專利名稱：用于控制交聯(lián)基質(zhì)的性質(zhì)的酶交聯(lián)劑的改性的制作方法
用于控制交聯(lián)基質(zhì)的性質(zhì)的酶交聯(lián)劑的改性發(fā)明人蓋伊·托莫和奧萊恩·普里斯-布魯姆
進旦 冃月^酶交聯(lián)基質(zhì)的應(yīng)用性酶交聯(lián)基質(zhì)在食品、化妝品和醫(yī)療行業(yè)的多種應(yīng)用中形成。特別在醫(yī)療應(yīng)用中，酶交聯(lián)水凝膠廣泛用于多種醫(yī)療應(yīng)用，包括組織密封劑和粘合劑、止血制劑、組織工程基質(zhì)或藥物輸送平臺。雖然一些水凝膠如明膠和泊洛沙姆可由于聚合物鏈之間在特定條件一例如溫度改變一下的物理相互作用而形成，但大多數(shù)聚合物溶液必須交聯(lián)以形成水凝膠。除固體凝膠的實際形成外，可植入的水凝膠必須耐受其所施用的組織中的普遍條件，如機械應(yīng)力、溫度增加和酶降解及化學降解。因此，在很多情況下，有必要交聯(lián)水凝膠基質(zhì)。交 聯(lián)可在體外通過水凝膠的預(yù)鑄塑或成型來進行。這種應(yīng)用主要用于組織工程或藥物輸送應(yīng)用?；蛘撸宦?lián)可在體內(nèi)進行(原位凝膠化或交聯(lián))，其中液體溶液被注入或施用于預(yù)期位點，并交聯(lián)以形成凝膠。凝膠形成可通過多種交聯(lián)方法啟動。凝膠形成的化學方法包括通過接觸如在氰基丙烯酸酯中或通過外部刺激如光啟動而啟動聚合。而且，凝膠形成可用低分子量交聯(lián)劑如戊二醛或碳二亞胺(Otani Y, Tabata Y, Ikada Y，胸外科年鑒，1999，67，922-6 (Otani Y,Tabata Y,Ikada Y,Ann Thorac Surgl999, 67，922-6)。Sung HW,Huang DM, Chang WH, HuangRN, Hsu JC.生物醫(yī)學材料研究雜志，1999，46，520-30 (Sung HW, Huang DM, Chang WH, HuangRN, Hsu JC. J Biomed Mater Res 1999, 46, 520-30) o0tani, Y. ; Tabata, Y. ; Ikada, Y.生物材料，1998，19，2167-73 (Otani, Y. ;Tabata, Y. ;Ikada, Y. Biomaterials 1998，19，2167-73)。Lim, D. ff. ; Nettles, D. L. ; Setton, L. A. ; Chilkoti1A.生物大分子，2008，9，222-30 (Lim, D.ff. ;Nettles, D. L. ; Setton, L. A. ; Chilkoti, A. Biomacromolecules 2008, 9, 222-30))或聚合物上活化的取代基(Iwata, H. ;Matsuda, S. ;Mitsuhashi, K. ; Itoh, E. ; Ikada, Y.生物材料，1998, 19, 1869-76 (Iwata, H. ;Matsuda, S. ;Mitsuhashi, K. ; Itoh, E. ; Ikada, Y.Biomaterials 1998, 19, 1869-76))通過化學交聯(lián)預(yù)形成的聚合物而實現(xiàn)。但是，化學交聯(lián)可在食品、化妝品或醫(yī)療應(yīng)用中存在問題，因為交聯(lián)劑通常具有毒性、致癌性或刺激性。此外，其為可容易擴散到交聯(lián)基質(zhì)外的小分子，可引起局部或全身損傷。替代化學交聯(lián)的是酶交聯(lián)方法。這些啟動凝膠形成的方法已被基于多種不同的交聯(lián)酶考察。實例包括酶交聯(lián)粘合劑如貽貝膠(Strausberg RL, Link RP.生物技術(shù)趨勢，1990，8，53-7 (StrausbergRL, Link RP. Trends Biotechnol 1990，8，53-7))或酶交聯(lián)血液凝固——如在纖維蛋白密封劑中(Jackson MR.美國外科雜志，2001，182，1S-7S(JacksonMR-Am J Surg2001, 182，1S-7S). Spotnitz WD.美國外科雜志，2001，182，8S-14S (SpotnitzWD. Am J Surg 2001，182，8S-14S)Buchta C, Hedrich HC, Macher M, Hocker P, Redl H.生物材料，2005，26，6233-41. 27-30(Buchta C, Hedrich HC, Macher M, Hocker P, RedlH. Biomaterials 2005,26,6233-41. 27—30))。貽貝膠的交聯(lián)通過粘合蛋白的卩，多巴)殘基向可進行隨后的蛋白質(zhì)間交聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)性醌殘基的酶轉(zhuǎn)化而啟動(Burzio LA, WaiteJH.生物化學，2000，39，11147-53 (Burzio LA,Waite JH.Biochemistry2000,39,11147-53). McDowell LM, Burzio LA, Waite JH, Schaefer JJ.生物化學雜志，1999，274，20293-5(McDowell LM, Burzio LA, Waite JH, Schaefer JJ.Biol Chem1999，274, 20293-5))。已被用于此類密封劑的酶一方面是酪氨酸酶,另一方面是漆酶和過氧化物酶，其通過分別由酪氨酸和其他酚類化合物形成醌和自由基發(fā)揮作用。其依次可交聯(lián)于蛋白質(zhì)上的游離胺或蛋白質(zhì)和多糖上經(jīng)類似改性的酚基。第二種充當技術(shù)模型的交聯(lián)操作是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化的反應(yīng)，其發(fā)生于血液凝固過程中(Ehrbar M, Rizzi SC, Hlushchuk R, Djonov V, Zisch AH, Hubbell JA, WeberFE, Lutolf MP.生物材料，2007，28，3856-66 (Ehrbar M, Rizzi SC, Hlushchuk R, DjonovV, Zisch AH, Hubbell JA, Weber FE, Lutolf MP. Biomaterials 2007, 28, 3856-66)) 原位凝膠形成的仿生方法已研究了因子XIIIa或其他組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的應(yīng)用(SperindeJ,Griffith L. Macromolecules 2000,33,5476-5480.Sanborn TJ,Messersmith PB, Barron AE.生物材料，2002，23，2703-10 (Sperinde J, Griffith L. Macromolecules2000, 33, 5476-5480. Sanborn TJ, Messersmith PB, Barron AE. Biomaterials2002, 23, 2703-10))。特別感興趣的另外的原位交聯(lián)凝膠形成是通過鈣非依賴性微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)的明膠交聯(lián)。mTG催化與因子XIIIa類似的交聯(lián)反應(yīng)，但微生物酶的活性不需要凝血酶或I丐。最初的mTG研究致カ于食品エ業(yè)應(yīng)用(Babin H, Dickinson E.食品膠體，2001，15，271-276(Babin H, Dickinson E. Food Hydrocolloids 2001，15，27ト276)·Motoki M, Seguro K.食品科學與技術(shù)趨勢，1998，9，204-210(Motoki M, SeguroK. Trends in Food Science & Technology 1998，9，204-210)),而后來的研究考慮潛在的醫(yī)療應(yīng)用。之前的體外研究已顯示，mTG可使明膠交聯(lián)以在數(shù)分鐘內(nèi)形成凝膠，明膠-mTG粘合劑可結(jié)合潮濕的或濕潤的組織，并且粘合強度相當于或優(yōu)于纖維蛋白基密封劑(Chen TH, Payne GF, et al.生物材料，2003，24，2831-2841 (Chen TH, PayneGF, et al. Biomaterials 2003,24,2831-2841)。McDermott MK, Payne GF, et al.生物大分子，2004，5，1270-1279(McDermott MK, Payne GF, et al. Biomacromolecules2004，5，1270-1279)。Chen T，Payne GF, et al.生物醫(yī)學材料研究部分B:應(yīng)用生物材料，2006，77，416-22 (Chen T, Payne GF, et al. J Biomed Mater Res B Appl Biomater2006, 77, 416-22) )0明膠和mTG用作醫(yī)療粘合劑在PCT W0/2008/076407被述及。在交聯(lián)基質(zhì)形成中酶用作交聯(lián)劑的其中ー個缺陷是，其在預(yù)期的凝膠狀態(tài)已形成后可繼續(xù)交聯(lián)反應(yīng)。這通常是不希望的，因為過度交聯(lián)可導致剛性較高、脆性較高而撓性較低的凝膠。此外，交聯(lián)基質(zhì)的機械性質(zhì)將在凝膠壽命中繼續(xù)改變，致使一致的性質(zhì)難以實現(xiàn)。超過預(yù)期交聯(lián)密度的持續(xù)酶交聯(lián)源自即使交聯(lián)基質(zhì)或水凝膠已經(jīng)形成時酶仍繼續(xù)催化交聯(lián)反應(yīng)能力。這取決于即使溶液粘性大幅增加酶仍繼續(xù)在整個基質(zhì)中擴散的能力。該觀點與 Hu 等(Hu BH, Messersmith PB. J.美國化學會志(Am. Chem. Soc.), 2003, 125 (47), pp14298 - 14299) 一致，其基于對肽移植的合成聚合物溶液的工作提出，在聚合物溶液部分交聯(lián)造成的初始網(wǎng)絡(luò)形成過程中，溶液粘性迅速増加，而轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的移動性迅速減少。過度酶交聯(lián)導致機械性質(zhì)減弱的問題之前已被記載多次
Bauer等證明，高水平的微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)引起小麥面筋蛋白過度交聯(lián)，導致面筋網(wǎng)絡(luò)彈性喪失和機械損傷。(Bauer N, Koehler P, Wieser H, and Schieberle P.微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶對小麥面筋蛋白II流變性質(zhì)的影響的研究.谷物化學.80(6) :787 -790 (Bauer N, Koehler P,Wieser H, and Schieberle P. Studies on Effects of MicrobialTransglutaminase on Gluten Proteins of Wheat II Rheological Properties. CerealChem. 80(6) :787 - 790))。Sakai等發(fā)現(xiàn)，酚之間大量共價交聯(lián)有效增強機械穩(wěn)定性，但是，酚之間進一步交聯(lián)導致脆性凝膠形成。(Sakai S, Kawakami K.離子和酶可交聯(lián)藻酸鹽的合成和表征，生物材料文獻，3 (2007), pp. 495 - 501 (Sakai S，Kawakami K. Synthesis and characterizationof both ionically and enzymatically crosslinkable alginate, Acta Biomater3(2007), pp. 495 - 501))。在輔因子依賴性交聯(lián)酶如鈣依賴性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的情況下，通過結(jié)合去除輔因子或在一定反應(yīng)時間后去除輔因子可限制交聯(lián)程度。但是，輔因子去除通常在水凝膠形成中技術(shù)上不可行，其中水凝膠可截留輔因子。當應(yīng)用與輔因子無關(guān)的酶如可來自微生物來源 的轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶時，交聯(lián)的有限程度可通過熱處理反應(yīng)系統(tǒng)得到。但是，這種處理引起對蛋白質(zhì)功能性的消極副作用，因此不希望被應(yīng)用。此外，不是所有反應(yīng)系統(tǒng)均適于進行熱處理。除在交聯(lián)基質(zhì)中導致過度交聯(lián)外，交聯(lián)酶在預(yù)期的交聯(lián)狀態(tài)已實現(xiàn)后于基質(zhì)中繼續(xù)擴散還可導致酶高速擴散到凝膠外，也被稱為酶洗脫。其還可存在如下問題釋放到身體中的高水平交聯(lián)酶可與身體組織相互作用，并引起局部或全身損傷。發(fā)明概述需要且將可用的是擁有可用于多種應(yīng)用的改善的酶交聯(lián)組合物。因此，需要且將可用的是擁有在固體基質(zhì)初始形成后在已得到預(yù)期機械性質(zhì)的點終止交聯(lián)基質(zhì)的酶交聯(lián)；和/或降低酶從固體交聯(lián)基質(zhì)洗脫的程度和速度的機制。本發(fā)明在至少一些實施方式中克服了背景技術(shù)的上述缺陷，并針對上述技術(shù)問題提供了解決方案(在其多個優(yōu)勢中，不希望提供封閉式列表)，這是通過提供通過聚合物酶交聯(lián)形成的基質(zhì)或水凝膠實現(xiàn)的，其中交聯(lián)酶分子已被改性，其目的在于提高基質(zhì)的交聯(lián)密度、機械性質(zhì)或其他性質(zhì)；和/或提供對交聯(lián)速度和/或程度改善的控制。任選的改變酶分子的方法是通過改變酶分子在正形成的交聯(lián)基質(zhì)中的感知量(perceived volumn)。改變后的感知量優(yōu)選根據(jù)形成基質(zhì)的聚合物的交聯(lián)程度確定,使得減少的交聯(lián)程度與用未改變的酶分子的交聯(lián)程度相比指示感知量增加。一種增加酶分子感知量的方法是通過使至少一個分子或部分共價或非共價連接酶分子而增加分子的尺寸和/或流體動力學體積。發(fā)明人已證明，水凝膠或交聯(lián)基質(zhì)中的酶交聯(lián)程度可由分子與酶的共價連接來調(diào)控，使得酶分子改變導致最終交聯(lián)水平較低。在此方式下，可避免過度交聯(lián)現(xiàn)象。其他增加感知量的方法是通過改變酶分子的靜電荷，使得其凈電荷與聚合物或共聚物鏈上的凈電荷符號相反。這可通過改變酶的等電點(pi)來實現(xiàn)。在非限制性假設(shè)下，增加酶分子的感知量降低分子在交聯(lián)基質(zhì)或水凝膠中的移動性或擴散。這防止其在超過的點后交聯(lián)有益于水凝膠的預(yù)期材料性質(zhì)繼續(xù)其交聯(lián)活性。
本文定義的“感知量”或“有效量”指交聯(lián)酶在交聯(lián)基質(zhì)中的有效流體動力學體積。感知量可通過在交聯(lián)反應(yīng)前或在交聯(lián)反應(yīng)中使酶共價或非共價結(jié)合另一分子、載體、聚合物、蛋白質(zhì)、多糖等而增加。本文定義的“擴散”或“移動性”指交聯(lián)酶或其他蛋白質(zhì)由于布朗運動在溶液、氫氣或基質(zhì)中的隨機分子運動。本文定義的“擴散系數(shù)”指量化ー類分子在特定條件下的擴散程度的術(shù)語。用于測量酶擴散的非限制性實例是通過測量酶從水凝膠的洗脫。本文定義的“移動性降低”指蛋白質(zhì)或酶在溶液中或在水凝膠中的分子運動較低或擴散系數(shù)較小。本文定義的“尺寸”指分子的分子量或流體動力學體積或感知量。
本文所用的“分子量”，簡稱MW，指以道爾頓或千道爾頓表示的蛋白質(zhì)或聚合物的絕對重量。例如，PEG化蛋白質(zhì)(B卩-已結(jié)合一個或多個PEG (聚こニ醇)分子的蛋白質(zhì))的MW是其所有組分的總WL 本文定義的“流體動力學體積”指蛋白質(zhì)或酶的表觀分子量，其通?？捎贸叽缗抛枭V測量。組分的流體動力學體積指組分的直徑或體積——假設(shè)當其以液體形式運動吋。本文定義的“基質(zhì)”指交聯(lián)材料的組合物。總體上，當基質(zhì)形成材料交聯(lián)時，包含這些材料的組合物從液體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z狀態(tài)，從而形成“凝膠”、“水凝膠”或“凝膠化組合物，，。凝膠可具有一定的粘弾性和流變性，該性質(zhì)為其提供一定程度的耐久性和膨脹能力。這些材料通常是聚合物?；|(zhì)可包含不交聯(lián)的材料，有時被稱為共聚物。本文所用的“聚合物”指包含重復(fù)單元的天然、合成或半合成的分子。本文所用的“共聚物”指參不參與交聯(lián)反應(yīng)均可并且通常不是基質(zhì)主要組分的基質(zhì)組分。非限制性實例包括多糖如葡聚糖和/或纖維素聚合物，如羧甲基纖維素。共聚物優(yōu)選不共價結(jié)合酶或基質(zhì)材料，如基質(zhì)的蛋白質(zhì)基料。本文所用的“載體”指交聯(lián)反應(yīng)前或中共價或非共價結(jié)合交聯(lián)酶的聚合物、蛋白質(zhì)、多糖或任何其他組分。本文定義的“交聯(lián)酶”指可將聚合物鏈上的底物基團直接(例如，通過轉(zhuǎn)谷氨化(transglutamination))或間接(例如,通過醌或自由基的形成)交聯(lián)到粘合基質(zhì)如水凝膠中的酶或酶組合。根據(jù)本發(fā)明至少ー些實施方式，提供了交聯(lián)基質(zhì)，其包含通過改性酶分子交聯(lián)的底物聚合物，所述改性的酶分子具有在基質(zhì)通過所述聚合物交聯(lián)而形成時改變酶分子在交聯(lián)基質(zhì)中的感知量的改性。任選地，所述改性酶分子具有増加所述改性酶分子的實際尺寸的改性。任選地，所述改性酶分子具有增加所述改性酶分子的流體動力學體積的改性。任選地，所述改性酶分子具有這樣的改性通過改變所述改性酶的等電點(pl)，相對于未改性酶，改變所述改性酶分子與所述底物聚合物的凈電荷符號相反的靜電荷。任選地，所述改性是酶賴氨酸的ε -氨基的改性，其通過選自如下的方法實現(xiàn)琥珀酰化(用琥珀酸酐)、こ?；?用こ酸酐)、氨甲?；?用氰酸酷)、還原烷基化(醛)和用馬來酸酐處理。任選地，所述改性是在包含酶的羧酸的ー個或多個側(cè)鏈的改性以減少負電荷數(shù)。任選地，所述改性包括使至少ー個分子或部分共價或非共價連接至所述改性酶分子。任選地，所述改性包括使改性分子共價連接至所述改性酶分子。任選地，所述改性酶分子與非改性酶相比具有降低的擴散速度和降低的交聯(lián)速度，但與非改性酶相比至少具有相似的測量酶活性。任選地，降低的交聯(lián)速度至少為非改性酶交聯(lián)速度的10%。任選地,所述改性分子包括載體或聚合物。任選地,所述聚合物包括合成聚合物、纖維素聚合物、蛋白質(zhì)或多糖。任選地，所述纖維素聚合物包括羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素或甲基纖維素中的一種或多種。任選地，所述多糖包括葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸或淀粉衍生物中的一種或多種。任選地，所述改性分子包括PEG (聚乙二醇)。任選地，所述PEG包括PEG衍生物。任選地，所述PEG衍生物包括活化PEG。任選地，所述活化PEG包括下列中的一種或多種甲氧基PEG(mPEG)、其衍生物、mPEG-NHS、mPEG的琥珀酰亞胺(NHS)酯(mPEG-琥珀酸酯-NHS)、 mPEG-戊二酸酯-NHS、mPEG-戊酸酯-NHS、mPEG_ 碳酸酯-NHS、mPEG_ 羧甲基-NHS、mPEG_ 丙酸酯-NHS、mPEG-羧戊基-NHS)、mPEG-硝基苯基碳酸酯、mPEG-丙醛、mPEG-甲苯磺酸酯、mPEG-羰基咪唑、mPEG-異氰酸酯、mPEG-環(huán)氧化物或其組合。任選地,所述活化PEG與所述酶上的胺基或巰基發(fā)生反應(yīng)。任選地，所述活化PEG與所述活化酶的賴氨酸殘基的摩爾比在O. 5至25的范圍內(nèi)。任選地，所述活化PEG是單功能、異雙功能、同雙功能或多功能的。任選地，所述活化PEG是分支PEG或多臂PEG。任選地，所述活化PEG的尺寸在1000道爾頓至40，000道爾頓的范圍內(nèi)。任選地，基質(zhì)進一步包括不共價結(jié)合至所述酶或所述底物聚合物的共聚物。任選地，所述共聚物包括多糖或纖維素聚合物。任選地，所述多糖包括葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸或淀粉衍生物。任選地，所述纖維素聚合物包括羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素。任選地，所述改性酶分子通過使所述改性酶分子交聯(lián)多個其他酶分子以形成多個交聯(lián)酶分子的聚集體而改性。任選地，所述改性酶分子的改性或改性程度影響基質(zhì)的至少一個性質(zhì)。任選地，所述至少一個性質(zhì)選自拉伸強度、剛性、所述底物聚合物的交聯(lián)程度、粘性、彈性、撓性、斷裂張力、斷裂應(yīng)力、泊松比、溶脹能力和楊氏模量或其組合。任選地，所述改性酶的改性程度決定所述改性酶在基質(zhì)中的移動性或自基質(zhì)的擴散。任選地,所述改性酶的所述改性使所述改性酶在所述改性酶和所述蛋白質(zhì)的溶液或在所述改性酶和所述蛋白質(zhì)的基質(zhì)中的擴散系數(shù)相對于非改性酶和所述蛋白質(zhì)的溶液或基質(zhì)降低。任選地，所述改性酶的改性程度決定一個或多個基質(zhì)機械性質(zhì)。任選地，所述改性酶分子與非改性酶分子相比顯示交聯(lián)速度在交聯(lián)聚合物中與在溶液中相比更大的差異。根據(jù)本發(fā)明至少一些實施方式，提供了控制基質(zhì)形成的方法，包括以在形成基質(zhì)時改變酶分子在交聯(lián)基質(zhì)中的感知量的改變使酶分子改性；混合所述改性酶分子與至少一種底物聚合物，該底物聚合物是所述改性酶分子的底物；和通過所述改性酶分子使所述至少一種底物聚合物交聯(lián)，形成基質(zhì)，其中所述形成基質(zhì)至少部分地由所述酶分子的所述改性控制。任選地，所述改性使所述改性酶分子的交聯(lián)速度隨所述至少一種底物聚合物的交聯(lián)程度增加而降低。任選地，在溶液中混合所述改性酶分子和所述至少一種底物聚合物，使得所述改性在所述溶液的粘性増加時控制所述至少ー種底物聚合物的交聯(lián)程度。任選地，所述改性包括酶在pH在7至9的范圍內(nèi)時的PEG化。任選地，PEG化反應(yīng)的pH為7. 5-8. 5。根據(jù)本方法和/或基質(zhì)的至少ー些實施方式，所述至少一種底物聚合物包括選自如下的底物聚合物可天然交聯(lián)的聚合物、可通過所述改性酶交聯(lián)的部分變性聚合物和包含功能基團的改性聚合物或可通過所述改性酶交聯(lián)的肽。任選地，所述至少ー種底物聚合物包括明膠、膠原、酪蛋白或白蛋白或改性聚合物，并且其中所述改性酶分子包括改性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和/或改性氧化酶。任選地，所述至少一種底物聚合物包括選自下列的明膠通過部分水解動物組織或得自動物組織的膠原得到的明膠，其中所述動物組織選自動物皮膚、結(jié)締組織、鹿角、角、骨、魚鱗和用細菌、酵母菌、動物、昆蟲或植物系統(tǒng)生成的重組明膠或任何類型的細胞培養(yǎng)物或其任意組合。任選地，所述明膠是哺乳動物或魚類起源的明膠。任選地，所述明膠是A型(酸處理)或B型(堿處理)。任選地，所述明膠具有250-300白化。任選地，所述明膠含有平均分子量75-150kda。任選地，所述改性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包括改性微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。任選地，所述改性 聚合物經(jīng)改性允許所述改性微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián)。任選地，所述改性氧化酶包括酪氨酸酶、漆酶或過氧化物酶中的ー種或多種。任選地，所述基質(zhì)進ー步包括包含通過所述改性氧化酶交聯(lián)的酚酸的糖作為所述至少ー種底物聚合物。任選地，所述糖包括阿拉伯糖基木聚糖或果膠中的ー種或多種。任選地，所述酶分子通過PEG化而改性，并且其中所述PEG化提供免疫原性掩蔽，這是通過掩蔽所述酶分子隔離接受基質(zhì)的宿主動物的免疫系統(tǒng)實現(xiàn)的。任選地，所述宿主動物是人。根據(jù)至少一些實施方式，提供了密封組織防止體液泄漏的方法，包括向組織施用本文所述的基質(zhì)。任選地，所述體液包括血液，使得所述基質(zhì)是止血剤。根據(jù)至少一些實施方式，提供了包含本文所述基質(zhì)的止血劑或外科密封劑。根據(jù)至少一些實施方式，提供了包含本文所述基質(zhì)的用于密封傷ロ的組合物。根據(jù)至少一些實施方式，提供了該組合物用于密封組織中的縫合線或釘合線(staple line)的應(yīng)用。根據(jù)至少一些實施方式，提供了包含本文所述基質(zhì)的用于局部藥物輸送的媒介物組合物。根據(jù)至少一些實施方式，提供了包含本文所述基質(zhì)的用于組織工程的組合物，適用作可注入支架。根據(jù)至少一些實施方式，提供了使組合物改性的方法，包括提供具有可交聯(lián)功能基團的改性酶和具有至少ー個可通過所述改性酶交聯(lián)的部分的蛋白質(zhì)；混合所述改性酶與所述蛋白質(zhì)，其中所述改性酶使所述蛋白質(zhì)交聯(lián)，而且也通過所述可交聯(lián)功能基団交聯(lián)于所述蛋白質(zhì)。使聚合物鏈上的底物基團直接交聯(lián)的直接交聯(lián)酶的非限制性實例包括轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和氧化酶。轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的實例包括微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)、組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)和因子XIII。這些酶可來自天然或重組來源。聚合物鏈中的谷氨酸和賴氨酸氨基酸是用于轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)的底物。氧化酶的非限制性實例是酪氨酸酶、漆酶和過氧化物酶。這些酶通過醌的形成(酪氨酸酶)或自由基的形成(漆酶，過氧化物酶)使聚合物交聯(lián)。然后醌和自由基彼此或與其他氨基酸或酚酸發(fā)生相互作用，以使聚合物交聯(lián)。這些酶可交聯(lián)的底物可以是包含酪氨酸或其他芳香族氨基酸的任何蛋白質(zhì)。底物還可以是包含酚酸如阿魏酸的碳水化合物。這種碳水化合物例如可以是阿拉伯糖基木聚糖或果膠。具有一個或多個適當官能基團的合成或部分合成的聚合物也可充當上述任意酶可交聯(lián)的底物。在本發(fā)明的另ー實施方式中，應(yīng)用酶組合。本文定義的“聚合物鏈(strand)”或“聚合物鏈(chain)”指酶交聯(lián)的底物聚合物，其根據(jù)本發(fā)明至少ー些實施方式優(yōu)選屬于以下類別其中ー種(僅為非限制性實例，并且不希望提供封閉的列表)
I)具有可由酶天然交聯(lián)的底物基團和本身可由酶天然交聯(lián)的任何聚合物。例如，在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的情況下，其將包括可由酶天然交聯(lián)的蛋白質(zhì)或多肽，如明膠、膠原和酪蛋白。 2)包含由于其結(jié)構(gòu)可由酶交聯(lián)但非天然可由酶交聯(lián)的底物基團的聚合物。在這種情況下，聚合物結(jié)構(gòu)必須在酶交聯(lián)前被改性。例如，在轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的情況下，其將包括非酶天然底物的蛋白質(zhì)，如白蛋白或乳球蛋白，因為其具有阻礙酶進入的球狀結(jié)構(gòu)?？赏ㄟ^用還原劑、變性劑或熱量使蛋白質(zhì)部分變性使其成為底物。3)非酶交聯(lián)底物但已被作為酶底物的肽或功能基團改性從而使改性聚合物可由酶交聯(lián)的天然或合成的聚合物。這種聚合物的非限制性實例包括任何適合的蛋白質(zhì)類型，其可例如任選地包括上述明膠。明膠可任選地包括任何類型的明膠，其包括本領(lǐng)域已知的蛋白質(zhì)，優(yōu)選包括但不限于通過部分水解動物組織和/或得自動物組織的膠原得到的明膠，該動物組織包括但不限于動物皮膚、結(jié)締組織(包括但不限于韌帶、軟骨及類似物)、鹿角或角及類似物、和/或骨、和/或魚鱗和/或骨或其他成分；和/或用細菌、酵母菌、動物、昆蟲或植物系統(tǒng)生成的重組明膠或任何類型的細胞培養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，動物來源的明膠優(yōu)選包括哺乳動物來源的明膠，更優(yōu)選包括豬皮、豬骨和牛骨或碎牛皮或任何其他豬或牛來源中的ー種或多種。更優(yōu)選，這種明膠包括豬明膠，因為其具有較低的過敏反應(yīng)率。動物來源的明膠可任選地為A型(酸處理)或B型(堿處理)，盡管優(yōu)選A型。優(yōu)選地，動物來源的明膠包括在第一提取過程中得到的明膠，其一般在較低的溫度(50-60°C，雖然該準確溫度范圍不必是限制)下進行。此方式下生成的明膠將在250-300水的范圍內(nèi)，并具有至少約95-100kDa的高分子量。優(yōu)選地，應(yīng)用275-300水的明膠。這種明膠制造商的非限制性實例是PB GelatinsCTessenderlo Group,Belgium)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，動物來源的明膠任選地包括魚明膠。任選地，可采用任何類型的魚，優(yōu)選冷水品種魚如鯉魚、鱈魚或梭魚或金槍魚。這種明膠的pH(在10%的溶液下測量)優(yōu)選在4-6的范圍內(nèi)。冷水魚明膠在10°C下于水中形成溶液，因此所有冷水魚明膠均被認為是O白化。對于本發(fā)明，任選并且優(yōu)選采用高分子量冷水魚明膠，更優(yōu)選包括至少約95-115kDa的平均分子量。這等同于250-300白化的動物明膠的分子量。冷水魚明膠在比動物明膠低很多的溫度下進行熱可逆凝膠化，這是因為其較低的脯氨酸和羥基脯氨酸水平。每1000個氨基酸殘，冷水魚明膠基具有100-130個脯氨酸和50-75個羥基脯氨酸基團，與之相比動物明膠具有135-145個脯氨酸和90-100個羥基脯氨酸(Haug U, Draget KI, Smidsr0dO. (2004).食品膠體(Food Hydrocolloids). 18:203 - 213)。這種明膠的制造商的非限制性實例是Norland Products (Cranbury, NJ)0在本發(fā)明一些實施方式中，利用低內(nèi)毒性明膠形成明膠-mTG組合物的明膠溶液成分。這種明膠購自供應(yīng)商如Gelita (Eberbach, Germany)。低內(nèi)毒性明膠被定義為低于每克1000內(nèi)毒性單位(EU)的明膠。更優(yōu)選，采用內(nèi)毒性低于500EU/克的明膠。對于極高敏感性的應(yīng)用，如將接觸脊柱或腦的材料的應(yīng)用，優(yōu)選內(nèi)毒性低于100EU/克的明膠，更優(yōu)選低于50EU/g的明膠。內(nèi)毒性低于10EU/g的明膠價格非常昂貴，但也可被用作本發(fā)明至少一些實施方式敏感性應(yīng)用的一部分。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，I型、II型或任何其他類型的水解或非水解膠原代替明膠作為正交聯(lián)的蛋白物質(zhì)。多種類型的膠原已證明了形成熱穩(wěn)定mTG-交聯(lián)凝膠的能力。
根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，采用重組人明膠。這種明膠購自供應(yīng)商如Fibrogen (San Francisco, CA)。重組明膠優(yōu)選至少約90%純,更優(yōu)選至少約95%純。一些重組明膠在10°C下是非凝膠化的，因此被認為是O白化的。對于本發(fā)明一些實施方式，優(yōu)選采用高分子量重組明膠,更優(yōu)選包括至少約95-100kDa的分子量。如上所述，可交聯(lián)的蛋白質(zhì)優(yōu)選包括明膠，但也可另外或取而代之包括另一類蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明一些實施方式，蛋白質(zhì)也是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的底物，并且優(yōu)選其特征在于適當?shù)霓D(zhuǎn)谷氨酰胺酶特異性多肽和聚合物序列。這些蛋白質(zhì)可任選地包括但不限于這樣的合成聚合物序列獨立地具有形成生物粘合劑或聚合物的性質(zhì)，該生物粘合劑或聚合物更優(yōu)選已被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶特異性底物改性，該轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶特異性底物增強材料被轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)的能力。這些材料類型中每一種的非限制性實例在下文中述及。具有適當?shù)霓D(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)目標的合成多肽和聚合物序列已被開發(fā)，其具有優(yōu)選約20至約40°C的轉(zhuǎn)變點。優(yōu)選的物理特征包括但不限于結(jié)合組織的能力和形成纖維的能力。如同凝膠型明膠(上述)，這些多肽可任選地被用于組合物中，該組合物的特征也在于降低其轉(zhuǎn)變點的一種或多種物質(zhì)。這種肽的非限制性實例被述及于US專利第5，428，014和5，939，385號，二者均由ZymoGenetics Inc提交，在此將其全部引入作為參考，如同在本文中得到完整描述。兩專利均描述了生物相容的、生物粘合的、可轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)的多肽，其中已知轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶催化蛋白質(zhì)結(jié)合的谷氨酰胺酰基殘基的Y-氨甲?；cLys殘基的氨基之間的轉(zhuǎn)?；磻?yīng)，導致ε-(Υ-谷氨?；?賴氨酸異構(gòu)肽鍵的形成。根據(jù)一些實施方式，生成的組合物被用作局部藥物輸送的媒介物。根據(jù)一些實施方式，生成的組合物是用于組織工程的可注入支架。根據(jù)一些實施方式，組合物是止血的組合物。根據(jù)一些實施方式，組合物是密封體液的組合物。本發(fā)明的組合物優(yōu)選提供迅速止血，從而最小化創(chuàng)傷或手術(shù)后的血液損失。 本文所用的“傷口 ”指患者任何組織的任何造成血液從循環(huán)系統(tǒng)流失或從任何其他體液從其生理途徑如任何類型脈管流失的損傷。該組織可以是內(nèi)部組織，如器官或血管；或外部組織，如皮膚。血液或體液的流失可以在內(nèi)部，如來自斷裂的器官；或在外部，如來自撕裂。傷ロ可在軟組織，如器官；或在硬組織，如骨。損傷可由任何劑或來源引起，包括外傷性創(chuàng)傷、感染或外科干預(yù)。損傷可危及生命或不危及生命。外科傷ロ閉合目前通過縫合和釘合實現(xiàn)，其通過將組織牽引在一起而促進愈合。但是，其經(jīng)常不能造成防止流體泄漏所必需的足夠的密封。因此，存在對防止手術(shù)后泄漏包括經(jīng)常沿釘合線和縫合線發(fā)生的泄漏的裝置和方法極大的、未滿足的醫(yī)療需要。這種裝置和方法需要作為縫合或釘合的輔助以實現(xiàn)在周圍血管重建、硬腦膜重建、胸部、心血管、肺部、神經(jīng)和胃腸道手術(shù)過程中的止血或其他流體停滯。如果對于所有粘合剤，當前市場上的大多數(shù)高壓止血的裝置都是有名無實的。因此，根據(jù)至少一些實施方式，本發(fā)明的組合物克服了這些缺陷，并可任選地用于止血。本文所用的，“約”意為所述值或加或減大約10%。本發(fā)明不同實施方式的其他特征和優(yōu)勢將由下文詳細描述和權(quán)利要求變得顯而易見。附圖簡述本文僅為示例而參考附圖對本發(fā)明進行描述。在現(xiàn)在具體詳細參考附圖的情況下要強調(diào)的是，所示細節(jié)僅是為示例和為示例性討論本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，并且是為提供本發(fā)明的原理和概念方面被認為最有用和最容易被理解的描述而展示。在這方面，沒有試圖比本發(fā)明基本理解所必需更具體地顯示本發(fā)明的結(jié)構(gòu)細節(jié)，隨同附圖的說明致使本發(fā)明的幾種形式如何在實踐中實施對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。在附圖中圖I :反應(yīng)pH和活化PEG的濃度對PEG化產(chǎn)物的尺寸和分布的影響；圖2 :反應(yīng)時間和pH對PEG化產(chǎn)物的尺寸和分布的影響；圖3 :利用不同濃度的PEG-NHS (2kD)對PEG化mTG的SDS-分析； 圖4 mTG和PEG化mTG自相同的交聯(lián)明膠洗脫；圖5 mTG (左)和PEG化mTG (右)自不同的交聯(lián)明膠洗脫；圖6 :與非PEG化mTG和2種PEG化mTG —起制成的明膠密封劑的爆裂壓カ值；圖7 mTG與葡聚糖之間的結(jié)合產(chǎn)物的SDS-PAGE分析；圖8 :辣根過氧化物酶(HRP)的PEG化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析；圖9 mTG的PEG化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，利用不同的反應(yīng)條件，凝膠顯示了不同的PEG化程度；

圖10 :mTG的PEG化產(chǎn)物SDS-PAGE分析，其中反應(yīng)性PEG是雙功能IOkD PEG-NHS ；圖11顯示由MALDI-T0F質(zhì)譜儀得到的PEG化mTG —般批次的質(zhì)荷譜；和圖12顯示mTG的PEG化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，其中PEG試劑與胺的比保持恒定，但反應(yīng)物濃度改變。發(fā)明詳述
下文本章節(jié)標題僅為便于描述而提供。要理解的是，其不意為以任何方式受到限制。同樣，除非另外限定，本文所用的所有技術(shù)術(shù)語和科學術(shù)語均與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員普遍理解的具有相同的含義。雖然類似或等同于本文所述的方法和材料可用于本發(fā)明的實踐或測試，但下文描述了適當?shù)姆椒ê筒牧?。在矛盾的情況下，本發(fā)明說明書，包括定義，將占據(jù)主導。此外，材料、方法和實例僅是示例性的，并不意為限制性的。
水凝膠中酶交聯(lián)劑增加的感知量發(fā)現(xiàn)除含酶聚合物溶液的粘性和部分交聯(lián)溶液的交聯(lián)密度(反應(yīng)基團的利用度)夕卜，交聯(lián)基質(zhì)中交聯(lián)酶的催化速度也可通過控制酶分子的感知量而得到控制。根據(jù)本發(fā)明至少一些實施方式，這種控制可任選并且優(yōu)選地通過在啟動交聯(lián)反應(yīng)或前在反應(yīng)本身過程中增加酶分子的感知量在基質(zhì)接近預(yù)期的機械狀態(tài)時導致交聯(lián)的催化速度降低。在此方式下，固化基質(zhì)在預(yù)期交聯(lián)密度狀態(tài)截留尺寸增大的酶，并防止進一步交聯(lián)。酶感知量是除其他因子外酶分子量和流體動力學體積的函數(shù)。交聯(lián)基質(zhì)的最終交聯(lián)程度可通過改造酶分子、基質(zhì)材料、交聯(lián)環(huán)境或這些因子的一些組合從而增加基質(zhì)形成時交聯(lián)基質(zhì)中酶分子的感知量而被限制。不希望受到單一假設(shè)限制，可能是增加的酶感知量導致酶在交聯(lián)基質(zhì)中的移動性降低。酶分子在早期交聯(lián)反應(yīng)階段保持移動性時降低酶移動性以控制最終交聯(lián)密度是最有效的，此時溶液粘性仍低，但在交聯(lián)進行時喪失移動性從而增加溶液粘性，并且在初始固體基質(zhì)或水凝膠已形成后更嚴 重地喪失移動性。天然地，基質(zhì)中酶移動性的精確水平應(yīng)被調(diào)控，從而取得具體應(yīng)用所需的交聯(lián)特征和程度。不希望受到單一假設(shè)的限制，尺寸增大或流體動力學體積增大的酶在交聯(lián)基質(zhì)中比非改性酶具有較低的擴散系數(shù)或移動性，因此更加有限地進入可交聯(lián)的底物。尺寸和/或流體動力學體積增大的酶分子降低酶分子在交聯(lián)基質(zhì)中的移動性的優(yōu)選方法是增大酶分子的有效尺寸。這可通過增加酶分子的分子量(MW)、增加流體動力學體積或增加MW和流體動力學體積而實現(xiàn)。這是優(yōu)選的方法，因為其不應(yīng)影響交聯(lián)基質(zhì)的結(jié)構(gòu)組成。為對本文所述的本發(fā)明實施方式有效，優(yōu)選以不消除酶活性或其使預(yù)期聚合物底物交聯(lián)為固體基質(zhì)或水凝膠的能力的方式增大酶分子尺寸。該酶還優(yōu)選保持足以在適當時間量內(nèi)形成基質(zhì)的活性。此外，尺寸增大的酶分子還優(yōu)選保持在交聯(lián)基質(zhì)中足以在阻止在基質(zhì)中的移動性前催化預(yù)期的交聯(lián)程度的移動性。多種增大交聯(lián)基質(zhì)或水凝膠中酶分子尺寸的方法已被確定I.使酶自身交聯(lián)(分子間交聯(lián))，從而形成可溶性多單元結(jié)合體。其實例在下文實施施例18中述及。2.使酶共價結(jié)合(固定化)在載體上I.固定化于可溶性蛋白質(zhì)，例如白蛋白；(Allen TM et al, 1985，JPET234:250-254, α -葡萄糖苷酶-白蛋白結(jié)合體慢性給藥對小鼠的影響，(Allen TM etal，1985，JPET 234:250-254，alpha-Glucosidase-albumin conjugates : effect ofchronic administration in mice))。II.固定化在可溶性聚合物上。優(yōu)選地,聚合物載體大于酶,在此一個或多個酶分子被固定在各聚合物分子上。也可能是單個酶分子通過兩個或更多個連接位點結(jié)合于一個以上聚合物分子。載體可以是天然、合成或半合成的。很多這種應(yīng)用被開發(fā)以增加體內(nèi)酶穩(wěn)定性或降低免疫原性。一種該聚合物家族是纖維素醚，包括但不限于羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素等。這種固定化之前已用酶如胰蛋白酶(Villaonga et al, 2000,分子催化學報，B: 10，483-490羧甲基纖維素酶改性的胰蛋白酶酶法制備和功能特性，(Villaonga et al, 2000, Journal of Molecular CatalysisB:10,483-490 Enzymatic Preparation and functional properties of trypsinmodified by carboxymethylcellulose))和溶菌酶(Chen SH et al, 2003,酶和微生物技術(shù)，33，643-649，通過偶聯(lián)可逆的水溶性聚合物溶菌酶的可逆固定化(Chen SH etal, 2003, Enzyme and Microbia丄 Technology33, 643-649，Reversible immobilization oflysozyme via coupling to reversibly soluble polymer))實現(xiàn)，雖然這種酶固定化之前從未被用于影響酶交聯(lián)的水凝膠或基質(zhì)的機械性質(zhì)。III.結(jié)合于葡糖胺基葡聚糖(GAG)，包括但不限于硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素、硫酸肝素和透明質(zhì)酸。如上，這種結(jié)合已被實現(xiàn)(Luchter-Wasylewska E etal., 1991,生物技術(shù)和應(yīng)用生物化學13:36-47，用硫酸軟骨素偶聯(lián)的人類前列腺酸性磷酸酶的碌定(Luchter-Wasylewska E et al. , 1991, Biotechnology and applied Diochemistryl3:36-47, Stabilization of human prostatic acid phosphatase by coupling withchondroitin sulfate)),雖然從未被用于影響酶交聯(lián)的水凝膠或基質(zhì)的機械性質(zhì)。IV.酶還可偶聯(lián)至多糖，如葡聚糖和淀粉衍生物如羥こ基淀粉。其實例可示于實施例13，其中酶偶聯(lián)至氧化葡聚糖。3.通過共價改性(ー個或多個)向單個酶分子添加ー個或多個部分。通常，但不一定，所述部分小于酶。這種改性的實例是交聯(lián)酶的PEG化，如下文多個實施例中充分描述。4.其他共價結(jié)合類型。例如,通過在酶表面上接枝生物素分子(生物素化)和在包含抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的分子或聚合物上固定生物素化酶。載體可以是非可交聯(lián)的可溶性聚合物，其功能是在交聯(lián)反應(yīng)前或中捕獲交聯(lián)酶?；蛘?，捕獲基團，例如?？股锼氐鞍谆蜴溍箍股锼氐鞍?，可被接枝在可交聯(lián)的聚合物本身上，導致交聯(lián)酶在交聯(lián)反應(yīng)過程中于逐步固定化于可交聯(lián)的聚合物上。5.酶與載體或聚合物非共價結(jié)合。例如，酶與載體或聚合物之間的靜電相互作用可提供穩(wěn)定但非共價鍵，此時酶的凈電荷與載體的凈電荷符號相反。增加酶分子尺寸相關(guān)的技術(shù)雖然增加酶尺寸之前已被多次公開，但其從未被考慮在形成酶交聯(lián)基質(zhì)或水凝膠和/或控制酶交聯(lián)基質(zhì)或水凝膠形成的背景下。交聯(lián)基質(zhì)中尺寸増大的酶的應(yīng)用完全是新穎的，因為尺寸増大的酶在這種基質(zhì)中的交聯(lián)反應(yīng)性之前未被以任何程度表征。此外，本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地證明，尺寸増大的酶的單獨的酶活性——如比色法酶活性分析所測——明顯不同于水凝膠形成中尺寸増大的酶的交聯(lián)活性，如凝膠化速率所示。例如，實施例5描述了用比色法分析測量酶催化凝膠化速率與酶活性值的比較。PEG化作為增加酶尺寸的非限制性示例方法在該實施例被述及。PEG化是聚こニ醇(PEG)分子與酶分子的共價連接，并且是增加酶分子尺寸的優(yōu)選方法。添加這樣的ー種或多種PEG分子的操作被稱為PEG化。PEG是用于增加酶尺寸的理想材料，因為其具有生物惰性，并已被證明了限制對PEG化的植入或注入分子的免疫源應(yīng)答的能力。雖然不知道本文所述的酶PEG化是否也引起這種免疫原性掩蔽(有限的免疫源應(yīng)答)，但不希望受到單一假設(shè)的限制，可能是事實上酶的PEG化確實限制對酶的免疫原性應(yīng)答，并且也可能由于延伸限制對交聯(lián)基質(zhì)的免疫原性應(yīng)答。ー種實現(xiàn)酶PEG化的方法是使酶與活化的甲氧基PEG (mPEG)發(fā)生反應(yīng)，該活化的甲氧基PEG與酶的胺基發(fā)生反應(yīng)(胺PEG化)。活化的mPEG的非限制性實例包括mPEG的琥珀酰亞胺(NHS)酯(mPEG-琥珀酸酯-NHS、mPEG_戊二酸酯-NHS、mPEG_戊酸酯-NHS、mPEG_碳酸酯-NHS、mPEG-羧甲基-NHS、mPEG_丙酸酯-NHS、mPEG_羧戊基-NHS)、mPEG_硝基苯基碳酸酯、mPEG-丙醛、mPEG-甲苯磺酸酯、mPEG-羰基咪唑、mPEG-異氰酸酯、mPEG-環(huán)氧化物?；罨膍PEG可是與酶的巰基發(fā)生反應(yīng)的mPEG (巰基PEG化)?；罨腜EG可以是單功能、異雙功能或同雙功能的。活化的PEG可以是分支PEG或多臂PEG。活化的PEG的尺寸的范圍可以是1000道爾頓至40，000道爾頓?；罨腜EG與酶的賴氨酸基團的摩爾比為O. 1:1至100:1，優(yōu)選O. 5:1至10:1。
優(yōu)選地，PEG化反應(yīng)的pH為7-9。更優(yōu)選反應(yīng)pH為7. 5-8. 5。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，可將PEG化酶自未反應(yīng)的酶進一步純化或從而減小PEG化產(chǎn)物的尺寸范圍。純化可利用尺寸排阻層析進行。或者或另外，純化可利用離子層析如SP-瓊脂糖、Q-瓊脂糖、SM-瓊脂糖或DEAE-瓊脂糖進行。或者或另外，自未反應(yīng)的酶的純化還可利用透析、超濾或硫酸銨分級分離進行。下文提供的多個實施例描述了轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶PEG化對于控制交聯(lián)水凝膠形成的應(yīng)用。實施例I描述了 mTG與PEG-NHS (5kD)的PEG化反應(yīng)。PEG化產(chǎn)物的尺寸和分布取決于PEG與mTG的比和反應(yīng)的pH。實施例2描述了 MTG與PEG-NHS (5kD)的PEG化反應(yīng)。PEG化產(chǎn)物的尺寸和分布取決于反應(yīng)持續(xù)時間和pH。實施例3描述了 MTG與PEG-NHS (2kD)的PEG化反應(yīng)。PEG化產(chǎn)物的尺寸和分布取決于PEG與mTG的比。實施例4描述了用于確定不同PEG化mTG (5kD PEG)制劑的PEG化程度的TNBS分析。結(jié)果表明，PEG化程度取決于反應(yīng)中活化的PEG:mTG的比。實施例5描述了用于確定PEG化mTG的活性的分析。結(jié)果表明，PEG化mTG保持其對小底物如羥基胺和CBZ-Gln-Gly的大部分活性，但喪失其對較大底物如明膠的大部分活性。實施例6和7描述了 mTG和PEG化mTG自交聯(lián)明膠凝膠的洗脫特征的SDS-PAGE分析。結(jié)果表明，PEG化mTG自凝膠洗脫比非PEG化mTG慢且程度低，可能是因為其較大的尺寸或流體動力學體積。實施例8描述了已自交聯(lián)明膠凝膠洗脫的mTG的活性測量。結(jié)果表明，自交聯(lián)明膠凝膠洗脫的非PEG化mTG保持其大部分活性(最大計算活性的86%)。實施例9描述了與PEG化或非PEG化mTG交聯(lián)的明膠凝膠的機械測試。結(jié)果證明，與PEG化mTG交聯(lián)的明膠凝膠比與非PEG化mTG交聯(lián)的凝膠更具強度，且相當更具撓性。實施例10描述了不同明膠密封劑制劑的爆裂壓力測試。結(jié)果表明，用PEG化mTG制成的明膠密封劑證明了爆裂壓力結(jié)果相當于用非PEG化mTG制成的密封劑。實施例11描述了對于體內(nèi)豬模型釘合線加固的密封劑應(yīng)用。實施例12描述了交聯(lián)酶非共價結(jié)合不可溶載體的影響。實施例13描述了氧化葡聚糖改性酶的影響。實施例14證明了辣根過氧化物酶(另一交聯(lián)酶)通過PEG化改性可使通過過氧化物酶交聯(lián)形成的基質(zhì)改性。實施例15證明了交聯(lián)酶部分PEG化的影響。實施例16證明了游離的PEG (PEG分子與交聯(lián)酶放置于溶液，但未共價結(jié)合酶)不影響凝膠化。實施例17示例了改性酶與非改性酶混合的不同混合物對凝膠化的影響。實施例18證明了雙功能PEG-酶橋?qū)δz化的影響。實施例19涉及PEG化mTG (微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)的質(zhì)譜分析。實施例20描述了以固定PEG:胺比用不同濃度的反應(yīng)物PEG化mTG，證明了總反應(yīng)物濃度對PEG化程度的巨大影響。
令人驚訝地在這些實施例中發(fā)現(xiàn)，雖然PEG化降低微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(mTG)交聯(lián)明膠的速率，但其不降低其在氧肟酸鹽分析中的活性——氧肟酸鹽分析是轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的黃金標準活性分析。這些結(jié)果與背景技術(shù)教導相矛盾，背景技術(shù)教導提出尺寸増大的酶對于水凝膠形成的應(yīng)用可能是不期望的，因為其可能在引起水凝膠形成中具有明顯較低的效力。應(yīng)當注意的是，TG酶(轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶)有時在背景技術(shù)中的PEG化背景下被提及；但是，這些參考文獻教導TG酶通過催化所述蛋白質(zhì)上谷氨酰基殘基與所述PEG分子連接的伯胺基的轉(zhuǎn)谷氨反應(yīng)而用作使其他蛋白質(zhì)能夠進行位點特異性PEG化或增強位點特異性PEG化(而非作為PEG化底物)的工具。但是，這種背景技術(shù)沒有教導或暗示TG酶本身PEG化以改變或控制其交聯(lián)活性或改變或控制由這些酶交聯(lián)的水凝膠基質(zhì)的機械性質(zhì)。交聯(lián)酶通過偶聯(lián)在交聯(lián)基質(zhì)上而移動性降低在降低交聯(lián)基質(zhì)中的酶移動性的另ー實施方式中，酶本身進行與交聯(lián)基質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)，同時催化交聯(lián)反應(yīng)。在酶移動經(jīng)過聚合物溶液以交聯(lián)基質(zhì)中的聚合物時，其逐步結(jié)合聚合物本身，因此被固定在基質(zhì)中。例如，生物素化酶可與包含抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白涂布的聚合物的可交聯(lián)聚合物成分混合。US專利6046024 (用生物素化酶和固定化抗生物素蛋白產(chǎn)生纖維蛋白單體的方法(Method of producing a fibrin monomerusing a biotinylated enzyme and immobilized avidin))描述 J 通過添カロ抗生物素蛋白改性的瓊脂糖自纖維蛋白原溶液捕獲生物素化凝血酶的方法。雖然在這種情況下瓊脂糖不可溶，但可以使抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白結(jié)合水可溶性聚合物，如美國專利5026785 (抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白改性水溶性聚合物如聚丙烯酰胺，及其在構(gòu)建可溶性多價大分子偶聯(lián)物中的用途(Avidin and streptavidin modified water-solublepolymers such as polyacrylamide, and the use thereof in the construction ofsoluble multivalent macromolecular conjugates))所述。轉(zhuǎn)谷氨酸胺酶的生物素化和隨后吸附于經(jīng)抗生物素蛋白處理的表面已顯示出是可行的(Huang XL et al,農(nóng)業(yè)食品化學，1995，43 (4)，pp 895 - 901 (Huang XL et al，J. Agric. Food Chem.，1995，43 (4)，pp895 - 901))?；蛘撸宦?lián)酶可共價結(jié)合抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白和加入交聯(lián)反應(yīng)的包含生物素化聚合物的結(jié)合體?？山宦?lián)的聚合物本身可生物素化，例如，明膠或非可交聯(lián)的共聚物如葡聚糖。分子量最高為500，000道爾頓的葡聚糖-生物素結(jié)合體可來自商業(yè)來源。交聯(lián)酶通過靜電相互作用在交聯(lián)基質(zhì)中移動件降低
在本發(fā)明的另一實施方式中，酶移動性通過基于酶與聚合物載體之間的靜電相互作用可逆結(jié)合而降低，其中酶的凈電荷與載體的凈電荷符號相反?？蓪⒚概c載體一起預(yù)溫育，并添加至交聯(lián)反應(yīng)；或可使其在交聯(lián)反應(yīng)過程中結(jié)合載體。例如，如果交聯(lián)酶在中性pH下帶正電，則其可靜電結(jié)合帶負電載體，例如羧甲基纖維素(CMC)?？蓪⒚概cCMC —起溫育以使其結(jié)合，然后將復(fù)合物加入交聯(lián)反應(yīng)；或分別添加酶和CMC。在后者情況下，酶將在交聯(lián)反應(yīng)過程中逐步結(jié)合CMC。還可以使酶在交聯(lián)反應(yīng)過程中結(jié)合可交聯(lián)的聚合物鏈本身，條件是可交聯(lián)的聚合物帶有相對于交聯(lián)酶符號相反的電荷?；蛘?，可改變交聯(lián)酶的等電點(PD，使得酶獲得與可交聯(lián)的聚合物或載體相比符號相反的電荷。在另一實施方式中，交聯(lián)酶以使其等電點(pi)改變的方式改性，導致酶在給定pH下具有不同的凈電荷。降低酶Pl的方式的實例是通過如下處理改變賴氨酸的ε-氨基例如但不限于琥珀?；?用琥珀酸酐)、乙?；?用乙酸酐)、氨甲?；?用氰酸酯)、還原烷基化(醛)和用馬來酸酐處理。這導致蛋白質(zhì)上每個改性氨基酸的凈正電荷最高減少一個電荷單位(除琥珀?；猓涫箖粽姾勺罡邷p少兩個電荷單位)和Pl降低。相反，包含羧酸如谷氨酸和天冬氨酸的側(cè)鏈可被改性以減少蛋白質(zhì)上的負電荷數(shù)量，由此增加P〗。例如，可以 基團，并且酰胺鍵在其與EDA之間形成。結(jié)果是蛋白質(zhì)的凈正電荷增加和Pl升高。蛋白質(zhì)自水凝膠釋放已被關(guān)聯(lián)于水凝膠聚合物鏈與俘獲的蛋白質(zhì)之間的靜電吸引力和排斥力。已提出，在蛋白質(zhì)從重組明膠基質(zhì)釋放的實驗中，靜電排斥力使俘獲的蛋白質(zhì)的擴散系數(shù)增大，相反靜電吸引力使擴散系數(shù)減小(Marc Sutter’ -JuergenSiepmann, Wim E. Hennink and Wim Jiskoot,用于蛋白質(zhì)緩釋的重組明膠水凝膠，受控釋放學報，第 119 卷，第 3 期，2007 年 6 月 22 日，第 301-312 頁(Marc Sutter’ -JuergenSiepmann, Wim E. Hennink and Wim Jiskootj Recombinant gelatin hydrogels for thesustained release of proteins, Journal of Controlled Release Volume 119，Issue3，22 June 2007，Pages 301-312))。改變水凝膠聚合物鏈的pi本身已被提出作為控制蛋白質(zhì)從該水凝膠釋放的方式。但是，與操控水凝膠中俘獲的蛋白質(zhì)與水凝膠鏈之間的靜電相互作用有關(guān)的背景技術(shù)涉及控制治療性蛋白質(zhì)從水凝膠釋放的速度的方法，其中蛋白質(zhì)本身與水凝膠形成無關(guān)。對于本發(fā)明至少一些實施方式，靜電相互作用被改變以提高水凝膠的機械性質(zhì)，其可能與酶在該酶交聯(lián)的水凝膠基質(zhì)中的移動性和擴散系數(shù)有關(guān)。因此，改變俘獲的交聯(lián)酶的pi是防止過度交聯(lián)的新穎方法，因為交聯(lián)酶在可交聯(lián)的基質(zhì)中的擴散或移動性通過改變俘獲的酶而非聚合物水凝膠的Pi而被嚴重限制。實施例I :反應(yīng)DH和PEG:mTG比對PEG化產(chǎn)物的尺寸和分布的影響材料:活化的PEG :mPEG-戊二酸酯-NHS 5kDa( SunBright ME_050GS，N0F corporation,Japan)。21]^_利用SP-瓊脂糖離子交換層析進一步純化的Ajinimoto activalO%?；钚詐H 6的O. 2M檸檬酸鈉中604單位/ml。朽1檬酸鈉、Hepes、SDS和β巰基乙醇來自Sigma Aldrich。30%丙烯酰胺/Bis 29:1和生物安全考馬斯G-250染色劑來自Bio-Rad....。
分子量標記物是Precision Plus Dual Color (Bio-Rad)。I單位mTG活性在pH 6. 0、37°C下每分鐘從N-CBZ-Gln-Gly和羥基胺催化形成I. O μ mol氧肟酸鹽。建立一組反應(yīng)，各反應(yīng)具有體積O. 2ml。所有反應(yīng)包括15u/ml mTG、適當?shù)姆磻?yīng)緩沖——pH 6的90mM檸檬酸鈉或pH 7的IOOmM H印es、和不同量的活化的PEG。PEG-NHS與蛋白質(zhì)中的伯胺、賴氨酸殘基側(cè)鏈上的ε -胺和蛋白質(zhì)的氨基末端發(fā)生反應(yīng)。反應(yīng)混合物中PEG與賴氨酸殘基的比在下文中詳細描述。將反應(yīng)在37°C下溫育1:36hr， 然后添加甘氨酸至最終濃度IlOmM以中和未與酶發(fā)生反應(yīng)的過量活化PEG分子。使各反應(yīng)的樣本通過在SDS和β巰基こ醇存在下于90°C加熱變性，并用SDS-PAGE (8% 解析凝膠(resolving gel), 4% 積層凝膠(stacking gel), Mini-Protean 電泳系統(tǒng)，BioRad)進行分析。為使蛋白質(zhì)顯現(xiàn)，將凝膠用生物安全考馬斯G-250染色劑染色，然后用水去染色。用CanoScan 8800F掃描儀掃描凝膠，圖像顯示在圖I中，顯示了反應(yīng)pH和活化PEG濃度對PEG化產(chǎn)物尺寸和分布的影響。泳道分配如下泳道I :mTG (對照)泳道2 :分子尺寸標記物(由上至下250kD，150kD，100kD，75kD，50kD，37kD，25kD)泳道3 53. 3mg/ml活化的PEG ；90mM檸檬酸鈉pH 6 ；PEG與賴氨酸的比9. 15泳道4 26. 6mg/ml活化的PEG ；90mM檸檬酸鈉pH 6 ；PEG與賴氨酸的比4. 59泳道5:13. 3mg/ml活化的PEG ；90mM檸檬酸鈉pH 6 ；PEG與賴氨酸的比2. 30泳道6 53. 3mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；PEG 與賴氨酸的比 9. 15泳道7 26. 6mg/ml 活化的 PEG ；IOOmM Hepes pH 7 ；PEG 與賴氨酸的比 4. 59泳道8 13. 3mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；PEG 與賴氨酸的比 2. 30由圖I可見，PEG量較大和pH増大導致導致凝膠上的酶具有増大的表觀分子量。實施例2 :反應(yīng)DH和持續(xù)時間對PEG化產(chǎn)物尺寸和分布的影響所有反應(yīng)包括15u/ml mTG。材料:活化的PEG mPEG~ 戊ニ酸酯-NHS 5kDa (SunBright ME-050GS, NOFcorporation,Japan)211ら_利用SP-瓊脂糖離子交換層析進ー步純化的Ajinimoto activalO%?；钚詐H 6的O. 2M檸檬酸鈉中604單位/ml。朽1檬酸鈉、Hepes、SDS和β巰基こ醇來自Sigma Aldrich。30%丙烯酰胺/Bis 29:1和生物安全考馬斯G-250染色劑來自Bio-Rad。分子量標記物是Precision Plus Dual Color (Bio-Rad)。I單位mTG活性將在pH 6. 0、37°C下每分鐘從N-CBZ-Gln-Gly和羥基胺催化形成I. O μ mol氧廂酸鹽。建立一組反應(yīng),各反應(yīng)具有體積O. 2ml,所有反應(yīng)包括15u/ml mTG、適當?shù)姆磻?yīng)緩
沖液-pH 7的IOOmM H印es或pH 8的IOOmM H印es、和25mg/ml PEG-NHS0反應(yīng)混合物
中PEG與賴氨酸殘基的比為4. 59。將反應(yīng)在室溫下溫育2hr。如下文所述在不同時間點提取樣本，并添加甘氨酸至最終濃度IlOmM以中和未與酶發(fā)生反應(yīng)的過量活化PEG分子。
使各反應(yīng)的樣本通過在SDS和β巰基乙醇存在下于90°C加熱變性，并利用SDS-PAGE (8%解析凝膠,4%積層凝膠，Mini-Protean電泳系統(tǒng)，BioRad)進行分析。為使蛋白質(zhì)顯現(xiàn)，將凝膠用生物安全考馬斯G-250染色劑染色，然后用水去染色。用CanoScan8800F掃描儀掃描凝膠，圖像顯示在圖2中，證明反應(yīng)時間和pH對PEG化產(chǎn)物尺寸和分布的影響。泳道分配如下泳道I :25mg/ml 活化的 PEG ；pH 8 的 IOOmM Hepes ；15min 反應(yīng)時間泳道2 25mg/ml 活化的 PEG ；pH 8 的 IOOmM Hepes ；30min 反應(yīng)時間泳道3 25mg/ml 活化的 PEG ；pH 8 的 IOOmM Hepes ；60min 反應(yīng)時間泳道4 25mg/ml 活化的 PEG ；pH 8 的 IOOmM Hepes ；120min 反應(yīng)時間泳道5 :分子尺寸標記物(由上至下250kD，150kD，100kD，75kD，50kD，37kD，25kD)
泳道6 25mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；15min 反應(yīng)時間泳道7 25mg/ml 活化的 PEG ；IOOmM Hepes pH 7 ；30min 反應(yīng)時間泳道8 25mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；60min 反應(yīng)時間泳道9 25mg/ml 活化的 PEG ； IOOmM Hepes pH 7 ；120min 反應(yīng)時間如所示圖2，反應(yīng)時間增加和pH增大導致凝膠上的酶具有增大的表觀分子量。實施例3 :用PEG-NHS (2kD)PEG化mTG PEG:mTG比對PEG化產(chǎn)物尺寸和分布的影
Ml材料:活化的PEG mPEG~ 戊二酸酯-NHS 2kDa( SunBright ME_020CS，N0F corporation,Japan)。利用SP-瓊脂糖離子交換層析進一步純化的Ajinimoto actival0%?；钚詐H 6的O. 2M檸檬酸鈉中604單位/ml。朽1檬酸鈉、Hepes、SDS和β巰基乙醇來自Sigma Aldrich。30%丙烯酰胺/Bis 29:1和生物安全考馬斯G-250染色劑來自Bio-Rad。分子量標記物是Precision Plus Dual Color (Bio-Rad)。I單位mTG活性將在pH 6. 0、37°C下每分鐘從N-CBZ-Gln-Gly和羥基胺催化形成Ι.ΟμπιοΙ氧肟酸鹽。反應(yīng)(20(^1)包括1511/1111 mTG, pH 8的IOOmM Hepes和不同濃度的PEG NHS (2kD)。將反應(yīng)在37°C下溫育2小時，然后添加10 μ I I. 5Μ甘氨酸(71mM最終濃度)以中和還未與酶發(fā)生反應(yīng)的PEG-NHS分子。使各反應(yīng)的樣本通過在SDS和β巰基乙醇存在下于90°C加熱變性，并利用SDS-PAGE (8%解析凝膠，4%積層凝膠，Mini-Protean電泳系統(tǒng)，BioRad)進行分析。為使蛋白質(zhì)顯現(xiàn)，將凝膠用生物安全考馬斯G-250染色劑染色，然后用水去染色。用CanoScan 8800F掃描儀掃描凝膠，圖像顯示在中圖3，證明利用不同濃度PEG-NHS (2kD)得到的PEG化mTG的SDS-分析。泳道分配如下泳道I :分子尺寸標記物泳道2 1. 75mg/ml PEG-NHS 2kD ；PEG 與賴氨酸的比 0. 74泳道3 :3. 5mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 與賴氨酸的比 I. 48泳道4 7mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 與賴氨酸的比 2. 97泳道5 14mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 與賴氨酸的比 5. 93泳道6 28mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 與賴氨酸的比 11. 86
泳道7 56mg/ml ；PEG-NHS 2kD ；PEG 與賴氨酸的比 23. 72如圖3所示，PEG-NHS量增加導致凝膠上的酶具有増大的表觀分子量。實施例4 :用于確定PEG化程度的TNBS分析材料:甘氨酸和5%TNBS溶液(苦基磺酸)來自Sigma Aldrich。碳酸氫鈉來自Frutarom (Israel)。
通過在500碳酸氫鹽緩沖液(pH 8. 5)中混合5%TNBS I制備稀釋的TNB S溶液。分光光度計是Anthelie Advanced (Secomam)。對于校準曲線，在碳酸氫鹽緩沖液(pH 8. 5)中制備下列甘氨酸溶液I μ g/ml、
2μ g/ml>4 μ g/ml>8 μ g/ml。將O. 5ml稀釋TNBS溶液與Iml標準甘氨酸溶液或樣本混合?；旌衔镌?7°C下溫育2小時。接著，添加0.5ml 10%SDS溶液和O. 25ml IM HCL以終止反應(yīng)。將溶液轉(zhuǎn)移到試管，并用分光光度計在335nm下讀取O. D.?；趯Ω拾彼峤⒌男是€，確定各PEG化mTG的游離NH2基團的百分比。%PEG 化=100-% 游離 NH2計算得出的PEG 化 mTG 的平均 MW :38，000+ (%PEG 化100X 18X5000)。結(jié)果顯示在下表I。
權(quán)利要求
1.交聯(lián)基質(zhì)，包含通過改性酶分子交聯(lián)的底物聚合物，所述改性酶分子具有在通過交聯(lián)所述聚合物形成所述基質(zhì)時改變所述交聯(lián)基質(zhì)中所述酶分子的感知量的改性。
2.權(quán)利要求I所述的基質(zhì)，其中所述改性酶分子具有增加所述改性酶分子實際尺寸的改性。
3.權(quán)利要求I所述的基質(zhì)，其中所述改性酶分子具有增加所述改性酶分子流體動力學體積的改性。
4.權(quán)利要求I所述的基質(zhì)，其中所述改性酶分子具有通過相比未改性酶改變所述改性酶的等電點(Pl)使所述改性酶分子的靜電荷變?yōu)榕c所述底物聚合物的凈電荷符號相反的改性。
5.權(quán)利要求4所述的基質(zhì)，其中所述改性在所述酶的賴氨酸的ε-氨基，所述改性通過選自琥珀?；?用琥珀酸酐)、乙酰化(用乙酸酐)、氨甲?；?用氰酸酯)、還原烷基化(醛)和用馬來酸酐處理的方法。
6.權(quán)利要求4所述的基質(zhì)，其中所述改性在一個或多個包含所述酶的羧酸的側(cè)鏈以減少負電荷數(shù)。
7.權(quán)利要求2-6中任一項所述的基質(zhì)，其中所述改性包括使至少一個分子或部分共價或非共價連接到所述改性酶分子上。
8.權(quán)利要求7所述的基質(zhì)，其中所述改性包括使改性分子共價連接到所述改性酶分子上。
9.權(quán)利要求8所述的基質(zhì)，其中所述改性酶分子相比于非改性酶具有降低的擴散速度和降低的交聯(lián)速度，但相比于非改性酶具有至少相似的測量酶活性。
10.權(quán)利要求9所述的基質(zhì)，其中降低的交聯(lián)速度為非改性酶交聯(lián)速度的至少10%。
11.權(quán)利要求9所述的基質(zhì)，其中所述改性分子包括載體或聚合物。
12.權(quán)利要求11所述的基質(zhì)，其中所述聚合物包括合成聚合物、纖維素聚合物、蛋白質(zhì)或多糖。
13.權(quán)利要求12所述的基質(zhì)，其中所述纖維素聚合物包括羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素或甲基纖維素中的一種或多種。
14.權(quán)利要求12所述的基質(zhì)，其中所述多糖包括葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸或淀粉衍生物中的一種或多種。
15.權(quán)利要求12所述的基質(zhì)，其中所述改性分子包括PEG(聚乙二醇)。
16.權(quán)利要求15所述的基質(zhì)，其中所述PEG包括PEG衍生物。
17.權(quán)利要求16所述的基質(zhì)，其中所述PEG衍生物包括活化的PEG。
18.權(quán)利要求17所述的基質(zhì)，其中所述活化的PEG包括甲氧基PEG(mPEG)、其衍生物、mPEG-NHS、mPEG的琥珀酰亞胺(NHS)酯(mPEG-琥珀酸酯-NHS)、mPEG-戊二酸酯-NHS、mPEG-戊酸酯-NHS、mPEG-碳酸酯-NHS、mPEG_ 羧甲基-NHS、mPEG_ 丙酸酯-NHS、mPEG_ 羧戊基-NHS)、mPEG-硝基苯基碳酸酯、mPEG-丙醛、mPEG-甲苯磺酸酯、mPEG-羰基咪唑、mPEG-異氰酸酯、mPEG-環(huán)氧化物中的一種或多種或其組合。
19.權(quán)利要求17或18所述的基質(zhì)，其中所述活化的PEG與所述酶上的胺基或巰基發(fā)生反應(yīng)。
20.權(quán)利要求17-19中任一項所述的基質(zhì)，其中所述活化的PEG與所述活化酶上的賴氨酸殘基的摩爾比在O. 5至25的范圍內(nèi)。
21.權(quán)利要求17-20中任一項所述的基質(zhì)，其中所述活化的PEG是單功能、異雙功能、同雙功能或多功能的。
22.權(quán)利要求17-21中任一項所述的基質(zhì)，其中所述活化的PEG是分支PEG或多臂PEG。
23.權(quán)利要求17-22中任一項所述的基質(zhì)，其中所述活化的PEG的尺寸在1000道爾頓至40，000道爾頓的范圍內(nèi)。
24.上述權(quán)利要求中任一項所述的基質(zhì)，進一步包括未共價結(jié)合到所述酶或所述底物聚合物上的共聚物。
25.權(quán)利要求24所述的基質(zhì)，其中所述共聚物包括多糖或纖維素聚合物。
26.權(quán)利要求25所述的基質(zhì)，其中所述多糖包括葡聚糖、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角質(zhì)素、肝素、硫酸肝素、透明質(zhì)酸或淀粉衍生物。
27.權(quán)利要求25所述的基質(zhì)，其中所述纖維素聚合物包括羧甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥乙基纖維素、甲基纖維素。
28.上述權(quán)利要求中任一項所述的基質(zhì)，其中所述改性酶分子通過使所述改性酶分子交聯(lián)多個其他酶分子從而形成多個交聯(lián)酶分子的聚集體而改性。
29.上述權(quán)利要求中任一項所述的基質(zhì)，其中所述改性酶分子的改性或改性程度影響所述基質(zhì)的至少一個性質(zhì)。
30.權(quán)利要求29所述的基質(zhì)，其中所述至少一個性質(zhì)選自拉伸強度、剛性、所述底物聚合物的交聯(lián)程度、粘性、彈性、撓性、斷裂張力、斷裂應(yīng)力、泊松比、溶脹能力和楊氏模量或其組合。
31.上述權(quán)利要求中任一項所述的基質(zhì)，其中所述改性酶的改性程度決定所述改性酶在所述基質(zhì)中的移動性或自所述基質(zhì)擴散。
32.權(quán)利要求31所述的基質(zhì)，其中相比于非改性酶和所述蛋白質(zhì)的溶液或基質(zhì)，所述改性酶的所述改性降低了所述改性酶在所述改性酶和所述蛋白質(zhì)的溶液中或在所述改性酶和所述蛋白質(zhì)的基質(zhì)中的擴散系數(shù)。
33.上述權(quán)利要求中任一項所述的基質(zhì)，其中所述改性酶的改性程度決定一個或多個基質(zhì)機械性質(zhì)。
34.上述權(quán)利要求中任一項所述的基質(zhì)，其中所述改性酶分子相于非改性酶分子顯示 交聯(lián)速度在交聯(lián)聚合物中與在溶液中相比更大的差異。
35.控制基質(zhì)形成的方法，包括使酶分子改性，其改性是在形成所述基質(zhì)時改變所述交聯(lián)基質(zhì)中所述酶分子的感知量；混合所述改性酶分子與至少一種底物聚合物，所述至少一種底物聚合物是所述改性酶分子的底物；和通過所述改性酶分子交聯(lián)所述至少一種底物聚合物形成所述基質(zhì)，其中形成所述基質(zhì)至少部分由所述酶分子的所述改性控制。
36.權(quán)利要求35所述的方法，其中所述改性隨著所述至少一種底物聚合物的交聯(lián)程度增加而降低所述改性酶分子的交聯(lián)速度。
37.權(quán)利要求36所述的方法，其中將所述改性酶分子和所述至少一種底物聚合物在溶液中混合，使得所述改性隨著所述溶液的粘性增加而控制所述至少一種底物聚合物的交聯(lián)程度。
38.權(quán)利要求37所述的方法，其中所述改性包括在pH范圍7至9下PEG化所述酶。
39.權(quán)利要求38所述的方法，其中所述PEG化反應(yīng)的pH為7.5-8. 5。
40.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法或基質(zhì)，其中所述至少一種底物聚合物包括選自天然可交聯(lián)的聚合物、可由所述改性酶交聯(lián)的部分變性的聚合物和包含可由所述改性酶交聯(lián)的官能基團或肽的改性聚合物的底物聚合物。
41.權(quán)利要求40所述的方法或基質(zhì)，其中所述至少一種底物聚合物包括明膠、膠原、酪蛋白或白蛋白或改性聚合物，并且其中所述改性酶分子包括改性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和/或改性氧化酶。
42.權(quán)利要求41所述的方法或基質(zhì)，其中所述至少一種底物聚合物包括選自由明膠組成的組，該明膠通過部分水解動物組織或從動物組織獲得的膠原而獲得，其中所述動物組織是選自下組，該組由以下各項組成動物皮膚、結(jié)締組織、鹿角、角、骨、魚鱗和用細菌、酵母菌、動物、昆蟲或植物系統(tǒng)產(chǎn)生的重組明膠或任何類型的細胞培養(yǎng)物或其任意組合。
43.權(quán)利要求42所述的方法或基質(zhì)，其中所述明膠是哺乳動物或魚類起源的。
44.權(quán)利要求43所述的方法或基質(zhì)，其中所述明膠是A型(酸處理的)或B型(堿處理的)。
45.權(quán)利要求44所述的方法或基質(zhì)，其中所述明膠是250-300白化(bloom)。
46.權(quán)利要求43所述的方法或基質(zhì)，其中所述明膠具有75-150kda的平均分子量。
47.權(quán)利要求41-46中任一項所述的方法或基質(zhì)，其中所述改性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶包括改性微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶。
48.權(quán)利要求47所述的方法或基質(zhì)，其中所述改性聚合物被改性從而允許通過所述改性微生物轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進行交聯(lián)。
49.權(quán)利要求41-46所述的方法或基質(zhì)，其中所述改性氧化酶包括酪氨酸酶、漆酶或過氧化物酶中的一種或多種。
50.權(quán)利要求49所述的方法或基質(zhì)，其中所述基質(zhì)進一步包括包含用于通過所述改性氧化酶交聯(lián)的酚酸的碳水化合物作為所述至少一種底物聚合物。
51.權(quán)利要求50所述的方法或基質(zhì)，其中所述碳水化合物包括阿拉伯糖基木聚糖或果膠中的一種或多種。
52.上述權(quán)利要求中任一項所述的方法或基質(zhì)，其中所述酶分子通過PEG化改性，并且其中所述PEG化通過掩蔽所述酶分子隔離接受所述基質(zhì)的宿主動物的免疫系統(tǒng)而提供免疫原性掩蔽。
53.權(quán)利要求52所述的方法或基質(zhì)，其中所述宿主動物是人。
54.密封組織防止體液泄漏的方法，包括向所述組織施用上述權(quán)利要求中任一項所述的基質(zhì)。
55.權(quán)利要求54所述的方法，其中所述體液包括血液，使得所述基質(zhì)是止血劑。
56.止血劑或外科密封劑，包含上述權(quán)利要求中任一項所定義的基質(zhì)。
57.密封傷口的組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項所定義的基質(zhì)。
58.權(quán)利要求57所述組合物用于密封組織中的縫合線或釘合線的用途。
59.用于局部藥物遞送的載體的組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項所述的基質(zhì)。
60.用于組織工程的組合物，包含上述權(quán)利要求中任一項所定義的基質(zhì)，適合用作可注射支架。
61.使組合物改性的方法，包括提供具有可交聯(lián)的官能基團的改性酶和具有至少一個可通過所述改性酶交聯(lián)的部分的蛋白質(zhì)；混合所述改性酶與所述蛋白質(zhì)，其中所述改性酶使所述蛋白質(zhì)交聯(lián)，并且還通過所述可交聯(lián)的官能基團交聯(lián)到所述蛋白質(zhì)上。
全文摘要
改進的通過酶交聯(lián)聚合物形成的基質(zhì)或水凝膠，其中交聯(lián)酶分子已被改性，其目的是改進交聯(lián)密度、機械性質(zhì)或基質(zhì)的其他性質(zhì)，和/或提供改進的對交聯(lián)速度和/或程度的控制，其中酶分子被改性以改變正在形成的交聯(lián)基質(zhì)中酶分子的感知量。還提供了制備方法和應(yīng)用。
文檔編號A61L24/10GK102711853SQ201080057151
公開日2012年10月3日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者奧萊恩·普里斯-布魯姆, 蓋伊·托莫 申請人:生命連結(jié)有限公司