨基酸序列的核酸，或在核酸不編碼氨基酸序列時，指基本相同的序列。因為遺傳密碼的簡并性，任何給定的蛋白質(zhì)可以由很多功能上相同的核酸編碼。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和G⑶都編碼氨基酸丙氨酸。因此，在每一個規(guī)定丙氨酸的密碼子位置，該密碼子可以被改變成任何所述相應(yīng)的密碼子而不改變所編碼的多肽。這樣的核酸變異是“沉默變異”，它是保守性修飾變異中的一種。本文中每一個編碼多肽的核酸序列也描述了該核酸的每一個可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，可以對核酸中的每個密碼子(除AUG以外，它通常是甲硫氨酸的唯一密碼子；以及TGG，它通常是色氨酸 的唯一密碼子)進行修飾，以產(chǎn)生功能上相同的分子。因此，在每一個所描述的編碼多肽的核酸序列中，暗含該核酸的每個沉默變異。關(guān)于氨基酸序列，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，對于在編碼序列中導(dǎo)致單個氨基酸或小百分比氨基酸的改變、添加或缺失的、核酸、肽、多肽或蛋白質(zhì)序列中的單替代、缺失或添力口，當(dāng)該改變導(dǎo)致氨基酸被其化學(xué)上類似的氨基酸替代時，則是“保守性修飾變體”。提供功能類似的氨基酸的保守性替代表在本領(lǐng)域公知。這樣的保守性修飾變體是對本發(fā)明的多態(tài)性變體、種間同源物和等位基因的補充且不排斥它們。下列8組各包含相互為保守性替代的氨基酸1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G) ; 2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E) ; 3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q) ;4)精氨酸(R)，賴氨酸⑷；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V) ;6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W) ;7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(見，例如,Creighton, Proteins (1984))。通過在比較窗口內(nèi)比較兩個最佳比對的序列來確定“序列同一性百分比”，其中為了兩條序列的最佳比對，與不包含添加或缺失的參考序列(例如，本發(fā)明的多肽)相比，t匕較窗口中的多核苷酸序列的部分可以包含添加或缺失(即，空位)。百分比這樣來計算確定在兩條序列中出現(xiàn)的相同核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量，以獲得匹配位置的數(shù)量，用匹配位置的數(shù)量除以比較窗口中位置的總數(shù)，將結(jié)果乘以100，以獲得序列同一性的百分比。在兩個或多個核酸或多肽序列的上下文中，術(shù)語“同一的”或百分比“同一性”指兩條或更多條序列或子序列為相同的序列。當(dāng)在比較窗口或指定區(qū)域內(nèi)進行比較和比對，按照下列序列比較算法之一或通過手工比對和目測確定，獲得最大對應(yīng)性時，如果兩條序列具有規(guī)定百分比的相同氨基酸殘基或核苷酸(即，在規(guī)定區(qū)域中，或當(dāng)沒有規(guī)定時，在參考序列的整個序列中，70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同)，這兩條序列是“基本相同的”。本發(fā)明提供了分別與本文中示例的多肽或多核苷酸(例如，SEQID NOS: 1-5、15-19和40-41之任一示例的可變區(qū)；SEQ ID NOS: 27-31之任一示例的可變片段;SEQ ID NOS:6-14、20-26 之任一示例的 CDRs; SEQ ID NOs:32-39 之任一示例的 FRs;和SEQ ID N0S:42_45之任一不例的核酸序列)基本相同的多肽或多核苷酸?？蛇x地，同一性存在于長度為至少約15、25或50個核苷酸的區(qū)域，或更優(yōu)選地于長度為100至500個或1000個或更多個核苷酸的區(qū)域，或于參考序列的全長中。就氨基酸序列而言，同一性或基本同一性可以存在于長度為至少5、10、15或20個氨基酸的區(qū)域，任選于長度為至少約25、30、35、40、50、75或100個氨基酸的區(qū)域，任選于長度為至少約150、200或250個氨基酸的區(qū)域，或于參考序列的全長區(qū)域中。就較短的氨基酸序列而言，例如20個或更少氨基酸的氨基酸序列，當(dāng)根據(jù)本文中定義的保守性替代，一個或兩個氨基酸殘基進行了保守性替代時，存在基本同一性。對于序列比較，一般將一條序列作為參考序列，將測試序列與其進行比較。在使用序列比較算法時，將測試和參考序列輸入計算機，如果需要的話，指定子序列的坐標，然后指定序列算法程序參數(shù)。可以使用默認的程序參數(shù)，或可以指定可選參數(shù)。然后，序列比較算法基于程序參數(shù)，計算測序序列相對于參考序列的百分比序列同一性。如本文中使用的，“比較窗口”包括選自20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150個的連續(xù)位置數(shù)之任一的區(qū)段，在該區(qū)段中可以將一個序列與相同連續(xù)位置數(shù)的參考序列，在兩條序列經(jīng)過最優(yōu)比對后，進行比較。用于比較的序列比對方法在本領(lǐng)域公知?？梢岳缤ㄟ^Smith和Waterman的局部同源算法(Needleman和 Wunsch(1970)Adv. Appl. Math. 2:482c)，通過 Needleman 和 Wunsch 的同源比對算法(Needleman 和 Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443)，通過 Pearson 和 Lipman 的相似性搜索方法(Pearson 和 Lipman(1988)Proc. Nat’ I. Acad. Sci. USA 85:2444),通過計算機執(zhí)行這些算法(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA, GeneticsComputer Group, 575Science Dr.，Madison, WI),或通過手工比對和目測(見,例如 Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology (1995增刊))，進行用于比較的序列最優(yōu)比對。適用來確定百分比序列同一性和序列相似性的算法的兩個例子是BLAST和BLAST2. 0 算法，其分別描述于 Altschul 等(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 和 Altschul 等(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中。用于執(zhí)行BLAST分析的軟件可從美國國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲取。該算法包括，首先通過鑒別查詢序列中長度為W的如下短字來鑒別高分值序列對(HSPs)，其中所述短字在與數(shù)據(jù)庫序列中同樣長度的字進行比對時，匹配或滿足一定的正值閾值分值T。T被稱為鄰近字分值閾值(Altschul等，同上)。這些初始的鄰近字命中物作為種子啟動搜索來尋找包含它們的更長的HSPs。只要累積比對分值可以增加，字命中物就沿著每條序列在兩個方向進行延伸。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(給一對匹配殘基的獎分；總是大于0)和N(給錯配殘基的罰分；總是小于0)，計算累積分值。對于氨基酸序列，使用打分矩陣計算累積分值。當(dāng)累積比對分值從其所達到的最大值降低了數(shù)量X，或由于一個或多個負得分殘基比對的累積而使累積分值變?yōu)?或以下，或到達任何一條序列的末端時，終止字命中物在每個方向上的延伸。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字長(W)為11、期望值(E)為10、M=5、N=-4和雙鏈比較，作為默認值。、對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字長為3、期望值(E)為10和BLOSUM62打分矩陣(見Henikoff 和 Henikoff (1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比對(B)為 50、期望值(E)為10、M=5、N=-4和雙鏈比較，作為默認值。BLAST算法也執(zhí)行兩條序列之間相似性的統(tǒng)計學(xué)分析(見，例如，Karlin和Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787)。BLAST 算法提供的對相似性的一種度量是最小加和概率(P(N))，該概率指示兩條核苷酸或氨基酸序列之間因偶然而發(fā)生匹配的概率。例如，如果在測試核酸與參考核酸的比較中，最小加和概率小于約0. 2，更優(yōu)選小于約0. 01，最優(yōu)選小于約0. 001，則該測試核酸被視為與參考序列相似。兩條核酸序列或多肽基本相同的一個指示是，如下文所描述的，由第一個核酸編碼的多肽可以與抗第二個核酸編碼的多肽所產(chǎn)生的抗體起免疫交叉反應(yīng)。因此，例如，當(dāng)兩個多肽僅因保守性替代而不同時，通常地，兩個多肽是基本相同的。兩條核酸序列基本相同的另一個指示是，如下文所描述的，這兩個分子或其互補體在嚴緊條件下互相雜交 。兩條核酸序列基本相同的另一個指示是，可以使用相同的引物來擴增序列。當(dāng)在描述抗原結(jié)合區(qū)在本發(fā)明的PCSK9結(jié)合分子中如何連接的上下文中使用時，術(shù)語“連接”涵蓋用于使這些區(qū)域在物理上接合的所有可能的手段。許多抗原結(jié)合區(qū)常通過化學(xué)鍵例如共價鍵(例如，肽鍵或二硫鍵)或非共價鍵來接合，所述化學(xué)鍵可以是直接鍵(即，在兩個抗原結(jié)合區(qū)之間沒有接頭)或間接鍵(即，在兩個或更多個抗原結(jié)合區(qū)之間借助于至少一個接頭分子)。術(shù)語“受試者”、“患者”和“個體”可互換使用，指哺乳動物，例如人或非人的靈長類哺乳動物。哺乳動物也可以是實驗室哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔、倉鼠。在一些實施方案中，哺乳動物可以是農(nóng)用哺乳動物(例如，馬、綿羊、牛、豬、駱駝科動物)或馴養(yǎng)哺乳動物(例如，犬，貓)。術(shù)語“治療可接受量”或“治療有效劑量”可互換使用，指足夠產(chǎn)生預(yù)期效果(即，降低血漿非HDL-C、高膽固醇血癥、動脈粥樣硬化、冠心病)的量。在一些實施方案中，治療可接受量不誘導(dǎo)或造成不期望的副作用。可以通過先施用低劑量，然后遞增地增加該劑量直到獲得預(yù)期效果，以確定治療可接受量。本發(fā)明的PCSK9拮抗抗體的“預(yù)防有效劑量”和“治療有效劑量”可以分別防止與PCSK9存在相關(guān)的疾病癥狀(例如，高膽固醇血癥)的發(fā)作或降低其嚴重性。所述術(shù)語也可以分別促進或增加無疾病癥狀期的頻率和持續(xù)時間?！邦A(yù)防有效劑量”和“治療有效劑量”也可以分別預(yù)防或改善因PCSK9活性引起的失調(diào)和疾病所導(dǎo)致的傷害或殘疾。術(shù)語“共用藥/共施用”指兩種活性劑在個體的血管中同時存在?？梢酝瑫r或順序地給予共用藥/共施用的活性劑。 如本文中使用的，詞組“基本由…組成”指包括在方法或組合物中的活性藥劑的類(genera)或種(species),以及對方法或組合物的預(yù)期目的無活性的任何賦形劑。在一些實施方案中，詞組“基本由…組成”明確地排除包括一種或多種非本發(fā)明的抗PCSK9抗體拮抗劑的其它活性劑的情況。在一些實施方案中，詞組“基本由…組成”明確地排除包括一種或多種非本發(fā)明的抗PCSK9抗體拮抗劑的其它活性劑和第二共施用劑的情況。術(shù)語“他汀類藥”指作為3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的競爭性抑制劑的一類藥劑。


圖I示例了親本小鼠單克隆抗體NVP-LFU720的重鏈(SEQ ID NO: I)和輕鏈(SEQID NO: 15)氨基酸序列。⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列以加下劃線和加粗表示。圖2示例了親本小鼠單克隆抗體NVP-LGT209的重鏈(SEQ ID NO: 2)和輕鏈(SEQID NO: 16)氨基酸序列。⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列以加下劃線和加粗表示圖3示例了親本小鼠單克隆抗體NVP-LGT210的重鏈(SEQ ID NO: 2)和輕鏈(SEQID NO: 18)氨基酸序列。⑶R1、⑶R2 和⑶R3的序列以加下劃線和加粗表示圖4示例了親本小鼠單克隆抗體NVP-LGT211的重鏈(SEQ ID NO:4)和輕鏈(SEQID NO: 16)氨基酸序列。⑶R1、⑶R2和⑶R3的序列以加下劃線和加粗表示圖5A-C 示例了，與 NVP-LFU720-NX-4 相比，NVP-LGT209 (A)、NVP-LGT210 (B)和NVP-LGT-211 (C)和幾種不同的人和小鼠抗原的結(jié)合的ELISA試驗測定。圖 6A-C 示例了 在 ELISA 中，NVP-LGT209 (A)、NVP-LGT210 (B)和 NVP-LGT-211 (C)與人和cyno的Pcsk9的結(jié)合。二抗為山羊抗小鼠抗體，按1:5000稀釋?！皟H二抗”(“2ndonly”)為單獨二抗對照。圖7示例了親本小鼠單克隆抗體NVP-LFU720與PCSK9的C末端第680-692位殘基(RSRHLAQASQELQ;SEQ ID NO: 49)結(jié)合。Humaneered 抗體 LGT209、LGT210 和 LGT211 競爭相同的表位。C端突變體A685X=SEQ ID NO: 56。圖8示例了，如在時間分辨熒光共振能量轉(zhuǎn)移(TR-FRET)生化試驗中測定的，親本小鼠抗體NVP-LFU720(5P20)對PCSK9和LDL-R間相互作用的破壞很差。相比之下，13C10以50nM的IC5tl破壞PCSK9-LDL-R FRET相互作用。將以熒光團標記的人PCSK9 (hPCSK9_AF)，與 NVP-LFU720-AX-1 或 13C10，在試驗緩沖液(20mM HEPES, pH 7. 2，150mM NaCl, ImMCaC12, 0. l%v/v吐溫20，和0. l%w/v BSA)中，于室溫孵育30分鐘。接著，加入銪標記的LDL-R(hLDL-R-Eu)，于室溫再孵育90分鐘，以使最終濃度為8nM的hPcsk9_AF和InM的hLDL-R-Eu。以平板讀取器(EnVision 2100, Perkin Elmer)測量 TR-FRET 信號(330nm 處激發(fā)，665nm處發(fā)射)，計算存在5P20或13C10時的百分比(%)抑制。通過在Prism(GraphPad)中繪制百分比抑制值的曲線來計算IC50值。每個數(shù)據(jù)點代表平均值土SD(每個點n=4個重復(fù))。數(shù)據(jù)為至少兩個獨立實驗的代表。圖9 示例了 Humaneered 抗體 LGT209、LGT210 和 LGT211 與小鼠抗體 LFU720 在導(dǎo)致增加的LDL-R水平和H印G2細胞的LDL攝取上是等效的。為了測量LDL-R，將細胞與PCSK-9結(jié)合抗體一起孵育，以抗LDL-R抗體進行標記。對于LDL攝取，將細胞與PCSK9結(jié)合抗體、PCSK9和DiI-LDL —起孵育。用流式細胞計測量LDL-R抗體和DiI-LDL熒光。對于每個試驗，顯示重復(fù)測量的平均值+SEM。結(jié)果為3次獨立實驗的代表。對于LDL攝取試驗，將PCSK9結(jié)合抗體在含10%的胎牛無脂蛋白血清(Intracel)和 200nM 人 PCSK9 (Hampton 等 PNAS (2007) 104:14604-14609)的 DMEM 中，于室溫孵育 30分鐘，將抗體/PCSK9/培養(yǎng)基溶液加到96孔板的孔中，孵育過夜。第二天，加入1，I’ -雙十八烷基_3，3，3’，3’ -四甲基-吲哚羰花青高氯酸鹽標記的LDL(DiI-LDL, BiomedicalTechnologies)，再孵育2小時。然后吸去培養(yǎng)基，以PBS將細胞洗3次，用0. 25%的胰蛋白酶-EDTA離解細胞。然后將細胞轉(zhuǎn)移到FACS緩沖液(含5%胎牛血清、2mM EDTA和0. 2%疊氮化鈉的PBS)中，于IOOOx g離心IO分鐘，吸去液體，以1%的多聚甲醛固定。使用流式細胞計(Becton Dickinson LSR II)，通過細胞的DiI熒光(488nm處激發(fā)，575nm處發(fā)射)測量LDL攝取。為了進行表面LDL-R測定，將細胞與含抗體的無血清培養(yǎng)基一起孵育，以PBS洗滌，用VerSine(Bi0Whittaker，17-771E)和FACS緩沖液收獲細胞。將細胞轉(zhuǎn)移到新的平板中，于1200rpm離心5分鐘,用正常兔IgG(MP biomedicals)進行封閉。于FACS緩沖液中以兔抗hLDL-R-Alexa 647IgG (5 u g/ml)標記的抗體標記細胞，離心，洗滌，以1%的多聚甲醛固定。通過流式細胞計(488nm處激發(fā)，633nm處發(fā)射)測量表面LDL-R。用Prism(GraphPad)計算EC50。圖10提供了用于確定本發(fā)明抗體降低膽固醇效果的人PCSK9輸注小鼠模型的研究設(shè)計示意圖。LGT209、LGT210和LGT211為Humaneered 抗PCSK9抗體，它們與hPCSK9以高親和力結(jié)合，與鼠PCSK9沒有可檢測的結(jié)合。為了測試LGT209、LGT210或LGT211是否能 夠抑制hPCSK9介導(dǎo)的非HDL膽固醇升高和阻止PCSK9介導(dǎo)的肝臟LDLR降解，在含有hPCSK9的微型滲透泵植入(用于連續(xù)輸注)之前3小時，將各個抗體注射到小鼠中。在hPCSK9注射后24小時，采集血漿和肝臟組織。圖11顯示以抗體LGT209、LGT210和LGT211治療導(dǎo)致了輸注小鼠模型中人PCSK9( “hPCSK9”)的積累。簡言之，通過使用mAb 7D16進行捕獲，以ELISA測定總的hPCSK9。mAb 7D16與LGT209、LGT210和LGT211結(jié)合PCSK9上的不同表位，能夠用于測量總的(游離的和結(jié)合的)PCSK9。所觀察到的總hPCSK9的增加可能是由于hPCSkK9/Ab復(fù)合物的增加。通過使用hPCSK9進行捕獲，以ELISA來測定游離的抗體。該測定測量了“游離的”抗體并可以度量1:1的Ab:PCSK9復(fù)合物。用僅媒介物、僅PCSK9、PCSK9+20mg/kg LGT210、PCSK9+20mg/kgNVP-LGT211、或小鼠非特異性IgG混合物(陰性對照)，處理C57BL/6小鼠。繪制數(shù)據(jù)點圖，用水平條界定平均值；視P〈0. 05為顯著。通過Meso Scale Discovery (MSD)試驗,定量血衆(zhòng)IgG水平。使用hPCSK9進行捕獲，測量了游離抗體。該測定測量了 “游離的”抗體并可以度量1:1的Ab:PCSK9復(fù)合物。對于IgG MSD測定，使用MSD標準96孔板(L11XA-3)。簡言之，以25至28 的捕獲抗原PCSK9-His(l u g/ml,于PBS中)包被平板(25_28ng孔)，于4°C過夜。除去包被溶液，每孔以150 ii I 5%的MSD Blocker A (R93AA-2)封閉平板，于室溫搖動I小時。以300 yl的PBS+0. 05%吐溫20洗滌平板3次，加入25 ill的IgG校準物稀釋液(以MSD blocker A進行從10，000至0. 0003ng/ml的10個系列稀釋)、未知的血漿樣品稀釋液(以MSD blocker A稀釋10，000X)、或質(zhì)量控制樣品，于室溫下?lián)u動孵育I小時。洗漆后，每孔加入25 u I Iug/ml的檢測抗體(MSD羊抗鼠SULF0-TAG標記的檢測抗體R32AC-5，以l%BSA/PBS/0. 05%吐溫20稀釋)，于室溫搖動孵育I小時。洗滌后，每孔加入150 ill IX讀取緩沖液T，立即在MSDSECTOR Imager 6000上讀取平板。使用MSD數(shù)據(jù)分析軟件，繪制標準曲線和計算未知樣品。通過Meso Scale Discovery (MSD)試驗，定量了血衆(zhòng) IgG 和 hPCSK9 水平。MSDhPCSK9測定與IgG測定類似，但有以下例外。以25-28 U I的捕獲抗體(7D16. C3:2. 95mg/ml)以 I ii g/ml 包被平板。mAb 7D16 與 LGT209、LGT210 和 LGT211 結(jié)合 PCSK9 上不同的表位，其可用于測量總的(游離的和結(jié)合的)PCSK9。封閉平板后，將25iU的hPCSK9校準物稀釋液(從10，000至0. 0003ng/ml的10個點)和血漿樣品稀釋液(以MSDblockerA稀釋10，000X)于室溫下?lián)u動孵育I小時，然后與第一檢測抗體(家兔ID#RB11835中，兔抗PCSK9多克隆抗體Ab4) —起孵育。在用MSD SECTOR Imager 6000進行讀取之前，添加一個與第二檢測抗體(MSD羊抗兔SULF0-TAG標記的檢測抗體R32AB-5)的孵育步驟。所觀察到的總hPCSK9的增加可能是由于hPCSkK9/Ab復(fù)合物的增加引起。使用GraphPad Prism 4. 02 (GraphPad軟件，San Diego, CA)進行統(tǒng)計分析。米用單因素方差分析(One-way AN0VA)來分析組的差異，當(dāng)發(fā)現(xiàn)了總體差異時,使用Newman-Keuls事后檢驗(Newman-Keuls post hoc test)確定處理組間的特定差異。圖12說明抗體LGT209、LGT210和LGT211導(dǎo)致輸注小鼠模型中肝臟LDL-R免受 hPCSK9 介導(dǎo)的降解。用僅媒介物、僅 PCSK9、PCSK9+20mg/kg LGT210、PCSK9+20mg/kgNVP-LGT211、或小鼠非特異性IgG混合物(陰性對照)，處理C57BL/6小鼠。顯示來自各個體動物的肝臟樣品。使用20 泳道 4_12%Bis_Tris Invitrogen Midi 膠(Invitrogen WG1402BX10)和MOPS電泳緩沖液(Invitrogen NPOOOI),對血衆(zhòng)膜樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將準備好的樣品于70°C加熱10分鐘，置于冰上，然后使用點陣多通道移液器將每個樣品各IOiU點樣到膠上。與樣品一起點加SeeBlue Plus2標記(Invitrogen LC5925),用于確定大小和膠的方向。在200V恒壓下電泳凝膠，直到染料的前緣到達膠的底部。電泳后，使用iBlot裝置(Invitrogen IB1001EU)，將膠向硝化纖維素膜(Invitrogen IB3010-01)轉(zhuǎn)移。以 20V進行7分鐘轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后，以Pierce Superblock T20 (Pierce 37536)封閉膜至少30分鐘。將膜置入“seal-a-meal”袋中,加入于Superblock中的兔抗LDLR抗體1:500稀釋物，然后于4°C搖動孵育過夜。將膜在TBS/0. 05%吐溫中搖動漂洗5次，每次5分鐘，然后向膜上加1:30,000稀釋于Superblock中的山羊抗兔HRP第二抗體，孵育I小時。再次將膜在TBS/0. 05%吐溫中搖動漂洗5次,每次5分鐘。使用Pierce SuperSignal West Pico化學(xué)發(fā)光底物(Pierce 37079)，按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)，檢測HRP綴合物。簡言之，混合等份的過氧化物溶液和Luminol/Enhancer溶液，將其加到膜上(0. 2ml/cm2)，5分鐘。吸除過量的溶液，以膜對Kodak BioMax MR X-射線膠片(Kodak 870 1302)進行曝光。圖13A-C示例了抗體LGT209、LGT210和LGT211導(dǎo)致hPCSK9輸注小鼠模型中血漿非HDL膽固醇的降低。預(yù)注射LGT209抗體導(dǎo)致對hPCSK9介導(dǎo)的非HDL膽固醇升高的46%防止。預(yù)注射LGT210或LGT211對hPCSK9介導(dǎo)的非HDL膽固醇升高導(dǎo)致等同的或更大的防止作用。13C10是經(jīng)過確認的鼠抗PCSK9抗體，其與hPCSK9高親和力地結(jié)合，用作該測定試驗的陽性對照。以僅媒介物、僅 PCSK9、PCSK9+20mg/kg LGT209、PCSK9+20mg/kg LGT210、PCSK9+20mg/kgNVP-LGT211, PCSK9+20mg/kg 13C10 或小鼠非特異性 IgG 混合物(陰性對照)，處理C57BL/6小鼠。顯示單個數(shù)值，以水平條界定平均值。使用Olympus臨床分析儀(Olympus美國公司01ympus AU400)定量血衆(zhòng)總膽固醇水平。將血衆(zhòng)樣品按1:3稀釋于ddH20中，按照生產(chǎn)商的指導(dǎo)，定量40 ii I稀釋的血漿樣品中總膽固醇水平。使用HelenaLaboratories的Spife 3000獲取脂蛋白膽固醇級分，以定量血漿HDL和非HDL。按照操作手冊中提供的技術(shù)指導(dǎo)，完成所有的步驟，包括準備樣品、制備凝膠、施加樣品、凝膠電泳、 染色、洗滌和干燥。然后，在Quick Scan 2000中采用Slit 5掃描凝膠，使用Helena光密度計，計算脂蛋白膽固醇級分的相對百分比。最后，通過將每個級分的百分比與總膽固醇水平相乘來計算HDL和非HDL的絕對值。圖14顯示，與“典型的” IgGl (PK)譜相比較，抗體LGT209、LGT210和LGT211(人IgGl-silent)的大鼠藥代動力學(xué)(PK)譜。與典型的IgGl的半衰期(約6天)相比，抗體LGT209、LGT210和LGT211的半衰期顯著更長(7_13天)(例如，如在人受試者中測定的)。沒有靶介導(dǎo)的沉積(TMD)的跡象，表明抗體不與嚙齒動物PCSK9交叉反應(yīng)。對于每個測試抗體，以10mgs/kg注射3只雄性Lewis大鼠。在時間=0、1、6、24小時以及2、4、8和16天，采集250 Ul血樣，稀釋經(jīng)澄清的血漿，在捕獲ELISA(山羊抗人IgG)中進行評估，以測量所回收的總的人抗體。也產(chǎn)生每個測試抗體的標準曲線。以所回收的IgG的量對預(yù)期的典型人IgG在大鼠中的回收量，進行繪圖。發(fā)明詳述I.引言本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合分子與蛋白原轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/kexin型 9a( “PCSK9”)特異結(jié)合。本發(fā)明的抗PCSK9抗體和抗原結(jié)合分子與PCSK9的C端結(jié)合，其具有意料不到的特性——干擾PCSK9介導(dǎo)的低密度脂蛋白受體(LDL-R)的降解而不干擾PCSK9與LDL-R的結(jié)合。特別地，抗PCSK9抗體和抗原結(jié)合分子與PCSK9的第680-692位殘基內(nèi)的表位結(jié)合，例如位于PCSK9的C末端的氨基酸序列RSRHLAQASQELQ (SEQ ID NO: 49)內(nèi)的表位。因為本發(fā)明的抗體和抗原結(jié)合分子可與結(jié)合在細胞上的PCSK9而非只與循環(huán)PCSK9結(jié)合，故它們在患者中具有相對較長的體內(nèi)半衰期，例如至少約7天或更長，在一些實施方案中，提供施用后至少2周的降脂效果。本發(fā)明的抗PCSK9抗體和抗原結(jié)合分子是PCSK9的拮抗劑，因為它們防止、減少和/抑制PCSK9介導(dǎo)的LDL-R的降解，從而促進低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)攝取的增加?？筆CSK9抗體和抗原結(jié)合分子可用于治療患有例如血脂異常、高膽固醇血癥、甘油三酯血癥和其它PCSK9介導(dǎo)的疾病狀況的受試者。2.改良的抗PCSK9抗體概述可以使用本領(lǐng)域已知的任何手段來產(chǎn)生抗PCSK9抗體片段，所述手段包括但不限于重組表達、化學(xué)合成、抗體四聚體的酶促消化，而全長單克隆抗體可以通過例如雜交瘤或重組生產(chǎn)方式來獲得。重組表達可以來自本領(lǐng)域已知的任何合適的宿主細胞，例如，哺乳動物宿主細胞、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆蟲宿主細胞等。當(dāng)恒定區(qū)存在時，抗PCSK9抗體的恒定區(qū)可以是任何合適的型或亞型，可以選擇以來自待以本發(fā)明方法治療的受試者的物種，例如人、非人靈長類動物，或其它哺乳動物，例如農(nóng)用動物(例如，馬、綿羊、牛、豬、駱駝科動物)、馴養(yǎng)哺乳動物(例如，犬，貓)或嚙齒動物(例如，大鼠、小鼠、倉鼠、兔)。在一些實施方案中，抗PCSK9抗體經(jīng)過人源化或Humaneered 。在一些實施方案中，恒定區(qū)同種型是IgG，例如IgGl。在一些實施方案中，將人IgGl恒定區(qū)突變，使其對效應(yīng)子配體，例如細胞上的Fe受體(FcR)(例如Fe y Rl)、或補體的Cl組分具有降低的結(jié)合親和性。見例如，美國專利號5，624，821。包含這種突變的抗體介導(dǎo)減少的或不介導(dǎo)抗體依賴性細胞毒性(ADCC)或補體依賴性細胞毒性(CDC)。在一些實施方案中，將IgGl恒定區(qū)的氨基酸殘基L234和L235替換為Ala234和Ala235。重鏈恒定區(qū)中殘基的編號為EU索引中的(見，Kabat 等，(1983) “Sequences of Proteins of Immunological Interest”，美國健康和公共事業(yè)部)。也見例如，Woodle 等,Transplantation (1999) 68 (5) : 608-616; Xu等，Cell Immunol (2000) 200 (I) :16-26;和 Hezareh 等，J Virol 75 (24) : 12161-8。本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子也包括具有駱駝科動物支架的單結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合單元。駱駝科中的動物包括駱駝、美洲駝和羊駝。駱駝科動物產(chǎn)生缺乏輕鏈的功能性抗體。重鏈可變區(qū)(VH)自發(fā)折疊，作為抗原結(jié)合單位獨立起作用。與經(jīng)典的抗原結(jié)合分子(Fabs)或單鏈可變片段(scFvs)中的6個⑶Rs相比，它的結(jié)合表面僅涉及3個⑶Rs。駱駝科動物抗體能夠達到與常規(guī)抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合親和性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法，產(chǎn)生具有本文中示例的抗PCSK9抗體的結(jié)合特異性的、基于駱駝科動物支架的抗PCSK9分子，所述方法例如 Dumoulin 等,Nature Struct. Biol. 11:500 - 515, 2002; Ghahroudi 等,FEBSLetters 414:521 - 526, 1997;和 Bond 等，J Mol Biol. 332:643-55，2003。本發(fā)明的改良的抗PCSK9抗體是經(jīng)改造的人抗體，其V區(qū)序列與人種系V區(qū)序列具有實質(zhì)性的氨基酸序列同一性，并保留參考抗體的特異性和親和性。見美國專利公布號2005/0255552和美國專利公布號2006/0134098，由此將兩者均以引用的方式并入本文。改良的過程包括從參考抗體的可變區(qū)中鑒定出決定抗原結(jié)合特異性所需的最小序列信息，和將該信息轉(zhuǎn)移到人部分V區(qū)基因序列的文庫，以產(chǎn)生人抗體V區(qū)的表位聚焦文庫(epitope-focused library)。可以使用基于微生物的分泌系統(tǒng)將該文庫的成員表達為抗體Fab片段,可以例如使用菌落轉(zhuǎn)印(colony-lift)結(jié)合試驗,篩選文庫中的抗原結(jié)合性Fabs0見例如，美國專利公布號2007/0020685。可以對陽性克隆進行進一步表征，以鑒定那 些具有最高親和性的陽性克隆。所產(chǎn)生的經(jīng)改造的人Fabs保留了親本(參考抗PCSK9抗體)的結(jié)合特異性，一般對抗原具有與親本抗體等同或更高的親和性，并含有與人種系抗體V區(qū)具有高度序列同一性的V區(qū)。產(chǎn)生表位聚焦文庫所需的最小結(jié)合特異性決定簇(BSD) —般由重鏈⑶R3( “⑶RH3”)中的序列和輕鏈⑶R3( “⑶RL3”)中的序列表示。BSD可以包含部分或整個長度的CDR3。BSD可以由連續(xù)的或非連續(xù)的氨基酸殘基組成。在某些情況下，從人V片段序列，構(gòu)建表位聚焦文庫，所述人V片段序列與來自參考抗體的包含BSD的獨特CDR3-FR4區(qū)以及人種系J片段序列連接(見，美國專利公布號2005/0255552)。備選地，可以通過順序的盒置換，產(chǎn)生人V片段文庫，其中開始僅部分的參考抗體V片段用人序列文庫替代。然后，將所鑒定的在參考抗體剩余的氨基酸序列中支持結(jié)合的人“盒”，在第二個文庫篩選中重組，以產(chǎn)生完整的人V片段(見，美國專利公布號2006/0134098)。在每種情況下，使用來自參考抗體的包含特異性決定簇的、成對重鏈和輕鏈CDR3片段、CDR3-FR4片段或J片段，以限制結(jié)合特異性，以便從文庫中獲得的抗原結(jié)合物保留參考抗體的表位特異性?？梢栽谖膸鞓?gòu)建中，向每條鏈的CDR3區(qū)引入另外的成熟改變，以鑒定具有最佳結(jié)合動力學(xué)的抗體。所獲得的經(jīng)改造的人抗體具有來源于人種系文庫的V片段序列，保留來自CDR3區(qū)中的短BSD序列，并具有人種系構(gòu)架區(qū)4 (FR4)。因此，在一些實施方案中，抗PCSK9抗體包含來自原初或參考單克隆抗體重鏈和輕鏈的CDR3中的最小結(jié)合序列決定簇(BSD)。重鏈和輕鏈可變區(qū)(CDR和FR)的其余序列，例如V片段和J片段，來自相應(yīng)的人種系和親和力成熟的氨基酸序列。V片段可以選自人V片段文庫?？梢酝ㄟ^親和力成熟進行進一步的序列精煉。在另一個實施方案中，抗PCSK9抗體的重鏈和輕鏈包含來自相應(yīng)的人種系序列的人V片段(FR1-⑶R1-FR2-⑶R2-FR3)，例如選自人V片段文庫的人V片段，和來自原初單克隆抗體的CDR3-FR4序列片段?？梢酝ㄟ^用相應(yīng)的人種系序列替代序列片段和/或通過親和力成熟，進一步精煉CDR3-FR4序列片段。例如，可以用相應(yīng)的人種系序列替代BSD周圍的FR4和/或⑶R3序列，而保留來自原初單克隆抗體的⑶R3的BSD。
在一些實施方案中，重鏈V片段的相應(yīng)人種系序列是Vhl-02。在一些實施方案中，重鏈J片段的相應(yīng)的人種系序列是JH4。在一些實施方案中，重鏈J片段包含人種系JH4部分序列WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 50)。來自人種系JH4的全長J片段是YFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51)。可變區(qū)基因依照免疫球蛋白可變區(qū)基因的標準命名系統(tǒng)來提及。目前的免疫球蛋白基因信息可以通過萬維網(wǎng)獲取，例如在ImMunoGeneTics (IMGT)、V-base 和 PubMed 數(shù)據(jù)庫中。也見 Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(2):100-16;Lefranc, Exp Clin Immunogenet. 2001;18(3):161-74;Exp ClinImmunogenet. 2001;18(4):242-54;和 Giudicelli 等，Nucleic Acids Res. 2005 JanI;33 (Database issue):D256_61。在一些實施方案中，輕鏈V片段的相應(yīng)的人種系序列是VK3L6。在一些實施方案中，輕鏈J片段的相應(yīng)的人種系序列是Jk2。在一些實施方案中，輕鏈J片段包含人種系Jk2部分序列FGQGTKLEIK (SEQ ID NO: 52)。來自人種系Jk2的全長J片段是YTFGQGTKLEIK (SEQID NO:53)。在一些實施方案中，重鏈V片段與氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFS(D/T)MYMSffVRQAPGQGLEWMGRIDPAN(A/E/G)HTNY(A/D)(P/Q)KFQ(A/G)RVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO: 28)具有至少 85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%的序列同一性。在一些實施方案中，重鏈V片段與氨基酸序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSTMYMSWVRQAPGQGLEWMGRIDPANEHTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCAR(SEQ ID NO: 27)具有至少 85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99%或 100% 的序列同一性。在一些實施方案中，輕鏈V片段與以下氨基酸序列具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性(E/Q) IV(L/M)TQSPATLSVSPGERATLSC(R/S)AS(Q/S)SVSYMHffYQQKPGQAPRLLIY(G/L)(T/V)F(N/R) (L/R)A (S/T)GIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO: 31)。在一些實施方案中，重鏈V片段與以下氨基酸序列具有至少 85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一,注 QIVLTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO 29).，在一些實施方案中，重鏈V片段與以下氨基酸序列具有至少85%、89%、90%、93%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的序列同一性 EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSYMHWYQQKPGQAPRLLIYGVFRRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTIGRLEPEDFAVYYC(SEQ ID NO :30).在一些實施方案中i)重鏈 CDR3 包含氨基酸序列 SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (SEQ ID NO: 14);以及ii)輕鏈CDR3可變區(qū)包含氨基酸序列LQWSSDPPT(SEQ ID NO:26)。在一些實施方案中i)重鏈CDR3包含選自SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；以及ii)輕鏈CDR3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含重鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)包括包含氨基酸序列(D/T)MYMS (SEQ ID NO: 8)的 CDRl ;包含氨基酸序列 RIDPAN(A/E/G) HTNY (A/D) (P/Q) KFQ (A/G) (SEQ ID NO: 11)的 CDR2 ;和包含氨基酸序列 SYYYY(A/N)MD (A/F/S/V/Y) (SEQ IDNO:14)的 CDR3。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體包含輕鏈可變區(qū)，所述輕鏈可變區(qū)包括包含氨基酸序列(R/S) AS (Q/S) SVSYMH (SEQ ID NO :22)的 CDRl ;包含氨基酸序列(G/L) (T/V)F(N/R) (L/R)A(S/T) (SEQ ID NO :25)的 CDR2 ;和包含氨基酸序列 LQWSSDPPT (SEQ ID NO :26)的CDR3。在一些實施方案中，重鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID NO: 32的氨基酸序列的FRl ;包含SEQ ID NO: 33的氨基酸序列的FR2 ;包含SEQ IDNO: 34的氨基酸序列的FR3 ;和包含SEQID N0:35的氨基酸序列的FR4。這些鑒定的氨基酸序列可以具有一個或多個替代的氨基酸(例如，來自親和力成熟)或一個 或兩個保守替代氨基酸。在一些實施方案中，輕鏈可變區(qū)包括包含SEQ ID NO: 36的氨基酸序列的FRl ;包含SEQ ID NO: 37的氨基酸序列的FR2 ;包含SEQ ID NO: 38的氨基酸序列的FR3 ;和包含SEQID N0:39的氨基酸序列的FR4。這些鑒定的氨基酸序列可以具有一個或多個替代的氨基酸(例如，來自親和力成熟)或一個或兩個保守替代氨基酸。本發(fā)明的抗PCSK9抗體的可變區(qū)在其全長上一般與相應(yīng)的人種系可變區(qū)氨基酸序列具有至少約 85%、例如至少約 89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或100%的總體可變區(qū)(例如，F(xiàn)R1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4)氨基酸序列同一性。例如，抗PCSK9抗體的重鏈可以與人種系可變區(qū)Vhl-02具有至少約85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性?？筆CSK9抗體的輕鏈可以與人種系可變區(qū) VK3L6 具有至少約 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%的氨基酸序列同一性。在一些實施方案中，僅對構(gòu)架區(qū)中的氨基酸進行添加、缺失或替代。在一些實施方案中，序列同一性比較不包括⑶3。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體包含與SEQ ID NO:40的重鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，和包含與SEQ ID NO: 41的輕鏈可變區(qū)(S卩，共有序列)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體包含與SEQ ID N0:1的重鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，和包含與SEQ ID NO: 15的輕鏈可變區(qū)(即，小鼠LFU720)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體包含與SEQ ID N0:2的重鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，和包含與SEQ ID NO: 16的輕鏈可變區(qū)(S卩，LGT-209)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體包含與SEQ ID N0:2的重鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，和包含與SEQ ID NO: 18的輕鏈可變區(qū)(S卩，LGT-210)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體包含與SEQ ID N0:4的重鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的重鏈可變區(qū)，和包含與SEQ ID NO: 16的輕鏈可變區(qū)(S卩，LGT-211)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的氨基酸序列同一性的輕鏈可變區(qū)。
在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體包含與SEQ ID N0:3的重鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的重鏈多肽，和包含與SEQ ID NO: 17的輕鏈可變區(qū)(S卩，LGT-209)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的輕鏈多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體包含與SEQ ID N0:3的重鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的重鏈多肽，和包含與SEQ ID NO: 19的輕鏈可變區(qū)(S卩，LGT-210)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的輕鏈多肽。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體包含與SEQ ID N0:5的重鏈可變區(qū)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的重鏈多肽，和包含與SEQ ID NO: 17的輕鏈可變區(qū)(S卩，LGT-211)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的氨基酸序列同一性的輕鏈多肽。對于鑒定的長度小于20個氨基酸的氨基酸序列，可以耐受一個或兩個保守氨基酸殘基替代而仍然保留期望的特異性結(jié)合和/或拮抗劑活性。本發(fā)明的抗PCSK9抗體與PCSK9結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Kd) —般小于約10_8M或1(T9M，例如，小于約KTiqM或l(TnM，在一些實施方案中小于約KT12M或1(T13M。任選地，可以根據(jù)本發(fā)明的方法多聚化和使用抗PCSK9抗體。抗PCSK9抗體可以是全長四聚體抗體(即，具有兩條輕鏈和兩條重鏈)、單鏈抗體(例如，scFv)、或包含抗體片段的分子，所述抗體片段形成一個或多個抗原結(jié)合位點并賦予PCSK9結(jié)合特異性，例如，包含重鏈和輕鏈可變區(qū)的分子(例如，F(xiàn)ab’或其它類似的片段)。本發(fā)明還提供編碼本文中描述的抗體的多核苷酸，例如，編碼如本文中描述的重鏈或輕鏈可變區(qū)或包含互補決定區(qū)的片段的多核苷酸。在一些實施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與選自SEQ ID NO:42, SEQ ID N0:43和SEQ ID NO:54的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與選自SEQ ID NO:44,SEQ ID N0:45和SEQ ID N0:55的多核苷酸具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一I"生。在一些實施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與SEQ ID N0:42的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與SEQ ID NO:45的多核苷酸(即，LGT-209)具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與選自SEQ ID N0:42的多核苷酸具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與選自SEQ ID N0:44的多核苷酸(即，LGT-210)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與選自SEQ ID N0:43的多核苷酸具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與選自SEQ ID N0:45的多核苷酸(即，LGT-211)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼重鏈的多核苷酸與SEQ ID N0:54的多核苷酸具有至少85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。在一些實施方案中，編碼輕鏈的多核苷酸與SEQ ID N0:55的多核苷酸(即，小鼠LFU720)具有至少 85%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的核酸序列同一性。3.用于鑒定抗PCSK9抗體的測定試驗可以通過產(chǎn)生抗PCSK9抗體，然后測試每個抗體減少或抑制PCSK9介導(dǎo)的事件(例如，與LDLR結(jié)合，促進LDLR降解)的能力，以鑒定拮抗劑抗體?？梢栽隗w外或體內(nèi)進行該測定試驗。優(yōu)選與PCSK9結(jié)合、不阻止PCSK9與LDLR結(jié)合、和減少或抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解的抗體。
可以使用本領(lǐng)域已知的方法測定抗體或抗原結(jié)合分子與PCSK9的結(jié)合，所述方法包括但不限于ELISA、Biacore和Western印跡。也可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法，測定PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解。在一些實施方案中，使用輸注小鼠模型，測定抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子抑制LDLR降解的能力。將抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子經(jīng)靜脈輸注(例如，3iig/小時)到小鼠中，測定肝臟膜制品中LDLR水平，并與來自接受了靜脈輸注對照抗體(例如，與不相關(guān)的抗原結(jié)合的抗體)的小鼠的肝臟膜制品中LDLR水平相比較。與接受了對照抗體的小鼠相比較，接受了拮抗劑抗PCSK9抗體的小鼠將具有可檢測地更高水平(例如，至少高10%、20%、50%、80%、100%)的LDLR。也可以測試抗PCSK9拮抗劑抗體在降低血漿LCL-C、非HDL-C和/或總膽固醇水平上的治療功效。將抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子經(jīng)靜脈輸注(例如，3 y g/小時)到哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、非人靈長類動物、人)中，測定血漿LCL-C、非HDL-C和/或總膽固醇水平，并與來自治療前的相同哺乳動物或來自接受了靜脈輸注對照抗體(例如，與不相關(guān)的抗原結(jié)合的抗體)的哺乳動物的血漿LCL-C、非HDL-C和/或總膽固醇水平相比較。與治療前的哺乳動物或接受了對照抗體的哺乳動物相比較，接受了拮抗劑抗PCSK9抗體的哺乳動物將具有可檢測地更低(例如，低至少10%、20%、50%、80%、100%)的血漿LCL-C、非HDL-C和/或總膽固醇水平。4.包含抗PCSK9抗體的組合物本發(fā)明提供了藥物組合物，其包含本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子，所述抗體或抗原結(jié)合分子與藥學(xué)上可接受載體配制在一起。組合物可以還包含其它適用于治療或預(yù)防給定失調(diào)的治療劑。藥學(xué)載體增強或穩(wěn)定組合物，或便于組合物的配制。藥學(xué)上可接受載體包括生理可接受的溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等。可以用本領(lǐng)域已知的多種方法對本發(fā)明的藥物組合物進行給藥。給藥的途徑和/或模式根據(jù)期望結(jié)果而不同。優(yōu)選通過靜脈、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、或皮下給藥，或給藥到目標位置的附近。藥學(xué)上可接受載體應(yīng)該適合于靜脈、肌內(nèi)、皮下、腸胃外、鼻內(nèi)、吸入、脊柱、或表皮給藥(例如，通過注射或輸注)。根據(jù)給藥的途徑，可以將活性化合物(即，抗體、雙特異性和多特異性分子)包在包衣料中，以保護化合物免受可造成化合物失活的酸和其它自然條件的作用。
可以將抗體，單獨或與其它合適的組分組合，制成氣霧劑(即，它們可以被“霧化”)以通過吸入來給藥?？梢詫忪F劑置于加壓的可接受的拋射劑(例如二氯二氟甲烷、丙燒、氣氣等)中。在一些實施方案中，組合物是無菌的和流動的?？梢岳缤ㄟ^使用例如卵磷脂等包衣劑、在分散劑的情況下通過維持所要求的顆粒大小和通過使用表面活性劑來維持恰當(dāng)?shù)牧鲃有?。在許多情況下，優(yōu)選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(例如甘露醇或山梨醇)、和氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中包括延緩吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁或明膠)來實現(xiàn)注射型組合物的長期吸收?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域公知和常規(guī)使用的方法，制備本發(fā)明的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體部分地由所給藥的特定組合物，以及由用于組合物給藥的特定方法來確定。因此，存在很多種合適的本發(fā)明藥物組合物制劑。用于配制抗體和確定適當(dāng)劑量及給藥方案的適用方法可以在例如 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第 21版，University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams 和 Wilkins編輯(2005)中，和在 Martindale: The Complete Drug Reference, Sweetman, 2005, London:Pharmaceutical Press 中，和在 Martindale, Martindale:The Extra Pharmacopoeia,第 31 版，1996，Amer Pharmaceutical Assn 和 Sustained and Controlled Release DrugDelivery Systems, J. R. Robinson 編輯，Marcel Dekker, Inc. , New York, 1978 中找到，由此將其每一均通過引用的方式并入本文。優(yōu)選在GMP條件下制備藥物組合物。一般在本發(fā)明藥物組合物中使用抗PCSK9抗體的治療有效劑量或有用劑量。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法，將抗PCSK9抗體配成藥學(xué)上可接受的劑型。調(diào)整給藥方案以提供期望的反應(yīng)(例如，治療反應(yīng))。在確定治療或預(yù)防有效劑量中，可以先低劑量給藥，然后逐步增加直到獲得期望的反應(yīng)而具有最小的或沒有不需要副作用。例如，可以給予單個的大劑量(bolus)，可以在一段時間內(nèi)給予幾個分劑量，或可以依據(jù)治療情形的緊迫性，按比例減少或增加劑量。特別有利的是，以單位劑量形式配制腸胃外組合物，以易于給藥和達成劑量的均一性。如本文中使用的單位劑量形式指合適作為單一劑量用于待治療的受試者的物理上分離的單位；每個單位包含預(yù)先確定的量的活性化合物，所述量經(jīng)計算可以在與所需藥物載體結(jié)合的情況下產(chǎn)生期望的治療效果。為了獲得對特定的患者、組合物和給藥模式可以有效達到期望治療反應(yīng)而對患者沒有毒性的活性成分的量，本發(fā)明的藥物組合物中活性成分的實際劑量水平可以是變化的。所選擇的劑量水平取決于多種藥物動力學(xué)因素，所述因素包括所使用的特定本發(fā)明組合物或其酯、鹽或酰胺的活性，給藥途徑，給藥時間，所使用的特定化合物的排泄速率，治療持續(xù)時間，與所使用的特定組合物結(jié)合使用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)，所治療的患者的年齡，性別，體重，狀況，一般健康狀況和以前的病史等因素。在一些實施方案中，藥物組合物包含抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子和第二藥的混合物。例如，組合物可以包含本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子和已知有利于降低膽固醇(包括LDL-C、非HDL-C和總膽固醇)和/或升高HDL-C的試劑?？膳c本發(fā)明抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子包含于混合物中的示例性第二藥包括但不限于HMG-CoA還原酶抑制劑(即，他汀類藥)、貝特類藥(例如，氯貝特(clofibrate)、吉非貝特(gemfibrozil)、非諾貝特(fenofibrate)、環(huán)丙貝特(ciprofibrate)、苯扎貝特(bezafibrate))、煙酸(niacin)及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑(例如，消膽胺(cholestyramine)、降膽寧(colestipol)、colesvelam)、回腸膽汁酸轉(zhuǎn)運(IBAT)抑制劑、甲狀腺激素模擬物(例如，化合物KB2115)、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR) a和Y雙重激動劑、酰基輔酶A: 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)抑制劑、Niemann Pick Cl-樣I (NPCl-Ll)抑制劑(例如，依折麥布(ezetimibe))、ATP結(jié)合盒(ABC)蛋白G5或G8的激動齊U、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoBlOO的抑制性核酸。降脂藥在本領(lǐng)域已知，其描述于例如Goodman and Gilman’s The PharmacologicalBasis of Therapeutics,第 11 版，Brunton, Lazo 和 Parker 編輯，McGraw-Hi 11 (2006) ; 2009Physicians，Desk Reference (PDR),例如，第 63 版(2008), Thomson PDR 中。 可以用于本發(fā)明組合物中的另外的降脂藥描述和/或綜述于例如 Chang 等，Curr Opin Drug Disco Devel(2002) 5 (4) :562-70;Sudhop等，Drugs (2002)62 (16):2333-47;Bays 和 Stein,Expert Opin Pharmacother (2003)4(11) :1901-38;KasteIein,Int J Clin Pract Suppl(2003)Mar(134):45-50;Tomoda和 Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89;Tenenbaum 等，Adv Cardiol(2008)45:127-53;Tomkin, Diabetes Care (2008)31 (2):S241-S248;Lee 等，J MicrobiolBiotechnol (2008) 18 (11) : 1785-8; Oh 等，Arch Pharm Res (2009) 32 (I) : 43-7; Birch 等，JMed Chem(2009) 52 (6) : 1558-68;以及 Baxter 和 Webb, Nature Reviews Drug Discovery(2009)8:308-320 中。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子作為與他汀類藥的混合物來提供。示例性的他汀類藥包括但不限于阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子作為與誘發(fā)高膽固醇血癥或甘油三酯血癥的藥的混合物來提供。例如，該第二藥可以是蛋白酶抑制劑，例如沙奎那韋(Saquinavir)、利托那韋(Ritonavir)、卻地那韋(Indinavir)、奈非那韋(Nelf inavir)、安普那韋(Amprenavir)、洛匹那韋(Lopinavir)、阿扎那韋(Atazanavir) >福沙那韋(Fosamprenavir)、替拉那韋(Tipranavir)、達蘆那韋(Darunavir)、阿巴卡韋-拉米夫定-齊多夫定(abacavir-lamivudine-zidovudine)(三協(xié)唯(Trizivir))。在一些實施方案中，第二藥為他克莫司(Tacrolimus)。5.使用抗PCSK9抗體的方法a.以抗PCSK9抗體治療的病況本發(fā)明的抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子可用于治療由PCSK9的活性或過度活性介導(dǎo)的任何疾病狀況。例如，由于多種原因或病因而患有或有危險患有血脂異?；蚋吣懝檀佳Y的個體可以受益于本發(fā)明的抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子的施用。例如，個體可以患有家族或遺傳傳遞的純合性或雜合性高膽固醇血癥，其中存在功能性LDL-R。與家族或遺傳傳遞的高膽固醇血癥相關(guān)的或引起該病的遺傳突變概述于例如Burnett和Hooper, ClinBiochem Rev (2008) 29 (I) : 11-26中。個體也可以患有其它疾病狀況、或從事有助或增加血脂異?；蚋吣懝檀佳Y患病風(fēng)險的行為。例如，個體可以是肥胖的、或患有糖尿病或代謝綜合癥。個體可以是吸煙者、具有久坐不動的生活方式、或高膽固醇飲食。靶向PCSK9可以用于降低、逆轉(zhuǎn)、抑制或阻止血脂異常、高膽固醇血癥和餐后甘油三酯血癥。見例如，Le May 等，Arterioscler Thromb Vasc Biol (2009) 29 (5) : 684-90; Seidah, Expert Opin Ther Targets(2009) 13 (I):19-28;和Poirier等，J Biol Chem(2009)PMID 19635789。因此，本發(fā)明的抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子的用藥可用于在有需要的個體中降低、逆轉(zhuǎn)、抑制或阻止血脂異常、高膽固醇血癥和餐后甘油三酯血癥。本發(fā)明的抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子可用于在有需要的個體中減少或降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。個體可以具有持續(xù)升高的LDL-C水平。在一些實施方案中，個體的LDL-C血漿水平持續(xù)高于80mg/dL，例如高于90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL或更高。本發(fā)明的抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子也可用于在有需要的個體中減少或降低非高密度脂蛋白膽固醇(非HDL-C)或總膽固醇。個體可以已經(jīng)服用了其它藥來降低膽固醇，并抵抗或不耐受該藥。例如，個體可以已經(jīng)在他汀類藥物治療方案下，該方案可能已經(jīng)被證明在該個體中在將LDL-C、非HDL-C或總膽固醇降低到可接受的水平上是無效的。個體也可以是不耐受他汀類用藥的。將本發(fā)明的抗PCSK9拮抗劑抗體和抗原結(jié)合分子與可以用于降低LDL-C或非HDL-C和/或升高HDL-C的第二藥聯(lián)合施用，將例如，通過允許施用較低劑量的第二藥，而提高第二藥的功效和耐受性。在一些實施方案中，個體在PCSK9基因中含有功能獲得性突變，例如導(dǎo)致LDLR的降解異常增加的突變。在一些實施方案中，個體正在接受誘發(fā)血脂異?；蚋吣懝檀佳Y的藥劑，S卩，個體患有藥物誘導(dǎo)性血脂異常或高膽固醇血癥。例如，個體可以正在接受蛋白酶抑制劑治療方案，例如，用于治療HIV感染。另一種已知導(dǎo)致血漿甘油三酯水平升高的藥是他克莫司(Tacix)Iimus)，它是一種給移植患者施用的免疫抑制性藥物。環(huán)孢菌素已經(jīng)被證實顯著增加LDL。見例如，Ballantyne等，(1996) 78 (5) : 532-5。第二代抗精神病藥(例如，阿立哌唑(aripiprazole)、氯氮平(clozapine)、奧氮平(olanzapine)、喹硫平(quetiapine)、利培酮(risperidone)和齊拉西酮(ziprasidone))也已經(jīng)與血脂異常相關(guān)。見例如，Henderson, J Clin Psychiatry(2008)69(2):e04 和 Brooks 等，Curr PsychiatryRep (2009) 11(1) : 33-40。b.抗PCSK9抗體的施用醫(yī)生或獸醫(yī)可以以低于達到期望療效所需水平的劑量水平，開始藥物組合物中本發(fā)明抗體的劑量，然后逐漸增加劑量直到獲得期望效果。通常，本發(fā)明的組合物的有效劑量根據(jù)許多不同的因素而變化，所述因素包括待治療的特定疾病或狀況、給藥的方式、靶點、患者的生理狀態(tài)、患者是人還是動物、所施用的其它藥物、和治療是預(yù)防性還是治療性的。需要滴定治療劑量以優(yōu)化安全性和功效。對于抗體用藥，劑量范圍從約0. 0001至IOOmg/kg、更通常為0. 01至5mg/kg宿主體重。例如，劑量可以是lmg/kg體重或10mg/kg體重或在l-10mg/kg范圍內(nèi)。可以每天、每周、每兩周、每月或，按需要或期望，更頻繁地或頻度較低地用藥。示例性治療方案是每周一次、每兩周一次、或每月一次或每3至6月一次施用。
在一些實施方案中，施用編碼本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子的多核苷酸。在藥劑為核酸的實施方案中，典型的劑量可以是約0. lmg/kg體重直到和包括約IOOmg/kg體重，例如，在約lmg/kg體重至約50mg/kg體重之間。在一些實施方案中，約1、2、3、4、5、10、15、20、30、40 或 50mg/kg 體重?？梢詥蝿┗蚍謩┝渴┯每贵w。通常多次施用抗體。單次劑量之間的時間間隔可以，按需要或期望的，是一周一次、兩周一次、一月一次或一年一次。時間間隔也可以是不定的，由測量患者中血液抗PCSK9抗體的水平來指示。在一些方法中，調(diào)整劑量以使血漿抗體濃度達到I - IOOOii g/ml，在一些方法中達到25-300 ii g/ml?？蛇x地，在需要較低頻率給藥時，可以將抗體以持久釋放制劑的形式施用。劑量和頻率隨患者中抗體的半衰期而變化。通常，人源化抗體表現(xiàn)比嵌合抗體和非人抗體更長的半衰期。給藥的劑量和頻率可以隨治療是預(yù)防性的還是治療性的而變化。在預(yù)防性應(yīng)用中，可以在一段長時間內(nèi)，按相對不頻繁的時間間隔，施用相對低的劑量。一些患者在其生命的剩余時間內(nèi)持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時需要以相對短的時間間隔施用相對高的劑量，直到疾病的發(fā)展被減弱或終止，優(yōu)選直到患者的疾病癥狀表現(xiàn)出部分或完全改善。此后，患者可以采用預(yù)防性方案。在一 些實施方案中，當(dāng)患者中血漿LDL-C水平升高到預(yù)先確定的閾值水平以上時，例如至少約80mg/dL,例如至少約 90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190mg/dL 或更高時，施用抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合劑。c.與第二藥的共施用PCSK9抗體拮抗劑可以與已知有利于降低膽固醇(包括LDL-C、非HDL-C和總膽固醇)和/或升高HDL-C的藥組合使用。活性劑可以與抗PCSK9拮抗劑抗體以混合物的形式一起施用，或者每一種活性劑可以分開地施用?？贵w活性劑和其它活性劑可以但不必須同時用藥。用于與本發(fā)明的抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子一起共施用的示例性第二藥包括但不限于HMG-CoA還原酶抑制劑(即，他汀類藥)、貝特類藥(例如，氯貝特、吉非貝特、非諾貝特、環(huán)丙貝特、苯扎貝特)、煙酸(niacin)及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑(例如，消膽胺、降膽寧、colesvelam)、回腸膽汁酸轉(zhuǎn)運(IBAT)抑制劑、甲狀腺激素模擬物(例如，化合物KB2115)、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR) a和Y雙重激動劑、?；o酶A: 二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制齊U、?；o酶A:膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶(ACAT)抑制劑、Niemann Pick Cl-樣I (NPCl-Ll)抑制劑(例如，依折麥布(ezetimibe))、ATP結(jié)合盒(ABC)蛋白G5或G8的激動劑、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoBlOO的抑制性核酸。另外有用的降脂藥描述和/或綜述于例如Chang等，Curr Opin Drug DiscoDevel (2002) 5 (4) : 562-70; Sudhop 等，Drugs (2002) 62 (16) : 2333-47; Bays 和 Stein, ExpertOpin Pharmacother(2003)4(11):1901-38;Kastelein, Int J Clin Pract Suppl (2003)Mar (134):45-50;Tomoda 和 Omura, Pharmacol Ther (2007) 115(3):375-89;Tenenbaum等,Adv Cardiol(2008)45:127-53;Tomkin, Diabetes Care(2008)31(2):S241-S248;Lee等，JMicrobiol Biotechnol(2008) 18(11) : 1785-8;0h 等，Arch PharmRes(2009)32(I):43-7;Birch 等，J Med Chem(2009)52 (6):1558-68;以及 Baxter 和Webb, Nature Reviews Drug Discovery(2009)8:308-320。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與他汀類藥一起共施用。示例性的他汀類藥包括但不限于阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與誘發(fā)高膽固醇血癥或甘油三酯血癥的藥劑一起共施用。例如，第二藥可以是蛋白酶抑制劑，例如沙奎那韋(Saquinavir)、利托那韋(Ritonavir)、卻地那韋(Indinavir)、奈非那韋(Nelfinavir) >安普那韋(Amprenavir)、洛匹那韋(Lopinavir)、阿扎那韋(Atazanavir)、福沙那韋(Fosamprenavir)、替拉那韋(Tipranavir)、達蘆那韋(Darunavir)、阿巴卡韋-拉米夫定-齊多夫定片(abacavir-lamivudine-zidovudine)(三協(xié)唯(Trizivir))。在一些實施方案中，第二藥為他克莫司(Tacrolimus)。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與特異靶向PCSK9或apoBlOO的抑制性核酸(例如，siRNA、miRNA、反義序列、核酶)一起共施用。6.藥盒本發(fā)明的藥物組合物可以以藥盒的形式提供。在某些實施方案中，本發(fā)明的藥盒 包含如本文中描述的抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子?？筆CSK9抗體或抗原結(jié)合分子可以以均一的或變化的劑量提供。在一些實施方案中，藥盒包含如本文中描述的一種或多種第二藥。第二藥可以與抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子在相同的制劑中或在分開的制劑中提供。第一和第二藥的劑量各自獨立地可以是均一的或變化的。在一些實施方案中，藥盒包含PCSK9抗體拮抗劑和一種或多種已知有利于降膽固醇(包括LDL-C、非HDL-C和總膽固醇)和/或升高HDL-C的藥。用于與本發(fā)明的抗PCSK9拮抗劑抗體或抗原結(jié)合分子一起包含在藥盒中的示例性第二藥包括但不限于，HMG-CoA還原酶抑制劑(S卩，他汀類藥)、貝特類藥(例如，氯貝特、吉非貝特、非諾貝特、環(huán)丙貝特、苯扎貝特)、煙酸(niacin)及其類似物、膽固醇吸收抑制齊U、膽汁酸螯合劑(例如，消膽胺、降膽寧、colesvelam)、回腸膽汁酸轉(zhuǎn)運(IBAT)抑制劑、甲狀腺激素模擬物(例如，化合物KB2115)、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR) a和Y雙重激動劑、酰基輔酶A: 二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、?；o酶A:膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT)抑制劑、Niemann Pick Cl-樣I (NPCl-Ll)抑制劑(例如，依折麥布(ezetimibe))、ATP結(jié)合盒(ABC)蛋白G5或G8的激動劑、膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoBlOO的抑制性核酸?？梢杂糜谒幒械牧硗獾慕抵幟枋龊?或綜述于例如Chang等，Curr OpinDrug Disco Devel (2002)5 (4):562-70;Sudhop 等,Drugs(2002)62(16):2333-47;Bays和 Stein,Expert Opin Pharmacother (2003)4 (I I) :1901-38;Kastelein, Int JClin Pract Suppl (2003)Mar (134):45-50;Tomoda 和 Omura,Pharmacol Ther (2007) 115 (3):375-89;Tenenbaum 等,Adv Cardiol (2008)45:127-53;Tomkin, DiabetesCare (2008) 31(2) : S241-S248; Lee 等，J Microbiol Biotechnol (2008) 18 (11) : 1785-8; Oh等，ArchPharm Res (2009) 32 (I) : 43-7; Birch 等，J Med Chem (2009) 52 (6) : 1558-68;以及Baxter and Webb, Nature Reviews Drug Discovery(2009)8:308-320 中。在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與他汀類藥一起在藥盒中提供。示例性的他汀類藥包括但不限于阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
在一些實施方案中，本發(fā)明的抗PCSK9抗體或抗原結(jié)合分子與誘發(fā)高膽固醇血癥或甘油三酯血癥的藥劑一起在藥盒中提供。例如，第二藥可以是蛋白酶抑制劑，例如沙奎那韋(Saquinavir)、利托那韋(Ritonavir)、卻地那韋(Indinavir)、奈非那韋(Nelfinavir) >安普那韋(Amprenavir)、洛匹那韋(Lopinavir)、阿扎那韋(Atazanavir)、福沙那韋(Fosamprenavir)、替拉那韋(Tipranavir)、達蘆那韋(Darunavir)、阿巴卡韋-拉米夫定-齊多夫定片(abacavir-lamivudine-zidovudine)(三協(xié)唯(Trizivir))。在一些實施方案中，第二藥為他克莫司(Tacrolimus)。實施例提供了以下實施例來對本發(fā)明進行舉例說明而不是加以限制。實施例I :Pcsk9拮抗劑NVPLFU720的產(chǎn)生和鑒定概述進行了產(chǎn)生抗Pcsk9的功能性抗體拮抗劑的研究。鑒定出了多個雜交瘤，這些雜交瘤分泌能夠與加His標簽的該蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體。對來自雜交瘤的抗體進行功能性拮抗劑活性的評估，所述活性由抗體抑制HepG2細胞上Pcsk9介導(dǎo)的LDL受體降解(從而導(dǎo)致這些細胞攝取LDL膽固醇的能力增加)的能力來度量。鑒定出了強效功能性鼠抗人Pcsk9IgGl-K單克隆抗體，將其命名為NVP-LFU720 (LFU720)。方法抗原和其它蛋白質(zhì)通過HEK293Freestyle 細胞(Invitrogen, Carlsbad, Ca)的轉(zhuǎn)染，產(chǎn)生分泌人Pcsk9蛋白的穩(wěn)定表達細胞系。簡言之，使用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑和具有mellittin 信號序列、成熟 Pcsk9cDNA(aa 31-692)和在序列 C 端上的 his6 (SEQ ID NO:57)標簽(由E. Hampton克隆，GNF, NPL 010051)的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染在BioCoat搖瓶(BectonDickinson)上以貼壁模式在補加了 10%胎牛血清的Freestyle 培養(yǎng)基(Invitrogen)中培養(yǎng)的細胞。轉(zhuǎn)染后48小時，通過向培養(yǎng)基中加入IOOii g/mL Zeocin，開始陽性轉(zhuǎn)染子的選擇。4周后，形成了 4個生產(chǎn)Pcsk9的細胞的穩(wěn)定細胞池。使生產(chǎn)水平最高的4號池在Freestyle 培養(yǎng)基中適應(yīng)無血清懸浮條件，隨后按比例擴大，以使用Wave 生物反應(yīng)器在10-20L生產(chǎn)量的規(guī)模上進行大規(guī)模生產(chǎn)。隨著時間進行幾輪后，獲得以12至30mg/L的速率生產(chǎn)的重組蛋白。收獲細胞上清液，通過交叉流過濾進行濃縮。將得到的濃縮液以0. 5mL/分鐘加載到25mL NiNTA His-BindSuperflow 柱(以 50mM Tris/300mM NaCl/lmM CaC12/2mM P -巰基乙醇(pH 7.4)進行平衡)。在以 50mMTris/300mM NaCl/20mM咪唑(pH 7. 4)進行基線洗滌后，以 50mMTris/300mMNaCl/250mM咪唑(pH 7.4)洗脫結(jié)合的物質(zhì)。將得到的洗脫物對PBS (pH 7.3)透析，過濾除菌和進行等分。通過分析性大小排阻色譜，分析樣品，以確定低聚化。純化的蛋白質(zhì)得到的HPLC色譜顯示出兩個峰，主峰占85%。全長蛋白質(zhì)的HPLC-ESI MS分析揭示了質(zhì)量58176. ODa,這與從所有半胱氨酸殘基均被氧化的mellitin_hsPcsk9 aa31_692_His預(yù)期的質(zhì)量相符。部分樣品還被N糖基化。約13kD質(zhì)量的污染性蛋白最可能是蛋白質(zhì)的游離原結(jié)構(gòu)域(pro-domain)。再次使用在Freestyle培養(yǎng)基中無血清懸浮培養(yǎng)的HEK293 Freestyle細胞，以大規(guī)模瞬時表達的方法，生產(chǎn)了來自小鼠和食蟹猴的Pcsk9的相應(yīng)同源物。使用聚乙烯亞胺作為質(zhì)粒DNA的載體，按1:3 (ii g/mL: u g/mL DNA: PEI)的比例，將重組質(zhì)?！哂刑烊磺皩?dǎo)序列和C末端his6 (SEQ ID N0:57)標簽特征的小鼠Pcsk9 cDNA和具有CD33
前導(dǎo)序列和C末端his6 (SEQ ID NO: 57)標簽特征的cyno Pcsk9-轉(zhuǎn)染到Freestyle細
胞中。在Wave 生物反應(yīng)器中，以10升的規(guī)模進行多輪生產(chǎn)，以類似于上文描述的用于人Pcsk9蛋白的操作程序，進行蛋白質(zhì)純化和表征。小鼠Pcsk9蛋白的產(chǎn)率在0. 7至2. 7mg/L培養(yǎng)基之間，cyno Pcsk9以3. lmg/L獲得。產(chǎn)生雜交瘤免疫小鼠和產(chǎn)生雜交瘤在免疫Bcl-2轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6-Tgn(bcl-2)22wehi品系)之前，以弗氏完全 佐劑按1:1稀釋純化的Pcsk9。采用要求多位點重復(fù)免疫(RIMMS)的程序免疫小鼠。簡言之，以1-3 y g的抗原，在接近外周淋巴結(jié)(PLN)的8個特定位點，注射小鼠。在12天內(nèi)重復(fù)該程序6次。在第12天，采集測試血液,使用ELISA分析血清抗體滴度。在第15天，從高滴度小鼠移出合并的PLN。為了收獲淋巴細胞，以plain DMEM洗滌PLN兩次，然后，通過.22微米的濾網(wǎng)(Falcon#352350)來進行離解。在融合前，將得到的淋巴細胞再洗滌2次。按
2.5個淋巴細胞對I個NSO細胞的比例，將NSO/Bcl-2骨髓瘤細胞與淋巴細胞混合。將細胞混合物離心，隨后，在I分鐘內(nèi)將ImL的PEG 1500逐滴加到細胞沉淀中。30秒后，緩慢加入ImL的DMEM，I分鐘后，在5分鐘內(nèi)加入19mL的DMEM。沉淀融合的細胞，以2x IO5個細胞/mL 的密度重懸浮在 HAT 培養(yǎng)基(DMEM+20%FBS, Pen/Strep/Glu, Ix NEAA, Ix HAT, 0. 5xHFCS)中，于37°C放置I小時。然后將細胞按每孔60 ii L加到384孔板中。篩選分泌抗Pcsk9的功能性抗體的雜交瘤融合后10天，對雜交瘤平板篩選Pcsk9特異性抗體的存在。為了進行ELISA篩選，以 50 ii L 的 Pcsk9 包被 Maxisorp 384 孔板(Nunc#464718)(于 PBS 中稀釋到 15ng/ 孔)，于4°C孵育過夜。吸除剩余的蛋白質(zhì)，以于PBS中1%的BSA封閉孔室。在于室溫下孵育30分鐘后，以PBS+0. 05%吐溫(PBST)洗滌孔室4次。將15 y L雜交瘤上清液轉(zhuǎn)移到ELISA平板中。將15iiL在移出PLN時采取的小鼠血清按1:1000稀釋在PBS中，作為陽性對照加入。在ELISA平板上的所有孔中加入50 ii L 二抗(山羊抗小鼠IgG - HRP (Jackson ImmunoResearch#l 15-035-071),按1:5000稀釋在PBS中)。在于室溫下孵育I小時后，以PBST洗滌平板8次。加入25 ii L TMB (KPL#50-76-05)，于室溫孵育30分鐘后，在605nm處讀取平板吸光度。將來自陽性孔的細胞擴大至24孔板的HT培養(yǎng)基(DMEM+20%FBS，Pen/Strep/Glu, Ix NEAA, Ix HT, 0. 5x HFCS)中。抗體純化使用蛋白G(Upstate#16_266 (Billerica, MA))純化包含 LFU720 的上清液。在加載上清液之前，以10倍柱體積的PBS平衡樹脂。在樣品結(jié)合后，以10倍柱體積的PBS洗滌柱，然后以5倍柱體積的0. IM甘氨酸(pH 2.0)洗脫抗體。立即以1/10體積的Tris HCl (pH9.0)中和柱級分。測量級分的0D280，合并陽性級分，將其對PBS (pH 7.2)透析過夜。結(jié)合動力學(xué)和Biacore測定使用光學(xué)生物傳感器Biacore S51，通過表面等離子共振測量，測定動力學(xué)結(jié)合參數(shù)。該技術(shù)允許無標記測定配體與受體的結(jié)合CO和解離(kd)微觀速率常數(shù)。因此，它特別適合于表征抗體-抗原相互作用。
通過以事先固定在S系列CM_5Biacore傳感器芯片(經(jīng)認證的)(Biacore#BR-1005-30)上的兔抗小 U Fcy 抗體(Biacore#BR-1005-14)捕獲小鼠抗體 LFU720，進行 Pcsk9 與 LFU720 (2 u g/mL)的結(jié)合研究。以 ‘Amine Coupling 試齊[J盒’(Biacore#BR-1000-50)進行Fe Y捕獲抗體的共價結(jié)合。以IOyl/分鐘的流速，將捕獲抗體(兔抗小鼠)，以IOmM乙酸鈉(pH 5)中的50 ii g/mL抗Fe Y抗體溶液(Biacore#BR-1003-51)，結(jié)合到EDC活化的葡聚糖表面。使0. 5 y M至7. 8nM(2倍系列稀釋)濃度范圍的 Pcsk9，在 PBS 加 IOOmM NaCl, 0. 005%P20 (Biacore#BR-1000-54)中，從捕獲的LFU720芯片上流過。使用Biacore S51評估軟件，分析得到的傳感圖。將從所有濃度得到的數(shù)據(jù)全體地擬合到I: ILangmuir模型上。
TR-FRET 測定在384 孔白色淺平板(Perkin Elmer, 6008280)中進行 TR-FRET 測定。在 15 y L的測定緩沖液(20mM HEPES, pH 7. 2，150mM NaCl, ImMCaCl2，0. l%v/v 吐溫 20 和 0. l%w/v BSA)中，將hPcsk9-AF (10. 7nM)與系列稀釋的未標記的hPcsk9蛋白、EGF-A肽或NVP-LFU720-AX-1抗體室溫孵育30分鐘。隨后，將5 y L于測定緩沖液中的hLDL-R-Eu (4nM)加到hPcsk9和NVP-LFU720-AX-1預(yù)孵育的復(fù)合物中，于室溫孵育90分鐘。這些標記的蛋白質(zhì)的最終濃度為8nM的hPcsk9-AF和InM的hLDL-R-Eu。以EnVision 2100多標記讀取儀(Perkin Elmer)，在330nm激發(fā)和665nm發(fā)射下，測量TR-FRET信號。使用以下公式將數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為經(jīng)標化的數(shù)值[(665nm值X 10，000) / (615nm值)]。用以下公式計算百分比抑制率100-[(處理樣品的標化后數(shù)值/未處理樣品的平均標化后數(shù)值)x 100]。使用Prism第5版，以公式Y(jié)=Bottom+(Top-Bottom)/(1+10' ((LogIC50-X)^HillSlope)) (GraphPad Prism軟件)，繪制百分比抑制劑量反應(yīng)曲線。LDL-R周轉(zhuǎn)率測定以胰蛋白酶處理H印G2細胞，將細胞按每孔6x IO4個細胞種到預(yù)先以l%v/v膠原蛋白包被的平底96孔板(Corning, 3595)中的100 y L培養(yǎng)基中，然后，在5%C02中于37° C孵育24小時。通常，以100 ii L包含hPcsk9蛋白、EGF-A肽和/或NVP-LFU720-AX-1抗體的無血清培養(yǎng)基處理細胞。處理后，棄去培養(yǎng)基，以IOOii L的PBS洗滌細胞。為了收獲細胞，加入 100 ii L 的 Versine (Biowhittaker, 17-771E)，在 5%C02 中于 37。C 孵育 I 小時，隨后加AlOOuL FACS緩沖液。將細胞轉(zhuǎn)移到V形底96孔板(Corning, 3894)中，于1200rpm離心5分鐘，以沉淀細胞。為了封閉細胞上非特異性結(jié)合位點，向每個孔中加入50 ii L IOOiig/mL 于 FACS 緩沖液中的正常兔 IgG(MP biomedicals, 55944)和小鼠 IgG(Sigma, 15381)，在冰上孵育30分鐘。于1200rpm離心細胞5分鐘，通過輕拍平板除去緩沖液。為了標記細胞，向每個孔中加入于FACS緩沖液中的647IgG(5u g/mL)和 10 u L 小鼠抗鐵傳遞蛋白-R-藻紅蛋白(PE) IgG(2 V- g/mL) (CD71, Becton DickinsonBiosciences, 624048)標記的抗體,在冰上孵育60分鐘。于1200rpm離心細胞5分鐘,通過輕拍平板除去緩沖液。通過以每孔200 y L的FACS緩沖液洗滌細胞兩次來除去未結(jié)合的抗體。在于PBS中的1%多聚甲醛中固定細胞，使用BD LSR II流式細胞儀和FACSDIVA軟件(Becton Dickinson),對活細胞進行設(shè)門(gate) (5000)和分析。在488nm激發(fā)和575nm發(fā)射下測量PE熒光的中值。在488nm激發(fā)和633nm發(fā)射下測量Alexa 647熒光的中值。通過Covance (Denver, PA,美國)制備了定制的兔抗hLDL_R多克隆IgG 583，用于H印G2細胞上表面hLDL-R的FACS檢測。對于在H印G2細胞表面上檢測hLDL-R，兔抗hLDL-R IgG 583表現(xiàn)出約7倍于正常兔IgG的窗口。為了確定抗hLDL-R IgG 583對H印G2細胞表面上LDL-R的特異性，用hLDL-R蛋白作為該IgG結(jié)合的競爭劑，進行了實驗。觀察到了隨著hLDL-R蛋白濃度的增加，抗hLDL-R IgG 583對H印G2細胞的平均中值熒光的劑量依賴性降低。這證明，如通過FACS所測量的，抗hLDL-R IgG 583特異地識別IfepG2細胞表面上LDL-R。后期工作直接將標記的抗hLDL-R-583-Alexa 647IgG用于H印G2細胞表面上LDL-R的FACS定量。LDL-C 攝取以胰蛋白酶處理H印G2細胞，將細胞按每孔6x IO4個細胞種到預(yù)先以l%v/v膠原蛋白包被的平底96孔板(Corning, 3595)中的100 yL培養(yǎng)基中，然后，在5%C02中于37° C孵育24小時。除非另作說明，以IOOii L包含hPcsk 9蛋白、EGF-A肽和/或NVP-LFU720-AX-1抗體的無血清培養(yǎng)基處理細胞。處理后，向每個孔加入20 y L于無血清培養(yǎng)基中的30iig/mL 3，3’-雙十八烷基吲哚羰花青標記的低密度脂蛋白(DiI-LDL)(Intracell, RP-077-175)，在5%C02中于37° C孵育2小時。通過輕拍平板，除去培養(yǎng)基，以IOOii L磷酸鹽緩沖鹽水(不含鈣或鎂的PBS, Invitrogen, 14190-144)洗滌細胞。通過輕拍平板，棄去PBS，向每個孔中加入IOOii L 0. 25%的胰蛋白酶-EDTA，在5% C02中于37° C孵育5分鐘。向每個孔中加入100 u L FACS緩沖液(含5%FBS、2mM EDTA和0. 2%疊氮化鈉的PBS)，通過于1200rpm離心5分鐘沉淀細胞。通過輕拍平板，除去培養(yǎng)基,通過向每個孔中加入 50 u L 于 PBS 中的 1%多聚甲醒(Electron Microscopy Sciences, 15710)固定細胞。使用BD LSR II流式細胞儀和FACSDIVA軟件(Becton Dickinson)，對活細胞進行設(shè)門和分析。在488nm激發(fā)和575nm發(fā)射下測量DiI-LDL熒光的中值，分析了 5000個細胞。使用微軟Excel 2002(微軟公司)繪制條形圖。按如下計算活化百分比％活化=[1_(X+A) ]x100，其中X=來自樣品孔的中值熒光讀數(shù)，A=來自僅以hPcsk9處理的孔的中值熒光讀數(shù)。將活化百分比相對于處理，進行繪圖，從使用公式Y(jié)=Bottom+ (Top-Bottom) /(1+10' ((LogEC50-X) X HillSlope))和 GraphPad Prism 5 (GraphPad 軟件)產(chǎn)生的劑量反應(yīng)曲線，確定EC5Q。結(jié)果抗人Pcsk9單克隆抗體的產(chǎn)生從以Pcsk9蛋白免疫的動物的原代淋巴結(jié)，收獲B細胞。使用標準PEG介導(dǎo)的融合，產(chǎn)生了雜交瘤。通過ELISA測定所得到的融合物，鑒定出與人Pcsk9的陽性結(jié)合者，并擴大以產(chǎn)生上清液。隨后通過功能測定，將多個鑒定出的ELISA陽性克隆進行分類。被鑒定為先導(dǎo)候選者的克隆是LFU720。除了我們的先導(dǎo)候選者LFU720以外，也鑒定出了多個其它克隆，這些克隆不能阻斷Pcsk9和LDLr的相互作用(如通過FRET所度量的)，但當(dāng)與Pcsk9結(jié)合時能夠阻斷Pcsk9介導(dǎo)LDLr降解的能力(如通過LDLc攝取來度量的)，包括克隆21D6、5A4-C1和13F1?？寺?1D6也顯示出能夠在體內(nèi)阻斷Pcsk9的LDLr降解作用。針對與Pcsk9的特異性結(jié)合，篩選LFU720通過在ELISA中評估與一系列其它蛋白質(zhì)的結(jié)合，檢測了 LFU720的特異性。將LFU720與三種其它帶HIS標簽的蛋白質(zhì)的結(jié)合，和與Pcsk9-HIS的結(jié)合進行了比較。這證明了與Pcsk9的結(jié)合是特異的，以及抗體不與HIS標簽結(jié)合。
評估LFU720與食蟹猴Pcsk9的結(jié)合測定了 LFU720與Pcsk9的食蟹猴同源物的結(jié)合。為了進行該測定，與Ni捕獲平板一起使用來自表達食蟹猴HIS標簽Pcsk9的細胞的上清液，從而避免純化該材料的需要。稀釋人Pcsk9，也通過其HIS標簽進行捕獲。LFU720與人和食蟹猴Pcsk9都能夠結(jié)合。5P20在ELISA中不與人LDL-R或小鼠Pcsk9結(jié)合。LFU720的結(jié)合動力學(xué)通過使用光學(xué)生物傳感器技術(shù)(Biacore)，分析了識別人Pcsk9蛋白的小鼠抗體LFU720的結(jié)合親和力。發(fā)現(xiàn)LFU720與重組人Pcsk9的結(jié)合具有亞納摩爾親和力(KD=200pM)的高親和力。
LFU720阻斷Pcsk9/LDL_R相互作用的篩選使用TR-FRET測定法來確定抗hPcsk9抗體NVP-LFU720是否能夠破壞hPcsk9_AF與hLDL-R-Eu標記的蛋白質(zhì)之間的相互作用。對未標記的hPcsk9蛋白或EGF-A肽進行評估，以證明該測定法能夠檢測TR-FRET信號(由hLDL-R-Eu與hPcsk9_AF標記的蛋白質(zhì)的相互作用引起)所遭到的破壞。增加濃度的未標記hPcsk9和hPcsk9-AF競爭與hLDL-R-Eu結(jié)合，這導(dǎo)致TR-FRET信號的降低。EGF-A肽破壞了 hLDL-R-Eu與hPcsk9_AF之間的相互作用，其具有2. 5 ii M的IC50。相反，NVP-LFU720不能很好地破壞hPcsk9_Eu與hLDL-R-AF之間的TR-FRET信號，其具有大于IOOOnM的IC50，并在低抗體濃度下表現(xiàn)出U形反應(yīng)。LFU720抑制Pcsk9介導(dǎo)的LDL-R降解的篩選已經(jīng)顯示，Pcsk9與LDL-R的結(jié)合導(dǎo)致LDL-R降解，使用H印G2細胞和重組人Pcsk9對此進行了證實。測定了 LFU720與Pcsk9結(jié)合以及阻斷該效應(yīng)的能力。NVP-LFU720抑制外源hPcsk9處理的HepG2細胞，導(dǎo)致細胞表面LDL-R增加。LFU720抑制Pcsk9和恢復(fù)LDL攝取的篩選Pcsk9介導(dǎo)的LDL-R降解的抑制應(yīng)該導(dǎo)致恢復(fù)H印G2細胞內(nèi)化LDL-C的能力。NVP-LFU720阻止了以外源hPcsk9處理的IfepG2細胞上Pcsk9介導(dǎo)的LDL-R降解，并導(dǎo)致DiI-LDL攝取的增加，EC50為99nM。實施例2 :產(chǎn)生 PCSK9 拮抗劑抗體 NVP-LGT209、NVP-LGT210 和 NVP-LGT211引言該實施例描述了通過改造鼠單克隆PCSK9拮抗劑抗體NVP-LFU720以使其與人種系抗體具有更高的序列同源性，從而產(chǎn)生人抗體NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP LGT211。NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVP LGT211保留了親本鼠抗體NVP-LFU720的表位特異性、親和力、和與食蟹猴PCSK9的交叉反應(yīng)性。比原始鼠抗體，NVP-LGT209、NVP-LGT210和NVPLGT211與人種系序列具有高得多的同源性，因此應(yīng)該更好地被人免疫系統(tǒng)所耐受。將小鼠單克隆抗體LFU720進行Humaneered ，以使其蛋白質(zhì)序列更接近人種系序列和降低其免疫原性。Humaneering 技術(shù)可通過南舊金山的KaloBios (在萬維網(wǎng)kalobios. com上)獲得?？贵w的Humaneering 產(chǎn)生改造的人抗體,其具有與人種系序列高度同源的V區(qū)序列，而仍然保留了親本或參考抗體的特異性和親和力(美國專利公布2005/0255552和2006/0134098)。該程序首先鑒定出參考Fab的重鏈和輕鏈可變區(qū)中的最小抗原結(jié)合特異性決定簇(BSDs)( 一般是重鏈CDR3和輕鏈CDR3中的序列)。由于這些重鏈和輕鏈BSDs在Humaneering 過程中構(gòu)建的所有文庫中都被保留下來，因此每個文庫都是表位聚焦的，且最終的、充分Humaneered 的抗體保留原始鼠抗體的表位特異性。接著，產(chǎn)生完整鏈文庫(其中以人序列的文庫置換整個輕鏈或重鏈可變區(qū))和/或盒文庫(其中以人序列文庫置換小鼠Fab的重鏈或輕鏈可變區(qū)的一部分)。使用細菌分泌系統(tǒng)將文庫的成員表達為抗體Fab片段，使用菌落轉(zhuǎn)印結(jié)合試驗(CLBA)對文庫篩選結(jié)合抗原的Fabs。對陽性克隆進行進一步的表征，以鑒定那些具有最高親和力的克隆。然后，將鑒定到的在剩余的鼠序列背景中支持結(jié)合的人盒，在最終的文庫篩選中組合，以產(chǎn)生完全地人V區(qū)。所得到的Humaneered 的Fabs 具有來自人文庫的V片段序列，保留在⑶R3區(qū)中鑒定的短BSD序列，并具有人種系構(gòu)架區(qū)4。通過將這些重鏈和輕鏈的可變區(qū)克隆到IgG表達載體中，將這些Fabs轉(zhuǎn)化為完整的IgGs。在該過程中產(chǎn)生的完全Humaneered 的抗體保留了親本鼠抗體的結(jié)合特異性，一般具有與親本抗體等同的或比其更高的親和力，并具有在蛋白質(zhì)水平上與人種系抗體基因有高度序列同一性的V區(qū)域。方法鼠V區(qū)的克隆使用RT-PCR，從使用標準方法自雜交瘤細胞系中分離的RNA，擴增鼠單克隆NVP-LFU720的V區(qū)DNA。成功用于自雜交瘤cDNA PCR擴增重鏈可變區(qū)的引物是VH14 (5 ’ -CTTCCTGATGGCAGTGGTT-3’；SEQ ID NO:58)(Chardes T等，1999，F(xiàn)EBS Letters;452(3):386-94)和 HCconstant (5，-GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC-3，;SEQ ID NO:59)。成功用于自雜交瘤cDNA PCR擴增輕鏈(K)可變區(qū)的引物是￥1^4/5(5’-11^6(1'11^160^八丁CAGTG-3，； SEQID NO: 60) (Chardes T 等，1999，同上)和 LCconstant (5，-GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG-3’；SEQ ID NO:61)。對所擴增的重鏈和輕鏈可變區(qū)進行測序。然后，使用PCR擴增V基因和整合用于向KaloBios載體中克隆的限制性酶切位點Vh在NcoI (5’)和NheI (3，)進入KB1292-His,所述KB1292_His是KB1292的經(jīng)修飾的版本，其在CHl上編碼具有氨基酸序列AAGASHHHHHH(SEQ ID NO: 62)的一個C端柔性接頭和6_His (SEQ IDNO:57)標簽;Vk 在 NcoI (5，)和 BsiWI (3，)進入 KB1296。然后，通過以 BssHII 和 ClaI 進行限制性消化和連接，將這些分開的重鏈和輕鏈載體組合成單個的雙順反子KaloBios Fab表達載體。在大腸桿菌中自該載體表達Fab片段。測試該Fab片段與PCSK9抗原的結(jié)合，將其稱為參考Fab SR032。Fab 純化通過使用KaloBios表達載體從大腸桿菌中分泌表達Fab片段。使細胞在2xYT培養(yǎng)基中生長至0D600為約0. 6。通過加入IPTG至100 y M和于33°C搖動4小時，誘導(dǎo)表達。通過滲透裂解從周質(zhì)級分中獲得組裝的Fab,使用Ni-NTA柱(HisTrap HP柱；GE Healthcarecatalog#17-5247-01)，按照標準方法進行親和色譜純化。在包含500mM咪唑的緩沖液中洗脫Fabs，并相對于不含鈣和鎂的PBS (pH 7.4)進行徹底透析。文庫構(gòu)建在文庫構(gòu)建中的第一步，通過KaloBios人V片段文庫序列的PCR擴增，產(chǎn)生表位聚焦的完整人V區(qū)文庫。在制備這些完整鏈文庫中，使用重疊PCR，將包含BSD的獨特⑶R3-FR4區(qū)和來自經(jīng)優(yōu)化的參考Fab SR038的人種系J片段序列連接到人V片段文庫上。不直接篩選這些完整V區(qū)文庫；而是，將它們用作構(gòu)建Vh和Vk中間文庫的模板。根據(jù)在⑶R區(qū)中與原始的鼠Vh和Vk最接近的人種系序列，選擇用于完整鏈文庫構(gòu)建的KaloBios人V片段文庫。原始的鼠NVP-LFU720 Vh在其⑶Rs上與人種系序列Vhl-02最接近，因此，使用包含Vhl亞群成員的兩個KaloBios文庫的混合物(KB1410和KB1411)制備完整Vh文庫。同樣，由于NVP-LFU720Vk在其⑶Rs上與Vk3L6人種系序列最接近，使用包含Vk3亞群成員的兩個KaloBios人V片段文庫的混合物(KB1423和KB1424)制備完整的Vk文庫。然后，以這些全長Vh和Vk文庫作為構(gòu)建盒文庫的模板，在盒文庫中僅部分親本鼠V片段被人序列文庫替代。通過橋式PCR構(gòu)建兩類盒以上述Vhl文庫的混合物(KB1410和KB1411)或Vk3文庫的混合物(KB1423和KB1424)作為模板，擴增了在FR1XDR1、和FR2的前面部分中包含人序列的前端盒。使用上述完整的人Vh區(qū)或Vk區(qū)文庫作為模板，擴增了在FR2的后面部分XDR2和FR3中包含人序列的中間盒。Vh盒在FR2中于氨基酸位置45-49 (Kabat編號)處具有重疊的共同序列；Vk FR2中于氨基酸殘基35-39 (Kabat編號)處具有重疊的共同序列。以這種方式,通過PCR構(gòu)建了人重鏈Vl和Vk 3同種型的前端和中間人盒文庫。將每個Vh盒文庫在NcoI (5’)和KpnI (3’)處克隆到載體KB1292_His中，將每個Vk盒文庫在NcoI (5，)和HindIII (3，)處克隆到載體KB1296-B (KaloBios載體 KB1296的修改版，其在FR4中添加有沉默的HindIII位點)中。然后，通過以BssHII和ClaI進行消化和其后的連接，將所得的Vh或Vk質(zhì)粒文庫與來自經(jīng)優(yōu)化的參考Fab SR038的互補鏈組合(例如，將Vh前端文庫與經(jīng)優(yōu)化的參考Vk載體組合)，以產(chǎn)生表達完整Fabs的雙順反子載體的文庫。一般 ELISA重組人或食蟹猴PCSK9_His6抗原用于所有的ELISA測定。典型地，通過于4°C孵育過夜，將稀釋于PBS (pH 7.4)中的PCSK9-His6抗原，按300ng/孔結(jié)合到96孔微量滴定板中。以于PBS中3%的BSA溶液于37°C封閉該平板I小時，然后以PBST清洗一次。向每個孔中加入包含F(xiàn)ab的誘導(dǎo)的細胞培養(yǎng)基、或稀釋的純化的Fab (50 y L)。在于37°C孵育I小時后，以PBST清洗平板3次。向每個孔加入按1:5000稀釋于PBS中的抗人K鏈HRP綴合物(Sigma#A7164) (50 U 1)，將平板于室溫孵育45分鐘。以PBST洗滌平板3次，然后向每個孔加入100 U LSureBlue TMB底物(KPL#52-00_03)，將平板于室溫孵育約10分鐘。在分光光度計中于650nm處讀取平板。為了對純化的人和小鼠IgGs進行特異性ELISAs，以一組純化的人或鼠抗原，按每孔88ng，包被384孔平板，于4°C孵育過夜。按如上描述封閉和洗滌平板，然后向每個孔中加入22 ii L于PBS中稀釋至2 u g/mL的純化的小鼠或人抗PCSK9抗體。將平板于37°C孵育I小時，然后以 PBST 洗漆。將抗小鼠 Fe 抗體(Jackson ImmunoResearch Labs#115-035-071)或與HRP綴合的抗人K抗體(Sigma#A7164)按1:5000稀釋于PBS中(25 u L)，加到每個孔中。將平板于室溫孵育I小時，然后按如上描述進行洗滌和顯色。菌落轉(zhuǎn)印結(jié)合試驗(CLBA)使用以6 ii g/mL的PCSK9_His6包被的硝酸纖維素濾膜,基本按照美國專利公布2005/0255552和2006/0134098中的描述，進行Fab片段的Humaneered 文庫的篩選。使用按1:5000稀釋于PBST中的堿性磷酸酶綴合的抗人K輕鏈抗體(Sigma#A3813)，檢測與包被有抗原的濾膜結(jié)合的Fabs,以針對堿性磷酸酶的DuoLux化學(xué)發(fā)光底物(VectorLaboratories #SK_6605)對印跡進行顯色。
生物素化重組PCSK9的產(chǎn)生和親和力測定通過在pRS5a/PCSK9質(zhì)粒中編碼PCSK9和His6(SEQ ID NO:57)標簽的基因之間插A EcoRI限制性位點，產(chǎn)生具有C末端Avi-(用于定點生物素化)和His6(SEQ ID NO:57)標簽的PCSK9(PCSK9-Avi-His6);表達帶C末端His6 (SEQ ID NO: 57)標簽的PCSK9 (Uniprot登錄號Q8NBP7)的第31-693位氨基酸。以T4多核苷酸激酶(Invitrogen)，將編碼Avi標簽(氨基酸序列GGGLNDIFEAQKIEWHE;SEQ ID NO: 63)及側(cè)翼有EcoRI突出端的寡核苷酸進行磷酸化，退火，隨后利用新插入的EcoRI位點連接到pRS5a/PCSK9中。通過測序分析，驗證包含Avi標簽的克隆。在293Freestyle表達系統(tǒng)(Invitrogen)中進行PCSK9_Avi_His6的表達，使用Ni-NTA樹脂(QIAGEN)純化所分泌的重組蛋白。純化后，將PCSK9-Avi-His6蛋白對IOmM Tris pH 8. 0, 50mM NaCl進行透析。以生物素-蛋白質(zhì)連接酶(Avidity)，按照生產(chǎn)商的規(guī)程，對蛋白質(zhì)進行體外生物素化。完成后，將反應(yīng)物對PBS pH 7. 2進行透析，通過Western印跡、以HRP綴合的鏈霉抗生物素蛋白為探針,對生物素化進行驗證。
使用溶液平衡滴定(“SET”)測定法，分析IgGs和Fab片段的結(jié)合動力學(xué)。簡言之，將hPCSK9的系列稀釋液加到60pM的IgG或Fab中，孵育過夜。以I y g/ml的hPCSK9包被96孔標準結(jié)合(Standard Bind)微量滴定板(Meso Scale Discovery),孵育過夜，以PBS/0. 05%(w/v)吐溫20洗滌，以PBS/5%(w/v) BSA封閉，再次洗滌。將抗體-抗原制備液加到PCSK9包被的標準結(jié)合板中，于室溫下孵育30分鐘。在進行3次另外的洗滌步驟后，加入Sulfo-Tag標記的羊抗人檢測抗體(R32AJ-5, Meso ScaleDiscovery),于室溫孵育I小時。在洗漆平板3次后,加入讀數(shù)緩沖液(Read Buffer) (Meso Scale Discovery),以SectorImager 6000 (Meso Scale Discovery)測量電化學(xué)發(fā)光(ECL)信號。用 Excel 插件 XLfit4. 3. 2 (ID Business Solutions),使用描述于 Piehler 等，(1997) J TmmunoI Methods201:189-206中的適合于抗體的擬合模型，處理ECL數(shù)據(jù)。觀察到了在溶液中人PCSK9與抗體LGT209、LGT210和LGT211之間的高親和力結(jié)合，每個抗體的計算KD值為150_190pM。產(chǎn)生和純化抗體通過使用293fectin轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen#51_0031),按照生產(chǎn)商的規(guī)程,將如下載體共轉(zhuǎn)染到293Freestyle細胞中，產(chǎn)生完全Humaneered 的NVP-LGT209、NVP_LGT210和NVP-LGT211抗體(沉默的IgGl K )。LGT-209-pJG04(Vh)+pJGlO(Vk)LGT-210-pJG04(Vh)+pJGOl(Vk)LGT-211-pSR74(Vh)+pJGlO(Vk)使用5-mL 的 Hi Trap 蛋白 A HP 柱(GE Healthcare#17-0403_03),從 293Freestyle細胞上清液中純化抗體。使用IgG洗脫緩沖液(Pierce #21004)洗脫抗體，通過透析將緩沖液交換成PBS。在AKTAFPLC液相色譜系統(tǒng)(GE Healthcare)上進行蛋白A親和色譜。表位競爭測定試驗使用ForteBio Octet QK系統(tǒng)和包被有生物素化PCSK9-Avi_His6的鏈霉抗生物素蛋白高結(jié)合生物傳感器(Streptavidin High BindingBiosensors),測定原始小鼠抗體NVP-LFU720和其Humaneered 衍生物NVP-LGT209之間對PCSK9上表位結(jié)合的競爭。然后，將以下3個不同的抗體結(jié)合到分開的PCSK9包被的傳感器上至飽和小鼠LFU720、完全人LGT209或?qū)φ招∈罂贵w7D16 (已知其與LFU720具有分開的表位)。接著，將所有的傳感器浸入到包含LFU720小鼠抗體的孔中，以確定第一抗體是否能夠阻斷LFU720結(jié)合。結(jié)果鼠和參考V區(qū)氨基酸序列將來自表達NVP-LFU720的雜交瘤的RT-PCR產(chǎn)物測序，通過使用ThermoElectronLTQ-Orbitrap質(zhì)譜儀,該序列在蛋白質(zhì)水平上大部分(95%或更高)得到了驗證。然后，將LFU720的重鏈和輕鏈可變區(qū)克隆到KaloBios載體中，以產(chǎn)生參考Fab SR032。不得不將NVP-LFU720Vk中第一個氨基酸從谷氨酰胺(Q)改變?yōu)楣劝彼?E)，以使其能夠克隆到KaloBios載體中來產(chǎn)生參考Fab SR032;因此，SR032Vk在第一個Vk位置上具有谷氨酸。Fab SR032具有來自NVP-LFU720的完整鼠V區(qū)，其與人恒定區(qū)融合，將其從大腸桿菌中純化。在PCSK9-His6抗原結(jié)合的稀釋ELISA測試中，所克隆的SR032參考Fab產(chǎn)生依賴Fab濃度的結(jié)合曲線。除了參考Fab(SR032)以外，還構(gòu)建了優(yōu)化的參考Fab, SR038。SR032中的幾個構(gòu)架氨基酸殘基在SR038中被改變成人種系的。參考和優(yōu)化的參考Fab的親和力分析在FRl和FR3中整合到優(yōu)化的參考SR038中的人種系殘基是由用于擴增人V片段全庫(repertoire)的PCR引物所規(guī)定的，因此它們存在于Humaneered V區(qū)文庫的所有成員中。構(gòu)建優(yōu)化的參考Fab來評估是否任何至人種系的變化都改變Fab結(jié)合的特性。通過使用純化的Fabs進行稀釋ELISA，確定了 SR032和SR038對重組PCSK9抗原的親和力是相同的，表明SR038中的氨基酸改變是被耐受的。文庫構(gòu)建和選擇完全Humaneered 的Fabs產(chǎn)生了重鏈和輕鏈前端和中間盒文庫(限制于Vhl或Vk3的亞群)，通過CLBA進行篩選。對于Vh，通過菌落轉(zhuǎn)印結(jié)合試驗，鑒定出了支持與PCSK9抗原結(jié)合的前端盒，但沒有鑒定出Vh中間盒。對于Vk，前端和中間盒都通過菌落轉(zhuǎn)印而被鑒定出來，此外，也鑒定出了一些完整Vk克隆(由于Vk前端文庫被完整鏈Vk克隆污染而引起)。來自每個文庫的許多結(jié)合者在以包含F(xiàn)ab的細胞上清液進行的ELISA測定中再次得到確認，自每個文庫從周質(zhì)級分中純化了幾種Fabs,使用Forte分析按親和力進行了等級排序。由于沒有鑒定到支持PCSK9結(jié)合的V重鏈中間盒，構(gòu)建了兩個誘變文庫，它們在重鏈CDR2或FR3中的所有位置上編碼親本鼠殘基或最接近的人種系殘基。由此，構(gòu)建了改造的人中間盒文庫，對其進行了篩選，鑒定出了抗原結(jié)合克隆。然后，將在各克隆中支持結(jié)合的Vh中間盒中向人種系的改變進行組合，以產(chǎn)生一個最終的中間盒，通過Forte分析，確認了在優(yōu)化的參考Fab背景中包含該盒的Fab具有與優(yōu)化的參考Fab —樣好的結(jié)合親和力。通過CLBA，對于重鏈和輕鏈都從所產(chǎn)生的文庫中成功鑒定出了支持與PCSK9結(jié)合的前端和中間人盒。通過ELISA,對這些結(jié)合物都進行了確認,然后,使用ForteBio Octet系統(tǒng)對Fabs進行了純化和等級排序。通過橋式PCR，將重鏈和輕鏈的高等級盒組合成一個最終的文庫，通過CLBA從該文庫中選擇支持與PCSK9結(jié)合的完全Humaneered 的Fabs。與 此平行，將所有排位第一的盒或鏈(最好的Vh前端、改造的Vh中間、最好的完整輕鏈)組合在一起，以產(chǎn)生單個Fab SR066，預(yù)期其支持高親和力的結(jié)合。親本小鼠mAb NVP-LFU720 以及 Humaneered Abs NVP-LGT209、NVP-LGT210 和NVP-LGT211的重鏈和輕鏈可變區(qū)序列分別顯示于圖1-4中。使用ForteBio Octet分析測試完全Humaneered 的Fabs對PCSK9抗原的親和力
對Humaneered SR066 Fab和從最終組合文庫中挑出的3個Fabs (#1-2，#3-2，和#4-2)進行了表達和純化。然后，使用ForteBio Octet系統(tǒng)，將這4個人Fabs的結(jié)合動力學(xué)與優(yōu)化的參考Fab SR038的動力學(xué)進行了比較(數(shù)字數(shù)據(jù)總結(jié)于表I中)。表I、完全 Humaneered Fabs 對 PCSK9 的親和力
權(quán)利要求
1.與蛋白原轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/kexin型9(PCSK9)結(jié)合的抗體，其中該抗體 a)不阻斷PCSK9與低密度脂蛋白受體(LDLR)的結(jié)合，且 b)抑制PCSK9介導(dǎo)的LDLR降解。
2.權(quán)利要求I的抗體,其中抗體與人PCSK9的第680-692位殘基中的至少ー個氨基酸結(jié)合。
3.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體與人PCSK9結(jié)合的平衡解離常數(shù)(Kd)為約500pM或更低
4.權(quán)利要求I的抗體,其中抗體的體內(nèi)半衰期為至少7天。
5.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體包括 (a)重鏈可變區(qū)，其包括人重鏈V片段、重鏈互補決定區(qū)3(CDR3)和重鏈框架區(qū).4(FR4)，以及 (b)輕鏈可變區(qū)，其包括人輕鏈V片段、輕鏈CDR3和輕鏈FR4，其中 i)重鏈CDR3 包含氨基酸序列 SYYYY(A/N)MD(A/F/S/V/Y) (SEQ IDNO: 14);以及 ii)輕鏈CDR3可變區(qū)包含氨基酸序列LQWSSDPPT(SEQID NO: 26)。
6.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈V片段與SEQID NO: 28具有至少85%的序列同一性，其中輕鏈V片段與SEQ ID NO: 31具有至少85%的序列同一性。
7.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈V片段與SEQID N0:27具有至少85%的序列同一性，其中輕鏈V片段與選自SEQ ID N0:29和SEQ ID NO: 30的氨基酸具有至少85%的序列同一性。
8.權(quán)利要求5的抗體，其中 i)重鏈CDR3包含選自SEQID NO: 12和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列；和 ii)輕鏈CDR3包含SEQID NO:26的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈FR4為人種系FR4。
10.權(quán)利要求9的抗體，其中重鏈FR4為SEQID N0:35。
11.權(quán)利要求5的抗體，其中輕鏈FR4為人種系FR4。
12.權(quán)利要求11的抗體，其中輕鏈FR4為SEQID N0:39。
13.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈V片段和輕鏈V片段各包括互補決定區(qū)I(OTRl)和互補決定區(qū)2(CDR2);其中 i)重鏈V片段的⑶Rl包含SEQID NO:8的氨基酸序列； ii)重鏈V片段的⑶R2包含SEQID NO: 11的氨基酸序列； iii)輕鏈V片段的⑶Rl包含SEQID NO: 22的氨基酸序列；以及 iv)輕鏈V片段的⑶R2包含SEQID NO:25的氨基酸序列。
14.權(quán)利要求13的抗體，其中 i)重鏈V片段的CDRl包含SEQID NO: 7 ； ii)重鏈V片段的CDR2包含SEQID NO: 10 ； iii)重鏈CDR3包含選自SEQID NO: 12和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列； iv)輕鏈V片段的CDRl包含SEQID NO: 21 ； V)輕鏈V片段的CDR2包含SEQ ID NO: 24 ;以及 vi)輕鏈 CDR3 包含 SEQ ID NO:26。
15.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈可變區(qū)與SEQID NO:40的可變區(qū)具有至少90%的氨基酸序列同一性，輕鏈可變區(qū)與SEQ ID N0:41的可變區(qū)具有至少90%的氨基酸序列同一性。
16.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈可變區(qū)與SEQID NO:40的可變區(qū)具有至少95%的氨基酸序列同一性，輕鏈可變區(qū)與SEQ ID N0:41的可變區(qū)具有至少95%的氨基酸序列同一性。
17.權(quán)利要求5的抗體，其中抗體包括包含SEQID NO:40的重鏈和包含SEQ ID NO:41的輕鏈。
18.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈可變區(qū)與選自SEQID NO:2和SEQ ID N0:4的可變區(qū) 具有至少90%的氨基酸序列同一性，輕鏈可變區(qū)與選自SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 18的可變區(qū)具有至少90%的氨基酸序列同一性。
19.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈可變區(qū)與選自SEQID NO:2和SEQ ID N0:4的可變區(qū)具有至少95%的氨基酸序列同一性，輕鏈可變區(qū)與選自SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 18的可變區(qū)具有至少95%的氨基酸序列同一‘注。
20.權(quán)利要求5的抗體，其中重鏈可變區(qū)包含選自SEQID NO:2和SEQ ID N0:4的氨基酸序列，輕鏈可變區(qū)包含選自SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:18的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體為FAb’片段。
22.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體為IgG。
23.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體為單鏈抗體(scFv)。
24.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體包含人恒定區(qū)。
25.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體與載體蛋白連接。
26.權(quán)利要求I的抗體，其中抗體被聚こニ醇化。
27.特異性結(jié)合PCSK9的抗體，其中所述抗體包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)各包含下列3個互補決定區(qū)(⑶Rs):⑶R1、⑶R2和⑶R3 ;其中 i)重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQID NO:8的氨基酸序列； ii)重鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQID NO: 11的氨基酸序列； iii)重鏈可變區(qū)的⑶R3包含SEQID NO: 14的氨基酸序列； iv)輕鏈可變區(qū)的⑶Rl包含SEQID NO:22的氨基酸序列； V)輕鏈可變區(qū)的⑶R2包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列； vi)輕鏈可變區(qū)的⑶R3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列；
28.權(quán)利要求27的抗體，其中 i)重鏈可變區(qū)的⑶Rl包含選自SEQID NO:6和SEQ ID NO:7的氨基酸序列； ii)重鏈可變區(qū)的CDR2包含選自SEQID NO:9和SEQ ID NO: 10的氨基酸序列； iii)重鏈可變區(qū)的CDR3包含選自SEQID NO: 12和SEQ ID NO: 13的氨基酸序列； iv)輕鏈可變區(qū)的CDRl包含選自SEQID NO:20和SEQ ID NO:21的氨基酸序列； V)輕鏈可變區(qū)的CDR2包含選自SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24的氨基酸序列； vi)輕鏈可變區(qū)的⑶R3包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列。
29.包含權(quán)利要求I的抗體和生理相容性賦形劑的組合物。
30.權(quán)利要求29的組合物，其中組合物還包含降低個體中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平的第二藥。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中第二藥是他汀類藥。
32.權(quán)利要求31的組合物，其中他汀類藥選自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
33.權(quán)利要求30的組合物,其中第二藥選自貝特類藥(fibrates)、煙酸(niacin)及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、ニ酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoBlOO的抑制性核酸。
34.在有需要的個體中降低LDL-C的方法，所述方法包括給個體施用治療上有效量的權(quán)利要求I的抗體，從而降低個體中的LDL-C。
35.權(quán)利要求34的方法，其中個體對他汀類藥治療反應(yīng)過低或具有抵抗性。
36.權(quán)利要求34的方法，其中個體不耐受他汀類藥治療。
37.權(quán)利要求34的方法，其中個體的基線LDL-C水平為至少約100mg/dL。
38.權(quán)利要求34的方法，其中個體患有家族性高膽固醇血癥。
39.權(quán)利要求34的方法，其中總膽固醇隨LDL-C而降低。
40.權(quán)利要求34的方法，其中個體患有甘油三酯血癥。
41.權(quán)利要求34的方法，其中個體具有功能獲得性PCSK9基因突變。
42.權(quán)利要求34的方法，其中個體患有藥物誘發(fā)性血脂異常。
43.權(quán)利要求34的方法，還包括以治療上有效的量，給個體施用在降低LDL-C中有效的第二藥。
44.權(quán)利要求43的方法，其中第二藥為他汀類藥。
45.權(quán)利要求44的方法，其中他汀類藥選自阿托伐他汀、西立伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、美伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀和辛伐他汀。
46.權(quán)利要求43的方法，其中第二藥選自貝特類藥(fibrates)、煙酸(niacin)及其類似物、膽固醇吸收抑制劑、膽汁酸螯合劑、甲狀腺激素模擬物、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)抑制劑、ニ酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)抑制劑、靶向PCSK9的抑制性核酸和靶向apoBlOO的抑制性核酸
47.權(quán)利要求43的方法，其中將抗體與第二藥作為混合物共施用。
48.權(quán)利要求43的方法，其中將抗體與第二藥劑以分開的方式共施用。
49.權(quán)利要求34的方法，其中將抗體進行靜脈內(nèi)給藥。
50.權(quán)利要求34的方法，其中將抗體進行皮下給藥。
全文摘要
本發(fā)明提供抗蛋白原轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素/kexin型9a(“PCSK9”)的抗體拮抗劑和使用這樣的抗體的方法。
文檔編號A61K39/395GK102652139SQ201080056182
公開日2012年8月29日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月11日
發(fā)明者D·約韋, J·李, S·B·科恩, S·魯 申請人:Irm責(zé)任有限公司, 諾瓦提斯公司