專利名稱：用于預(yù)防或治療宮頸癌的、包含人乳頭瘤病毒變形體及免疫增強(qiáng)劑的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療宮頸癌的、包含人乳頭瘤病毒ihumanpapillomavirus ; HPV)變形體及免疫增強(qiáng)劑的組合物。更具體地，融合蛋白通過誘導(dǎo)HPV16和18型抗原特異性免疫應(yīng)答治療由HPV引起的腫瘤。所述融合蛋白包括融合多肽
信號(hào)肽及免疫增強(qiáng)肽，所述融合多肽被重組，以使作為人乳頭瘤病毒16和18型的抗原E6、E7的三維結(jié)構(gòu)變形。
背景技術(shù)：
眾所周知，宮頸癌{cervical cancer)是由于受人乳頭瘤病毒16和18型等的高危型人乳頭瘤病毒的感染而引起的疾病Hausen, H et al.Biochem Biophys Acta1996, 1288; F55-F78，Mark H et al.J Natl Cancer Inst 1993, 85;沒姑-沒份)。在HPV蛋白中E6、E7蛋白對(duì)宮頸癌的發(fā)病起主要作用，而且已確認(rèn)在宮頸癌患者的腫瘤組織中表達(dá)99%,從而成為制備用于治療和預(yù)防宮頸癌的疫苗的主要祀物質(zhì)(ra/ Knebel Doeberitzet al.1nt.J.Cancer 1992, 51;與已知用作腫瘤抑制蛋白p53結(jié)合,通過促進(jìn)P53的分解，用細(xì)胞凋亡^poptosis)途徑阻止細(xì)胞周期的進(jìn)行。E7與作為腫瘤抑制因子的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白pRb {retinoblastoma /Troiei/ )結(jié)合,通過使之失活并促進(jìn)其分解，誘導(dǎo)細(xì)胞周期進(jìn)入 S 期{Cobrinik et al., Trends Biochem Sci 1992，17:312-5、。然而，為治療宮頸癌，在使用通過同時(shí)表達(dá)HPV16的E6、E7蛋白的核酸序列的組合物的臨床試驗(yàn)中，其療效并不顯著{Garcia F et al.0bstet Gynecol 2004, 103;317-326)。此結(jié)果表明，僅施用HPV抗原是無法發(fā)生足以治療或抑制宮頸癌的抗原特異性免疫應(yīng)答的。因此，為治療子宮癌，需增強(qiáng)E6、E7的免疫原性(Jmmunogenicity),并且需消除所述蛋白的致癌能力。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的目的在于，提供用于預(yù)防或治療由HPV引起的疾病的新型融合蛋白及編碼所述融合蛋白的多核苷酸所述融合蛋白可抑制HPV E6、E7蛋白的致癌能力并展現(xiàn)增強(qiáng)的免疫原性。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供表達(dá)所述融合蛋白的重組載體meter)、包含所述載體的宿主細(xì)胞以及用所述宿主細(xì)胞表達(dá)融合蛋白的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供用所述融合蛋白的、用于預(yù)防或治療由HPV引起的疾病的組合物。

本發(fā)明的另一個(gè)目的在于，提供用所述組合物的、用于預(yù)防或治療由HPV引起的疾病的方法。
技術(shù)方案
為達(dá)到上述目的，一方面，本發(fā)明提供融合蛋白，該融合蛋白包括:融合多肽，即三維結(jié)構(gòu)變形的、源于人乳頭瘤病毒16和18型并包含SEQ ID NO:1氨基酸序列的E6、E7 ;用于分泌所述融合多肽的信號(hào)肽；和免疫增強(qiáng)肽。另一方面，本發(fā)明提供多核苷酸，該多核苷酸用于編碼本發(fā)明的融合蛋白。另一方面，本發(fā)明提供重組載體，該重組載體包括本發(fā)明的多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞由本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化而成。

另一方面，本發(fā)明提供用于表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的方法，該方法是通過培養(yǎng)本發(fā)明的經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞完成的。另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療由人乳頭瘤病毒引起的疾病的組合物，該組合物包括作為活性成分的、選自本發(fā)明的融合蛋白、由表達(dá)所述融合蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化而成的宿主細(xì)胞及其均衆(zhòng)(homogenate)中的一種或多種的物質(zhì)。另一方面，本發(fā)明提供用于預(yù)防或治療由人乳頭瘤病毒引起的疾病的方法，該方法包括向需要者施用有效劑量的本發(fā)明的組合物的步驟。有益.效果
本發(fā)明所制備的融合蛋白通過誘導(dǎo)高的HPV16和18型抗原特異性免疫應(yīng)答來治療由HPV引起的腫瘤，所述融合蛋白包括為改變?cè)从贖PV16和18型E6、E7蛋白的三維結(jié)構(gòu)而被重組的融合蛋白、用于向細(xì)胞外分泌該融合蛋白的信號(hào)肽及免疫增強(qiáng)肽。


圖1展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過本發(fā)明的GX-188E治療后展示的HPV16的E6特異性⑶8+ T細(xì)胞應(yīng)答的圖。圖2展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過本發(fā)明的GX-188E治療后展示的HPV16的E7特異性⑶8+ T細(xì)胞應(yīng)答的圖。圖3展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過本發(fā)明的GX-188E治療后展示的HPV18的E6特異性⑶8+ T細(xì)胞應(yīng)答的圖。圖4展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過本發(fā)明的GX-188E治療后展示的HPV18的E7特異性⑶8+ T細(xì)胞應(yīng)答的圖。圖5展示了對(duì)抗癌模型中的C57BL/6小鼠皮下注射腫瘤細(xì)胞株TC-1并經(jīng)過本發(fā)明的GX-188E治療后展示的抗癌效果的圖。
具體實(shí)施例方式下面將詳細(xì)地說明本發(fā)明的內(nèi)容。本發(fā)明涉及融合蛋白，該融合蛋白包括:源于人乳頭瘤病毒16及18型并包含SEQID NO:1氨基酸序列的三維結(jié)構(gòu)變形的E6、E7融合多肽；用于分泌所述融合多肽的信號(hào)肽；和免疫增強(qiáng)肽。本發(fā)明的融合蛋白包括融合多肽，該融合多肽被重組以使源于人乳頭瘤病毒16及18型的E6、E7的三維結(jié)構(gòu)變形。更具體地，所述融合多肽由源于人乳頭瘤病毒16型的E6蛋白的第I 85位的氨基酸、E7蛋白的第I 65位的氨基酸、E6蛋白的第70 158位的氨基酸、E7蛋白的第5(Γ98位的氨基酸和源于人乳頭瘤病毒18型的Ε6蛋白的第1 85位的氨基酸、Ε7蛋白的第廣65位氨基酸、Ε6蛋白的第7(Γ158位的氨基酸、Ε7蛋白的第5(Tl05位的氨基酸組成。最為具體地，融合多肽可包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。此外，所述信號(hào)肽指包括約2(Γ30個(gè)氨基酸的肽，所述肽能將在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白，尤其將包含Ε6、Ε7融合多肽的蛋白分泌至細(xì)胞外。而且，用于編碼所述肽的核酸序列被稱為“分泌信號(hào)序列”。由于本發(fā)明的Ε6、Ε7融合多肽是在受病毒感染的細(xì)胞的核內(nèi)表達(dá)的蛋白/TTOtei/7)，其免疫力弱。因此，由分泌信號(hào)序列表達(dá)的信號(hào)肽誘導(dǎo)三維結(jié)構(gòu)變形的E6、E7分泌至細(xì)胞外,從而增強(qiáng)抗原特異性體液免疫應(yīng)答GtoffioraTr immune,(95/70/75(9)及細(xì)胞免疫應(yīng)答(ceBw/ar immune response ) 所述信號(hào)肽可使用包括哺乳動(dòng)物等的高等真核細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)肽，如tPA(組織型纖溶酶原激活物)、HSV gDs，或可使用生長激素等的分泌信號(hào)序列。優(yōu)選地，可使用tPA。更優(yōu)選地，可包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列。此外，免疫增強(qiáng)肽指激活與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞(如，樹突狀細(xì)胞等)以增強(qiáng)免疫應(yīng)答的妝。

所述免疫增強(qiáng)肽可使用⑶40配體、Flt3配體(fms樣酪氨酸激酶3配體)、鞭毛蛋白或0X40等。優(yōu)選地，可使用Flt3配體。所述Flt3配體是能夠誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞(dendriticcell, DC)的增殖與成熟的因子，經(jīng)抗原可增強(qiáng)免疫應(yīng)答，而且在與腫瘤抗原融合時(shí)具有能非常有效地減少腫瘤的效果。更優(yōu)選地，所述Flt3配體包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。另一方面，本發(fā)明涉及用于編碼本發(fā)明的融合蛋白的多核苷酸。所述多核苷酸用于編碼本發(fā)明的融合蛋白，所述E6、E7融合多肽可由SEQ ID NO:4的堿基序列編碼而成，但不限于此。此外，所述信號(hào)肽可由SEQ ID NO:5的堿基序列編碼而成，但不限于此。此外，所述免疫增強(qiáng)肽可由SEQ ID NO:6的堿基序列編碼而成，但不限于此。此外，本發(fā)明的多核苷酸可通過化學(xué)合成方法或遺傳工程技術(shù)而制備。化學(xué)合成方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，可使用任何方法。此外，也可通過委托商業(yè)核酸合成及制造商購買。當(dāng)通過遺傳工程技術(shù)制備時(shí)，例如，通過分別制得用于編碼已知的E6和E7融合多肽、信號(hào)肽和免疫增強(qiáng)肽的核酸片段，連接這些片段以符合讀框來制備。所述制得核酸片段的方法為本領(lǐng)域已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可通過適當(dāng)?shù)南拗泼溉菀讓⑵溥B接。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，將公開通過化學(xué)合成法制備的方法。另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的重組載體。在本發(fā)明中，“載體”指包括外源DNA的遺傳結(jié)構(gòu)，所述外源DNA被插入于編碼多肽的基因組中。本發(fā)明所述的載體為將分泌信號(hào)序列、編碼人乳頭瘤病毒的三維結(jié)構(gòu)變形的E6和E7融合多肽的核酸序列以及編碼免疫增強(qiáng)肽的核酸序列等被插入至基因組中的載體，例如，包括質(zhì)粒載體rector)、粘粒載體(cioswit/ vector)、曬菌體(Aacteriophage vector )、酵母載體(尺狀t vector )或如腺病毒載體iadenoviralvec tor )、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(re tro viral vec tor )和腺伴隨病毒載體(Mdmo—associ a tedviral Fecior)的病毒載體vector)0所述分泌信號(hào)序列為能編碼肽的核酸序列，所述肽能將在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的腫瘤抗原分泌至細(xì)胞外并使其被免疫細(xì)胞識(shí)別，其包括如tPA、HSV gDs或生長激素的分泌信號(hào)序列。優(yōu)選地，可以使用哺乳動(dòng)物的高等真核細(xì)胞中所用的分泌信號(hào)序列。更優(yōu)選地，可使用tPA(組織型纖溶酶原激活物)。最優(yōu)選地，所述分泌信號(hào)序列可包含SEQ ID NO:5的堿基序列。此外，本發(fā)明的分泌信號(hào)序列可用在宿主細(xì)胞中具有高表達(dá)頻率的遺傳密碼子替換。此外，編碼所述免疫增強(qiáng)肽的核酸序列指編碼通過激活與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞來增強(qiáng)免疫應(yīng)答的肽的核酸序列。所述免疫增強(qiáng)肽可使用CD40配體、Flt3配體、鞭毛蛋白(.Flagellin )或0X40等。更優(yōu)選地，免疫增強(qiáng)肽可使用Flt3配體。此外，編碼本發(fā)明的免疫增強(qiáng)肽的核酸序列可用在宿主細(xì)胞中具有高表達(dá)頻率的遺傳密碼子替換。此外，本發(fā)明的重組載體所包含的所述多核苷酸可用在宿主細(xì)胞中具有高表達(dá)頻率的遺傳密碼子替換。本發(fā)明中所表達(dá)的“用在宿主細(xì)胞中具有高表達(dá)頻率的遺傳密碼子替換”或“遺傳密碼子最優(yōu)化”指，當(dāng)宿主細(xì)胞內(nèi)的DNA轉(zhuǎn)錄或翻譯成蛋白時(shí)，根據(jù)宿主中存在的具有更高偏愛性的遺傳密碼子，在指示氨基酸的遺傳密碼子中用更高偏愛性的遺傳密碼子替多核苷酸遺傳密碼子，從而增強(qiáng)由核酸編碼的氨基酸或蛋白的表達(dá)效率。其中，“宿主細(xì)胞”包括原核或真核細(xì)胞，真核細(xì)胞不僅指包括真菌、酵母等的低等真核細(xì)胞，還指包括哺乳動(dòng)物等的高等真核細(xì)胞。本發(fā)明的重組載體包括用編碼所述融合蛋白的核酸，該核酸形式是在宿主細(xì)胞中適于表達(dá)編碼本發(fā)明的融合蛋白的核酸的形式。即，本發(fā)明的重組載體包括一個(gè)或多個(gè)基于宿主細(xì)胞選取的用于表達(dá)的調(diào)控序列，該序列與要表達(dá)的核酸序列可操作地鏈接。

“可操作地鏈接”指，目標(biāo)核苷酸序列(例如，在體外轉(zhuǎn)錄/翻譯系統(tǒng)中或在宿主細(xì)胞中)以合適方式與所述調(diào)控序列鏈接，以完成其表達(dá)。術(shù)語“調(diào)控序列”包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子及其他調(diào)控元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))。調(diào)控序列包括在眾多宿主細(xì)胞中指示組成型表達(dá)目標(biāo)核酸的調(diào)控序列，以及在特定的宿主細(xì)胞中指示表達(dá)核酸的調(diào)控序列(例如，組織特異性調(diào)控序列)。本領(lǐng)域技術(shù)人員能理解表達(dá)載體的設(shè)計(jì)可根據(jù)要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇及目標(biāo)蛋白表達(dá)水平等的因素而改變。本發(fā)明的表達(dá)載體可被弓I入宿主細(xì)胞中以表達(dá)所述融合蛋白。此外，本發(fā)明的載體可通過標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)制備，該標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)包括，如平端和粘端連接、通過用限制酶的處理提供適當(dāng)?shù)哪┒?、為防止不?dāng)結(jié)合通過堿性磷酸酶處理的磷酸基的去除以及通過T4 DNA鏈接酶的酶鏈接等。通過化學(xué)合成方法或遺傳工程技術(shù)制得的用于編碼信號(hào)肽、人乳頭瘤病毒的E6和E7融合多肽和免疫增強(qiáng)肽的各DNA可與包含適合的調(diào)控序列的載體進(jìn)行重組，以提供本發(fā)明的載體。包含所述調(diào)控序列的載體可通過商業(yè)方法進(jìn)行購買或制備，本發(fā)明制備并使用pGX27，pGX27用作制備DNA疫苗的載體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述重組載體可用于制備細(xì)胞株來制造本發(fā)明的融合蛋白，用作基因治療的用于基因轉(zhuǎn)移的載體，或用作向受試者施用于的藥物活性成分。在另一方面，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化為載體的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞的種類如上所述。轉(zhuǎn)化可用通過將核酸導(dǎo)入有機(jī)體、細(xì)胞、組織或器官內(nèi)的已知的方法，根據(jù)宿主細(xì)胞在本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的范圍內(nèi)選擇適合的技術(shù)實(shí)施所述方法。所述方法包括電穿孔法Qelectropora tiο/ )、原生質(zhì)體融合、磷酸韓(CaPO4)沉淀、氯化韓(CaCl2)沉淀、用碳化娃纖維的攪拌、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、聚乙二醇，硫酸葡聚糖、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Uifofectamin )等,但不限于此。在另一方面，本發(fā)明涉及用于表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白的方法，即通過培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞來完成。通過在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)已轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，或通過培養(yǎng)導(dǎo)入至任何動(dòng)物體內(nèi)的所轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，可容易地表達(dá)并大量制備本發(fā)明的融合蛋白。另一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療由個(gè)體人乳頭瘤病毒引發(fā)的疾病的組合物，該組合物包括選自本發(fā)明的融合蛋白、由用于表達(dá)所述融合蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞及其均漿中的一種或多種的物質(zhì)。在本發(fā)明中，“受試者”包括人、猴、鼠、豬、牛及兔子等的哺乳動(dòng)物，但不限于此。此外，由所述病毒引發(fā)的疾病可包括宮頸癌、肝門與生殖器疣warts )、贊撫(verruca )等。此外，本發(fā)明的組合物可包含藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯樹膠、藻酸鹽、明膠、磷酸鈣、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羥基苯甲酸酯、丙基羥基苯甲酸酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油等。進(jìn)一步，該組合物還可包含潤滑劑、潤濕劑、調(diào)味劑、乳化劑和防腐劑
坐寸ο本發(fā)明的組合物可通過如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、口服、經(jīng)皮、粘膜內(nèi)、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)或皮下等的任何途徑向受試者給藥，但不限于此。本發(fā)明的組合物可通過將組合物施用至體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后將所培養(yǎng)的細(xì)胞向受試者體內(nèi)施用，從而間接向受試者用藥。本發(fā)明可進(jìn)行全身或局部給藥。 本發(fā)明的組合物可制成用于口服或注射如腸外的劑型，所述口服劑型包括顆粒齊U、粉劑、液體、片劑、膠囊劑或干糖漿劑，但不限于此。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物的劑型可以為液體或注射液劑型。本發(fā)明的作為活性成分的融合蛋白或重組表達(dá)載體的有效劑量可以為約0.05 500mg/kg，優(yōu)選為0.5 50mg/kg，以單次劑量或分批劑量為準(zhǔn)。然而，所述給藥劑量應(yīng)由所需治療的疾病的狀況、患者的年齡及體重、癥狀的嚴(yán)重性等因素確定，因此所述范圍不會(huì)限于此。另一方面，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療由個(gè)體人乳頭瘤病毒引發(fā)的疾病的方法，該方法包括向受試者施用有效量的本發(fā)明的組成物的步驟。本發(fā)明的藥物組合物、該組合物的功效、給藥方法及給藥劑量等的內(nèi)容如上所述。在本發(fā)明的方法中，受試者包括人、猴、鼠、豬、牛和兔等的哺乳動(dòng)物，但不限于此。此外，由所述病毒引發(fā)的疾病包括宮頸癌、肝門與生殖器疣、贅疣等。以下，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例及比較例，將更為詳細(xì)地說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍不限于下列實(shí)施例。
實(shí)施例< 實(shí)施例 1> GX-188E DNA 的結(jié)構(gòu)
本發(fā)明的實(shí)施例中所用的縮寫的定義如下:最優(yōu)化核酸序列，"tPa"或"t"表示組織型纖溶酶原激活物的分泌信號(hào)序列；"F"或"Flt3L"表示fms樣酪氨酸激酶3配體。以相連形式化學(xué)合成包含SEQ ID NO:5核酸序列的最優(yōu)化遺傳密碼子的tPa分泌信號(hào)序列和包含SEQ ID NO:6核酸序列的最優(yōu)化遺傳密碼子的Flt3L。在末端加入KpnI(5’)、NheI(3’)位點(diǎn)，以便插入于載體中。用KpnI和NheI限制酶處理用于制備DNA疫苗的載體pGX10(韓國專利申請(qǐng)公布號(hào)2003-0047667)，然后用連接酶連接所合成的tPa_Flt3L，從而制備pGX10/tF。以相連形式化學(xué)合成用于編碼HPV16 E6的第I 85位氨基酸的最優(yōu)化遺傳密碼子的核酸序列、用于編碼HPV16 E7的第I 65位氨基酸的最優(yōu)化遺傳密碼子的核酸序列、用于編碼HPV16 E6的第70 158位氨基酸的最優(yōu)化遺傳密碼子的核酸序列、用于編碼HPV16 E7的第50 98位氨基酸的最優(yōu)化遺傳密碼子的核酸序列、用于編碼HPV18 E6的第I 85位氨基酸的最優(yōu)化遺傳密碼子的核酸序列、用于編碼HPV18 E7的第I 65位氨基酸的最優(yōu)化遺傳密碼子的核酸序列、用于編碼HPV18 E6的第70 158位氨基酸的最優(yōu)化遺傳密碼子的核酸序列、用于編碼HPV18 E7的第50 105位氨基酸的最優(yōu)化遺傳密碼子的核酸序列(以下，16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C: SEQ ID N0:4)。在末端加入NheI (5，) ,XbaI (3，)位點(diǎn)，以便插入到載體中。用NheI和XbaI酶處理pGX10/tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C，然后用連接酶連接所合成的 16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C，從而制備 pGX10/tFpGX10/tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C。通過用 KpnI 和 Xbal 酶處理 pGX10/tF，分離出 tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C，用 NheI 和 XbaI 酶處理 pGXIO 后，用連接酶連接 16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C，從而制備 pGX27/tF16E6N16E7N16E6C16E7C18E6N18E7N18E6C18E7C (以下均稱〃GX-188E〃)。<實(shí)施例2> GX-188E對(duì)宮頸癌的治療效果的證實(shí)
為確認(rèn)GX-188E對(duì)宮頸癌的治療效果，對(duì)C57BL/6小鼠皮下注射5 X IO5個(gè)TC-1腫瘤細(xì)胞，在注射后的第3天和第8天肌肉注射5(^g及IOOPg量的GX-188E，然后進(jìn)行電穿孔法。從注射腫瘤細(xì)胞起的第27天為止觀察腫瘤細(xì)胞的體積變化，在第36天去除小鼠的脾，然后將I X IO6個(gè)細(xì)胞與IL-2及HPV16的E6 CD8 T細(xì)胞表位(抗原決定基，epitope) (E648_57 ；EVYDFAFRDL, P印tron，韓國)或 HPV18 的 E7 CD8 T 細(xì)胞表位(E749_57 ；RAHYNIVTF, Peptron,韓國)或HPV18的E6肽池(P印tide pool)或HPV18的E7肽池一起置于已用50μ1的5Pg/ml的抗鼠IFN-g抗體(BD Pharmigen, Sandiego,加州)包被的平板中并在37°C和5%C02的培養(yǎng)箱(Froma，Minnesota,美國)中培養(yǎng)24小時(shí)。用PBST洗滌所述平板后，向其中分別加入50μ1的2Pg /ml的含有懸垂生物素的IFN-g檢測(cè)抗體(BD Pharmigen, Sandiego,力口州)并在常溫下培養(yǎng)約3小時(shí)。之后，用PBST洗滌，其中加入5(^g的已稀釋至1:2000的鏈霉抗生物素蛋白-AKP (堿性磷酸酶)并在常溫下培養(yǎng)約I小時(shí)。用PBST洗滌后，分別加入50μ1的在IOml的堿性磷酸鹽緩沖液中的66μ1的NBT (Promega, Madison, WI)與33μ1的BCIP (Promega, Madison, WI)的混合物，以使其相互反應(yīng)。將平板置于37°C培養(yǎng)箱中約30分鐘，然后用蒸餾水(D.W.)洗滌并用計(jì)數(shù)器對(duì)所生成的斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。
與用作為對(duì)照組的pGX27處理過的小鼠相比，可確認(rèn)用GX-188E對(duì)TC-1腫瘤細(xì)胞治療過的小鼠的腫瘤體積明顯減小(請(qǐng)參照?qǐng)D5 )。產(chǎn)業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明的融合蛋白可用于 由HPV引起的腫瘤的治療劑。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白包括:源于人乳頭瘤病毒16及18型并包含SEQ ID NO:1氨基酸序列的三維結(jié)構(gòu)變形的E6、E7融合多肽；用于分泌所述融合多肽的信號(hào)肽；和免疫增強(qiáng)肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，信號(hào)肽為選自組織型纖溶酶原激活物tPa、HSV gDs及生長激素的分泌信號(hào)肽中的一種或多種的融合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，信號(hào)肽為包含SEQID N0:2氨基酸的融合蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，免疫增強(qiáng)肽為選自CD40配體、fms樣酪氨酸激酶3 (Flt3)配體、鞭毛蛋白及0X40中的一種或多種的融合蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，免疫增強(qiáng)肽為包含SEQID N0:3氨基酸的融合蛋白。
6.多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸能編碼人乳頭瘤病毒的E6、E7融合多肽并包含SEQ ID NO:3堿基序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸能編碼信號(hào)肽并包含SEQID NO:5的喊基序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸能編碼免疫增強(qiáng)肽并包含SEQ ID NO:6的喊基序列。
10.重組載體，其特征在于，該重組載體包含權(quán)利要求6所述的多核苷酸。
11.宿主細(xì)胞，其特征 在于，該宿主細(xì)胞由權(quán)利要求10所述的重組載體轉(zhuǎn)染而成。
12.表達(dá)權(quán)利要求1所述的融合蛋白的方法，其特征在于，該方法為通過培養(yǎng)權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞來完成的。
13.用于預(yù)防或治療由人乳頭瘤病毒引起的疾病的組合物，其特征在于，該組合物包括作為活性成分的、選自權(quán)利要求1所述的融合蛋白、由表達(dá)所述融合蛋白的重組載體轉(zhuǎn)化而成的宿主細(xì)胞及其均漿中的一種或多種物質(zhì)。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，所述由人乳頭瘤病毒引起的疾病為宮頸癌。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其特征在于，該組合物進(jìn)一步包含醫(yī)學(xué)上可接受的載體。
16.用于預(yù)防或治療由人乳頭瘤病毒引起的疾病的方法，其特征在于，該方法包括將有效劑量的權(quán)利要求13所述的組合物向受試者施用的步驟。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述由人乳頭瘤病毒引起的疾病為宮頸癌。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療包括人乳頭瘤病毒變形體及免疫增強(qiáng)劑的宮頸癌的組合物。更具體地，融合蛋白通過誘導(dǎo)HPV16及18型抗原特異性免疫應(yīng)答治療由HPV引起的腫瘤，所述融合蛋白包括融合多肽，該融合多肽被重組以使人乳頭瘤病毒16及18型的抗原E6、E7的三維結(jié)構(gòu)變形；信號(hào)肽，該信號(hào)肽用于分泌所述融合多肽；和免疫增強(qiáng)肽。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103180343SQ201080068626
公開日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2010年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月13日
發(fā)明者成英哲, 徐尚煥, 徐有石 申請(qǐng)人:株式會(huì)社吉耐森, 株式會(huì)社拜德