專利名稱：抗體配制劑的制作方法
抗體配制劑本發(fā)明涉及針對表皮生長因子受體的抗體(抗EGFR抗體)的藥物配制劑、用于制備所述配制劑的方法和配制劑的用途。在第一方面，本發(fā)明涉及一種藥物配制劑，其包含I 至 200mg/ml IgG 類抗 EGFR 抗體；I 至 IOOmM 緩沖劑；0. 001 至 l%(w/v)表面活性劑；I至500mM至少一種穩(wěn)定劑；pH 范圍為 4.0 至 7. O。 依照本發(fā)明的配制劑可以以液體形式、凍干形式或以自凍干形式重建的液體形式提供。除非下文中另有定義，在本文中如本領域中一般使用的那樣使用術語。如本文中所使用的，術語“IgG類抗EGFR抗體”包括靶向人表皮生長因子受體(EGFR)(又稱為 HER-I 或 ErbB-I (Ullrich 等，Nature 309, 418-425 (1984) ; SwissProt 登錄號 #P00533 ; 二級登錄號:000688, 000732、P06268、Q14225、Q68GS5、Q92795、Q9BZS2、Q9GZX1、Q9H2C9、Q9H3C9、Q9UMD7、Q9UMD8、Q9UMG5 )，及其天然存在的同等型和變體的免疫球蛋白G(IgG)類免疫球蛋白的抗體?？捎糜谝勒毡景l(fā)明的配制劑的例示性IgG類抗EGFR抗體包括西妥昔單抗(cetuximab)/IMC-C225 (ErbitUX ,其記載于 Goldstein 等,Clin Cancer ResI, 1311-1318 (1995))、帕尼單抗(panitumumab)/ABX-EGF (Vectibix ，其記載于 Yang等，Cancer Res 59， 1236-1243(1999)，Yang 等，Critical Reviews in Oncology/Hematology 38, 17-23 (2001))、尼妥珠單抗(nimotuzumab) /h_R3 (TheraCim ，其記載于 Mateo 等,Immunotechnology 3，71-81 (1997);Crombet-Ramos 等,Int J Cancer
101,567-575(2002),Boland 和 Bebb, Expert Opin Biol Ther 9,1199-1206(2009))、馬妥珠單抗(matuzumab)/EMD 72000 (其記載于 Bier 等，Cancer Immunol Immunother46, 167-173 (1998), Kim, Curr Opin Mol Ther 6,96-103(2004))、和扎魯木單抗(zalutumumab) /2F8 (其記載于 Bleeker 等，J TmmunoI 173, 4699-4707 (2004), Lammertsvan Bueren, PNAS105, 6109-6114(2008))。可用于依照本發(fā)明的配制劑的優(yōu)選的IgG類抗EGFR抗體記載于W02006/082515和TO 2008/017963，通過提及而將其全部內容收入本文，并且包括如下的抗體，其特征在于它們是具有大鼠單克隆抗體ICR62的結合特異性的嵌合抗體，且它們的效應器功能通過改變的糖基化得到增強。優(yōu)選抗體的特征在于它們包含大鼠ICR62抗體的至少一個(S卩，1、2、3、4、5、或6個)互補決定區(qū)(OTR)，或至少含有所述⑶R的特異性決定殘基，且包含自異源多肽衍生的序列的其變體或截短形式?！疤禺愋詻Q定殘基”意指那些直接涉及與抗原相互作用的殘基。具體地，優(yōu)選的抗體包含(a)選自下組的重鏈CDRl序列SEQ ID NO: I、SEQ ID NO:2, SEQID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO:7,SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、和 SEQ ID NO: 13 ； (b)選自下組的重鏈 CDR2序列SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ IDNO:19,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:24,SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、和 SEQ ID NO:30 ;和(c)重鏈⑶R3序列SEQ ID NO: 31。優(yōu)選的抗體進一步包含(a)選自下組的輕鏈⑶Rl序列SEQ ID NO: 32 和 SEQ ID NO: 33 ； (b)輕鏈 CDR2 序列 SEQ ID NO: 34 ;和(c)輕鏈 CDR3 序列 SEQ ID NO:35。更優(yōu)選的抗體的特征在于它們包含大鼠ICR62抗體的至少三個⑶R，或至少含有 所述CDR的特異性決定殘基的其變體或截短形式。更優(yōu)選的抗體包含a)在重鏈可變域中如SEQ ID NO: I所示的CDR1、如SEQ ID NO: 16所示的CDR2、和如SEQ ID NO:31所示的CDR3，和b)在輕鏈可變域中如SEQ ID NO:33所示的CDRlJn SEQ ID NO:34所示的CDR2、和如SEQ ID N0:35所示的CDR3。其它優(yōu)選的抗體包含依照SEQ ID N0:36的大鼠ICR62抗體重鏈可變域，或其變體；和非鼠多肽。此外，優(yōu)選的抗體可以包含依照SEQ ID NO:37的大鼠ICR62抗體輕鏈可變域，或其變體；和非鼠多肽。更優(yōu)選的抗體包含SEQ ID NO:38的重鏈可變域和SEQ ID NO:39的輕鏈可變域。優(yōu)選的抗體是靈長類化的(primatized)或更優(yōu)選的是人源化抗體?！叭嗽椿笨贵w指包含來自非人高變區(qū)(HVR)的氨基酸殘基和來自人框架區(qū)(FR)的氨基酸殘基的嵌合抗體。人源化抗體基本上通常包含兩個可變域，其中所有或基本上所有HVR (例如，互補決定區(qū)(⑶R))對應于非人抗體的那些HVR，且所有或基本上所有FR對應于人抗體的那些FR。任選地，人源化抗體可以至少包含自人抗體衍生的抗體恒定區(qū)的一部分?？贵w(例如非人抗體)的“人源化形式”指已經經歷人源化的抗體。人源化可以通過本領域中已知的多種方法來實現(xiàn)，所述方法包括但不限于(a)將整個非人可變域嫁接至人恒定區(qū)上以生成嵌合抗體，(b)在保留或不保留至關重要的框架殘基(例如，那些對于保留良好的抗原結合親和力或抗體功能重要的殘基)的情況中僅將非人(例如供體抗體)CDR嫁接至人(例如接受體抗體)框架和恒定區(qū)上，(c)僅將非人特異性決定區(qū)(SDR或CDR;對于抗體-抗原相互作用至關重要的殘基)嫁接至人框架和恒定區(qū)上，或者(d)移植整個非人可變域，但是通過替換表面殘基來用人樣部分“掩蓋”它們。優(yōu)選地，可用于依照本發(fā)明的配制劑的抗體包含人Fe區(qū)。更優(yōu)選地，人重鏈恒定區(qū)是Ig Y-UnSEQ ID N0:40中所列的，S卩，抗體是人IgGl亞類的。優(yōu)選的抗體已經被糖工程化改造成在Fe區(qū)中具有改變的寡糖結構。具體地，與非糖工程化改造抗體相比，優(yōu)選的抗體在Fe區(qū)中具有增加比率的非巖藻糖基化寡糖。優(yōu)選地，非巖藻糖基化寡糖的百分比是至少20%，更優(yōu)選地至少50%，至少70%，最優(yōu)選地至少75%。非巖藻糖基化寡糖可以是雜合或復合類型的。優(yōu)選的抗體在Fe區(qū)中還可以具有增加比例的兩分型寡糖。優(yōu)選地，抗體的Fe區(qū)中的兩分型寡糖的百分比是占總寡糖的至少50%，更優(yōu)選地至少60%，至少70%，至少80%，或至少90%，且最優(yōu)選地至少90-95%。
特別優(yōu)選的抗體在Fe區(qū)中具有增加比例的兩分型、非巖藻糖基化寡糖。兩分型、非巖藻糖基化寡糖可以是雜合或復合的。具體地，如下的抗體是優(yōu)選的，其中抗體Fe區(qū)中至少15%，更優(yōu)選地至少20%，更優(yōu)選地至少25%，更優(yōu)選地至少30%，更優(yōu)選地至少35%的寡糖是兩分型、非巖藻糖基化的。如本文中所使用的，術語“糖工程化改造的”包括對天然存在的或重組的蛋白質、多肽或其片段的糖基化樣式的任何操作。糖工程化改造包括細胞糖基化機制的代謝工程化改造，包括寡糖合成途徑的遺傳操作以實現(xiàn)這些細胞中表達 的糖蛋白的糖基化改變。此外，糖工程化改造包括突變和細胞環(huán)境對糖基化的影響。特別地，糖工程化改造可以導致細胞中的糖基轉移酶活性改變，諸如葡糖氨基轉移酶和/或巖藻糖基轉移酶活性改變。非巖藻糖基化和/或兩分型的相對量是缺乏巖藻糖和/或具有兩分型GIcNAc殘基的碳水化合物結構相對于經N-糖苷酶F處理的蛋白質樣品中通過MALDI-TOF MS鑒定的所有糖結構的百分比。優(yōu)選抗體的特征還在于它們已經被糖工程化改造成具有升高的效應器功能和/或升高的Fe受體結合親和力。如本文中所使用的，術語“效應器功能”指那些可歸因于抗體的Fe (天然序列Fe區(qū)或氨基酸序列變體Fe區(qū))的生物學活性。優(yōu)選地，升高的效應器功能是下列一項或多項升高的Fe介導的細胞的細胞毒性(包括升高的抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC))、升高的抗體依賴性細胞吞噬(ADCP)、升高的細胞因子分泌、升高的免疫復合物介導的抗原呈遞細胞的抗原攝取、升高的對天然殺死(NK)細胞的結合、升高的對巨噬細胞的結合、升高的對單核細胞的結合、升高的對多形核細胞的結合、升高的直接信號傳導誘導凋亡、升高的靶物結合抗體的交聯(lián)、升高的樹突細胞成熟、或升高的T細胞引發(fā)。優(yōu)選地，升高的Fe受體結合親和力是升高的對Fe活化受體的結合，最優(yōu)選地，升高的對Fe Y RIIIa的結合?？捎糜谝勒毡景l(fā)明的配制劑的最優(yōu)選的IgG類抗EGFR抗體的特征在于它包含SEQID NO:38的重鏈可變域和SEQ ID NO:39的輕鏈可變域，是人源化的，并且包含人重鏈恒定區(qū)Ig Y-I JnSEQ ID N0:40中所列的。此抗體稱作“hu-ICR62IgGl抗EGFR單抗”?？梢詫虿粚u-ICR62IgGl抗EGFR單抗糖工程化改造，如上文所描述的，以與非糖工程化改造抗體相比在Fe區(qū)中具有增加比例的非巖藻糖基化寡糖。優(yōu)選地，通過重組手段，例如通過那些記載于WO 2006/082515和W02008/017963的重組手段來生成可用于依照本發(fā)明的配制劑的抗體。此類方法是本領域中公知的，并且包括在原核或真核細胞中的蛋白質表達，隨后分離抗體多肽，并且通常純化至藥學可接受純度。對于蛋白質表達，通過標準方法將編碼輕和重鏈或其片段的核酸插入合適的表達載體中。在合適的宿主細胞中實施表達，所述合適的宿主細胞包括培養(yǎng)的細胞，優(yōu)選地培養(yǎng)的哺乳動物細胞諸如CHO細胞、HEK 293細胞、HEK293-EBNA細胞、BHK細胞、NSO細胞、SP2/0細胞、YO骨髓瘤細胞、P3X63小鼠骨髓瘤細胞、PER細胞、PER. C6細胞或雜交瘤細胞、大腸桿菌細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和植物細胞，而且還有轉基因動物、轉基因植物或培養(yǎng)的植物或動物組織內包含的細胞。優(yōu)選的宿主細胞是CHO細胞?？梢砸呀泴⒈磉_抗體所使用的宿主細胞操作為具有改變的糖基轉移酶活性水平，諸如改變的葡糖胺基轉移酶和/或巖藻糖基轉移酶活性，從而生成具有改變的糖基化樣式的抗體。優(yōu)選地，已經將宿主細胞操作為表達升高的一種或多種具有P (1,4)-N-乙酰葡糖氨基轉移酶III(GnTIII)活性的多肽和任選地一種或多種具有甘露糖苷酶II (ManII)活性的多肽水平。具有GnTIII活性的多肽可以是包含GnTIII的催化域和異源高爾基駐留多肽的高爾基定位域，優(yōu)選地甘露糖苷酶II的高爾基定位域的融合多肽?？梢耘c可用于本發(fā)明的IgG類抗EGFR抗體一起采用的糖工程化改造方法記載于 W02006/082515、WO 2008/017963、美國專利 No. 6，602，684、EP 1071700、W01999/54342、美國專利申請公開文本 No. 2004/0241817、EP 1587921、W02004/065540、Umaila等，Nature Biotechnol 17,176-180 (1999)、及 Ferrara 等，Biotechn Bioeng 93，851-861 (2006)，通過提及而將每篇的全部內容完整收入本文。通過標準的技術，例如蛋白A親和層析、大小排阻層析、和本領域中公知的其它技術，例如如記載于WO 2006/082515和WO 2008/017963的技術自細胞(上清液或裂解后的細胞)回收抗體。對于依照本發(fā)明的配制劑，抗體以約I至約200mg/ml,優(yōu)選地約I至約100mg/ml,更優(yōu)選地約10至約75mg/ml,且最優(yōu)選地約20至約50mg/ml的濃度使用。如本文中所使用的，術語“緩沖劑”意指穩(wěn)定藥用制劑的pH的藥學可接受賦形劑。合適的緩沖液是本領域中公知的，并且可以參見文獻。例如，可以采用檸檬酸鹽、乙酸鹽、組氨酸鹽、琥珀酸鹽、蘋果酸鹽、磷酸鹽或乳酸鹽、和/或其相應的游離酸或堿，及其各種鹽和/或酸和堿的混合物。優(yōu)選的藥學可接受緩沖液包括但不限于組氨酸緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液。優(yōu)選的緩沖液是乙酸鹽緩沖液，最優(yōu)選的是乙酸鈉緩沖液。其它優(yōu)選的緩沖液是組氨酸緩沖液，即具有組氨酸，一般為L-組氨酸作為緩沖劑的緩沖液。最優(yōu)選的是L-組氨酸/HCl緩沖液，其包含L-組氨酸或L-組氨酸和鹽酸L-組氨酸的混合物，且用氫氯酸實現(xiàn)pH調節(jié)。除非另有指示，術語“L-組氨酸”在本文中用于描述緩沖劑時指L-組氨酸/HCl緩沖液?？梢酝ㄟ^將合適量的L-組氨酸和鹽酸L-組氨酸在水中溶解，或者通過將合適量的L-組氨酸在水中溶解，并通過添加氫氯酸HCl來將pH調節(jié)至期望的數(shù)值來制備L-組氨酸/HCl緩沖液。上文提及的緩沖液一般以約 ImM至約IOOmM,優(yōu)選地約IOmM至約50mM，更優(yōu)選地約15至30mM，且最優(yōu)選地20mM的濃度使用。不管所使用的緩沖液，可以用本領域中已知的酸或堿，例如HCl、乙酸、磷酸、硫酸和檸檬酸、氫氧化鈉和氫氧化鉀將PH調節(jié)至范圍為約4. 0至約7. 0，優(yōu)選地約5. 0至約6. 0，且最優(yōu)選地約5. 5的數(shù)值。如本文中所使用的，術語“表面活性劑”意指藥學可接受表面活性劑。優(yōu)選地，使用非離子型表面活性劑。藥學可接受表面活性劑的例子包括但不限于聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(Tween)、聚氧乙烯烴基醚(Bri j)、烴基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(Poloxamer, Pluronic)、和十二燒基硫酸鈉(SDS)。優(yōu)選的聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯是聚山梨酯20 (聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯，以商標Tween 20 出售)和聚山梨酯80(聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯，以商標Tween 80 出售)。優(yōu)選的聚乙烯-聚丙烯共聚物是那些以名稱Ph.ironic F68或Poloxamer 188 出售的。優(yōu)選的聚氧乙烯烴基酯是那些以商標Brij 出售的。優(yōu)選的烴基苯基聚氧乙烯酯以商品名稱Triton X出售，最優(yōu)選的是對叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(以商品名稱Triton X-100 出售)。在使用聚山梨酯20 (Tween 20 )和聚山梨酯80 (Tween 80 )時，它們一般以范圍為約0. 001至約1%，優(yōu)選地約0. 01至約0. 1%，且更優(yōu)選地約0. 02%至約0. 05%的濃度使用。在本發(fā)明的配制劑中，表面活性劑的濃度描述為以重量/體積(w/v)表述的百分比。
如本文中所使用的，術語“穩(wěn)定劑”意指保護活性藥學成分和/或配制劑在制造、貯存和應用期間免于化學和/或物理降解的藥學可接受賦形劑。穩(wěn)定劑包括但不限于糖類、氨基酸、多元醇，例如甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、右旋糖苷、甘油、阿糖醇、丙二醇、聚乙二醇、環(huán)狀糊精，例如羥丙基-￠-環(huán)狀糊精、磺丁基乙基-￠-環(huán)狀糊精、￠-環(huán)狀糊精、聚乙二醇，例如PEG 3000,PEG 3350,PEG 4000,PEG 6000、清蛋白，例如人血清清蛋白(HSA)、牛血清清蛋白(BSA)、鹽,例如氯化鈉、氯化鎂、氯化I丐,螯合劑,例如EDTA,如下文定義的。如上文提及的，穩(wěn)定劑可以以約I至約500mM的量，優(yōu)選地以約10至約300mM的量，且更優(yōu)選地以約120mM至約300mM的量存在于配制劑中。配制劑中可以存在超過一種選自相同或不同組的穩(wěn)定劑。如本文中所使用的，術語“糖類”包括單糖和寡糖。單糖是一種酸不可水解的單體碳水化合物，包括單糖及其衍生物，例如氨基糖。糖類通常處于其D構象。單糖的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、脫氧核糖、神經氨酸。寡糖是一種分支或線
性鏈中的由經由糖苷鍵連接的超過一個單體糖類單元組成的碳水化合物。寡糖內的單體糖類單元可以是相同或不同的。根據(jù)單體糖類單元的數(shù)目，寡糖是二、三、四、五糖等。與多糖相反，單糖和寡糖是水溶性的。寡糖的例子包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖。優(yōu)選的糖類是蔗糖和海藻糖(即a，a-D-海藻糖)，最優(yōu)選的是蔗糖。海藻糖是海藻糖二水合物形式。糖類可以以約100至約500mM的量，優(yōu)選地以約200至約300mM的量，最優(yōu)選地以約240mM的量存在于配制劑中。如本文中所使用的，術語“氨基酸”意指擁有位于羧基基團的a -位置處的氨基模塊的藥學可接受有機分子。氨基酸的例子包括但不限于精氨酸、甘氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、脯氨酸。優(yōu)選地，所采用的氨基酸在每種情況中是L形式。優(yōu)選地，堿性氨基酸，諸如精氨酸、組氨酸、或賴氨酸以其無機鹽形式(有利地，氫氯酸鹽形式，即作為鹽酸氨基酸)采用。優(yōu)選的氨基酸是鹽酸精氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選地，甲硫氨酸以約10至約25mM，最優(yōu)選地約IOmM的濃度使用。優(yōu)選地，鹽酸精氨酸以約100至約200mM的濃度，最優(yōu)選地以約155mM的濃度使用。穩(wěn)定劑內的亞組是凍干保護劑(Iyoprotectant)。術語“凍干保護劑”意指在凍干方法、隨后的貯存和重建期間針對脫穩(wěn)定化條件保護不穩(wěn)定性活性成分(例如蛋白質)的藥學可接受賦形劑。凍干保護劑包括但不限于下組糖類、多元醇(諸如例如糖醇)和氨基酸。優(yōu)選的凍干保護劑可以選自下組糖類諸如蔗糖、海藻糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、麥芽糖、半乳糖、果糖、山梨糖、棉子糖、神經氨酸、氨基糖諸如葡糖胺、半乳糖胺、N-甲基葡糖胺(“甲葡胺”)、多元醇諸如甘露醇和山梨糖醇、和氨基酸諸如精氨酸和甘氨酸或其混合物。凍干保護劑一般地以約10至500mM的量，優(yōu)選地以約10至約300mM的量，且更優(yōu)選地以約100至約300mM的量使用。穩(wěn)定劑內的亞組是抗氧化劑。術語“抗氧化劑”意指阻止活性藥用成分氧化的藥學可接受賦形劑?？寡趸瘎┌ǖ幌抻诳箟难?、谷胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸、檸檬酸、EDTA?？寡趸瘎┛梢砸约s0. 01至約IOOmM的量，優(yōu)選地以約5至約50mM的量，且更優(yōu)選地以約5至約25mM的量使用。依照本發(fā)明的配制劑還可以包含一種或多種張力劑。術語“張力劑”意指用于調控配制劑張力的藥學可接受賦形劑。配制劑可以是低滲的、等張的或高滲的。一般地，等張性指通常相對于人血清滲透壓(250-350m0smol/kg左右)的溶液滲透壓。依照本發(fā)明的配制劑可以是低滲的、等張的或高滲的，但是優(yōu)選地會是等張的。等張配制劑是液體或自固體形式，例如自凍干形式重建的液體，并且意指與其比較的一些其它溶液，諸如生理鹽溶液和血清具有相同張力的溶液。合適的張力劑包括但不限于氯化鈉、氯化鉀、甘油和來自氨基酸或糖的組的任何組分，特別地蔗糖。張力劑一般以約5mM至約500mM的量使用。在穩(wěn)定劑和張力劑內，存在著可以以這兩種方式(即它們可以同時是穩(wěn)定劑和張力劑)發(fā)揮功能的一組化合物。其例子可以在糖、氨基酸、多元醇、環(huán)狀糊精、聚乙二醇和鹽的組中找到?？梢酝瑫r作為穩(wěn)定劑和張力劑的糖的例子是海藻糖。配制劑還可以含有佐劑諸如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑?？梢酝ㄟ^滅菌規(guī)程和通過納入各種抗細菌和抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸等兩者確保預防微生物的存在。一般地，防腐劑以約0.001至約2%(w/v)的量使用。防腐劑包括但不限于乙醇、苯甲醇、酚、間甲酚、對氯間甲酚、對羥基苯甲酸甲酯或丙酯、苯扎氯銨。在第一方面，本發(fā)明涉及藥物組合物，其包含I 至 200mg/ml IgG 類抗 EGFR 抗體；I 至 IOOmM 緩沖劑；0. 001 至 l%(w/v)表面活性劑；I至500mM至少一種穩(wěn)定劑，pH 范圍為 4.0 至 7. O。在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑中包含的IgG類抗EGFR抗體的濃度范圍為I至100mg/ml,優(yōu)選地10至75mg/ml,最優(yōu)選地20至50mg/ml。特別優(yōu)選的是25mg/ml的濃度。在另一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑中包含的緩沖劑是組氨酸緩沖液，優(yōu)選地L-組氨酸/HCl緩沖液，或乙酸鹽緩沖液，優(yōu)選地乙酸鈉緩沖液。特別優(yōu)選的是L-組氨酸/HCl緩沖液(即L-組氨酸作為緩沖劑)。優(yōu)選地，緩沖劑的濃度為10至50mM，更優(yōu)選地15至30mM，最優(yōu)選地20mM。優(yōu)選地，緩沖劑提供5. 0至6. 0，更優(yōu)選地5. 5±0. 3的pH。 在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑中包含的表面活性劑是聚山梨酯，優(yōu)選地聚山梨酯20或聚山梨酯80，最優(yōu)選地聚山梨酯80。優(yōu)選地，表面活性劑的濃度為0. 01至0. I %，更優(yōu)選地0. 02至0. 05% (w/v)，最優(yōu)選地 0. 02 至 0. 03%。在又一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑中包含的至少一種穩(wěn)定劑選自下組鹽，優(yōu)選地氯化鈉，糖類，優(yōu)選地海藻糖二水合物或蔗糖，和氨基酸，優(yōu)選地鹽酸精氨酸。優(yōu)選地，至少一種穩(wěn)定劑的濃度為120至300mM。在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑包含選自鹽、糖和氨基酸的組的第一穩(wěn)定劑和作為第二穩(wěn)定劑的甲硫氨酸。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述第一穩(wěn)定劑的濃度為120至300mM,且所述第二穩(wěn)定劑甲硫氨酸以5至25mM的濃度存在。
在一個特別優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑包含糖類，優(yōu)選地海藻糖二水合物或蔗糖，最優(yōu)選地蔗糖作為第一穩(wěn)定劑和甲硫氨酸作為第二穩(wěn)定劑。優(yōu)選地，糖類的濃度為約240mM，且優(yōu)選地，甲硫氨酸的濃度為約10mM。在另一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑中包含的IgG類抗EGFR抗體是人源化抗體,并且包含a)在重鏈可變域中 SEQ ID NO: I 的 CDR1、SEQ ID NO: 16 的 CDR2 和 SEQ ID NO: 31的CDR3，和b)在輕鏈可變域中 SEQ ID NO: 33 的 CDRl、SEQ ID NO: 34 的 CDR2和 SEQ ID No: 35的 CDR3。 在一個特別優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑中包含的IgG類抗EGFR抗體是 hu-ICR62IgGl 抗 EGFR 單抗。在某些實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑中包含的IgG類抗EGFR抗體已經被糖工程化改造成與非糖工程化改造抗體相比在其Fe區(qū)中具有增加比例，優(yōu)選地至少20%、至少50%或至少70%的非巖藻糖基化寡糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑包含10 至 50mg/ml IgG 類抗 EGFR 抗體；15至30mM緩沖劑，其選自L-組氨酸和乙酸鈉；0. 02至0. 05%(w/v)表面活性劑，其選自聚山梨酯20和聚山梨酯80 ；120至300mM至少一種穩(wěn)定劑，其選自海藻糖二水合物、蔗糖、鹽酸精氨酸和氯化鈉；任選地，5至25mM甲硫氨酸作為第二穩(wěn)定劑；pH 為 5. 5 ±0.3。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑包含10 至 50mg/ml hu_ICR62 IgGl 抗 EGFR 單抗；15 至 30mM L-組氨酸；0. 02 至 0. 05% (w/v)聚山梨酯 80 ；120至300mM至少一種穩(wěn)定劑，其選自海藻糖二水合物、蔗糖、和鹽酸精氨酸；任選地，5至25mM甲硫氨酸作為第二穩(wěn)定劑；pH 為 5. 5 ±0. 3。在又一個優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑包含10 至 50mg/ml IgG類抗EGFR抗體，優(yōu)選地hu_ICR62 IgGl 抗EGFR單抗、20mM L-組氨酸、240mM海藻糖二水合物、0. 02至0. 03%(w/v)聚山梨酯80, pH 5. 5 ；或10 至 50mg/ml IgG類抗EGFR抗體，優(yōu)選地hu_ICR62 IgGl 抗EGFR單抗、20mM L-組氨酸、155mM鹽酸精氨酸、0. 02%(w/v)聚山梨酯80, pH 5.5;或10 至 50mg/ml IgG類抗EGFR抗體，優(yōu)選地hu_ICR62 IgGl 抗EGFR單抗、20mM L-組氨酸、240mM海藻糖二水合物、0. 02至0. 03%(w/v)聚山梨酯80、10mM甲硫氨酸，pH 5. 5 ；或
10 至 50mg/ml IgG類抗EGFR抗體，優(yōu)選地hu_ICR62 IgGl 抗EGFR單抗、20mM L-組氨酸、240mM 蔗糖、0. 02 至 0. 03%(w/v)聚山梨酯 80，pH 5.5;或10 至 50mg/ml IgG類抗EGFR抗體，優(yōu)選地hu_ICR62 IgGl 抗EGFR單抗、20mM L-組氨酸、240mM鹿糖、0. 02至0. 03%(w/v)聚山梨酯80、10mM甲硫氨酸，pH 5.5。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑包含20 至 50mg/ml IgG 類抗 EGFR 抗體，優(yōu)選地 hu_ICR62IgGl 抗 EGFR 單抗；20mM L-組氨酸；0. 02 至 0. 03% (w/v)聚山梨酯 80 ； 240mM第一穩(wěn)定劑，其中所述第一穩(wěn)定劑是選自下組的糖類海藻糖二水合物和蔗糖，優(yōu)選地蔗糖；IOmM甲硫氨酸作為第二穩(wěn)定劑；pH 為 5. 5 ±0.3。在某些實施方案中，依照本發(fā)明的配制劑不包含氯化鈉。在某些實施方案中，配制劑不包含二價陽離子。在某些實施方案中，配制劑不包含乳糖酸。在某些實施方案中，配制劑不包含多元醇。在某些實施方案中，配制劑不包含右旋糖苷。依照本發(fā)明的配制劑可以為液體形式、凍干形式或自凍干形式重建的液體形式。在某些實施方案中，配制劑為液體形式。如本文中結合依照本發(fā)明的配制劑使用的，術語“液體”意指于至少約2至約8° C的溫度在大氣壓下作為液體的配制劑。如本文中結合依照本發(fā)明的配制劑使用的，術語“凍干的”意指通過本領域中本身已知的冷凍-干燥方法制造的配制劑。通過冷凍，接著在真空下將冰升華，并于升高的溫度脫附殘留水來除去溶劑(例如水)。凍干物通常具有約0.1至5%(w/w)的殘留水分，并且以粉末或物理上穩(wěn)定的片餅存在。凍干物以在添加重建介質后快速溶解為特征。如本文中結合依照本發(fā)明的配制劑使用的，術語“重建形式”意指凍干并通過添加重建介質再溶解的配制劑。合適的重建介質包括但不限于注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BffFI)、氯化鈉溶液(例如0. 9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%葡萄糖)、含有表面活性劑的溶液(例如，0. 01%聚山梨酯20)、pH緩沖溶液(例如磷酸鹽緩沖溶液)。依照本發(fā)明的配制劑是生理學耐受良好的，可以容易地制備，可以精確地分配，而且在貯存持續(xù)時間里、在重復冷凍和融化周期和機械壓力期間就分解產物和聚集體而言是穩(wěn)定的。它于冰箱溫度(2-8° C)在一段超過I年的時間里是穩(wěn)定的。本發(fā)明進一步包括用于制備依照本發(fā)明的配制劑的方法。所述方法包括將IgG類抗EGFR抗體針對含有預期的緩沖液組成的滲濾緩沖液進行緩沖液更換，并在需要的情況中，通過滲濾濃縮抗體，接著將賦形劑(例如海藻糖二水合物、蔗糖、精氨酸、氯化鈉、甲硫氨酸)以儲備溶液添加至抗體溶液，接著將表面活性劑以儲備溶液添加至抗體/賦形劑溶液，并且最終使用緩沖溶液將抗體濃度調節(jié)至期望的終濃度，由此也達到最終的賦形劑和表面活性劑濃度?；蛘?，也可以將賦形劑以固體添加至包含IgG類抗EGFR抗體的起始溶液。若IgG類抗EGFR抗體為固體(例如凍干物)形式，則可以通過首先將抗體在水或緩沖溶液(任選地，其包含一種或多種賦形劑)中溶解，隨后以儲備溶液或固體添加別的賦形劑來制備依照本發(fā)明的配制劑。有利地，也可以將IgG類抗EGFR抗體在包含所有其它賦形劑的溶液中直接溶解?？梢砸呀浽谟糜谥苽銲gG類抗EGFR抗體的方法期間或該方法結束時添加依照本發(fā)明的配制劑中存在的一種或多種賦形劑，例如通過在制備抗體后實施的最終純化步驟中將IgG類抗EGFR抗體在包含一種、超過一種或優(yōu)選地所有配制劑賦形劑的溶液中直接溶解來進行。若包含抗體和賦形劑的溶液尚沒有期望的PH，則這通過添加酸或堿，優(yōu)選地使用已經存在于緩沖系統(tǒng)中的酸或堿來調節(jié)。這繼之以無菌過濾。本發(fā)明進一步包括依照本發(fā)明的配制劑用于制備可用于治療疾病，特別是細胞增殖病癥(其中表達EGFR，特別是其中與相同細胞類型的正常組織相比異常表達(例如過表達)EGFR)的用途。此類病癥包括不同類型的癌癥，諸如膀胱、腦、頭和頸、胰腺、肺、乳腺、卵巢、結腸、前列腺、皮膚、和腎癌?？梢酝ㄟ^本領域中已知的方法和那些記載于WO2006/082515和WO 2008/017963的方法(例如，經由免疫組織化學測定法、免疫熒光測定法、免疫酶測定法、ELISA、流式細胞術、放射性免疫測定法、Western印跡、配體結合、激酶活性等)來測定EGFR表達水平。 可以通過本領域中已知的多種方法來施用本發(fā)明的組合物。如熟練技術人員會領會的，施用路徑和/或模式會隨期望的結果而有所變化。為了通過某些施用路徑來施用本發(fā)明的組合物，可能有必要將組合物在稀釋劑中稀釋。藥學可接受稀釋劑包括鹽水、葡萄糖、林格(Ringer)和水性緩沖溶液。優(yōu)選地，通過靜脈內(i. V.)、皮下(s. c.)或任何其它胃腸外施用手段諸如那些在藥學領域中已知的手段來施用依照本發(fā)明的配制劑。如本文中所使用的，短語“胃腸外施用”意指通常通過注射進行的與腸和表面施用不同的施用模式，并且包括但不限于靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹膜內、經氣管、皮下、表皮下、關節(jié)內、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊柱內、硬膜外和胸骨內注射和輸注。組合物必須是無菌的，而且是流體的，其程度使得組合物通過注射器或輸注系統(tǒng)可投遞。在水外，載體可以是等張緩沖鹽水溶液、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇等)及其合適的混合物?？梢酝ㄟ^本領域中已知的方法，例如超濾-滲濾、透析、添加和混合、凍干、重建及其組合來制備依照本發(fā)明的配制劑。下文可以找到制備依照本發(fā)明的配制劑的例子。實施例更為詳細地解釋本發(fā)明，但是不應解釋為限制本發(fā)明的范圍。通過提及而明確地完整收錄本文中所引用的所有專利和科學文獻的公開內容。
實施例依照本發(fā)明的IgG類抗EGFR抗體配制劑是基于使用如下文所概述的通用制備和分析方法和測定法得到的如下文所提供的實驗結果開發(fā)的。實施例I :配制劑組分的制備通過一般自重組蛋白生成已知的技術來制造IgG類抗EGFR抗體hu-ICR62 IgGl抗EGFR單抗。制造此抗體的技術記載于WO 2006/082515和WO 2008/017963。簡言之，自母細胞庫將如在WO 2006/082515和WO 2008/017963中所描述的那樣制備的經遺傳工程改造的中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)在細胞培養(yǎng)物中擴充。使用在MabSelect SuRe 柱(GE)上的蛋白A親和層析，接著是在Capto S 柱(GE)上的陽離子交換層析，及最終在Capto Q 柱(GE)上的陰離子交換層析步驟自條件化細胞培養(yǎng)基純化hu-ICR62 IgGl抗EGFR單抗。使用Viresolve Pro膜(Millipore)通過納米過濾除去病毒,將抗體濃縮,并通過滲濾轉移入期望的緩沖液中。對于制備依照這些例子的配制劑，在20mM組氨酸緩沖液(L-組氨酸/HCl緩沖液)(pH為約6. 0)中以約20mg/ml的濃度提供hu_ICR62 IgGl抗EGFR單抗抗體。依照本發(fā)明的配制劑的賦形劑在實踐中廣泛使用，并且是本領域技術人員已知的。因此，不需要在本文詳細解釋它們。如下開發(fā)依照本發(fā)明的液體藥物產品配制劑。實施例2 :液體配制劑的制備對于制備液體配制劑，將hu_ICR62 IgGl抗EGFR單抗針對含有預期的緩沖液組成的滲濾緩沖液進行緩沖液更換，并且在需要的情況中，通過滲濾濃縮至約50-80mg/ml的抗體濃度。在完成滲濾操作后，將賦形劑(例如，海藻糖、氯化鈉、甲硫氨酸)以儲備溶液添加至·抗體溶液。然后，將表面活性劑以50至200倍儲備溶液添加。最后，用緩沖液將蛋白質濃度調節(jié)至約25mg/ml或約50mg/ml的最終hu_ICR62 IgGl抗EGFR單抗抗體濃度。 將所有配制劑無菌過濾通過0. 22 y m低蛋白質結合濾器，并在無菌條件下填充入無菌6ml玻璃管形瓶中，用經ETFE (乙烯和四氟乙烯的共聚物)包被的橡膠塞和鋁壓褶帽(crimp cap)密封。填充體積是約2. 4ml。將這些配制劑在不同ICH溫度條件(5° C、25° C和40° C)貯存不同時間間隔，并通過搖動(于5° C和25° C以200min-l的搖動頻率持續(xù)I周)和冷凍-融化壓力法來施壓。在應用壓力測試之前和之后通過下列分析方法來分析樣品1)UV分光光度法；2)大小排阻層析(SEC)；3)通過離子交換層析(IEC)；4)通過溶液的濁度；5)檢查可見顆粒。在Perkin Elmer A 35 UV分光光度計上以240nm至400nm的波長范圍實施用于測定蛋白質含量的UV分光光度術。用相應的配制緩沖液將純的蛋白質樣品稀釋至約0. 5mg/mlo依照等式I計算蛋白質濃度。
lA怖誶倍故等式I , z A - J-I
蛋白質含量=W針對320nm的光散射校正280nm的UV光吸收，并乘以稀釋倍數(shù)(其自純樣品和稀釋緩沖液的加權質量和密度確定)。用分子除以比色皿的路徑長度d和消光系數(shù)e的乘積。使用大小排阻層析(SEC)來檢測配制劑中的可溶性高分子量種類(聚集體)和低分子量水解產物(LMW)。在具有Waters W2487雙重吸光度檢測儀并裝備有TosoHaas TSK凝膠G3000SWXL柱的Waters Alliance 2695 HPLC儀上實施該方法。使用200mM磷酸鈉，pH7. 0作為流動相通過等度洗脫模式來分開完整的單體、聚集體和水解產物，并以280nm的波長檢測。實施離子交換層析(IEC)以檢測配制劑中改變hu-ICR62 IgGl抗EGFR單抗的凈電荷的化學降解產物。該方法使用裝備有UV檢測儀(檢測波長280nm)和Dionex ProPacWCX-IO柱(4mm x 250mm)的合適的HPLC儀。分別使用水中的IOmM磷酸鈉緩沖液pH 6.0和IOmM磷酸鈉緩沖液pH 6. 0+750mM NaCl作為流動相A和B，流速為I. OmL/分鐘。為了測定濁度，于室溫使用HACH 2100AN濁度計以FTU (濁度單位)測量乳光。通過使用Seidenader V90-T目視檢查儀對樣品分析可見顆粒。下文添加的表I中提供了配制劑A至L的穩(wěn)定性測試結果。結果顯示，為了獲得最大抗體穩(wěn)定性和沒有顆粒的抗體配制劑，使用L-組氨酸/HCl緩沖液比使用乙酸鈉緩沖液更有利，而糖類諸如海藻糖二水合物和蔗糖是最有利的穩(wěn)定劑，且聚山梨酯80是最有利的表面活性劑。
權利要求
1.一種藥物配制劑，其包含 I至 200mg/ml IgG 類抗 EGFR 抗體; I至IOOmM緩沖劑； O.001至l%(w/v)表面活性劑； I至500mM至少一種穩(wěn)定劑， pH范圍為4. O至7. O。
2.依照權利要求I的配制劑，其中所述IgG類抗EGFR抗體濃度范圍為I至100mg/ml。
3.依照權利要求I或2的配制劑，其中所述緩沖劑是組氨酸緩沖液或こ酸鹽緩沖液。
4.依照權利要求I至3中任ー項的配制劑，其中所述緩沖劑的濃度為10至50mM。
5.依照權利要求I至4中任ー項的配制劑，其中所述緩沖劑提供5.O至6. O的pH。
6.依照權利要求I至5中任ー項的配制劑，其中所述表面活性劑是聚山梨酷。
7.依照權利要求I至6中任ー項的配制劑，其中所述表面活性劑的濃度為O.01至O.l%(w/v) ο
8.依照權利要求I至7中任ー項的配制劑，其中至少ー種穩(wěn)定劑選自下組鹽、糖類、和氨基酸。
9.依照權利要求I至8中任ー項的配制劑，其中所述至少ー種穩(wěn)定劑的濃度為120至.300mM。
10.依照權利要求I至9中任ー項的配制劑，其包含選自鹽、糖和氨基酸的組的第一穩(wěn)定劑和作為第二穩(wěn)定劑的甲硫氨酸。
11.依照權利要求10的配制劑，其中所述第一穩(wěn)定劑的濃度為120至300mM，且所述第ニ穩(wěn)定劑甲硫氨酸的濃度為5至25mM。
12.依照權利要求I至11中任ー項的配制劑，其包含 . 10 至 50mg/ml IgG 類抗 EGFR 抗體； .15至30mM緩沖劑，其選自L-組氨酸和こ酸鈉； O.02至O. 05%(w/v)表面活性劑，其選自聚山梨酯20和聚山梨酯80 ； .120至300mM至少ー種穩(wěn)定劑，其選自海藻糖ニ水合物、蔗糖、鹽酸精氨酸和氯化鈉； 任選地，5至25mM甲硫氨酸作為第二穩(wěn)定劑； pH 為 5. 5±0· 3。
13.依照權利要求I至12中任ー項的配制劑，其包含 .10至50mg/ml IgG類抗EGFR抗體、20mM L-組氨酸、240mM海藻糖ニ水合物、O. 02至O.03%(w/v)聚山梨酯 80，pH 5. 5 ； 或 .10至50mg/ml IgG類抗EGFR抗體、20mM L-組氨酸、155mM鹽酸精氨酸、O. 02%(w/v)聚山梨酷80，pH 5. 5 ； 或 . 10至50mg/ml IgG類抗EGFR抗體、20mM L-組氨酸、240mM海藻糖ニ水合物、O. 02至O.03%(w/v)聚山梨酯80、IOmM甲硫氨酸，pH 5. 5 ； 或 .10 至 50mg/ml IgG 類抗 EGFR 抗體、20mM L-組氨酸、240mM 鹿糖、O. 02 至 O. 03%(w/v)聚山梨酯80，pH 5. 5 ； 或.10 至 50mg/ml IgG 類抗 EGFR 抗體、20mM L-組氨酸、240mM 鹿糖、0. 02 至 0. 03%(w/v)聚山梨酯80、IOmM甲硫氨酸，pH 5.5。
14.依照權利要求I至13中任一項的配制劑，其包含20 至 50mg/ml hu_ICR62 IgGl 抗 EGFR 單抗； 20mM L-組氨酸；0.02 至 0. 03%(w/v)聚山梨酯 80 ； 240mM第一穩(wěn)定劑，其中所述第一穩(wěn)定劑是選擇海藻糖二水合物和蔗糖的糖； IOmM甲硫氨酸作為第二穩(wěn)定劑； pH 為 5. 5±0. 3。
15.依照權利要求I至14中任一項的配制劑，其中所述IgG類抗EGFR抗體是人源化抗體，并且包含a)在重鏈可變域中SEQ ID NO:l 的 CDR1、SEQ ID NO: 16 的 CDR2 和 SEQIDNO: 31 的 CDR3，和 b)在輕鏈可變域中SEQ ID NO:33 的 CDRl、SEQ ID NO:34 的 CDR2 和 SEQ ID No:35 的CDR3。
16.依照權利要求I至15中任一項的配制劑，其中所述IgG類抗EGFR抗體是hu-ICR62IgGl抗EGFR單抗。
17.依照權利要求I至16中任一項的配制劑，其中所述IgG類抗EGFR抗體已經被糖工程化改造成與非糖工程化改造抗體相比在其Fe區(qū)中具有增加比例的非巖藻糖基化寡糖。
18.依照權利要求I至17中任一項的配制劑，其為液體形式、凍干形式或自凍干形式重建的液體形式。
19.依照權利要求I至18中任一項的配制劑用于制備可用于治療癌癥的藥物的用途。
20.如本文中所描述的發(fā)明。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對表皮生長因子受體(EGFR)的抗體的藥物配制劑、所述配制劑的制備方法和用途。
文檔編號A61K9/08GK102686241SQ201080059591
公開日2012年9月19日 申請日期2010年12月23日 優(yōu)先權日2009年12月29日
發(fā)明者H-C.馬勒, M.阿德勒, U.格勞肖普夫 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司