專利名稱：用于骨和軟骨修復(fù)的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大體上涉及植物提取物和包含這些植物提取物的組合物的用途，用于治療骨和軟骨損傷、疾病或缺損，促進(jìn)骨和軟骨損傷的愈合以及促進(jìn)骨和軟骨的形成。在此披露的具體實(shí)施方案尤其在治療骨折以及骨形成和再生中得到應(yīng)用。
背景技術(shù)：
骨是一種活組織，含有多種組分，包括碳酸鈣、磷酸鈣、膠原和水，并且通過(guò)骨基質(zhì)的重吸收和沉積不斷得到補(bǔ)充。發(fā)生骨折時(shí)，通常的治療是把骨折的骨復(fù)位到合適的位置，穩(wěn)定該骨的位置，然后等待骨愈合過(guò)程的發(fā)生。骨愈合是一種復(fù)雜的過(guò)程，通常認(rèn)為涉及三個(gè)時(shí)期反應(yīng)期、修復(fù) 期和重塑期。在反應(yīng)期，骨折部位形成血腫，并且炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞在前列腺素的介導(dǎo)下浸潤(rùn)該骨。這導(dǎo)致肉芽組織的形成、血管組織向內(nèi)生長(zhǎng)、以及間充質(zhì)細(xì)胞的遷移。在修復(fù)期，成纖維細(xì)胞開(kāi)始鋪設(shè)間質(zhì)，它有助于支持血管向內(nèi)生長(zhǎng)。隨著血管向內(nèi)生長(zhǎng)，鋪設(shè)了膠原基質(zhì)，同時(shí)分泌類骨質(zhì)并隨后礦化，這導(dǎo)致在修復(fù)部位周圍形成柔軟的愈傷組織(軟骨)。經(jīng)過(guò)從數(shù)周到數(shù)月的時(shí)間，軟骨骨化，在骨折骨片之間形成編織骨的橋梁。在重塑期，發(fā)生愈合的骨骼恢復(fù)其原來(lái)的形狀、結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度。重塑期會(huì)緩慢持續(xù)數(shù)月至數(shù)年，但是典型地在三至六個(gè)月內(nèi)實(shí)現(xiàn)足夠的骨強(qiáng)度。顯然，骨折愈合是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。值得注意的是，軟骨與其他結(jié)締組織不同，不含有血管，因此與其他結(jié)締組織相比，軟骨生長(zhǎng)和修復(fù)得更慢。此外，當(dāng)愈合過(guò)程中任一步驟沒(méi)有適當(dāng)或及時(shí)發(fā)揮作用，骨愈合可能就被延遲或損害。這對(duì)個(gè)人而言是一個(gè)重大挫折，也是費(fèi)用高昂的臨床問(wèn)題。因此，使身體自然再生骨和軟骨的過(guò)程加快的方法顯然是有利的。諸位發(fā)明人已經(jīng)驚訝地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)誘導(dǎo)新骨形成和新軟骨生長(zhǎng)，在此披露的植物提取物和包含這些植物提取物的組合物促進(jìn)了骨和軟骨的修復(fù)。發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第一方面,提供了黃槿(Hibiscus tiliaceus L.)的一種生物活性提取物。該提取物可以進(jìn)一步包括濱5[豆(Vigna marina(Burm. )Merr.)、椰子(Cocosnucifera L.,)或欖仁(Terminalia catappa L.)中一種或多種的提取物。這種或這些提取物可以衍生自以下各項(xiàng)中的一種或多種樹(shù)皮、葉片、藤蔓、豆子、外殼或堅(jiān)果。在一個(gè)實(shí)施方案中，該黃槿提取物衍生自樹(shù)皮，典型地衍生自搗碎的新鮮樹(shù)皮。該提取物可以使用一種基于植物的油、一種烴和/或一種醇制備，和/或包含一種基于植物的油、一種烴和/或一種醇。該基于植物的油可以衍生自植物種子或果實(shí)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，該基于植物的油衍生自椰子。該椰子油可以是例如初榨椰子油、精煉椰子油、氫化椰子油或分餾椰子油。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第二方面，提供了一種組合物，它包括根據(jù)該第一方面的提取物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。在具體的實(shí)施方案中，該組合物用于治療骨或軟骨損傷，和/或促進(jìn)骨或軟骨的形成、修復(fù)或再生?？梢詫⒃摻M合物配制成適于任何途徑的給藥，例如局部給藥或胃腸外給藥。胃腸外給藥可以包括，例如骨內(nèi)輸液或鞘內(nèi)注射。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第三方面，提供了一種用于促進(jìn)受試者體內(nèi)骨或軟骨的形成、修復(fù)或再生的方法，該方法包括向有此需要的受試者給予一個(gè)有效量的根據(jù)該第一方面的提取物、根據(jù)該第二方面的組合物、或在所述提取物或組合物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片。該受試者可能患有骨和軟骨損傷、缺損或疾病，或者易感染或易誘發(fā)這類損傷、缺損或疾病。該損傷可以是例如骨折。該疾病可以是退行性骨病，例如骨質(zhì)疏松。該受試者可能正經(jīng)歷或已經(jīng)歷骨或軟骨移植操作，例如骨骼融合術(shù)，例如脊柱融合操作。這些成骨細(xì)胞或成骨祖細(xì)胞可以是自然產(chǎn)生的、異基因或異種的。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第四方面，提供了一種用于治療受試者體內(nèi)骨或軟骨的損傷、缺損或疾病的方法，該方法包括向該受試者給予一個(gè)有效量的根據(jù)該第一方面的提取物、根據(jù)該第二方面的組合物、或者在所述提取物或組合物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片。該損傷可以是例如骨折。該疾病可以是退行性骨病，例如骨質(zhì)疏松。該提取物或組合物可以提高該損傷或疾病的愈合率或愈合度。該提取物或組合物可以促進(jìn)骨或軟骨的形成、修復(fù)或再生。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第五方面，提供了一種用于促進(jìn)在骨或軟骨移植物或可植入裝置周圍的骨或軟骨生長(zhǎng)的方法，該方法包括在移植或植入操作之前、過(guò)程中或之后向受試者給予一個(gè)有效量的根據(jù)該第一方面的提取物、根據(jù)該第二方面的組合物、或者在所述提取物或組合物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片。該移植物可以是同體移植物或異體移植物。該移植術(shù)可以例如用于修復(fù)骨折、或用于骨骼融合(例如脊柱融合)目的。該可植入裝置可以是一種骨固定裝置或假體。根據(jù)該第一方面的提取物、根據(jù)該第二方面的組合物、或者在所述提取物或組合物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片可以涂在該假體上，用作一種骨固定裝置的輔助物，或者用作一種骨水泥的輔助物用于固定該假體或骨固定裝置。根據(jù)以上這些方面和實(shí)施方案，向受試者給藥可以在關(guān)節(jié)鏡或開(kāi)放手術(shù)操作時(shí)進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)第六方面，提供了一種用于骨形成或生長(zhǎng)的方法，該方法包括在一個(gè)有效量的根據(jù)該第一方面的提取物或根據(jù)該第二方面的組合物的存在下，在適宜誘導(dǎo)骨形成或生長(zhǎng)的條件下孵育成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明本發(fā)明將僅通過(guò)非限制的實(shí)例，參照附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，其中圖I示出了 10至14周齡雌性大鼠的皮膚組織學(xué)剖面圖。A :無(wú)治療；B :每天涂抹椰子油，共七天；C :每天涂抹乙醇中的黃槿，共七天；以及D :每天涂抹椰子油中的黃瑾，共、七天。這些皮膚樣本用蘇木精和伊紅染色，并且放大400倍顯示。圖2示出了 12周齡雌性新西蘭兔的皮膚組織學(xué)剖面圖。A和B :無(wú)治療；(和0 :每天涂抹椰子油中的濱豇豆、椰子、欖仁和黃槿的組合提取物，共七天出和？每天涂抹椰子油中的黃槿，共七天。這些皮膚樣本用蘇木精和伊紅染色，并且放大40倍(A，C，E)和400倍(B，D，F(xiàn))顯示。圖3示出了未治療(A和B)的和已治療(C至F)的18月齡雌激素缺乏(在六周齡摘除卵巢)的大鼠與未治療(G至H)的18月齡非雌激素缺乏(在六周齡進(jìn)行了對(duì)照手術(shù)，之后令大鼠恢復(fù))的大鼠以及已治療的大鼠(I至L)的組織學(xué)差異，此前通過(guò)截骨術(shù)造成股骨的手術(shù)性骨折并通過(guò)內(nèi)固定進(jìn)行手術(shù)修復(fù)。每天把椰子油中的黃槿提取物涂抹到這些經(jīng)治療大鼠的骨折部位，共21天。該骨折組織學(xué)樣本用蘇木精和伊紅(A、C、E、G、I、K)和藏紅花-0染料(Saffron-0 Stain) (B、D、F、H、J、L)染色，藏紅花_0染料把軟骨中的蛋白多糖染成紫色，并放大12倍顯示。 圖4示出了未治療的18月齡雌激素缺乏(在六周齡摘除卵巢)的大鼠(Ovx對(duì)照)(在六周齡進(jìn)行了對(duì)照手術(shù)，之后令大鼠恢復(fù))與經(jīng)治療的18月齡雌激素缺乏(在六周齡摘除卵巢)的大鼠(Ovx rx)其骨折部位的組織學(xué)評(píng)分圖，此前這些大鼠通過(guò)截骨術(shù)在股骨造成手術(shù)性骨折并通過(guò)內(nèi)固定進(jìn)行手術(shù)修復(fù)。每天把椰子油中的黃槿提取物涂抹到這些經(jīng)治療的大鼠的骨折部位，共3星期。圖5示出了在12周齡的新西蘭白兔體內(nèi)，用截骨術(shù)造成的20mm尺骨(包括骨膜)手術(shù)性缺損并且沒(méi)有移植物或替代性填充物的計(jì)算機(jī)模型(A和C)以及放射線圖(B和D)，此前每天涂抹白兔背部的上皮表面而不是骨折部位的肢體(共七天)A和C:帶有中間烴提取物的椰子油；C和D :椰子油中的黃槿烴提取物。圖6示出了 12周齡的雌性新西蘭白兔的組織學(xué)剖面圖，此前在骨折部位(通過(guò)截骨術(shù)造成20mm尺骨(包括骨膜)的手術(shù)性缺損并且沒(méi)有移植物或者替代性填充物)每天涂抹(共七天)椰子油中的濱豇豆、椰子、欖仁和黃槿的組合提取物(C和D)，椰子油中的黃槿提取物(E和F)。A和B，未治療的對(duì)照。這些樣本用五色染色，并放大12. 5倍(A、C、E)和25倍(B、D、F)顯示。圖7示出了 12周齡的雌性新西蘭白兔的組織學(xué)剖面圖，此前每天涂抹骨折部位(通過(guò)截骨術(shù)造成的20mm尺骨(包括骨膜)手術(shù)性缺損并且沒(méi)有移植物或替代性填充物)的上皮表面(共七天)A和B :椰子油中濱豇豆、椰子和欖仁的組合提取物(無(wú)黃槿)；(和D :乙醇中的黃槿提取物出和F :乙醇提取后的椰子油中的黃槿提取物；以及G和H :乙醇和烴提取后的椰子油中的黃槿提取物。這些樣本用五色染色，并放大12. 5倍顯示。圖8示出了 12周齡的新西蘭白兔通過(guò)截骨術(shù)造成的20mm尺骨(包括骨膜)手術(shù)性缺損的骨生長(zhǎng)評(píng)分圖，此前在骨折部位的上皮表面每天涂抹乙醇中的中間密度黃槿沉淀(HeA中間)、乙醇提取后的椰子油中的黃槿(eAo)、乙醇中的黃槿(eA乙醇)以及乙醇提取后的椰子油中的濱豇豆、椰子和欖仁的組合提取物(eNPKo)。圖9示出了雌性新西蘭兔脊柱的X-射線圖(A-D)和CT掃描圖(E)，這些兔子在12周齡時(shí)經(jīng)歷了使用從髂嵴收獲的同體移植物進(jìn)行的雙側(cè)單水平后外側(cè)融合。手術(shù)后進(jìn)行常規(guī)護(hù)理(A和B)，或者五天內(nèi)每天涂抹、之后每周兩次涂抹直到六周，將乙醇與烴提取后的椰子油中的黃槿提取物(C至E)涂抹到骨折部位周圍的喙部上皮表面，而不覆蓋該骨折部位。X-射線顯示出雙側(cè)的脊柱修復(fù)，其中A圖未治療組和C圖經(jīng)治療組顯示出手術(shù)后六周的愈合性融合體，以及六周時(shí)未治療動(dòng)物(B)和經(jīng)治療動(dòng)物(D)的髂嵴處的供體收獲位點(diǎn)。CT掃描顯示了經(jīng)治療動(dòng)物在六周時(shí)的髂嵴(E)。

圖10示出了雌性新西蘭兔的脊柱的組織學(xué)剖面圖，這些兔子在12周齡時(shí)經(jīng)歷了用從髂嵴收獲的同體移植物進(jìn)行的雙側(cè)單水平后外側(cè)融合。手術(shù)后進(jìn)行常規(guī)護(hù)理(A)，或者五天內(nèi)每天涂抹、之后每周涂抹兩次直到六周，將こ醇和烴提取后的椰子油中的5mL黃槿提取物(B)涂抹到骨折部位周圍的喙部上皮表面，而不覆蓋該骨折部位。這些樣本用蘇木精和伊紅染色，并以放大12. 5倍的復(fù)合圖像顯示，示出了橫突和距該椎體側(cè)2-3mm的脊柱融合體。圖11示出了經(jīng)治療的同體移植物在8周時(shí)以及未治療對(duì)照物在12周時(shí)的機(jī)械測(cè)
試結(jié)果。
圖12示出了經(jīng)以下處理的質(zhì)譜圖A:こ醇和烴提取后的椰子油中的黃槿；以及B :烴中間層。0}本發(fā)明的詳細(xì)說(shuō)明冠詞“ー種”和“一個(gè)”在此用于指示該冠詞的ー個(gè)或ー個(gè)以上(即至少ー個(gè))語(yǔ)法對(duì)象。作為示例，“ー種元素”是指ー種或ー種以上元素。除非上下文另有要求，貫穿整個(gè)說(shuō)明書(shū)和以下的權(quán)利要求書(shū)，“包括” 一詞及其多種變體(例如，“包括了”和“包括著”)應(yīng)該理解為是指包含所述整體、步驟或整體或步驟的組，但并不排除任何其他整體、步驟或整體或步驟的組。在此所使用，術(shù)語(yǔ)“有效量”和“有效劑量”其涵義包括提取物或組合物的ー個(gè)無(wú)毒但卻足夠的量或劑量，以便提供所希望的效果。所要求的精確量或劑量將因?yàn)橥磕ㄅc受試者的不同而變化，這取決于多種因素，例如該提取物或組合物是否在體外、活體外或體內(nèi)給藥；正在治療的物種；受試者的年齡和總體狀況；正在治療的病況的嚴(yán)重程度；所給予的具體提取物或組合物；給藥模式；等等。因此，不可能指定一個(gè)精確的有效量或劑量。但是，對(duì)于任何給定的情況，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可僅使用常規(guī)的試驗(yàn)方法來(lái)確定合適的有效量或劑量。在此所使用，術(shù)語(yǔ)“提取物”指衍生自ー種或多種植物的活性制劑。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，提及“活性的”是指該提取物能夠產(chǎn)生在此披露的所期望的治療效果。提取物是通過(guò)“提取”過(guò)程獲得的，本領(lǐng)域的技術(shù)人員通常應(yīng)當(dāng)將該“提取”理解為包括用ー種溶剤、液體、或超臨界流體處理植物材料，以便溶解該活性制劑并且從將其從剩余的不想要的植物材料中分離。提取物可以是液體形式(例如煎劑、溶液、輸液或酊劑)或固體形式(例如粉劑或顆粒)。在此所使用的術(shù)語(yǔ)“組合提取物”指從ー種以上植物物種制得的提取物。在組合提取物中，來(lái)自這些植物物種中任ー種的植物材料可以一起或分別進(jìn)行提取。換言之，來(lái)自這些物種中的ー些或全部物種的材料可以在添加該溶劑、液體或者超臨界流體之前進(jìn)行組合，和/或來(lái)自這些物種中的ー些或全部物種的材料可以用ー種溶劑、液體或超臨界流體単獨(dú)處理，并且隨后將如此獲得的制劑組合。這樣，可以使用相同或不同的溶劑(或液體或超臨界流體)從不同的物種中提取活性制劑。術(shù)語(yǔ)“提取物”和“組合提取物”在整個(gè)說(shuō)明書(shū)可以互換使用。術(shù)語(yǔ)“促進(jìn)了”和“促迸”及其變體當(dāng)用于骨和軟骨的形成、修復(fù)和再生的上下文時(shí)是指在此披露的提取物或組合物的誘導(dǎo)、刺激、增強(qiáng)、或者直接或間接地影響或?qū)е滦鹿呛托萝浌切纬?、或骨或軟骨修?fù)或再生的能力。這種促進(jìn)可以在體內(nèi)、活體外或體外發(fā)生。術(shù)語(yǔ)“增強(qiáng)了”、“增強(qiáng)”及其變體當(dāng)用于骨或軟骨形成、修復(fù)和再生的上下文時(shí)是指在此披露的提取物或組合物直接或間接地增強(qiáng)或提高骨和軟骨形成、修復(fù)和再生所涉及的自然生理過(guò)程的活性率或程度。在此所使用，術(shù)語(yǔ)“受試者”包括人類、靈長(zhǎng)類、家畜動(dòng)物(如棉羊、豬、牛、馬、驢)、實(shí)驗(yàn)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(如小鼠、兔、大鼠、豚鼠)、伴侶動(dòng)物(如狗、貓)、表演動(dòng)物(如狗、貓、豬、牛、棉羊、馬)以及圈養(yǎng)的野生動(dòng)物(如狐貍、袋鼠、鹿)。典型地，該受試者是人類或?qū)嶒?yàn)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。更典型地，該受試者是人類。在此所使用，術(shù)語(yǔ)“治療了”、“治療”、“預(yù)防了”以及“預(yù)防”是指以下任ー以及所有用途，這些用途包括以任一方法用于治療一種狀況或癥狀，預(yù)防ー種狀況或疾病的確立，或者預(yù)防、阻礙、延緩或逆轉(zhuǎn)ー種狀況或疾病的進(jìn)程或其他不希望的癥狀。因此，術(shù)語(yǔ)“治療”和“預(yù)防”以及類似術(shù)語(yǔ)應(yīng)當(dāng)以其最廣泛的含義來(lái)理解。例如，治療并不一定意味著治療患者直至完全康復(fù) 在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”意思是它所指的化合物適于和身體的組織接觸使用，其毒性、不相容性、不穩(wěn)定性、刺激性、過(guò)敏反應(yīng)等等并未達(dá)到尚可的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的程度。如在此所示例，本發(fā)明闡明了諸位發(fā)明人的令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，即來(lái)自太平洋島嶼的不同植物的提取物當(dāng)給予至哺乳動(dòng)物的皮膚時(shí)促進(jìn)骨和軟骨修復(fù)、以及新骨和新軟骨形成中的用途。因此，在此提供的是黃槿的生物活性提取物以及包含這些提取物的組合物盡管以黃槿的提取物為例，還考慮該提取物還可能衍生自任何木槿屬(Hibiscussp.)的ー種或多種植物，包括但不限于紅葉■ (Hibiscus acetosella)、夏威夷朱豐堇(Hibiscus bracKenriagei)、大麻豐堇(Hibiscus cannabinus)、長(zhǎng)柄-木豐堇(Hibiscusdiversifolius) > Hibiscus lavaterioide、魯威豐堇(Hibiscus Iudwigiiノ、大口十木豐堇(Hibiscus macrophyllus)、Hibiscus macropodus、高紅豐堇(Hibiscus elatus)、Hibiscusescobariae、Hibiscus ficulneus、ノ戶山笑蓉(Hibiscus paramutabilis)、具柄木豐堇(Hibiscus pedunculatus)、毛茛木豐堇(Hibiscus platanifolius)、福射刺芙蓉(Hibiscusradiatus)、朱豐堇(Hibiscus rosa-sinensis)、玫瑰爺(Hibiscus sabdariffa)、裂瓣朱豐堇(Hibiscus schizopetalus)、史氏;木豐堇(Hibiscus scottiiノ、Hibiscus socotranus、華木豐堇(Hibiscus sinosyriacus)、光売木豐堇(Hibiscus splendensノ、Hibiscus stenanthus、條紋木豐堇(Hibiscus striatus)、木豐堇(Hibiscus syriacus)、三葉木豐堇(Hibiscustrilobusノ、或 Hioiscus waimeae。根據(jù)某些實(shí)施方案的提取物和組合物還可以包括豇豆屬(Vigna sp.)和/或訶子屬(Terminalia sp.)的提取物。在具體實(shí)施方案中，豇豆屬為濱豇豆和/或訶子屬為欖仁。還考慮豇豆屬提取物可以衍生自下列植物中的ー種或多種，包括但不限于飛蛾J3. (Vigna aconitifolia)、赤ii (Vigna angularis)、蟲(chóng)咼牛藤(Vigna caracalla)、Vignadebilis、云南野紅豆、披針葉紅豆(Vigna Ianceolata)、長(zhǎng)葉紅豆(Vigna Iuteola)、濱海 Si ii (Vigna maritime)、黑吉 ii (Vigna mungo)、Vigna o-wahuensis、長(zhǎng)虹(Vigna parkeri)、綠豆(Vigna radiata)、金茅5エ豆(Vigna speciosa)、馬島花生(Vignasubterranea)、三裂葉 5エ豆(Vigna tri Iobata)、飯豆(Vigna umbel lata)、Si 豆(Vignaunguiculata)或野迎顯(Vigna vexillate)。還考慮訶子屬提取物可以衍生自下列植物中的ー種或多種，包括但不限干Terminalia acuminata、翅攬7I一(Terminalia alata)、高山攬仁(Terminalia altissima)、亞馬遜攬仁(Terminalia amazonia)、狹葉攬仁(Terminalia angustifolia)、喬木狀攬仁(Terminalia arborea)、樹(shù)狀攬仁(Terminalia arbuscula)、群島攬仁(Terminaliaarchipelagi)、 M Yl 攬仁(Terminalia arjunaノ 、了半J Tj 攬仁(Terminalia australis)、Terminalia avicennioides、油攬仁(Terminalia bellirica)、紅果攬仁樹(shù)(Terminaliabialata)、Terminalia bracnystemma、楊攬仁 uerminaiia brassii)、Terminaliabucidoides、黑攬仁(Terminalia buceras(黑撤攬(Bucida buceras)))、Terminaliabursarina、馬尼 SI 攬仁(Terminalia calamansanaiノ、Iロ」于(Terminalia chebula)、Terminalia cherrieri、Terminalia ciliata、黃花攬仁(Terminalia citrina)、■氏攬仁木(Terminalia copelandii)、多皮攬仁(Terminalia corticosa)、Terminalia eddowesii、可食攬仁(Terminalia edulis)、捕圓攬仁(Terminalia elliptica)、綿穗攬仁(Terminalia eriostachya)、紅葉攬仁(Terminalia erythrophylla)、法地?cái)埲?uerminalia ferdinandiana)、Terminalia foetidissima、填攬 7I一 (Terminaliafranchetii)、光葉攬仁(Terminalia glabrescens)、粉葉攬仁(Terminaliaglaucifolia)、Terminalia hararensis、Terminalia hecistocarpa、攬イー樹(shù)(Terminaliaintermedia)、種特迪 ^!攬仁(Terminalia ivorensis)、Terminaliajanuariensis、Terminalia kaernbachii、Terminalia kangeanensis、Terminalia kuhlmannii、_葉攬仁(Terminalia latifolia)、小葉攬仁(Terminalia mantaly)、Terminalia molinetii、莫氏攬仁(Terminalia muelleri)、千果攬仁(Terminalia myriocarpa)、亮葉攬仁(Terminalianitens)、Terminalia novocaledonica、長(zhǎng)圓攬仁樹(shù)(Terminalia oblongata)、倒卵形攬仁木(Terminalia obovata)、緬甸攬仁木(Terminalia oliveri)、圓維花攬仁(Terminaliapaniculata)、細(xì)花攬仁(Terminalia parvifIora)、膜葉攬仁(Terminalia pellucida)、顯脈攬仁(Terminalia phanerophlebiaノ、Terminalia phellocarpa、類李個(gè)覽仁(Terminaliaprunioides)、Terminalia reitzii、Terminalia rerei、Terminalia schimperiana、絹毛攬仁(Terminalia sericea)、布拉斯李子(Terminalia seriocarpa)、近匙葉攬仁(Terminalia subspathulata；、艷HI3攬 1 一 (Terminalia superba)、姆南攬仁或 Terminaliavolucris。還提供了釆用在此披露的提取物和組合物用于促進(jìn)或增強(qiáng)骨或軟骨形成、修復(fù)或再生的方法。這些方法尤其可應(yīng)用于治療骨或軟骨損傷、缺損或疾病。這種損傷、缺損或疾病可以是急性的或慢性的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)很容易地理解與在此披露的實(shí)施方案相關(guān)的損傷、缺損或疾病的范圍，即在該范圍內(nèi)新骨或新軟骨形成、受損或有缺陷的骨或軟骨的修復(fù)、或骨或軟骨的再生是希望的或有利的。僅僅作為示例，該損傷可以是例如創(chuàng)傷造成的，例如骨折或半月板損傷。作為示例，這些缺損和疾病包括先天性骨缺損、骨或脊椎變形、骨肉瘤、骨發(fā)育不良、骨質(zhì)疏松癥、骨軟化癥(佝僂病)、成骨不全(脆骨病)、骨的佩吉特氏病、骨關(guān)節(jié)炎以及其他特點(diǎn)為骨代謝、形成或再吸收異?；蚺c其相關(guān)的疾病和狀況。
在此披露的實(shí)施方案也應(yīng)用于手術(shù)操作，以便矯正骨損傷、畸形或疾病，其中骨生長(zhǎng)或再生的促進(jìn)或增強(qiáng)是有利的。例如，在此披露的實(shí)施方案可以與以下操作聯(lián)合使用骨骼融合(例如脊柱融合)操作，椎間盤(pán)重建或取出，或植入骨填充材料(例如羥基磷灰石塊、脫礦化的骨基質(zhì)塞、膠原基質(zhì))，固定裝置(例如ー種桿、螺釘、栓、盤(pán)等)，手術(shù)植入物或假體裝置(例如假體髖部或膝部)，或與骨水泥(例如用于填充骨和假體裝置之間的空隙或者把假體裝置固定到骨上的骨水泥)結(jié)合使用。這種植入材料、植入物或裝置可以是可再吸收的或不可再吸收的。在具體實(shí)施方案中，用于治療骨損傷、缺損和紊亂目的的提取物和組合物的應(yīng)用可以通過(guò)使用活體外操作實(shí)現(xiàn)。例如，在損傷例如骨折的情況下，ー個(gè)或多個(gè)骨片或骨段可以從有待治療的受試者體內(nèi)取出，并用在此披露的提取物或組合物進(jìn)行活體外培養(yǎng)。如果條件適宜，這個(gè)或這些骨片或骨段和提取物或組合物也可以與骨固定裝置或假體一起培養(yǎng)。在適宜的條件下培養(yǎng)適宜的一段時(shí)間以后，為了至少啟動(dòng)骨形成、修復(fù)或再生，可以將這個(gè)或這些骨骨片或骨段以及可任選的骨固定裝置或假體再次導(dǎo)入該受試者體內(nèi)。培養(yǎng)條件將取決于應(yīng)用，但是適宜的條件可以由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定，無(wú)需過(guò)多實(shí)驗(yàn)。可 替代地，環(huán)境可能要求必須使用衍生自其他個(gè)體或生物體的ー個(gè)或多個(gè)骨片或骨段。 類似地，成骨細(xì)胞或成骨祖細(xì)胞可以用在此披露的提取物或組合物進(jìn)行活體外培養(yǎng)，之后將這些成骨細(xì)胞或成骨祖細(xì)胞導(dǎo)入需要治療的受試者體內(nèi)。這些細(xì)胞可以是自然產(chǎn)生的(同種的)、異基因的或異種的。也可以采用活體外細(xì)胞療法，使用取自例如骨髄或成人外周血的間充質(zhì)細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、成人干細(xì)胞或任何其他專能細(xì)胞、多能細(xì)胞、全能細(xì)胞、或體外產(chǎn)生的“設(shè)計(jì)者”細(xì)胞。在此使用的術(shù)語(yǔ)“成骨祖細(xì)胞”涵蓋了所有具有分化為成骨細(xì)胞能力的專能細(xì)胞、多能細(xì)胞和全能細(xì)胞，不管它們是自然衍生的還是人工創(chuàng)造的。本發(fā)明的提取物可以是基于水性的、油和/或有機(jī)溶劑的提取物，通過(guò)任何可獲得的植物材料単獨(dú)地、組合地和/或相繼地提取得到，這些植物材料例如是葉、根、樹(shù)皮、莖、果實(shí)、嫩枝、堅(jiān)果、堅(jiān)果殼、種子、種皮、果仁、花朵、藤蔓和/或木材。合適的提取エ藝以及合適的提取溶劑和提取液是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的。用于提取的水性溶劑(例如水、酸、堿)、油(例如衍生自椰子的油)以及有機(jī)溶劑(這些溶劑可以是極性的(如醇類，例如こ醇)、非極性的(例如己燒)和/或鹵代的(如ニ氯甲烷))可依次用于提取或以組合混合物用于提取。重要的是，如在此所示例，該提取物的活性當(dāng)被提取至椰子油、極性溶劑(例如こ醇)或非極性溶劑(例如異戊烷)時(shí)得以保持。根據(jù)本發(fā)明，使用例如超臨界氮或ニ氧化碳的超臨界流體提取也可以用來(lái)獲取提取物。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員還應(yīng)當(dāng)了解，本發(fā)明的提取物可以經(jīng)受一個(gè)或多個(gè)提取后步驟，以便例如提高或保持該提取物的穩(wěn)定性、修飾或改變?cè)撎崛∥锏奈锢硇问?、或協(xié)助將該提取物配制成用于給予受試者的一種組合物。僅作為示例，ー種液體形式的提取物可以被低壓凍干以產(chǎn)生固體形式的提取物。本發(fā)明的提取物可以衍生自任何合適的植物材料。合適的植物材料包括葉、根、樹(shù)皮、莖、果實(shí)、嫩枝、堅(jiān)果、堅(jiān)果殼、種子、種皮、果仁、花朵、藤蔓或木材。該植物材料可以是例如新鮮的、干燥的或凍干的。對(duì)于任意給定的植物物種，ー種以上的植物材料可以用于提取物的生產(chǎn)。當(dāng)提取物衍生自黃槿時(shí)，典型地該提取物是葉、藤蔓和/或豆子提取物。本發(fā)明的一種或多種提取物可以根據(jù)本發(fā)明以藥物組合物的形式給藥，這些組合物可以包括一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。這些提取物還可以與其他治療劑組合，例如但不限于抗生素、抗微生物劑、消毒剤、麻醉劑和/或其他骨或軟骨生長(zhǎng)或修復(fù)的促進(jìn)劑。應(yīng)當(dāng)了解，對(duì)于任何特定個(gè)體，本發(fā)明的組合物的具體劑量水平將取決于各種因素，包括例如所采用的具體提取物的活性；有待治療的個(gè)體的年齡、體重、一般健康狀況和飲食；給藥時(shí)間；這種/這些提取物的穩(wěn)定性；身體上的涂藥部位、以及與其他任何治療或療法的組合。根據(jù)環(huán)境條件和有待治療的個(gè)體的情況，可以使用按照要求確定的劑量水平和模式進(jìn)行單次或多次給藥。有技術(shù)的受眾可以容易地確定合適的劑量方案?？梢詰?yīng)用一個(gè)寬的劑量范圍?？紤]到人類受試者，例如，每天每千克體重可以給予從大約0. Img到大約Img的提取物。劑量方案可以進(jìn)行調(diào)整以提供最佳的治療反應(yīng)。例如，可以將數(shù)個(gè)分開(kāi)的劑量以每小時(shí)、每天、每周、毎月或其他合適的時(shí)間間隔進(jìn)行給藥，或者該劑量可以根據(jù)情況的急迫性所要求地成比例地減少?！愣?，一個(gè)有效劑量預(yù)計(jì)是在姆24小時(shí)姆千克體重大約0. OOOlmg到大約 IOOOmg的范圍內(nèi)；典型地,姆24小時(shí)姆千克體重大約0. OOlmg到大約750mg ;姆24小時(shí)姆千克體重大約0. Olmg到大約500mg ;姆24小時(shí)姆千克體重大約0. Img到大約500mg ;姆24小時(shí)姆千克體重大約0. Img到大約250mg ;姆24小時(shí)姆千克體重大約I. Omg到大約250mg。更典型地，一個(gè)有效劑量預(yù)計(jì)在姆24小時(shí)姆千克體重大約I. Omg到大約200mg的范圍內(nèi)；每24小時(shí)每千克體重大約I. Omg到大約IOOmg ;每24小時(shí)每千克體重大約I. Omg到大約50mg ;姆24小時(shí)姆千克體重大約I. Omg到大約25mg ;姆24小時(shí)姆千克體重大約5. Omg到大約50mg ;姆24小時(shí)姆千克體重大約5. Omg到大約20mg ;姆24小時(shí)姆千克體重大約5. Omg到大約15mg。該提取物在局部施用的組合物中的存在量可以是大約0. 001% (W/W)與大約15% (W/W)之間、或大約0. 001%與大約12%之間、或大約0. 001%與大約10%之間、或大約0. 005%與大約10%之間、或大約0. 01%與大約10%之間、或大約0. 05%與大約10%之間、或大約0. 05%與大約5%之間。在此披露的組合物可以通過(guò)任何方便或合適的路徑給藥，例如通過(guò)胃腸外、局部、ロ服或經(jīng)鼻路徑給藥。胃腸外給藥可以包括，例如骨內(nèi)輸液、或鞘內(nèi)、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下的給藥。在某些實(shí)施方案中，在關(guān)節(jié)鏡或開(kāi)放手術(shù)操作時(shí)采用在此披露的多種方法和組合物可能會(huì)影響治療。典型地，局部施用的配置品包括本發(fā)明的一種或多種提取物，連同一種或多種可接受的載體以及任選的任何其他治療成分。適合局部給藥的配置品可以為任何合適的形式，例如可以按配方制成搽劑、洗剤、霜?jiǎng)?、凝膠、軟膏或糊劑。藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑的例子是去離子水或蒸餾水；鹽水溶液；基于植物的油，例如花生油、紅花油、橄欖油、棉籽油、玉米油、芝麻油、落花生油(arachis oil)或椰子油；硅油，包括聚硅氧烷，例如甲基聚硅氧烷、苯基聚硅氧烷以及甲基苯基聚硅氧烷；揮發(fā)性硅酮；礦物油，例如液體石蠟、軟石蠟或角鯊?fù)?；纖維素衍生物，例如甲基纖維素、こ基纖維素、羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉或羥丙基甲基纖維素；低級(jí)鏈烷醇，例如こ醇或異丙醇；低級(jí)芳烷醇；低級(jí)聚亞烷基ニ醇或低級(jí)亞烷基ニ醇，例如聚こニ醇、聚丙ニ醇、こニ醇、丙ニ醇、1，3-丁ニ醇或甘油；月旨肪酸酯，例如棕櫚酸異丙酯、肉豆蘧酸異丙酯或油酸こ酯；聚こ烯吡咯烷酮；瓊脂；卡拉膠；西黃蓍膠或阿拉伯膠以及石油膏。典型地，這種或這些載體按重量計(jì)將構(gòu)成這些組合物的10%至 99. 9%o根據(jù)本發(fā)明的洗劑包括那些適合涂抹到皮膚或表皮附屬物的洗劑。涂抹到皮膚的洗劑或搽劑也可以包括促進(jìn)皮膚干燥和使皮膚涼爽的藥劑(比如一種醇或丙酮)，和/或加濕劑(例如甘油)；或油(例如椰子油、蓖麻油或落花生油)根據(jù)本發(fā)明的霜?jiǎng)④浉嗷蚝齽┦窃撎崛∥锏陌牍腆w配制品，用于外用。這些配制品可以通過(guò)將細(xì)?；蚍蹱畹奶崛∥飭为?dú)與ー種油狀或非油狀的基質(zhì)混合，或者該提取物在溶液中或懸浮于水性或非水性流體中與以上基質(zhì)混合。該基質(zhì)可以包括烴類，例如硬石蠟、軟石蠟或液體石蠟、甘油、蜂蠟、金屬皂；膠水；自然來(lái)源的油，例如椰子油、杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄欖油；羊毛脂或羊毛脂衍生物，或脂肪酸，例如硬脂酸或油酸，連同一種醇，例如丙ニ醇或聚こニ醇。本發(fā)明的這些組合物能夠按照以下量值包括在局部施用的運(yùn)載體中約0. 001%(W/W)與約90% (W/W)之間、或約1% (W/W)與約50% (W/W)之間，或約1% (W/W)與約40% (W/W)之間，或約 1% (W/W)與約 20% (W/W)之間、或約 0. 01%、0. 5%、1%、2%、3%、4%、
25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%。這些提取物和/或組合物還能以任何形式浸潰到透皮貼劑、硬膏劑和敷料(例如繃帶或水狀膠體敷料)中，例如以液體或者半液體的形式。這些提取物和/或組合物也可以涂布到骨固定裝置、假體或骨水泥上，或者用作骨固定裝置、假體或骨水泥的輔助物。這些提取物和/或組合物也可以用作骨移植填充物或骨替代品的添加劑，例如同種移植骨、輕基磷灰石、wo 11 ano site或磷酸三I丐。在特定環(huán)境下，例如在術(shù)后促進(jìn)骨和軟骨的形成、修復(fù)或再生中，可以適當(dāng)?shù)赝ㄟ^(guò)胃腸外給藥(典型地注射)來(lái)對(duì)這些組合物進(jìn)行給藥。適宜于注射用途的藥物形式包括無(wú)菌水溶液(當(dāng)為水溶性吋)或分散劑，以及用于臨時(shí)配置無(wú)菌注射液的無(wú)菌粉末。該藥劑在制備和儲(chǔ)藏條件下必須是穩(wěn)定的，并且保存時(shí)必須防止微生物如細(xì)菌和真菌的污染作用。該載體可以是ー種溶劑或分散介質(zhì)，包含例如水、こ醇、多元醇(例如甘油、丙ニ醇和液體聚こニ醇等)、它們適當(dāng)?shù)幕旌衔镆约爸参镉?。適宜的流動(dòng)性可以例如通過(guò)使用一種包衣劑(例如卵磷脂)、在分散劑的情形下通過(guò)保持所要求的粒徑，以及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)保持。防止微生物發(fā)揮作用可以通過(guò)不同的抗細(xì)菌和抗真菌劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如對(duì)羥基苯甲酸酷、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在多數(shù)情況下，優(yōu)選包括等滲劑，例如糖類或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長(zhǎng)吸收可以通過(guò)在這些組合物中使用延遲吸收的藥劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，例如單硬脂酸鋁和明膠。無(wú)菌注射液是通過(guò)將活性化合物以所要求的量與以上列舉的各種其他成分按照要求一起摻入到合適的溶劑中、之后過(guò)濾滅菌制備的。通常，分散劑是通過(guò)將不同的滅菌提取物與以上列舉的所要求的其他成分一起摻入到在ー種含有基本分散介質(zhì)的無(wú)菌運(yùn)載體中而制備的。在用于制備滅菌注射液的滅菌粉末的情形下，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，這些技術(shù)從預(yù)先無(wú)菌過(guò)濾的溶液中產(chǎn)生該提取物的粉末以及任何額外的所希望的提取物。本發(fā)明的組合物也能以單位劑量的形式方便地呈現(xiàn)，并且以藥學(xué)領(lǐng)域中熟知的任何方法制成。該方法可以包括將ロ服組合物的多種組分與ー種載體結(jié)合，該載體構(gòu)成了一種或多種輔助成分。一般而言，這些組合物通過(guò)以下方法制備將該ロ服組合物的組分與一種液體載體或細(xì)粒固體載體均勻一致地結(jié)合，然后若有必要將該產(chǎn)品塑形為所希望的組合物。適宜ロ服給藥的組合物能以不連續(xù)的單元(即，劑型)存在，例如明膠膠囊或HPMC膠囊、藥囊或片劑，每個(gè)単元含有ー個(gè)預(yù)定量的組合物的每種組分，該組分為粉末、顆粒、水性液體或非水性液體中的溶液或懸浮液、或水包油液體乳劑或油包水液體乳剤。當(dāng)該組合物被配制成膠囊時(shí)，該ロ服組合物的組分可以與ー種或多種藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)行配制，這些載體例如淀粉、乳糖、微晶纖維素和/或ニ氧化硅。額外的成分可以包括潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂和/或硬脂酸鈣。片劑可以通過(guò)壓片或模印制備，任選地與ー種或多種輔助成分一起。壓制片可以通過(guò)以下方式制備在一臺(tái)合適的機(jī)器中以自由流動(dòng)的形式壓制該ロ服組合物的組分，例如粉末或顆粒，任選地與粘合劑、潤(rùn)滑劑(例如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣)、惰性稀釋劑或表面 活性/分散劑混合。模印片可以通過(guò)在一臺(tái)合適的機(jī)器中模印經(jīng)惰性液體稀釋劑潤(rùn)濕的粉末狀組合物的混合物而制成。這些片劑可以任選地進(jìn)行包衣，例如用腸溶包衣劑，并且可以進(jìn)行配制以便使該組合物在包衣內(nèi)緩慢或受控釋放。本發(fā)明考慮了多種聯(lián)合療法，其中在此說(shuō)明的提取物和組合物與其他合適的藥劑或治療方法共同實(shí)施，這些藥劑或治療方法可以促進(jìn)所希望的治療效果。例如，人們可以尋求將抗生素、抗微生物劑、麻酔剤、鎮(zhèn)痛劑、或其他骨或軟骨的生長(zhǎng)或修復(fù)促進(jìn)劑與在此披露的提取物或組合物聯(lián)合給藥。提及“聯(lián)合用藥”是指對(duì)相同的配置品或兩個(gè)不同的配置品通過(guò)相同或不同的路徑同時(shí)給藥，或按照相同或不同的路徑依次給藥。提及“依次”給藥是指兩類藥劑的給藥時(shí)間差為數(shù)秒鐘、數(shù)分鐘、數(shù)小時(shí)或數(shù)天。這些藥劑能以任意順序給藥。例如，本發(fā)明的實(shí)施方案考慮在該提取物或組合物給藥之前或之后給藥ー種脂質(zhì)或油，例如椰子油。本說(shuō)明書(shū)中所引用的任何現(xiàn)有出版物(或從它派生的信息)或任何已知的問(wèn)題，不是也不應(yīng)被視為承認(rèn)或允許或以任何形式暗示該現(xiàn)有出版物(或從它派生的信息)或任何已知的問(wèn)題構(gòu)成了與本說(shuō)明書(shū)相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域的常見(jiàn)一般性知識(shí)的一部分?，F(xiàn)在參考以下具體實(shí)例說(shuō)明本發(fā)明，這些實(shí)例不應(yīng)當(dāng)被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)例實(shí)例I-濱豇豆、椰子、欖仁和黃槿在椰子油中的組合提取物的制備將椰子油(200mL)加入到濱豇豆的新鮮碎葉(IOOg)以及欖仁的新鮮碎葉(IOOg)中。將該混合物放進(jìn)坩堝中，在100°c下水浴20分鐘。將混合物從熱源移開(kāi)，并立即過(guò)濾和擠壓以提取椰子油。將得到的含有濱豇豆和欖仁提取物的椰子油添加到具有綠色堅(jiān)果的椰子的新鮮碎殼(IOOg)以及黃槿刮下的樹(shù)皮(IOOg)中。讓該混合物靜置沉降4h，然后過(guò)濾擠壓以提取椰子油。然后倒置椰子油，并將其存儲(chǔ)于20°C以下，直到椰子油凝固。混合物中任何剰余的水分或固體通過(guò)從固化的椰子油中傾析而移除。然后將椰子油在大約56°C的熱水浴中加熱，并過(guò)濾。所得的濾液含有濱豇豆、椰子、欖仁和黃槿的組合提取物。
實(shí)例2-黃槿提取物的制備2. I椰子油中的黃槿提取物將黃槿的新鮮碎樹(shù)皮(IOOg)浸泡在椰子油(IOOmL)中。通過(guò)冷壓黃槿與椰子油的混合物，或加熱該混合物來(lái)制備提取物。冷壓是通過(guò)將黃槿與椰子油混合物放入一個(gè)新咖啡柱塞中，讓混合物靜置沉降lh，然后下壓柱塞從而提取油。將該混合物再靜置沉降5min，并再次下壓柱塞以釋放更多的油。將該過(guò)程重復(fù)5次，直到壓不出油。當(dāng)通過(guò)加熱制備提取物時(shí)，將黃槿與椰子油混合物在坩堝中在100°C下水浴中加熱20min，從熱源移開(kāi)，然后立即過(guò)濾和壓榨以提取椰子油。冷壓或加熱以及過(guò)濾之后在提取物中剰余的任何水分或固體通過(guò)以下方法被移除倒置該椰子油提取物，并將其存儲(chǔ)在20°C以下，直到椰子油凝固，然后傾析凝固的椰子油，或在分液漏斗中傾析。2. 2こ醇提取后的椰子油中的黃槿提取物將黃槿的新鮮碎樹(shù)皮(IOOOg)浸沒(méi)在95% -100%的こ醇(2000mL)中，并讓其浸 泡6h。除去こ醇，在第二份こ醇(2000mL)中將黃槿再浸泡6h。將所得的こ醇提取物加到椰子油(250mL)中。一半以上こ醇的體積通過(guò)在こ醇沸點(diǎn)以上加熱而去除。然后按照以下方法提取椰子油在傾析器中靜置至少2h之后從溶液中傾析；或者倒置該椰子油提取物，并將其存儲(chǔ)在20°C以下，直到椰子油凝固，然后傾析凝固的椰子油。2. 3こ醇和烴提取后的椰子油中的黃槿提取物把黃槿的新鮮碎樹(shù)皮(IOOOg)浸沒(méi)在95% -100%的こ醇(2000mL)中，并讓其浸泡6h。然后除去こ醇，將黃槿在第二份こ醇(2000mL)中再浸泡6h。將得到的こ醇溶液與己烷、戊烷、甲基丁烷或ー個(gè)當(dāng)量的烴或氟/氯/溴烴(250mL) 一起攪動(dòng)。在傾析器中靜置至少2h之后，從溶液中傾析烴層和油性泡沫層，或者將こ醇溶液從95%稀釋到ー個(gè)較低的濃度，通常為但不一定是50%的こ醇，然后在各層沉降后傾析。將水(250mL)或醇(250mL)加入到提取到的烴層。向其中加入椰子油(250mL)，攪動(dòng)該混合物并允許其沉降。將該混合物加熱到該烴的沸點(diǎn)，除去該烴。2. 4こ醇提取后的椰子油中的黃槿提取物將黃槿的新鮮碎樹(shù)皮(IOOOg)浸沒(méi)在95% -100%的こ醇(2000mL)中，并浸泡6h。然后除去こ醇，將濱豇豆在第二份こ醇(2000mL)中再浸泡6h。將得到的こ醇提取物與椰子油(250mL) —起攪動(dòng)。在傾析器中靜置至少2h之后，從溶液中傾析出該烴；或者將こ醇溶液從95%稀釋到ー個(gè)較低的濃度，通常為但不一定是50%的こ醇，然后在各層沉降后傾祈。當(dāng)混合物攪動(dòng)和沉降時(shí)，通過(guò)將ー種低沸點(diǎn)烴加入到該混合物中可以促進(jìn)椰子油的傾析。然后倒置椰子油，并將其存儲(chǔ)在20°C以下，直到椰子油凝固，或者通過(guò)在分離器中傾析。實(shí)例3-黃槿的單個(gè)提取物對(duì)于皮膚的作用對(duì)在實(shí)例2中所說(shuō)明而制備的提取物對(duì)于皮膚的活性進(jìn)行評(píng)估。日劑量為lmL椰子油中的黃槿提取物(實(shí)例2. I)和ImLこ醇中的黃槿提取物(實(shí)例2. 2)。將這些提取物局部涂抹到10-14周齡雌性大鼠背部的上皮表面。對(duì)照組為每天用ImL椰子油治療或不治療的10-14周齡雌性大鼠。圖IA至ID示出了經(jīng)以下處理7天時(shí)的皮膚組織學(xué)未經(jīng)治療的對(duì)照組(IA);每天涂抹椰子油(IB);こ醇中的黃槿提取物制劑(IC);以及こ醇提取后的椰子油(ID)。這些組織學(xué)剖面圖表明，該提取物在こ醇中的活性有限，但是椰子油中的提取物誘導(dǎo)上皮肥大以及特定毛囊中的上皮附屬物。對(duì)實(shí)例I和2. 2中所述而制備的提取物對(duì)皮膚的活性進(jìn)行評(píng)估。將日劑量ImL的提取物局部涂抹到12周齡雌性新西蘭兔背部的上皮表面。對(duì)照物是12周齡雌性新西蘭兔的未經(jīng)治療的皮膚。圖2A至2F示出了經(jīng)以下處理7天時(shí)的皮膚組織學(xué)未治療的對(duì)照物(2A和B)；以及每天涂抹如實(shí)例I所述而制備的椰子油中的濱豇豆、椰子、欖仁和黃槿組合提取物(2C和D);以及如實(shí)例2. 2所述而制備的椰子油中的黃槿(2E和F)。這些組織學(xué)剖面圖表明，這些提取物誘導(dǎo)了上皮肥大以及特定毛囊中的上皮附屬物。實(shí)例4-治療雌激素缺乏骨和非雌激素缺乏骨的 骨折進(jìn)行了ー項(xiàng)研究來(lái)評(píng)估如實(shí)例2. I所述制備的黃槿提取物對(duì)于雌激素缺乏和非雌激素缺乏大鼠的骨折修復(fù)的作用。在這項(xiàng)研究中，將日劑量ImL的提取物局部涂抹到18個(gè)月齡雌激素缺乏(在6周齡時(shí)摘除卵巣)的大鼠以及18個(gè)月齡卵巢完好(在6周齡時(shí)進(jìn)行了對(duì)照手木，并讓大鼠恢復(fù))的大鼠的上皮表面，此前通過(guò)截骨術(shù)造成股骨骨折并且通過(guò)內(nèi)固定進(jìn)行手術(shù)修復(fù)。將該提取物毎日涂抹到試驗(yàn)動(dòng)物上，共計(jì)3周。對(duì)照動(dòng)物是沒(méi)有局部涂抹提取物的18個(gè)月齡雌激素缺乏(在6周齡時(shí)摘除卵巣)的大鼠以及18月齡卵巢完整的大鼠。在3周時(shí)評(píng)估這些動(dòng)物的組織學(xué)，特別要注意愈合骨折中軟骨以及新骨的形成。圖3A至3H示出了骨折部位的組織學(xué)。結(jié)果表明，治療組中沿軟骨帽的廣泛的新軟骨生長(zhǎng)以及新骨形成，特別值得注意的是發(fā)生在雌激素缺乏骨中的量值。圖4是ー個(gè)柱狀圖，示出了未經(jīng)治療的雌激素缺乏大鼠(Ovx對(duì)照)與經(jīng)治療的雌激素缺乏大鼠(Ovx rx)的骨折部位的組織學(xué)評(píng)分。為了確定總體組織學(xué)得分，對(duì)以下骨折愈合和組織響應(yīng)參數(shù)進(jìn)行評(píng)分愈傷組織形成、骨愈合、骨髄變化以及皮質(zhì)重塑。每個(gè)參數(shù)的評(píng)分為從0(沒(méi)有形成愈傷組織；骨折中沒(méi)有新骨；纖維組織或紅色；并且沒(méi)有重塑)到3 (整個(gè)缺損形成了完整的愈傷組織；全骨橋愈合；成人型脂髓；以及完全重塑皮質(zhì))，其中評(píng)分I表示輕度愈合(< 50 % )，并且評(píng)分2表示中度愈合(> 50 %，但小于完全骨折愈合或組織反應(yīng))。3周后，與未治療的雌激素缺乏的大鼠相比，經(jīng)治療的雌激素缺乏的大鼠的骨折部位的骨折愈合和組織反應(yīng)的組織學(xué)總評(píng)分顯著更高。實(shí)例5-骨折治療進(jìn)行了ー項(xiàng)研究以評(píng)估如實(shí)例I和2. I所述制備的黃槿提取物對(duì)骨折愈合的作用。在該研究中，將日劑量ImL的提取物局部涂抹到12周齡的新西蘭白兔的上皮表面，此前用截骨術(shù)造成20mm尺骨(包括骨膜)的手術(shù)性缺損并且沒(méi)有移植物或替代性填充物。將該提取物每天涂抹這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，共計(jì)I周。對(duì)照動(dòng)物為沒(méi)有局部涂抹該提取物的12周齡新西蘭白免。在I周時(shí)，評(píng)估這些動(dòng)物的放射學(xué)和組織學(xué)數(shù)據(jù)，特別注意軟骨和新骨形成。圖5A至是骨的放射照片，而圖6A至6F以及7A至7D示出了該骨折部位的骨缺損的組織學(xué)圖像。這些圖表明黃槿提取物對(duì)骨折愈合的作用。七天后，與未經(jīng)治療或?qū)φ罩委煵糠窒啾?，在骨折部位明顯有更多的骨形成、新軟骨形成和血管分布。圖8是ー個(gè)骨生長(zhǎng)評(píng)分的柱狀圖，該圖示出了使用基于骨或軟骨占用空間百分比的愈合評(píng)分定義來(lái)評(píng)價(jià)的缺損的骨愈合。使用了以下的評(píng)分系統(tǒng)0 =無(wú)可見(jiàn)骨；1 =最小(1%至20% )新骨生長(zhǎng)且無(wú)軟骨；2 =輕度(1-20% )軟骨，具有新骨生長(zhǎng)；3 =中度(20%至40% )軟骨和骨生長(zhǎng)；4 =明顯(60%至80% )軟骨和骨生長(zhǎng)；5 =缺損完全充滿新的骨和軟骨；6 =缺損填滿新骨而沒(méi)有軟骨；7 =皮質(zhì)骨取代編織骨；并且8 =新的骨髄腔形成。7天后，與在未經(jīng)治療或?qū)φ罩委煵糠种杏盲炒贾械闹虚g密度黃槿沉淀(HeA中間)、こ醇中的黃槿(eAこ醇)、或こ醇提取后的椰子油中的濱豇豆、椰子和欖仁的組合提取物(eNPKo)進(jìn)行治療的骨折部位相比，用こ醇提取后的椰子油中的黃槿(eAo)所治療的骨折部位明顯有更多骨形成。實(shí)例6-脊柱融合自體移植后的骨形成進(jìn)行了ー項(xiàng)研究以評(píng)估如實(shí)例2. 4中所述制備的黃槿提取物對(duì)骨折修復(fù)的作用。在這項(xiàng)研究中，將日劑量Iml的提取物局部涂抹到12周齡的新西蘭白兔 的上皮表面，此前將兔子麻醉并使用從髂嵴收獲的自體移植物進(jìn)行雙側(cè)單水平后外側(cè)融合。將提取物(5mL)每天涂抹到這些試驗(yàn)動(dòng)物上，共5天，然后每周兩次直到處死。對(duì)照動(dòng)物為沒(méi)有局部涂抹該提取物的12周齡的新西蘭白兔。圖9A至9E示出了經(jīng)治療以及未經(jīng)治療的對(duì)照動(dòng)物其脊柱的X射線圖和CT掃描圖。這些圖像顯示了木槿的提取物對(duì)自體移植部位周圍骨生長(zhǎng)的作用。與未經(jīng)治療或?qū)φ罩委煹墓钦巯啾?，僅七天之后骨折部位就有了更多的骨形成、新的軟骨形成以及更大的血
管供應(yīng)。圖IOA和IOB顯示在6周時(shí)的脊椎組織學(xué)。圖IOA示出了在6周時(shí)對(duì)照自體移植的組織學(xué)，用蘇木精和伊紅染色覆蓋整個(gè)脊柱融合體。在具有良好形成的髓隙與致密皮質(zhì)骨(A)的融合體的每一端可以看出橫突，并且與該橫突相鄰的是少量的軟骨(B)。自體移植的骨片仍然可見(jiàn)并且是壞死的，有腔隙損失(C)。該融合體的中心主要是纖維組織(D)以及一些新的編織骨(E)。圖IOB示出了在6周時(shí)經(jīng)治療的自體移植物的組織學(xué)，用蘇木精和伊紅染色覆蓋整個(gè)脊柱融合體。在具有良好形成的髓隙和致密皮質(zhì)骨(A)的融合體的每一端可以看出橫突，并且與該橫突相鄰的是皮質(zhì)的新骨(B)。自體移植物的骨片幾乎不可見(jiàn)，并且大多被吸收和替換(C)。該融合體的中心主要是軟骨(D)、新髓隙(E)和一些新的編織骨(F)。圖11示出了與在12周未經(jīng)治療的對(duì)照物相比，在8周經(jīng)治療的自體移植物的機(jī)械測(cè)試結(jié)果。在所有脊椎中，手術(shù)切斷韌帶和椎間盤(pán)，留下橫突脊柱融合體作為椎體之間的橋梁。施加荷載，直到該融合體斷裂。對(duì)每個(gè)樣本記錄峰荷。圖11所示的數(shù)據(jù)表明，8周治療組至少與12周對(duì)照ー樣強(qiáng)，并且具有更大骨強(qiáng)度的趨勢(shì)。實(shí)例7-分析黃槿提取物開(kāi)發(fā)了ー種使用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析來(lái)研究這些提取物組合物的方法。例如，對(duì)こ醇和烴提取后的椰子油中的黃槿提取物(實(shí)例2. 3)和該烴中間層進(jìn)行GC-MS分析。圖12A示出了椰子油中的黃槿提取物的質(zhì)譜圖，主峰在30. 99min。該中間層也包含在30. 99min的峰(圖12B)，然而，該峰比椰子油中的黃槿提取物觀察到的峰至少小7倍。概括而言，椰子油中的黃槿提取物的質(zhì)譜圖中的主峰在30. 99、35. 47、37. 48、39. 56、42. 85、43. 28,49. 04,52. 51,55. 97和58. 54min。大多數(shù)次峰對(duì)應(yīng)于在椰子油中發(fā)現(xiàn)的脂肪酸こ酷。
權(quán)利要求
1.黃槿的一種生物活性提取物。
2.如權(quán)利要求I所述的提取物，進(jìn)一步包括濱豇豆、椰子、或欖仁中一種或多種的一種生物活性提取物。
3.如權(quán)利要求I或2所述的提取物，其中該提取物衍生自樹(shù)皮、葉片、藤蔓、豆子、外殼或堅(jiān)果中的一種或多種。
4.如權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的提取物，其中該黃槿提取物衍生自樹(shù)皮。
5.如權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的提取物，其中該提取物是使用一種基于植物的油、一種烴和/或一種醇制備的，和/或包含一種基于植物的油、一種烴和/或一種醇。
6.如權(quán)利要求5所述的提取物，其中該基于植物的油衍生自植物種子或果實(shí)。
7.如權(quán)利要求5所述的提取物，其中該基于植物的油衍生自椰子。
8.如權(quán)利要求7所述的提取物，其中該椰子油是初榨椰子油、精煉椰子油、氫化椰子油或分餾椰子油。
9.一種組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的提取物以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，用于治療骨或軟骨損傷和/或促進(jìn)骨或軟骨的形成、修復(fù)或再生。
11.如權(quán)利要求9或權(quán)利要求10所述的組合物，其中該組合物局部給藥或胃腸外給藥。
12.如權(quán)利要求11所述的組合物，其中該胃腸外給藥是通過(guò)骨內(nèi)輸液或鞘內(nèi)注射進(jìn)行的。
13.一種用于在受試者體內(nèi)促進(jìn)骨或軟骨的形成、修復(fù)或再生的方法，該方法包括向有此需要的受試者給予一個(gè)有效量的如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的提取物、或如權(quán)利要求9所述的組合物、或在所述提取物或組合物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中該受試者患有骨和軟骨損傷、缺損或疾病，或者可能易感染或易誘發(fā)骨或軟骨損傷、缺損或疾病。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該損傷是骨折。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中該疾病是退行性骨病。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其中該退行性骨病是骨質(zhì)疏松。
18.如權(quán)利要求13至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中該受試者正經(jīng)歷或已經(jīng)歷骨或軟骨的移植操作。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中該移植是骨骼融合。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中該骨骼融合是脊柱融合。
21.如權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些成骨細(xì)胞或成骨祖細(xì)胞是自然產(chǎn)生的。
22.如權(quán)利要求13至20中任一項(xiàng)所述的方法，其中這些成骨細(xì)胞或成骨祖細(xì)胞是異基因的。
23.一種用于治療受試者體內(nèi)骨或軟骨的損傷、缺損或疾病的方法，該方法包括向該受試者給予一個(gè)有效量的如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的提取物、或如權(quán)利要求9所述的組合物、或在所述提取物或組合物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該損傷是骨折。
25.如權(quán)利要求23所述的方法，其中該疾病是退行性骨病。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中該退行性骨病是骨質(zhì)疏松。
27.如權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中該提取物或組合物提高了該損傷或疾病的愈合率或愈合度。
28.如權(quán)利要求23至26中任一項(xiàng)所述的方法，其中該提取物或組合物促進(jìn)了骨或軟骨的形成、修復(fù)或再生。
29.一種用于促進(jìn)骨或軟骨移植物或可植入裝置周圍的骨或軟骨生長(zhǎng)的方法，該方法包括在移植或植入操作之前、過(guò)程中或之后向受試者給予一個(gè)有效量的如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的提取物、或如權(quán)利要求9所述的組合物、或在所述提取物或組合物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該移植物是同體移植物或異體移植物。
31.如權(quán)利要求29或權(quán)利要求30所述的方法，其中該移植步驟用于修復(fù)骨折、或用于骨骼融合目的。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中該骨骼融合是脊柱融合。
33.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該可植入裝置是一種骨固定裝置或一種假體。
34.如權(quán)利要求29所述的方法，其中該提取物、該組合物、或這些成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片被涂在該假體上，用作該骨固定裝置的一種輔助物，或者用作骨水泥的一種輔助物用來(lái)固定該假體或骨固定裝置。
35.如權(quán)利要求13至34中任一項(xiàng)所述的方法，其中向該受試者給藥是在關(guān)節(jié)鏡或開(kāi)放手術(shù)操作時(shí)進(jìn)行的。
36.一種用于骨形成或骨生長(zhǎng)的方法，該方法包括在一個(gè)有效量的如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的提取物、或權(quán)利要求9所述組合物的存在下，在適宜誘導(dǎo)骨形成或骨生長(zhǎng)的條件下孵育成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片。
37.如權(quán)利要求13至36中任一項(xiàng)所述的方法，其中椰子油在給予該提取物或組合物之前或之后給予的。
38.如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的生物活性提取物、或在所述提取物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片的用途，用于制造一種促進(jìn)受試者體內(nèi)骨或軟骨的形成、修復(fù)或再生的藥物或藥物組合物。
39.如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的生物活性提取物、或在所述提取物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片的用途，用于制造一種治療受試者體內(nèi)骨或軟骨損傷、缺損或疾病的藥物或藥物組合物。
40.如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的生物活性提取物、或在所述提取物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片的用途，用于制造一種藥物或藥物組合物用來(lái)促進(jìn)一種骨或軟骨移植物或可植入裝置周圍的骨或軟骨生長(zhǎng)。
41.如權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的生物活性提取物、或在所述提取物的存在下培養(yǎng)的成骨細(xì)胞、成骨祖細(xì)胞或骨段或骨片的用途，用于制造一種用于骨形成或骨生長(zhǎng)的藥物或藥物組合物。
全文摘要
在此說(shuō)明了黃槿的生物活性提取物以及包含該提取物的多種組合物。本發(fā)明還提供了該提取物和這些組合物的治療用途，特別是用于促進(jìn)骨和軟骨損傷的愈合以及促進(jìn)骨和軟骨的形成。
文檔編號(hào)A61P19/08GK102770148SQ201080063286
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者威廉·沃爾什, 格拉哈姆·馬西森 申請(qǐng)人:庫(kù)克島醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司