專利名稱：抗前胃泌素的單克隆抗體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及抗前胃泌素的單克隆抗體、用于產(chǎn)生這類抗體的組合物和方法，以及在例如結(jié)腸直腸癌的診斷和/或治療中使用這類抗體的方法等。6.
背景技術(shù)：
結(jié)腸直腸癌(CRC)是主要的公共健康問題，其每年影響超過1，000，000人，且每年造成超過500，000例死亡。CRC是癌癥引起的死亡中的第二位原因。僅在美國，2009年報道了約147，000例新病例和超過49，900例CRC引起的死亡。存在三種形式的CRC 散發(fā)性CRC ;由DNA錯配修復(fù)基因中的種系突變引起的遺傳性非息肉性結(jié)腸癌(HNPCC);及由APC基因中的種系突變引起的家族性腺瘤性息肉病(FAP)。散發(fā)性CRC占病例的近85%，而HNPCC 占約 5%, FAP 占約 1% (Heyer 等，1999，Oncogene 18 :5325-5333)。CRC的臨床治療通常涉及常伴隨化學(xué)療法的腫瘤手術(shù)切除。目前，約50%的CRC患者在診斷五年內(nèi)死亡?？煽康暮Y選測試的缺乏和目前可得的療法的無效性是高死亡率的主要原因。存在對用于診斷CRC的新的臨床方法，以及對其他健康組織具有最小副作用的對結(jié)腸直腸癌腫瘤有效的治療的迫切需要。7.發(fā)明概述本申請?zhí)峁┯糜谠诎ㄈ祟惖膭游镏性\斷和/或治療結(jié)腸直腸癌(CRC)的組合物和方法。本申請中所述的多種發(fā)明部分基于申請人的單克隆抗體發(fā)現(xiàn)，該單克隆抗體特異性結(jié)合前胃泌素(PG)，例如人前胃泌素(hPG)(由CRC腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生的多肽)，并在CRC的體外模型中顯示抗增殖特性。前胃泌素由結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生，認(rèn)為它通過觸發(fā)阻斷細(xì)胞正常分化過程(包括導(dǎo)致細(xì)胞死亡的那些過程)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來刺激這些細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)和體外CRC模型中，編碼前胃泌素的胃泌素基因轉(zhuǎn)錄物的排除(depletion)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞分化和程序性細(xì)胞死亡，減少腫瘤細(xì)增殖。雖然并非旨在受限于任何操作理論，但認(rèn)為抗_hPG抗體通過結(jié)合PG來阻斷或抑制其與它的一個或多個信號發(fā)放配偶體相互作用的能力。這轉(zhuǎn)而抑制結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞中否則將導(dǎo)致增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，一方面，本公開提供特異性結(jié)合PG(例如hPG)但不結(jié)合胃泌素基因的其他產(chǎn)物的單克隆抗體。參照

圖1，胃泌素基因翻譯為101個氨基酸的多肽(稱為前胃泌素原(pre-progastrin))，其包含信號序列(下劃線)，切割該信號序列產(chǎn)生前胃泌素(80個氨基酸的多肽)。轉(zhuǎn)而切割前胃泌素來產(chǎn)生對應(yīng)于前胃泌素的殘基38至71的34個氨基酸的產(chǎn)物，然后用甘氨酸殘基在其羧基端延長，產(chǎn)生甘氨酸延長的G34( “G34-Gly”)。此切割的副產(chǎn)物是5個氨基酸的肽(稱為C端側(cè)翼肽或CTFP)，其包含前胃泌素的殘基75至80。然后進(jìn)一步切割G34-Gly產(chǎn)生17個殘基的多肽，該多肽在序列上對應(yīng)于前胃泌素的殘基55至71，稱為G17-Gly。去除G34-Gly和G17_Gly的C端甘氨酸，然后C端酰胺化，分別產(chǎn)生G34和G17，二者都是C端酰胺化的。因此，前胃泌素的前37個殘基是它特有的(即不存在于它的加工產(chǎn)物，如G34、G34-Gly、G17、G17_Gly或CFTP中)，而殘基38至80還存在于胃泌素基因的翻譯后產(chǎn)物中。申請人:已發(fā)現(xiàn)，雖然可以用技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生抗-PG單克隆抗體，但抗原的選擇很重要。并非所有衍生自hPG的抗原都在生理條件下刺激特異性結(jié)合hPG的單克隆抗體的產(chǎn)生。如下文所述，用來產(chǎn)生抗hPG的多克隆抗體的多種抗原(如全長重組人前胃泌素(見例如Singh WO 08/076454)和對應(yīng)于hPG的C端最后十個氨基酸的肽(見例如Hollande WO 07/135542))未能產(chǎn)生抗_hPG單克隆抗體。但是，申請人在hPG序列內(nèi)發(fā)現(xiàn)了可以用來產(chǎn)生特異性結(jié)合hPG的單克隆抗體的抗原性N端和C端序列。非常令人驚奇， 申請人:發(fā)現(xiàn)，不必將抗原序列限制于PG序列特有的一段序列來獲得特異性結(jié)合PG而不結(jié)合其他胃泌素基因衍生產(chǎn)物的單克隆抗體。與胃泌素基因的其他產(chǎn)物(例如G17、G34和CTFP)具有共同序列的肽抗原產(chǎn)生了不但結(jié)合hPG，而且特異性結(jié)合hPG的單克隆抗體。申請人:用衍生自hPG分子不同區(qū)域的抗原產(chǎn)生了單克隆抗體?？捎镁哂袑?yīng)于hPG N端區(qū)域的序列的肽抗原獲得和/或與hPG N端區(qū)域結(jié)合的單克隆抗-PG抗體在本文中稱為“N端抗-hPG單克隆抗體”?？梢杂脕順?gòu)建用于獲得N端抗-PG單克隆抗體的免疫原的具體示例性抗原區(qū)對應(yīng)于hPG的殘基I至14 =SffKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO 25)。用于獲得N端抗-PG單克隆抗體的包含此抗原的示例性免疫原描述于表IA和實施例部分中。可用具有對應(yīng)于hPG C端區(qū)域的序列的肽抗原獲得和/或結(jié)合hPG C端區(qū)域的單克隆抗-PG抗體在本文中稱為“C端抗-hPG單克隆抗體”?？梢杂脕順?gòu)建用于獲得C端抗-PG單克隆抗體的免疫原的具體示例性抗原區(qū)對應(yīng)于hPG的殘基55至80 =QGPffLEEEEEAYGWMDFGRRSAEDEN(SEQ ID NO :27)。用于獲得C端抗-PG單克隆抗體的包含此抗原的示例性免疫原描述于表IB和實施例部分中。 對于一些用途，希望得到對hPG具有高親和力的抗-hPG單克隆抗體。對于某些用途，如治療用途，希望得到至少約IOOnM的親和力，雖然可以希望得到具有更高親和力的抗體，例如至少約 90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、lnM、0. lnM、0. OlnM或甚至更高的親和力。本文公開的多種具體的示例性抗-PG單克隆抗體顯示從10_6至10_12M的范圍內(nèi)的親和力(見表6)。具有尤其適合于所希望的具體應(yīng)用的親和力的抗-PG單克隆抗體可以容易地從這些中選擇，或者用多種免疫原、互補決定區(qū)(CDR)序列、可變重鏈Vh和可變輕鏈'序列及本文所述方法來產(chǎn)生或設(shè)計?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知或本文所述的技術(shù)測定任意具體的抗-PG單克隆抗體的親和力，例如ELISA、等溫滴定量熱法(ITC)、BIAcore或熒光偏振測定。hPG是相對小的多肽，長度僅為80個氨基酸。預(yù)期以相對高的親和力(例如至少約IOnM)特異性結(jié)合hPG的任意單克隆抗體都將干擾PG與它的一個或多個信號發(fā)放配偶體相互作用的能力，從而抑制CRC細(xì)胞的增殖。但是，申請人發(fā)現(xiàn)，并非所有抗-PG單克隆抗體都是中和性的(即，并非所有結(jié)合PG的單克隆抗體都干擾或抑制其生物信號發(fā)放活性)。實際上，如將在實施例部分中更詳細(xì)地討論，申請人發(fā)現(xiàn)，一些抗-PG單克隆抗體雖然對PG顯示高特異性和高親和力，但不中和PG。例如，如下文實施例部分中詳述，抗-hPG MAB14以約6pM的Kd結(jié)合hPG，但不抑制體外CRC細(xì)胞的生長。特異性結(jié)合hPG的非中和性單克隆抗體用于診斷目的，而中和PG的那些抗-hPG單克隆抗體尤其適合于治療CRC的治療應(yīng)用。本文所用的“中和性抗-hPG單克隆抗體”是這樣的單克隆抗體，與用非特異性單克隆抗體處理的對照樣品相比，其產(chǎn)生抗_hPG單克隆抗體處理的測試樣品中存活CRC細(xì)胞數(shù)目的統(tǒng)計上顯著的減少。用于評估任意具體的抗_hPG單克隆抗體中和hPG的能力的具體測定描述于下文發(fā)明詳述部分中。雖然預(yù)期在此測定中顯示中和活性(例如活細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計上顯著地減少40%、30%、20%、15%或甚至10% )的抗-hPG單克隆抗體也提供治療益處，但認(rèn)為在此測定中顯示使活細(xì)胞數(shù)目減少至少約50%的那些抗-hPG單克隆抗體在治療CRC中尤其有用。

因此，在一些實施方案中，抗-PG單克隆抗體是中和性抗-PG單克隆抗體。已發(fā)現(xiàn)，抗-PG單克隆抗體中和PG的能力不是表位依賴性的。如實施例部分中所示例，N端和C端抗-PG抗體都具有中和活性。因此，在一些實施方案中，中和性抗-PG單克隆抗體是N端中和性抗體，在其他實施方案中，抗-PG單克隆抗體是C端中和性抗體。表位定位顯示，即使在針對同一免疫原產(chǎn)生時,N端抗-PG單克隆抗體也并非全都結(jié)合相同的表位。C端抗-hPG單克隆抗體的情況也是這樣。實施例部分中的表8和9中提供了通過丙氨酸掃描和SPOT技術(shù)鑒定的示例性N端和C端抗-hPG單克隆抗體結(jié)合的表位。在一些實施方案中，抗-hPG單克隆抗體結(jié)合包含對應(yīng)于hPG N端部分的氨基酸序列的表位。在具體實施方案中，N端抗-hPG單克隆抗體結(jié)合包含hPG的殘基10至14(SEQID NO :28)、hPG 的殘基 9 至 14 (SEQ ID NO 29)、hPG 的殘基 4 至 10 (SEQ ID NO 30)、hPG的殘基2至10 (SEQ ID NO :31)或hPG的殘基2至14 (SEQ ID NO 32)的表位。在一些實施方案中，抗-hPG單克隆抗體結(jié)合包含對應(yīng)于hPG C端區(qū)域部分的氨基酸序列的表位。在具體實施方案中，C端抗-hPG單克隆抗體結(jié)合包含hPG的殘基71至74 (SEQ ID NO 33)、hPG 的殘基 69 至 73 (SEQ ID NO 34)、hPG 的殘基 76 至 80 (SEQ ID NO 35)或hPG的殘基67至74 (SEQ ID NO 36)的表位。預(yù)期可以互換結(jié)合大致相同的表位的抗-hPG單克隆抗體的對應(yīng)的CDR和/或Vh和'鏈來產(chǎn)生新的抗-hPG單克隆抗體。例如，如表9中所指出，示例性抗-hPG單克隆抗體MAb 5和MAb 6結(jié)合相同的表位?？梢栽O(shè)計在其\鏈中包含這兩種抗體的' ⑶R的多種組合和/或在其Vh鏈中包含這兩種抗體的Vh CDR的多種組合的抗-hPG單克隆抗體。作為說明多種可能的組合的具體實例，這種抗體可以在其'鏈中包含MAb 5的CDR I和2(分別為 VlCDRL 5 和 Vl CDR2. 5)及 MAb 6 的 CDR 3 (VL CDR3. 6)，在其 Vh 鏈中包含 MAb 6 的 CDRI (VH CDR1. 6)及 MAb 5 的 CDR 2 和 3 (分別為 Vh CDR2. 5 和 Vh CDR3. 5)。已鑒定了幾種對hPG具有高特異性和親和力并在體外測定中顯示良好的抗腫瘤活性的抗_hPG單克隆抗體，且在一些情況下測定了它們的CDR的序列，它們的Vh和\鏈的序列，和/或提出用于人源化形式的％和'鏈的序列。還保藏了幾種雜交瘤。發(fā)明詳述部分中更詳細(xì)地描述了所有這些示例性抗_hPG單克隆抗體，以及用于本文所述多種試劑盒和方法中的抗_hPG單克隆抗體(例如與參考抗體競爭結(jié)合PG的單克隆抗體)的其他具體實施方案。本公開的抗-hPG單克隆抗體包括與參考抗-hPG單克隆抗體競爭結(jié)合hPG的抗體。參考抗_hPG單克隆抗體可以是本文所述抗-hPG單克隆抗體中的任一種。非限制性實例包括包含本文所述的三個\⑶R和三個Vh⑶R的抗體；包含具有本文所示氨基酸序列的Vh鏈和\鏈的抗體；包含本文所示的人源化重鏈和輕鏈多肽的抗體；由本文所公開的雜交瘤中的任一種產(chǎn)生的抗體；與本文所公開的hPG內(nèi)的表位結(jié)合的抗體。本文所述抗-PG單克隆抗體可以是全長抗體、多鏈或單鏈抗體、這類抗體的選擇性結(jié)合PG的片段(包括但不限于Fab、Fab'、(Fab/ )2、Fv和scFv)、替代體(surrobody)(包括替代輕鏈構(gòu)建體)、單結(jié)構(gòu)域抗體、人源化抗體、駱騎源化(camelized)抗體等形式。它們還可以屬于或衍生自任何同種型，包括例如IgA (例如IgAl或IgA2)、IgD、IgE、IgG (例如IgGU IgG2、IgG3或IgG4)或IgM0在一些實施方案中，抗-PG抗體是IgG(例如IgGU IgG2、IgG3 或 IgG4)。抗-PG單克隆抗體可以具有人或非人來源。非人來源的抗-PG抗體的實例包括但不限于哺乳動物來源(例如猿猴、嚙齒動物、山羊和兔)的那些。優(yōu)選人源化在人類中用于治療用途的抗-PG單克隆抗體。另一方面，本公開提供能夠用來產(chǎn)生抗-PG單克隆抗體的核酸。提供編碼本文所述抗-hPG單克隆抗體的免疫球蛋白輕鏈和重鏈多肽的核酸及包含該核酸的載體。此外，本文提供用這類載體轉(zhuǎn)化的原核和真核宿主細(xì)胞，以及提供改造來表達(dá)抗_hPG單克隆抗體的輕鏈和重鏈多肽的真核(例如哺乳動物)宿主細(xì)胞。還提供能夠表達(dá)輕鏈和重鏈二者，并將本文所述單克隆抗體分泌入培養(yǎng)該宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中的宿主細(xì)胞。在一些實施方案中，宿主細(xì)胞是雜交瘤。還提供通過培養(yǎng)宿主細(xì)胞來產(chǎn)生抗_hPG單克隆抗體的方法。中和性抗-PG單克隆抗體(如抗-hPG單克隆抗體)結(jié)合PG并阻斷依賴PG的信號發(fā)放，導(dǎo)致CRC腫瘤細(xì)胞中PG誘導(dǎo)的應(yīng)答的抑制。因此，還提供抑制CRC細(xì)胞的PG誘導(dǎo)的應(yīng)答的方法，其包括抑制細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞死亡和/或刺激細(xì)胞增殖。通常，該方法包括以對抑制CRC細(xì)胞的一種或多種PG誘導(dǎo)的應(yīng)答有效的量使CRC細(xì)胞與中和性抗-PG單克隆抗體接觸，或使細(xì)胞群體暴露于中和性抗-PG單克隆抗體?？梢酝ㄟ^對含有CRC細(xì)胞的環(huán)境(其可以是細(xì)胞培養(yǎng)物或腫瘤中)施用中和性抗_hPG單克隆抗體來在體外或體內(nèi)進(jìn)行該方法。本文所述中和性抗-PG單克隆抗體抑制CRC腫瘤細(xì)胞的依賴PG的增殖，這使它們成為用于治療結(jié)腸直腸癌的有用治療劑。因此，還提供包含中和性抗-PG單克隆抗體的藥物組合物，及用中和性抗-PG單克隆抗體和/或藥物組合物來治療CRC的方法。藥物組合物可以配制用于任意方便的給藥途徑(包括例如腸胃外、皮下或靜脈內(nèi)注射)，且通常將包含中和性抗_hPG單克隆抗體和適合用于希望的施用方式的一種或多種可用載體、賦形劑和/或稀釋劑，且可以包含將在發(fā)明詳述部分中進(jìn)一步描述的其他可選成分。對于治療用途，可以以便于使用的單位劑量形式包裝組合物。治療方法通常包括對需要治療的受試者(例如診斷為患有CRC的受試者)施用對提供治療益處有效的量的中和性抗-PG單克隆抗體和/或其藥物組合物。下文更詳細(xì)地描述的治療益處包括CRC的任意改善，例如減慢或停止CRC的進(jìn)展、降低CRC的嚴(yán)重度、抑制CRC腫瘤的生長或CRC細(xì)胞的增殖、減小CRC腫瘤的大小和/或降低CRC患者中的PG血清水平。受試者可以是人或非人，包括家養(yǎng)動物(例如貓、狗、牛、豬、馬)或非家養(yǎng)動物。優(yōu)選地，抗-PG單克隆抗體對所治療的物種的PG特異。例如，對人患者施用抗-hPG抗體，對犬患者施用抗-狗PG抗體等。使用抗-hPG單克隆抗體療法的受試者可以是處于疾病進(jìn)展的任意階段的患者(例如CRC階段O、I、II、III或IV)、接受了 CRC療法(例如化學(xué)療法、放射療法、手術(shù)切除)的患者或正在接受其他CRC療法的患者。本文所述抗-PG單克隆抗體治療可以與其他療法組合或輔助其他療法。其他CRC療法的非限制性實例包括本文所述化學(xué)療法治療、放射療法、手術(shù)切除和抗體療法。在具體實例中，抗-hPG單克隆抗體與化療劑組合施用。在另一具體實例中，抗-hPG單克隆抗體輔助手術(shù)切除施用?？?PG單克隆抗體還可以彼此組合使用?；加蠧RC腫瘤的個體通常具有提高的循環(huán)PG水平(例如在血清或血漿中)。因
此，為了診斷CRC，可以用抗-hPG單克隆抗體來檢測PG水平。因此，在已經(jīng)診斷為患有CRC的患者中，可以用抗_hPG單克隆抗體來選擇適于接受抗-PG療法的受試者或監(jiān)測治療功效。如本文所公開，在受試者中診斷結(jié)腸直腸癌的方法包括確定用本公開的抗_hPG單克隆抗體測量的來自受試者的樣品(例如血液樣品或血清樣品)中的前胃泌素的量是否高于閾值水平。在具體實施方案中，該閾值水平是50pM。在一些實施方案中，使用兩種抗-PG抗體，一種識別PG的C端區(qū)域，另一種識別PG的N端區(qū)域。在此實施方案中，N端或C端抗體中的一種或二者都是本文所述抗-PG單克隆抗體。優(yōu)選地，使用N端和C端抗-PG單克隆抗體。抗體可以是(但無需是)中和性的。為了監(jiān)測治療功效，可以通過比較在不同時間采集的樣品中PG的量，用抗-PG單克隆抗體來測定來自已接受或正在接受CRC治療的受試者的樣品中前胃泌素的水平是否隨時間降低。前一段中所述抗-PG抗體的具體實施方案也可以用于此測定。還提供適合用于進(jìn)行本文所述多種診斷方法、監(jiān)測方法和其他方法的試劑盒。這類試劑盒通常將包含本文所述抗-PG單克隆抗體，且可選地包含適合用于進(jìn)行具體測定的其他抗-PG抗體和/或試劑。在一些實施方案中，用可檢測標(biāo)記(如熒光團)標(biāo)記包含于試劑盒中的一種或多種抗-PG抗體。在具體實施方案中，試劑盒包含特異性結(jié)合PG的N端區(qū)域的抗-PG抗體、特異性結(jié)合PG的C端區(qū)域的抗-PG抗體，且可選地包含適合用于進(jìn)行診斷測定的試劑，其中N端特異性抗體是本文所述N端抗-PG單克隆抗體和/或C端特異性抗體是本文所述C端抗-PG單克隆抗體。本文所述多種發(fā)明的特征和優(yōu)勢將從其示例性實施方案的以下詳細(xì)描述變得更為顯而易見。8.附圖簡述圖I提供前胃泌素原、前胃泌素及包括G34、G34-Gly、G17、G17_Gly和C端側(cè)翼肽CTFP的前胃泌素加工產(chǎn)物的氨基酸序列。圖2提供以下示例性鼠抗-hPG單克隆抗體的Vh和\鏈的多肽序列和對應(yīng)的多核苷酸序列抗-hPG MAb 3 (SEQ ID NO 16、12、17和13，按出現(xiàn)的順序)(圖2A、2B)、抗-hPGMAb 4 (SEQ ID NO 18、14、19 和 15，按出現(xiàn)的順序)(圖 2C、2D)、抗-hPG MAb 8 (SEQ ID NO67、59、71 和 63，按出現(xiàn)的順序)(圖 2E、2F)、抗-hPG Mab 13 (SEQ ID NO 68、60、72 和 64，按出現(xiàn)的順序)(圖2G、2H)、抗-hPG MAb 16 (SEQ ID NO 69、61、73和65，按出現(xiàn)的順序)(圖 2I、2J)和抗-hPG MAb 19 (SEQ ID NO 70、62、74 和 66，按出現(xiàn)的順序)(圖 2K、2L)，其中每條鏈的三個⑶R下劃線。圖3A-C提供圖表，顯示示例性鼠抗-hPG單克隆抗體MAb 1-4 (圖3A)、MAb 5-14和20-23(圖3B)及MAb 3和15-19(圖3C)在漸增的抗體濃度下的相對結(jié)合親和力(測量為492nm吸光度)。圖4提供圖表,顯示四種不同的示例性鼠抗-hPG單克隆抗體在280nm和330nm下的吸光度(光密度)之比，與牛血清白蛋白對照樣品相比較(隨意單位)。圖5A-C提供圖表，顯示23種不同的示例性鼠抗-hPG單克隆抗體與25或50ng hPG的結(jié)合，與所示緩沖液單獨(陰性對照)、250ng KLH(陰性對照)和衍生自胃泌素基因的肽(50和250ng的CTFP、G17或G17_Gly (在圖中稱為“G-Gly，，))相比較。圖5A顯示抗-hPGMAb 1-4的結(jié)合，圖5B顯示抗-hPG MAb 5-14和21-23的結(jié)合，圖5C顯示抗-hPG MAb 3A和15-20的結(jié)合。 圖6提供圖表，顯示多克隆N端抗-hPG抗體在漸增的抗-hPG MAb3濃度下與hPG的結(jié)合。圖7提供圖表，顯示如下用抗-hPG單克隆抗體處理的代表性CRC細(xì)胞系的增殖用示例性抗-hPG單克隆抗體MAb 3和MAb 4 (分別為圖7A、7B、7C，顯示處理結(jié)束時的活細(xì)胞數(shù)目相對于抗體處理起始時(TO)的變化)或抗-hPG多克隆抗體(分別為圖7D、7E、7F，顯示處理結(jié)束時的活細(xì)胞數(shù)目相對于抗體處理起始時(TO)的變化)處理的所示SW480、HCT-116、LS174T ;用抗-hPG MAb 5至MAb 23處理的CRC細(xì)胞系SW620的增殖(圖7G，作為對照抗體處理的細(xì)胞的數(shù)目的百分比顯示處理結(jié)束時相對于處理起始時(TO)的活的抗-hPG處理的細(xì)胞)；用抗-hPGMAb 8、13、14、16和19處理的LS174T細(xì)胞的增殖(圖7H，作為對照抗體處理的細(xì)胞的數(shù)目的百分比顯示處理結(jié)束時相對于處理起始時(TO)的活的抗-hPG處理的細(xì)胞)；及用抗-hPG單克隆抗體MAb 8、13、14、16、19處理的抝!'-116細(xì)胞的增殖(圖71，作為對照抗體處理的細(xì)胞的數(shù)目的百分比顯示處理結(jié)束時相對于處理起始時(TO)的活的抗-hPG處理的細(xì)胞)。圖8提供圖表，顯示對照單克隆抗體、抗-hPG MAb 8(5iig/mL)、hPG預(yù)孵育的抗-hPG MAb 8、hPG預(yù)孵育的對照抗體或hPG單獨4種處理后48小時的LS174T活細(xì)胞數(shù)目。圖9提供圖表，顯示與對照多克隆抗體相比，用抗-hPG抗體處理的小鼠中每只小鼠的腫瘤數(shù)目(圖9A)及平均腫瘤長度和高度(圖9B)。9.示例性實施方案詳述9. I發(fā)明詳述最初將前胃泌素(PG)鑒定為胃泌素(刺激胃酸分泌的腸肽激素)的前體。胃泌素以衍生自前胃泌素的許多不同分子形式(G17、G34、甘氨酸延長的G17、甘氨酸延長的G34)存在。見圖I。胃泌素基因編碼101個氨基酸的產(chǎn)物前胃泌素原。第一切割去除21個氨基酸殘基的信號肽(圖I中下劃線)，產(chǎn)生80個氨基酸的肽PG。SEQ ID NO 20中提供人PG(hPG)的了解、已知的多肽序列。如圖I中所示，從I至80編號hPG的氨基酸殘基，最靠近氨基端的殘基為I位。前胃泌素的前40個氨基酸內(nèi)的序列稱為“N端”，而落在殘基41至80內(nèi)的序列稱為“C端”。最近的研究顯示，CRC患者中前胃泌素水平升高。正常生理條件下，前胃泌素占人類總分泌肽的不到10%。在結(jié)腸直腸癌中，血漿和腫瘤組織中的前胃泌素水平都升高，可能是由于胃泌素基因的增加的表達(dá)偶聯(lián)基因產(chǎn)物的不完全加工。一項研究顯示CRC患者與對照患者相比顯著更高的血清前胃泌素水平，但胃泌素更多的加工形式無這種差異(Siddheshwar等，2001，Gut 48 :47-52)。在所測試的CRC腫瘤樣品中，80-100%的樣品顯示提高的 PG 水平。見例如 Ciccotosto 等，1995,Gastroenterology 109 :1142-1153 ；Baldwin等，1998, Gut 42 :581-584 ；Van Solinge, 1993, Gastroenterology 104:1099-1107。通過實驗進(jìn)一步證實了 PG在CRC中的作用，該實驗顯示，與野生型小鼠或表達(dá)酰胺化胃泌素的小鼠相比，用致癌劑氧化偶氮甲烷處理的表達(dá)重組人PG的小鼠在結(jié)腸中具有顯著更多數(shù)目的異常隱窩灶、腺瘤和腺癌(Singh 等 2000, Gastroenterology 119 :162-171)。最近，Hollande等顯示，前胃泌素通過抑制ICAT(0 -聯(lián)蛋白/Tcf4信號發(fā)放的負(fù)調(diào)節(jié)物)來刺激￠-聯(lián)蛋白/Tcf4途徑，且阻斷前胃泌素導(dǎo)致ICAT的從頭表達(dá)。見WO2007/135542。雖然并非旨在受限于任何操作理論，但認(rèn)為，由于增加的ICAT表達(dá)，阻斷前胃泌素信號發(fā)放導(dǎo)致￠-聯(lián)蛋白/Tcf4誘導(dǎo)的增殖的抑制。在缺乏持續(xù)的依賴PG的信號發(fā)放的情況下，細(xì)胞增殖受抑制，并觸發(fā)細(xì)胞分化和/或細(xì)胞死亡(包括凋亡)。雖然存在對治療和診斷CRC的新的臨床途徑、PG刺激CRC腫瘤細(xì)胞增殖的證據(jù)的需要，雖然癌癥的治療越來越集中于單克隆抗體療法，但迄今為止，沒有任何報道顯示任何單克隆抗體能夠阻斷依賴PG的腫瘤細(xì)胞增殖，或甚至結(jié)合PG。已證明這類抗體(本文首次呈現(xiàn))難以制備。作為第一個挑戰(zhàn)，申請人發(fā)現(xiàn)，重組人前胃泌素(其可以用來產(chǎn)生多克隆抗-hPG抗體)未能在測試小鼠中誘導(dǎo)單克隆免疫原性應(yīng)答。因此，有必要設(shè)計僅使用PG的肽片段的免疫原來產(chǎn)生對前胃泌素而不是對其他胃泌素基因產(chǎn)物特異的抗體。甚至在雜交瘤克隆產(chǎn)生結(jié)合抗原肽的抗體時，也發(fā)現(xiàn)與該肽的結(jié)合不能明確預(yù)測或完全不能預(yù)測結(jié)合PG的能力。如下文實施例中更詳細(xì)地顯示,許多雜交瘤產(chǎn)生抗體,該抗體結(jié)合用于免疫原中的PG抗原肽，但未能結(jié)合PG。本公開提供抗-hPG單克隆抗體，該單克隆抗體不僅結(jié)合針對其產(chǎn)生它們的抗原肽，還特異性結(jié)合hPG。非常令人驚奇地，用抗原獲得了相對于它的加工形式(例如G34、G34-Gly、G17、G17-Gly、CTFP)對hPG高度特異的單克隆抗體，該抗原在一些情況下并非hPG特有，而是包含一種或多種前胃泌素加工產(chǎn)物共有的氨基酸序列區(qū)域。此外，還令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，雖然hPG的尺寸相對小(80個氨基酸)，但并非所有抗-hPG單克隆抗體(甚至對hPG顯示高度的親和力和特異性的那些)都中和它的生物學(xué)活性。抗-hPG單克隆抗體申請人:發(fā)現(xiàn)了用于產(chǎn)生抗-hPG單克隆抗體的肽抗原。用于產(chǎn)生本公開的抗_hPG抗體的肽包含不見于多肽的加工更多的形式(如甘氨酸延長或酰胺化的胃泌素或CTFP)中的前胃泌素特有序列，但也可以包含見于hPG的加工形式中的序列。在一些實施方案中，針對具有對應(yīng)于hPG N端區(qū)域的氨基酸序列的肽抗原產(chǎn)生抗-hPG單克隆抗體，并命名為N端抗-hPG單克隆抗體?？梢杂脕順?gòu)建用于獲得N端抗-PG單克隆抗體的免疫原的具體示例性抗原區(qū)對應(yīng)于與接頭序列偶聯(lián)的hPG的殘基I至14(SWKPRSQQPDAPLG(SEQ ID NO :25))。在其他實施方案中，針對具有對應(yīng)于hPG C端區(qū)域的氨基酸序列的肽抗原產(chǎn)生抗-hPG單克隆抗體，并命名為C端抗-hPG單克隆抗體?？梢杂脕順?gòu)建用于獲得C端抗-PG單克隆抗體的免疫原的具體示例性抗原區(qū)對應(yīng)于與接頭序列偶聯(lián)的hPG的殘基55至80 (SEQ ID NO
27)。見表I。本公開的抗-PG單克隆抗體結(jié)合PG，且用于檢測和從復(fù)雜混合物分離PG。此外，本公開的抗-PG單克隆抗體獨特地適合于結(jié)腸直腸癌的治療和/或診斷應(yīng)用。在多種實施方案中，抗-hPG單克隆抗體(1)特異性結(jié)合PG而不是其他胃泌素基因產(chǎn)物；(2)對hPG具有高親和力；(3)在體外和體內(nèi)抑制結(jié)腸直腸癌細(xì)胞增殖；(4)在體內(nèi)減小腫瘤尺寸和腫瘤數(shù)目；(5)在包含其他胃泌素基因衍生肽的復(fù)雜混合物中檢測PG。表達(dá)胃泌素基因，并廣泛加工，以產(chǎn)生在正常穩(wěn)態(tài)中具有作用的幾種蛋白質(zhì)產(chǎn)物。另一方面，健康受試者的循環(huán)中通常檢測不到前胃泌素。本公開的單克隆抗體旨在靶向前胃泌素而不是衍生自胃泌素基因的其他肽。因此，抗_hPG單克隆抗體特異性結(jié)合來自人類和其他動物的前胃泌素，而不結(jié)合其他胃泌素基因產(chǎn)物，如但不限于甘氨酸延長的胃泌素
或酰胺化胃泌素或C端側(cè)翼肽(CTFP)?？梢园匆韵掠肊LISA測定抗-hPG單克隆抗體的特異性。用含有一個或多個適當(dāng)濃度的測試肽(例如25和50ng重組人PG，及50和250ngCTFP或其他胃泌素衍生的基因產(chǎn)物)的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)在4°C過夜孵育96孔板，然后用洗滌溶液(PBS和0. I %Tween-20)洗滌孔三次，然后每孔用IOOy L封閉溶液(PBS、0. I % Tween-20,0. 1%牛血清白蛋白或酪蛋白水解物)在22°C孵育2小時。封閉后，洗滌孔三次，加入待測定的抗體(測試抗體)。向每個孔中加入100 ii L含測試抗體(0. 3至Ing/mL)的PBS和0. I % Tween-20。然后在22°C孵育平板2小時，然后棄除測試抗體溶液，并在洗滌步驟(3 X IOOii L洗滌溶液，如上文指出)后替換為含有第二抗體(與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG(Fc)抗體)的封閉溶液。用第二抗體孵育I小時后，向每個孔中加入100 u L底物溶液(例如Fast(PD或鄰苯二胺二鹽酸，可從Sigma-Aldrich Co.獲得，按廠家的說明配制)，并在22°C避光孵育20分鐘。通過加入50 ii L 4N硫酸來終止反應(yīng)，并通過在492nm測量光密度(0. D.)來測定所催化的底物量。底物轉(zhuǎn)化與結(jié)合抗原的第一(測試)抗體的量成比例。實驗一式兩份地進(jìn)行，將OD測量結(jié)果作為抗原濃度的函數(shù)作圖。如果對hPG的測量O.D.在0.2和1.5之間，且用CTFP或任意其他胃泌素基因衍生肽不存在高于背景的統(tǒng)計上顯著的信號，則將測試抗體評分為對PG特異，其中背景是來自僅包含PBS的對照孔的平均信號。發(fā)現(xiàn)本公開的幾種抗-hPG單克隆抗體高度特異。在一些實施方案中，與其他胃泌素基因產(chǎn)物相比，抗-hPG單克隆抗體對前胃泌素顯示高100倍的特異性。在這類實施方案中，需要多100倍的抗原(例如甘氨酸延長的胃泌素或酰胺化胃泌素)來產(chǎn)生與在抗原是前胃泌素時觀察到的結(jié)合相同的結(jié)合。用于測定結(jié)合的其他方法包括但不限于免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、放射性物質(zhì)標(biāo)記的免疫測定(RIA)、夾心法ELISA(Monoclonal Antibody ExperimentManual(Kodansha Scientific 出版，1987) ；Second Series Biochemical ExperimentCourse,第 5 卷，Immunobiochemistry Research Method, Tokyo Kagaku Dojin 出版(1986))。治療用途和診斷用途都希望得到對PG具有高親和力的抗_hPG單克隆抗體。對于某些用途，如治療用途，雖然希望得到至少約IOOnM的親和力，但可以希望得到具有更高親和力的抗體，例如至少約 90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、lnM、0. lnM、0. OlnM、10pM、IpM 或甚至更高的親和力。在一些實施方案中，單克隆抗體以約IpM至約IOOnM的范圍內(nèi)的親和力或任意前述值之間的親和力特異性結(jié)合hPG?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知或本文所述的技術(shù)測定抗-hPG單克隆抗體對hPG的親和力，例如但不限于ELISA、等溫滴定量熱法(ITC)、BIAcore, Proteon或熒光偏振測定。使用來自hPG N端或C端區(qū)域的抗原，可以產(chǎn)生識別hPG的不同表位的抗體。單克隆抗體識別的表位將取決于用來產(chǎn)生抗體的具體抗原，且可以用技術(shù)人員已知的技術(shù)定位，如丙氨酸掃描和SPOT分析(見下文實施例部分)。例如，表位定位顯示，抗-hPG MAb 2和MAb 4結(jié)合相同的表位；抗-hPG MAb I和MAb 2結(jié)合大致相同的表位；MAb 17、MAb 18、MAb 19和MAb 20結(jié)合大致相同的表位；MAb 15和MAb 16結(jié)合大致相同的表位；抗-hPGMAb 5,MAb 6,MAb 7,MAb 9和MAb 12結(jié)合相同的表位，且與抗-hPG MAb 10結(jié)合大致相同的表位；抗_hPG MAb 11和MAb 14結(jié)合大致相同的表位。

可以用本文所述競爭性測定來測定抗-hPG單克隆抗體是否識別特定表位，其中參考抗體結(jié)合的表位是已知的。在一些實施方案中，抗_hPG單克隆抗體與參考抗體競爭，該參考抗體結(jié)合具有對應(yīng)于hPG N端區(qū)域的氨基酸序列的表位。在具體實施方案中，抗-hPG單克隆抗體與參考抗體競爭，該參考抗體結(jié)合包含hPG的殘基10至14 (SEQ ID NO
28)、hPG 的殘基 9 至 14 (SEQ ID NO 29)、hPG 的殘基 4 至 10 (SEQ ID NO 30)、hPG 的殘基 2至10 (SEQ ID NO: 31)或hPG的殘基2至14 (SEQ ID NO 32)的表位。在一些實施方案中，抗-hPG單克隆抗體與參考抗體競爭，該參考抗體結(jié)合具有對應(yīng)于hPG C端區(qū)域的氨基酸序列的表位。在具體實施方案中，抗_hPG單克隆抗體與參考抗體競爭，該參考抗體結(jié)合包含hPG 的殘基 71 至 74 (SEQ ID NO 33)、hPG 的殘基 69 至 73 (SEQ ID NO 34)、hPG 的殘基 76至 80(SEQ ID NO :35)或 hPG 的殘基 67 至 74(SEQ ID NO :36)的表位?？?PG單克隆抗體可以是中和性的。雖然并非旨在受限于任何操作理論，但認(rèn)為中和性抗_hPG單克隆抗體通過結(jié)合PG來阻斷或抑制其與它的一個或多個信號發(fā)放配偶體相互作用的能力。這轉(zhuǎn)而抑制結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞中否則將導(dǎo)致增殖、減少的細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在一些實施方案中，中和性抗-PG單克隆抗體結(jié)合hPG的N端區(qū)域。在具體實施方案中，中和性抗-PG單克隆抗體與抗-hPG MAb UMAb 2、MAb 3、MAb 4、MAb 15,MAb 16,MAb 17,MAb 18,MAb 19或MAb 20競爭結(jié)合PG。在其他實施方案中，中和性抗-PG單克隆抗體結(jié)合hPG的C端區(qū)域。在具體實施方案中，中和性抗-PG單克隆抗體與抗-hPG MAb 5、MAb 6、MAb 7、MAb 8、MAb 9、MAb 10、MAb IUMAb 12、MAb 13、MAb 21、MAb 22或MAb 23競爭結(jié)合PG。確定抗-PG單克隆抗體是否是中和性抗體的具體測試可以按以下進(jìn)行。按下文實施例7中所述，將CRC LS174T細(xì)胞按約50，000細(xì)胞/孔接種在6孔板中。然后按實施例7中所述用測試抗-PG單克隆抗體或?qū)φ諉慰寺】贵w以12小時的間隔處理細(xì)胞48小時，抗體濃度為約5 u g/mL。使用雙尾Mann-Whitney檢驗(p < 0. 05時認(rèn)為差異顯著)，與用對照非特異性抗體處理的細(xì)胞的數(shù)目相比，如果用測試抗體處理的CRC癌細(xì)胞的數(shù)目顯示存活細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計上顯著地減少至少10%，則將測試抗體定義為在此測定中是中和性的。準(zhǔn)對處理期開始時(稱為T0)的細(xì)胞數(shù)目校正總細(xì)胞數(shù)。如本文所使用，抗體(Ab)指特異性結(jié)合具體抗原或與具體抗原免疫反應(yīng)的免疫球蛋白分子，且包括多克隆、單克隆、遺傳改造和以其他方式修飾的抗體形式，包括但不限于嵌合抗體、人源化抗體和抗體的抗原結(jié)合片段，包括例如Fab'、F(ab' ) 2、Fab、Fv、rlgG和scFv片段。在多種實施方案中，抗-hPG單克隆抗體包含抗體恒定區(qū)的全部或部分。在一些實施方案中，恒定區(qū)是選自 IgA(例如 IgAl*IgA2)、IgD、IgE、IgGH^i^n IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)和IgM的同種型。本文所用的術(shù)語“單克隆抗體”不限于通過雜交瘤技術(shù)產(chǎn)生的抗體。通過本領(lǐng)域可得或已知的任意手段從單個克隆(包括任意真核、原核或噬菌體克隆)衍生單克隆抗體?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的多種技術(shù)(包括使用雜交瘤技術(shù)、重組技術(shù)和噬菌體展示技術(shù)或其組合)制備用于本公開的單克隆抗體。在本公開的許多用途(包括抗_hPG單克隆抗體在人類中的體內(nèi)用途和體外檢測測定)中，可以適宜地使用嵌合抗體、靈長類源化(primatized)抗體、人源化抗體或人抗體。術(shù)語“scFv”指單鏈Fv抗體，其中將來自傳統(tǒng)抗體的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域連接形成一條鏈。

提到“Vh”指抗體的免疫球蛋白重鏈(包括Fv、scFv或Fab的重鏈)的可變區(qū)。提至IJ“”指免疫球蛋白輕鏈(包括FV、SCFV、dSFV或Fab的輕鏈)的可變區(qū)。抗體(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白。抗體對具體靶標(biāo)顯示結(jié)合特異性，而免疫球蛋白包括抗體和缺乏靶標(biāo)特異性的其他抗體樣分子二者。天然抗體和免疫球蛋白通常是由兩條相同的輕(L)鏈和兩條相同的重(H)鏈組成的約150,000道爾頓的異四聚體糖蛋白。每條重鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)(Vh)，隨后是多個恒定結(jié)構(gòu)域。每條輕鏈在一端具有可變結(jié)構(gòu)域(VJ，在其另一端具有恒定結(jié)構(gòu)域。本公開的抗-hPG單克隆抗體包含互補決定區(qū)(OTR)。⑶R也稱為輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域二者中的高變區(qū)。可變結(jié)構(gòu)域的更高度保守的部分稱為構(gòu)架區(qū)(FR)。如本領(lǐng)域已知，取決于背景和本領(lǐng)域已知的多種定義，描述抗體高變區(qū)的氨基酸位置/邊界可以不同?？勺兘Y(jié)構(gòu)域內(nèi)的一些位置可以視為雜種高變位置，因為可以在一組標(biāo)準(zhǔn)下認(rèn)為這些位置在高變區(qū)內(nèi)，而在不同的一組標(biāo)準(zhǔn)下認(rèn)為這些位置在高變區(qū)外。這些位置中的一個或多個也可以見于延長的高變區(qū)中。本公開提供在這些雜種高變位置中包含修飾的抗體。天然重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域各包含四個FR區(qū)，該FR區(qū)主要采用P -折疊構(gòu)象，通過三個⑶R連接，該⑶R形成環(huán)連接，且在一些情況下形成￠-折疊結(jié)構(gòu)的部分。每條鏈中的⑶R通過FR區(qū)近距離保持在一起，并與來自其他鏈的CDR —起促成抗體祀結(jié)合部位的形成(見Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institute of Health,Bethesda, Md. 1987)。鑒定了幾種對hPG具有高特異性和親和力且具有良好的抗腫瘤活性的抗_hPG單克隆抗體，并對它們的CDR及可變重鏈和輕鏈進(jìn)行了測序。鼠重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域在本文中稱為mVjPm'，隨后是對應(yīng)的單克隆抗體的編號，例如抗-hPG MAb 3的mVH. 3和m'. 3?？?hPG單克隆抗體具有三個可變輕鏈⑶R和三個可變重鏈⑶R，分別稱為Vh⑶R1、2或3和' ⑶Rl、2或3，隨后是示例性抗-hPG單克隆抗體的編號。例如MAb 3的' ⑶Rl表示為\⑶Rl. 3，MAb 3的Vh⑶Rl表示為Vh⑶Rl. 3。類似地，人重鏈和輕鏈可變結(jié)構(gòu)域在本文中稱為hVH和h'，隨后是對應(yīng)的單克隆抗體的編號。在一些實施方案中，針對hPG的N端部分產(chǎn)生的抗-hPG單克隆抗體具有三個可變輕鏈CDR和三個可變重鏈CDR,其中Vl CDRl選自QSIVHSNGNTY( “Vl CDR I. 3” ；SEQ IDNO 4)、QSLVHSSGVTY ( “VL CDR I. 4” ；SEQ ID NO :10)、QSLLDSDGKTY ( “VL CDR I. 16” ；SEQID NO 50)和 SQHRTYT ( “VL CDR I. 19，，;SEQ ID NO :51) ；VL CDR2 選自 KVS ( “VL CDR 2. 3”和 “VL CDR 2.4”；SEQ ID NO :5)、LVS( “VL CDR 2. 16” ；SEQ ID NO :53)和 VKKDGSH(“VLCDR 2.19”；SEQ ID NO :54) ；VL CDR3 選自 FQGSHVPFT ( “VL CDR 3. 3” ；SEQ ID NO :6)、SQSTHVPPT ( “VL CDR 3. 4”;SEQ ID NO :11)、WQGTHSPYT( “VL CDR 3. 16”;SEQ ID NO :57)和GVGDAIKGQSVFV( “VL CDR 3. 19” ；SEQ ID NO :58) ；VH CDRl 選自 GYIFTSYff ( “VH CDR I. 3” ；SEQ ID NO 1) ,GYTFSSSff ( ^Vh CDR I. 4^；SEQ ID NO 7),GYTFTSYY( ^Vh CDR I. 16”;SEQ IDNO 39) GYSITSDYA( “VH CDR I. 19”；SEQ ID NO :40) ；VH CDR2 選自 FYPGNSDS ( “VH CDR2.3”;SEQ ID NO :2)、FLPGSGST( “VH CDR 2. 4”;SEQ ID NO :8)、INPSNGGT ( “VH CDR 2. 16”；SEQ ID NO 43)和 ISFSGYT ( “VH CDR 2. 19，，;SEQ ID NO :44) ；VH CDR3 選自 TRRDSPQY ( “VHCDR 3. 3” ；SEQ ID NO :3)、ATDGNYDffFAY( “VH CDR 3. 4” ；SEQ ID NO :9)、TRGGYYPFDY( “VHCDR 3. 16”;SEQ ID NO :47)和 AREVNYGDSYHFDY(^Vh CDR 3. 19”;SEQ ID NO :48)。見表 1A。 在一些實施方案中，針對hPG的C端部分產(chǎn)生的抗-hPG單克隆抗體具有三個可變輕鏈 CDR 和三個可變重鏈 CDR，其中，\ CDRl 選自 KSLRHTKGITFfVli CDR I. 8”;SEQ ID NO:49)和 QSLLDSDGKTY( “VL CDR I. 13”；SEQ ID NO :50) ；VL CDR2 選自 QMS( “VL CDR 2.8”;SEQ ID NO 52)和 LVS ( “VL CDR 2. 13” ；SEQ ID NO :53) ；VL CDR3 選自 AQNLELPIT( “VLCDR 3.8”；SEQ ID NO :55)和 WQGTHFPQT( “VL CDR 3.13”；SEQ ID NO :56) ；VH CDRl 選自GFTFTTYA( “VH CDR I. 8” ；SEQ ID NO :37)和 GFIFSSYG( “VH CDR I. 13”；SEQ ID NO :38)；Vh CDR2 選自 ISSGGTYT ( “VH CDR 2. 8” ；SEQ ID NO :41)和 INTF⑶RT ( “VH CDR 2. 13” ；SEQID NO 42) ；VH CDR3 選自 ATQGNYSLDF ( “VH CDR 3. 8”; SEQ ID NO :45)和 ARGTGTY(“VH CDR3. 13” ；SEQ ID NO :46)。見表 IB。
權(quán)利要求
1.單克隆抗體，其特異性結(jié)合人前胃泌素(hPG)。
2.權(quán)利要求I的單克隆抗體，其特異性結(jié)合hPG的N端區(qū)域。
3.權(quán)利要求2的單克隆抗體，其可用包含具有對應(yīng)于SEQID N0:25的氨基酸序列的肽抗原的免疫原獲得。
4.權(quán)利要求2的單克隆抗體，其與可從選自43B9G11、WE5H2G7、6B5B11C10、20D2C3G2、1E9A4A4、1E9D9B6、1C8D10F5、1A7C3F11、1B3B4F11 和 ICl 1F5E8 的雜交瘤獲得的參考抗 _hPG單克隆抗體競爭結(jié)合hPG。
5.權(quán)利要求2的單克隆抗體，其包含在序列上對應(yīng)于可從選自43B9G11、WE5H2G7、6B5B11C10、20D2C3G2、1E9A4A4、1E9D9B6、1C8D10F5、1A7C3F11、1B3B4F11 和 1C11F5E8 的雜交瘤獲得的單克隆抗體的\和Vh⑶R的\和Vh⑶R。
6.權(quán)利要求2的單克隆抗體，其包含具有選自以下'和Vh⑶R序列組之一的序列的Vl 和 Vh CDR (i)Vh CDR1. 3、Vh CDR 2. 3, Vh CDR 3. 3, Vl CDR I. 3, Vl CDR 2. 3 和 Vl CDR 3. 3 ；(ii)Vh CDR I. 4, Vh CDR 2. 4, Vh CDR 3. 4, Vl CDR I. 4, Vl CDR2. 4 和 Vl CDR 3. 4 ；(iii)Vh CDR I. 16、Vh CDR 2. 16、Vh CDR 3. 16、Vl CDR I. 16、Vl CDR 2. 16 和 Vl CDR3. 16 ;和(iv)Vh CDR I. 19、Vh CDR 2. 19、Vh CDR 3. 19、Vl CDR I. 19、Vl CDR 2. 19 和 Vl CDR3. 19。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的單克隆抗體，其是人源化的。
8.權(quán)利要求7的單克隆抗體，其包含具有選自以TVh和'序列組之一的序列的Vl鏈(i)hVH 3 (SEQ ID N0:21)和 hVL 3 (SEQ ID N0:22)；(ii)hVH 4 (SEQ ID N0:23)和 hVL 4 (SEQ ID NO:24)；(iii)hVH 16a (SEQ ID N0:84)和 hVL 16a (SEQ ID N0:85)；(iv)hVH 16b (SEQ ID N0:86)和 hVL 16b (SEQ ID NO:87);(v)hVH 16c (SEQ ID N0:88)和 hVL 16c (SEQ ID NO:89);(vi)hVH 19a (SEQ ID N0:90)和 hVL 19a (SEQ ID N0:91)；(vii)hVH 196b (SEQ ID N0:92)和 hVL 19b (SEQ ID NO:93) -M(viii)hVH 19c (SEQ ID N0:94)和 hVL 19c (SEQ ID NO:95).
9.權(quán)利要求I的單克隆抗體，其特異性結(jié)合hPG的C端區(qū)域。
10.權(quán)利要求9的單克隆抗體，其可用包含具有對應(yīng)于SEQID NO:27的氨基酸序列的肽抗原的免疫原獲得。
11.權(quán)利要求9的單克隆抗體，其與可從選自1B4A11D11、1B6A11F2、1B11E4B11、1C10D3B9、1D8F5B3、1E1C7B4、2B4C8C8、2B11E6G4、2C6C3C7、2H9F4B7、1F11F5E10、1F11F5G9和1A11F2C9的雜交瘤獲得的參考抗-hPG單克隆抗體競爭結(jié)合hPG。
12.權(quán)利要求9的單克隆抗體，其包含在序列上對應(yīng)于可從選自1B4A11D11、1B6A11F2、IB11E4B11、1C10D3B9、1D8F5B3、1E1C7B4、2B4C8C8、2B11E6G4、2C6C3C7、2H9F4B7、1F11F5E10、1F11F5G9和1A11F2C9的雜交瘤獲得的單克隆抗體的'和Vh CDR的Vl和VhCDR。
13.權(quán)利要求9的單克隆抗體，其包含具有選自以TVh和'⑶R序列組之一的序列的Vh 和 Vl CDR (i)Vh CDR I. 8, Vh CDR 2. 8, Vh CDR 3. 8, Vl CDR I. 8, Vl CDR 2. 8 和 Vl CDR 3. 8 ;和(ii)Vh CDR I. 13、Vh CDR 2. 13、Vh CDR 3. 13、Vl CDR I. 13、Vl CDR 2. 13 和 Vl CDR3.13。
14.權(quán)利要求9-13中任一項的單克隆抗體，其是人源化的。
15.權(quán)利要求14的單克隆抗體，其包含具有選自以下Vh和\序列組之一的序列的Vh和\鏈(i)hVH 8a (SEQ ID N0:75)和 hVL 8a (SEQ ID N0:76)；(ii)hVH 8b (SEQ ID N0:77)和 hVL 8b (SEQ ID N0:78)；(iii)hVH 8c (SEQ ID N0:79)和 hVL 8c (SEQ ID N0:76)；(iv)hVH 13a (SEQ ID N0:80)和 hVL 13a (SEQ ID NO:81) -M(v)hVH 13b (SEQ ID N0:82)和 hVL 13b (SEQ ID N0:83)。
16.權(quán)利要求1-15中任一項的單克隆抗體，其具有約IpM至約7nM的范圍內(nèi)的親和力。
17.權(quán)利要求1-8中任一項的單克隆抗體，其與包含對應(yīng)于選自SEQID N0:28、29、30、31和32的序列的氨基酸序列的表位結(jié)合。
18.權(quán)利要求I和9-15中任一項的單克隆抗體，其與包含對應(yīng)于選自SEQID N0:33、34,35和36的序列的氨基酸序列的表位結(jié)合。
19.權(quán)利要求1-8中任一項的單克隆抗體，其與選自抗-hPGMAbl、抗-hPG MAb2、抗-hPG MAb3、抗-hPG MAb4、抗-hPG MAbl5、抗-hPG MAbl6、抗-hPG MAbl7、抗-hPG MAb18,抗-hPG MAb 19和抗-hPG MAb20的參考抗體競爭結(jié)合hPG。
20.權(quán)利要求I和9-15中任一項的單克隆抗體，其與選自抗-hPGMAb5、抗-hPG MAb6、抗-hPG MAb7、抗-hPG MAb8、抗-hPG MAb9、抗-hPG MAblO、抗-hPG 獻(xiàn)1311、抗-證6 MAbl2、抗-hPG MAbl3、抗-hPG MAbl4、抗-hPG MAb21、抗-hPG MAb22 和抗-hPG MAb23 的參考抗體競爭結(jié)合hPG。
21.權(quán)利要求I的單克隆抗體，其在用LS174T細(xì)胞進(jìn)行的體外測定中中和hPG活性。
22.組合物，其包含權(quán)利要求1-21中任一項的單克隆抗體及賦形劑、載體和/或稀釋劑。
23.權(quán)利要求22的組合物，其配制用于藥用用途。
24.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-15中任一項的抗-hPG單克隆抗體的可變輕鏈(')。
25.多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1-15中任一項的抗-hPG單克隆抗體的可變重鏈(VH)。
26.表達(dá)載體，其包含編碼權(quán)利要求I的抗-hPG單克隆抗體的可變輕鏈(')的多核苷酸。
27.表達(dá)載體，其包含編碼權(quán)利要求I的抗-hPG單克隆抗體的可變重鏈(Vh)的多核苷酸。
28.宿主細(xì)胞，其用適合用于表達(dá)權(quán)利要求1-21中任一項的抗-hPG單克隆抗體的多核苷酸對轉(zhuǎn)化。
29.雜交瘤，其能夠分泌權(quán)利要求1-21中任一項的抗-hPG單克隆抗體。
30.權(quán)利要求29 的雜交瘤，其選自 43B9G11、WE5H2G7、6B5B11C10、20D2C3G2、1B4A11D11、1B6A11F2、1B11E4B11、1C10D3B9、1D8F5B3、1E1C7B4、2B4C8C8、2B11E6G4、2C6C3C7、2H9F4B7、1E9A4A4、1E9D9B6、1C8D10F5、1A7C3F11、1B3B4F11、1C11F5E8、1F11F5E10UF11F5G9 和 1A11F2C9。
31.權(quán)利要求29 的雜交瘤，其選自 43B9G11、WE5H2G7、1B4A11D11、1B6A11F2、1B11E4B11、1D8F5B3、1E1C7B4、2B4C8C8、2B11E6G4、2H9F4B7、1E9A4A4、1C8D10F5、1A7C3F11、ICl 1F5E8UF11F5E10UF11F5G9 和 1A11F2C9。
32.權(quán)利要求29 的雜交瘤，其選自 1B4A11D11、1B6A11F2、1B11E4B11、2B4C8C8、2B11E6G4 和 1E9A4A4。
33.獲得抗-hPG單克隆抗體的方法，其包括 Ca)在適宜的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求29的雜交瘤；和 (b)從培養(yǎng)基或雜交瘤細(xì)胞回收抗-hPG單克隆抗體。
34.治療結(jié)腸直腸癌的方法，其包括對受試者施用對治療所述結(jié)腸直腸癌有效量的人源化中和性抗_hPG單克隆抗體。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述中和性抗-hPG單克隆抗體與可從選自43B9G11、WE5H2G7、6B5B11C10、20D2C3G2、1B4A11D11、1B6A11F2、1B11E4B11、1C10D3B9、1D8F5B3、1E1C7B4、2B4C8C8、2B11E6G4、2C6C3C7、2H9F4B7、1E9A4A4、1E9D9B6、1C8D10F5、IA7C3F11、1B3B4F11、ICl 1F5E8、IFl 1F5E10、IFl 1F5G9 和 IAl 1F2C9 的雜交瘤獲得的抗 _hPG 單克隆抗體競爭結(jié)合。
36.權(quán)利要求34的方法，其中所述中和性抗-hPG單克隆抗體具有在序列上對應(yīng)于選自抗-hPG MAbl、抗-hPG MAb2、抗-hPG MAb3、抗 _hPGMAb4、抗-hPG MAb5、抗-hPG MAb6、抗-hPG MAb7、抗-hPG MAb8、抗-hPG MAb9、抗-hPG MAblO、抗-hPG 獻(xiàn)1311、抗-證6 MAbl2、抗-hPGMAbl3、抗-hPG MAbl5、抗-hPG MAbl6、抗-hPG 獻(xiàn)1317、抗-詘6獻(xiàn)1318、抗-詘6 MAb 19,抗-hPG MAb20、抗-hPG MAb21、抗-hPG MAb22 或抗-hPG MAb23 的抗-hPG 單克隆抗體的CDR 的 CDR。
37.抑制結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞增殖的方法，其包括使結(jié)腸直腸腫瘤細(xì)胞暴露于中和性抗-hPG單克隆抗體。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述中和性抗-hPG單克隆抗體與可從選自43B9G11、WE5H2G7、6B5B11C10、20D2C3G2、1B4A11D11、1B6A11F2、1B11E4B11、1C10D3B9、1D8F5B3、1E1C7B4、2B4C8C8、2B11E6G4、2C6C3C7、1E9A4A4、1E9D9B6、1C8D10F5、1A7C3F11、1B3B4F11、ICl 1F5E8、IFl 1F5E10、IFl 1F5G9和IAl 1F2C9的雜交瘤獲得的抗_hPG單克隆抗體競爭結(jié)合。
39.權(quán)利要求37的方法，其中所述中和性抗-hPG單克隆抗體具有在序列上對應(yīng)于選自抗-hPG MAbl、抗-hPG MAb2、抗-hPG MAb3、抗-hPG MAb4、抗-hPG MAb5、抗-hPG MAb6、抗-hPG MAb7、抗-hPG MAb8、抗-hPG MAb9、抗-hPG MAblO、抗-hPG 獻(xiàn)1311、抗-證6 MAbl2、抗-hPG MAbl3、抗-hPG MAbl5、抗-hPG MAbl6、抗-hPG MAbl7、抗-hPG MAbl8、抗-hPGMAbl9、抗-hPG MAb20、抗-hPG MAb21、抗-hPG MAb22 或抗-hPG MAb23 的抗-hPG 單克隆抗體的CDR的CDR。
40.權(quán)利要求37的方法，其在體外進(jìn)行。
41.權(quán)利要求37的方法，其在體內(nèi)進(jìn)行。
42.用于檢測hPG的試劑盒，其包含權(quán)利要求2的N端抗-hPG單克隆抗體和特異性結(jié)合hPG的C端區(qū)域的抗體。
43.權(quán)利要求42的試劑盒，其中所述特異性結(jié)合hPG的C端區(qū)域的抗體是多克隆抗體。
44.用于檢測hPG的試劑盒，其包含權(quán)利要求9的C端抗-hPG單克隆抗體和特異性結(jié)合hPG的N端區(qū)域的抗體。
45.權(quán)利要求44的試劑盒，其中所述特異性結(jié)合hPG的N端區(qū)域的抗體是多克隆抗體。
46.在受試者中診斷結(jié)腸直腸癌的方法，其包括用權(quán)利要求1-15中任一項的至少一種單克隆抗體定量來自所述受試者的血清樣品中的前胃泌素，其中約20至400pM的范圍內(nèi)的前胃泌素的量是結(jié)腸直腸癌的指示。
47.選擇適于進(jìn)行抗-hPG療法的患者的方法，其包括用權(quán)利要求1-15中任一項的至少一種單克隆抗體定量來自結(jié)腸直腸癌患者的血清樣品中的前胃泌素，其中約20至400pM的范圍內(nèi)的前胃泌素的量是進(jìn)行抗_hPG療法的適合性的指示。
48.監(jiān)測結(jié)腸直腸癌治療的有效性的方法，其包括用權(quán)利要求1-15中任一項的至少一種單克隆抗體定量正在進(jìn)行結(jié)腸直腸癌治療的受試者的血液前胃泌素水平作為時間的函數(shù)，其中所述受試者血清前胃泌素水平依賴時間的降低指示所述治療有效。
49.抑制細(xì)胞中依賴前胃泌素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)系統(tǒng)的方法，其包括使分泌hPG的細(xì)胞暴露于對抑制依賴前胃泌素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有效的量的中和性抗-PG單克隆抗體。
全文摘要
本公開涉及前胃泌素單克隆抗體、其片段、包含前胃泌素單克隆抗體的組合物，以及產(chǎn)生和使用前胃泌素單克隆抗體及其組合物的方法。本公開涉及用前胃泌素單克隆抗體和包含前胃泌素單克隆抗體或其片段的組合物治療結(jié)腸直腸癌的方法。本公開還涉及包括前胃泌素的檢測的方法，其包括診斷結(jié)腸直腸癌的方法和在患有結(jié)腸直腸癌的受試者中監(jiān)測抗癌療法的功效的方法。
文檔編號A61K39/395GK102791735SQ201080057237
公開日2012年11月21日 申請日期2010年10月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者D·朱伯特, F·霍蘭德, J·帕內(nèi)坎, L·布迪爾 申請人:健康和醫(yī)學(xué)國家研究院, 拜若提, 科學(xué)研究國家中心