專利名稱：含有cd36表達性結締組織鞘細胞的用于再生毛囊的組合物的制作方法
技術領域：
本發(fā)明提供用于再生毛囊的、含有表達⑶36抗原(血小板反應蛋白受體)的結締組織鞘(“DS”:真皮鞘)細胞(下文也稱為“CD表達性DSc”)以及任選地毛乳頭(“DP”:真皮乳頭)細胞(下文也稱為“DPc”)的組合物，應用所述組合物再生毛囊的方法，進一步地提供負載通過該方法再生的毛囊的動物或3維皮膚模型。
背景技術：
毛發(fā)在美學外貌上被看做是極為重要的。因此，由于先天或后天原因而脫毛對于許多人是深刻的煩惱。尤其是在高齡化社會、壓力社會這樣的現(xiàn)代社會，由于各種后天的原因，頭部毛發(fā)遭受脫毛危機的機會越來越多。與此對應，對于提供發(fā)揮包括促進毛發(fā)長出、毛發(fā)的粗化(太毛化)的毛發(fā)生長效果的更優(yōu)異的毛發(fā)生長劑，進行了各種嘗試。毛囊是成熟的生物體中幾乎一生反復自我再生的例外的器官。期望闡明其自我再生的機制與需求高的臨床應用關聯(lián)，所述應用如利用組織、細胞移植進行脫毛治療，構建含有毛囊、皮脂腺的近似天然的機能也優(yōu)異的皮膚片等。近年來，隨著對干細胞研究的關心的增加，毛囊上皮干細胞(上皮細胞)的研究急速進展，另外，作為毛囊特異性間充質系統(tǒng)細胞的毛乳頭細胞的性質也逐漸被知曉。毛乳頭細胞行使為用于毛囊的自我再生的毛囊上皮干細胞輸送活化信號的稱為指揮塔臺的功能，在毛囊重建評價系統(tǒng)中判定為與毛囊上皮干細胞共同為不可缺少的細胞(Kishimoto等人.，Proc.Natl.AcaDSc1.USA (1999),Vol.96，pp.7336-7341 ;非專利文獻 I)。與構成毛囊的大部分的上皮系統(tǒng)細胞不同，DP、環(huán)繞毛囊周圍的DS共同地由間充質系統(tǒng)來源的細胞群構成。關于DS，近年來報告了許多表明其對毛囊形成的重要性的發(fā)現(xiàn)。也報告了在毛乳頭大鼠胡須的毛球部切斷毛囊移植實驗中，DP由DS再生(1)，在小鼠中對切斷了下部二分之一的毛囊進行DS移植誘導毛囊 再生(2)。另外，Jahoda等人也報告(Development.1992 Apr:114 (4):887-97 ;非專利文獻2)，通過對人移植DS，能夠誘導毛囊的再構建(Horne KA and Jahoda CA.Development.1992 Nov: 116(3):563-71 ;非專利文獻3)。進一步地，Tobin, Paus等人的小組報告，在小鼠毛周期中，DS與DP間產(chǎn)生細胞移動，在毛發(fā)長出期開始增殖的DPc之前結締組織鞘細胞(DSc)開始增殖(Tobin DJ等人.，J.1nvest.Dermatol.，120:895-904，2003 ;非專利文獻 4)。這樣，DS對毛囊形成發(fā)揮重要作用的可能性高，但其作用機制幾乎不明，DSC的性質尚且不知。因此我們研究了表征DSC的基因表達譜，為了闡明對毛囊形成的作用機制而進行分析?，F(xiàn)有技術文獻
非專利文獻
非專利文獻 1:Kishimoto 等人，Proc.Natl.AcaDSc1.USA (1999), Vol.96, pp.7336-7341
非專利文獻 2: Jahoda CA 等人,Development.1992 Apr; 114(4): 887-97.非專利文獻 3:Horne KA and Jahoda CA.Development.1992 Nov; 116 (3): 563-71.非專利文獻 4:Tobin DJ 等人，J.1nvest.Dermatol.，120:895-904, 2003非專利文獻 5:J.Linder 等人,Federation of American Societies forExperimental Biology, 14(2)， 319(2000)。
發(fā)明內容
發(fā)明要解決的課題
本發(fā)明的課題是提供新的毛囊再生系統(tǒng)。解決課題的手段
本發(fā)明人利用微陣列研究DSc的基因表達譜，結果鑒定了作為DPc與FBc(成纖維細胞)相比表達率為2倍以上高的基因的304個基因。對這些基因利用GeneSpring的GeneOntology進行功能分類，結果其大多屬于血管相關因子，表明了 DS與血管的關系。接著發(fā)現(xiàn)其中DSc高表達⑶36，并且得知DSc中的有關⑶36的表達與顯示毛發(fā)長出促進效果的 HGF (肝細胞增殖因子)(J.Linder 等人.，F(xiàn)ederation of American Societies forExperimental Biology, 14(2)，319 (2000):非專利文獻 5)的表達是聯(lián)鎖的。因此，本申請包含以下發(fā)明:
[1]用于再生毛囊的組合物，其含有⑶36表達性結締組織鞘([DS]:真皮鞘)細胞。[2] [I]所述的用于再生毛囊的組合物，其還含有毛乳頭(“DP”:真皮乳頭)細胞。[3] [2]所述的組合物，其中⑶36表達性DSc與DPc的細胞數(shù)的比是約10:1
I:10o[4] [2]或[3]所述的組合物，其中⑶36表達性DSc以及DPc共同來自小鼠、或共同來自大鼠、或共同來自人。[5] [2]或[3]所述的組合物，其中⑶36表達性DSc以及DPc是異種細胞，分別來自小鼠、大鼠或人。[6]再生毛囊的方法，其中對人移植[I] [5]中任一項所述的組合物。[7]再生毛囊的方法，其中對受體動物移植[I] [5]中任一項所述的組合物。[8] [7]所述的方法，其中受體動物是免疫系統(tǒng)受抑制的動物。[9][7]或[8]所述的方法，其中受體動物是選自裸鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(7備'y 7 )、裸大鼠的免疫系統(tǒng)受抑制的動物。[10]再生毛囊的方法，其中制備含有[2] [5]中任一項所述的組合物的皮膚三維模型。[11]嵌合動物，其如下形成:對受體動物移植[I] [5]中任一項所述的組合物，并使其負載如此重建的毛囊。[12] [11]所述的嵌合動物，其中受體動物是免疫系統(tǒng)受抑制的動物。[13] [11]或[12]所述的嵌合動物，其中受體動物是選自裸鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠U電y K ^ ^ )、裸大鼠的免疫系統(tǒng)受抑制的動物。[14]皮膚三維模型，其如下形成:制備含有[2] [5]中任一項所述的組合物的皮膚三維模型，并使其負載如此重建的毛囊。發(fā)明效果本發(fā)明的用于毛囊再生的組合物可以在用于毛囊再生的移植手術、毛囊再構成的研究和開發(fā)中利用。


圖1顯示毛囊組織的構造的模式圖。圖2各種血管相關因子在各種細胞中的表達。圖3進行了⑶36以及⑶31染色的組織染色圖。圖4利用⑶36以及⑶31染色的毛囊的整鋪片(whole_mount)染色圖。圖5⑶36陽性DSc與血管內皮細胞的共培養(yǎng)結果。圖6CD36陽性DSc的HGF表達結果。
具體實施例方式 本發(fā)明提供用于再生毛囊的含有DSc以及任選地DPc的組合物，應用所述組合物再生毛囊的方法，進一步地提供負載如此再生的毛囊的動物或3維皮膚模型。CD36抗原也稱為血小板反應蛋白受體。CD36是脊椎動物的許多細胞類型表面所見的膜內在蛋白質，也稱為FAT、SCARB3、GP88、糖蛋白IV(gpIV)、糖蛋白III b(gpIII b)。CD36是細胞表面蛋白B類清除受體家族的成員。CD36除血小板反應蛋白外，與膠原、寄生了惡性瘧原蟲的紅細胞、氧化低密度脂蛋白、天然脂蛋白、氧化磷脂、長鏈脂肪酸等多種配體結合。在應用基因改變嚙齒動物的最近的研究中，在脂肪酸和糖代謝、心臟病、味覺、以及腸內的食物性脂肪輸送中，確認了 CD36的明確功能。CD36可與耐糖量異常、動脈粥樣硬化、動脈高壓、糖尿病、心肌病、以及阿爾茲海默病有關。⑶36抗原與毛發(fā)生長的關系是完全未知的。DSc是構成環(huán)繞毛囊中DP周圍的鞘部分的細胞，與DPc同樣為間充質系統(tǒng)細胞。DP來源于DS，在毛發(fā)長出期DP增殖之前，DS增殖，因此考慮DS供給DPc (Tobin DJ等人.，J.1nvest.Dermatol., 120:895-904，2003 ;非專利文獻 4)。表達⑶36的DSc沒有特別限定，例如，可以利用針對⑶36的抗體，優(yōu)選單克隆抗體，通過常用的細胞分選技術從DPc等中選擇。本發(fā)明的DSc可以得自所有哺乳動物的表皮，所述哺乳動物例如人，黑猩猩，其他靈長類，家畜動物例如犬、貓、兔、馬、綿羊、山羊、牛、豬，其它實驗用動物例如大鼠、小鼠、豚鼠，更優(yōu)選裸鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(7 t Π7 )、裸大鼠。另外，該表皮部位可以是有毛部位例如頭皮，也可以是無毛部位例如包皮?！癉Pc (毛乳頭細胞)”作為間充質系統(tǒng)細胞位于毛囊最底部，為了毛囊的自我再生而向毛囊上皮干細胞遞送活化信號，行使稱為指揮塔臺的功能。僅含有活化毛乳頭細胞的毛乳頭細胞制備物可以例如通過使用轉基因小鼠的Kishimoto等人.，Proc.Natl.AcaDSc1.USA (1999)，Vol.96，pp.7336-7341記載的方法制備。但是，從產(chǎn)量等來看，可以優(yōu)選這樣制備，對例如從皮膚組織去除表皮組織而得到的真皮組織級分進行膠原處理并制備細胞懸浮物，隨后冷凍保存該細胞懸浮物使毛囊上皮細胞殺滅。具體地，利用上述冷凍保存的方法可以例如如下實施。1.準備哺乳動物的皮膚。2.將該皮膚按需要在蛋白分解酶溶液、例如胰蛋白酶溶液中靜置適當?shù)臅r間例如一晚，其后用鑷子等除去表皮部分，用膠原酶處理殘留的真皮，制備細胞懸浮液。
3.按需要通過Cell Straine過濾懸浮液,靜置除去沉淀物。4.測量細胞數(shù)，以適當?shù)募毎芏?、?yōu)選I X IO5 1x107ml左右的細胞密度在冷凍保護液中再懸浮，按需要小量分裝，按通常的細胞保存方法冷凍保存。5.保存適當時期后融解并使用。冷凍方法沒有特別限制，在_20°C以下、優(yōu)選_50°C以下、更優(yōu)選_80°C以下的超低溫冷庫中或液氮中保存。冷凍保存時期也沒有特別限制，能夠殺滅上皮細胞即可，例如I天以上、優(yōu)選3天以上、更優(yōu)選I周以上時期。即使在液氮中保存4個月，也確認到毛乳頭細胞繼續(xù)生存。冷凍保護液可以使用細胞保存中使用的通常的保存液，例如Cell Banker 2細胞冷凍保存液(目錄號BLC-2)(日本全藥工業(yè)制)。細胞數(shù)的測量可以通過技術人員公知的方法實施。例如，對于細胞數(shù)的測量，可以在血球計(SLGC社制、EOSINOPHIL COUNTER)中提供用等量的0.4%臺盼藍染色液(N0.15250-061, invitrogen)稀釋的細胞懸浮液,按血球計所附的使用說明書記載的方法算出。本發(fā)明的DPc與DSc同樣，可以來自所有哺乳動物的皮膚，所述哺乳動物例如人，黑猩猩，其他靈長類，家畜動物例如犬、貓、兔、馬、綿羊、山羊、牛、豬，其它實驗用動物例如大鼠、小鼠、豚鼠，更優(yōu)選裸鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(7 t7 )、裸大鼠。優(yōu)選地，本發(fā)明的用于毛囊再生的組合物可以進一步地含有“上皮系統(tǒng)細胞”?！吧掀は到y(tǒng)細胞”是構成皮膚 的表皮或上皮的大部分的細胞，由與真皮連接的I層基底細胞產(chǎn)生。以小鼠為例，上皮系統(tǒng)細胞可以優(yōu)選使用新生兒(或胎兒)來源的上皮系統(tǒng)細胞，也可以是成熟的皮膚、例如休眠期毛的上皮或成長期毛的上皮來源的細胞，也可以是角化細胞形態(tài)的細胞的培養(yǎng)物。這樣的細胞可以通過技術人員公知的方法從期望的供體動物的皮膚制備。在適當?shù)姆桨钢?，上皮系統(tǒng)細胞可以如下制備。1.準備哺乳動物的皮膚。2.將該表皮按需要在0.25%胰蛋白酶/PBS中在4°C下靜置一晚進行胰蛋白酶處理。3.利用鑷子等僅剝離表皮部分，切碎后在適當?shù)呐囵B(yǎng)液(例如角化細胞用培養(yǎng)液)中在4°C懸浮處理約I小時。4.將該懸浮物通過具有適當孔徑的Cell Strainer，隨后經(jīng)離心分離器回收上皮系統(tǒng)細胞。5.將該細胞制備物用KGM或SFM培養(yǎng)基以期望的細胞密度懸浮，在冰上靜置直至使用之前。本發(fā)明的上皮系統(tǒng)細胞與DSc和DPs同樣地，可以來自所有哺乳動物的表皮，所述哺乳動物例如人，黑猩猩，其他靈長類，家畜動物例如犬、貓、兔、馬、綿羊、山羊、牛、豬，其它實驗用動物例如大鼠、小鼠、豚鼠，更優(yōu)選裸鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(7 t Π々^ )、裸大鼠。另外，該表皮部位可以是有毛部位例如頭皮，也可以是無毛部位例如包皮。DSc與DPc的使用比率沒有特別限定，優(yōu)選在本發(fā)明組合物中的含有比率為1:10 10:1、更優(yōu)選1:3 3:1。進一步地，對于DSc與DPs的總量，上皮系統(tǒng)細胞可以以1:10 10:1、更優(yōu)選1:1 10:1、再優(yōu)選1:1 3:1、最優(yōu)選1:1含有。
DSc與DPc、進一步地任選地上皮系統(tǒng)細胞的組合可以是同種系，也可以是異種系。因此，本發(fā)明的用于再生毛囊的組合物可以是，例如，DSc、DPc、上皮系統(tǒng)細胞全部是人來源的組合，DSc、DPc、上皮系統(tǒng)細胞的全部是人以外的哺乳動物的同種來源的組合(以上稱為同種系)，DSc以及DPc是人來源、上皮系統(tǒng)細胞是人以外的哺乳動物來源的組合，DSc以及DPc的一個是人來源、另一個以及上皮系統(tǒng)細胞是人以外的哺乳動物的同種或異種來源的組合，DSc以及DPc的一個是人以外的哺乳動物來源、另一個以及上皮系統(tǒng)細胞是人來源的組合(以上稱為異種系)等。
向受體動物移植本發(fā)明涉及的用于毛囊再生的組合物的方法可以是其自身公知的移植方法。例如，參考 Weinberg 等人，J.1nvest.Dermatol.Vol.100 (1993),pp.229-236。例如在向裸鼠移植時，準備的細胞在移植前約I小時前混合，通過離心(9000 Xg, IOmin.)除去培養(yǎng)液，制成50 100 μ L左右的細胞團后，快速地流入埋入裸鼠背部皮膚的硅樹脂制圓頂式室內。2周后非常小心地摘取該室，再3周以后可以對移植部位的毛發(fā)形成的有無進行肉眼觀察。在包含人的動物中以毛發(fā)長出為目的進行移植時也可以類似地操作，適當?shù)姆椒ㄓ舍t(yī)師、獸醫(yī)適當決定。上述組合物向受體動物移植時，該移植可以為同種移植即自體移植、同種同基因移植或同種異基因移植，也可以為異種移植。在同種移植時，毛乳頭細胞制備物以及上皮系統(tǒng)細胞均與接受者同種。在異種移植中，存在毛乳頭細胞制備物或上皮系統(tǒng)細胞中的任一與接受者為異種、另一個與接受者為同種的情況，以及這二者與接受者均為異種的情況。受體動物可列舉所有哺乳動物、例如人，黑猩猩，其他靈長類，家畜動物例如犬、貓、兔、馬、綿羊、山羊、牛、豬，其它實驗用動物例如大鼠、小鼠、豚鼠，更優(yōu)選裸鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(7K ^ ^ )、裸大鼠。另外，通過向適當?shù)氖荏w動物移植本發(fā)明涉及的上述組合物，可以提供負載再生毛囊的嵌合動物。所述嵌合動物可以作為有力的動物模型，例如用于研究和闡明毛囊再生的機制，或用于對毛囊再生或毛發(fā)長出或脫毛有效的藥劑、原料藥進行篩選。受體動物不限于向該動物移植的系統(tǒng)中含有的各細胞的來源，優(yōu)選免疫系統(tǒng)受抑制的動物。另外動物種類為能夠作為實驗動物使用的動物，只要按本發(fā)明目的，可為任何動物，優(yōu)選可列舉小鼠、大鼠等。這些動物中，免疫系統(tǒng)受抑制的動物若以小鼠為例，可列舉裸鼠這樣的如具有胸腺缺乏的性質的動物?？紤]到本發(fā)明的目的，特別優(yōu)選的受體動物可列舉市售的裸鼠(例如Balb-cnu/nu系統(tǒng))、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(〃 K ^ ^ ^ )(例如Balb/c-SCID)、裸大鼠(例如 F344/NJcl-rnu)。進一步地，通過將本發(fā)明涉及的組合物包含在三維皮膚模型中，可以提供負載再生毛囊的三維皮膚模型。但是，在此情況下，作為毛發(fā)長出的指揮塔臺的毛乳頭細胞是必須的。三維皮膚模型可以通過技術人員公知方法(Exp.Cell Res.Amano S.等人.，(2001),Vol.271, pp.249 - 362)，例如下述方法進行制備。三維皮膚模型以各自I X IO6 IO8個/cm2、優(yōu)選1.0 1.5X IO7個/cm2、更優(yōu)選約1.27X IO7個/cm2的量含有DSc以及DPc。三維皮膚模型制備方法
將人成纖維細胞適當量分散在0.1%膠原溶液/DMEM/10% FBS中，在培養(yǎng)皿中分配，迅速地在37°C的CO2培養(yǎng)箱中靜置。凝膠化后，從培養(yǎng)皿側面及底面剝離凝膠，使其在培養(yǎng)皿中漂浮。邊搖動膠原凝膠邊培養(yǎng)，使凝膠收縮為約5分之一制成真皮模型。將真皮模型置于不銹鋼柵格上，其上設置玻璃環(huán)，將KGM (表皮細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基)中分散的人培養(yǎng)表皮細胞(1.0XlO6細胞數(shù)/ml) 0.4ml注入玻璃環(huán)內進行培養(yǎng)。此時同時混合并注入DSc以及DPc。也可以替代人培養(yǎng)表皮細胞使用小鼠新生兒表皮細胞。在培養(yǎng)皿內放入DMEM -KGM - 5% FBS + Ca2+培養(yǎng)基，直至真皮模型上部暴露于空氣，培養(yǎng)，約一周后觀察皮膚模型，判斷毛囊原基形成的有無和再現(xiàn)性。負載了重建毛囊的3維皮膚模型與上述負載再生毛囊的嵌合動物同樣地，能夠用于研究、闡明毛囊的再生的機制，以及篩選對毛發(fā)長出、脫毛有效的藥劑、原料藥。下面列舉實施例對本發(fā)明進一步地詳細說明。實施例1 (方法)
細胞的分離以及培養(yǎng)
在含有10%胎牛血清的DMEM(GibC0/inVitiOgen)中，將人頭皮組織的真皮部分用刀除去，從斷面取出毛囊。應用精密鑷子從毛囊除去含有ORS(毛囊上皮系統(tǒng)細胞)的毛干，取出DP 和 DS。在含有培養(yǎng)基-1 (含有 10% 胎牛血清、10 ng/ml EGF,20 ng/ml bFGF、0.00075%β巰基乙醇、青霉素100單位/ml (效價)、鏈霉素0.lmg/ml (效價)、兩性霉素B 0.25ug/ml (效價)的二 〃 7 4成纖維細胞用低血清培養(yǎng)基)的膠原包被35mm皿(Iwaki)上靜置培養(yǎng)分離的DP，分離的DS在37°C、40分實施膠原酶處理后同樣地在膠原包被35mm皿上靜置培養(yǎng)。二者均在經(jīng)過I周后確認增殖，之后作為DPc、DSc用作實驗樣品。成纖維細胞(FBc)使用市售細胞(東洋紡)。DSc、DPc、FBc利用培養(yǎng)基-1進行7 10天的靜置培養(yǎng)。其后，利用胰蛋白酶進行細胞的傳代。培養(yǎng)條件是37°C、5%C02，將膠原包被搖瓶T-75 (Iwaki)`用作培養(yǎng)容器。另外，供給實驗的各細胞應用傳代I次 3次的細胞。血管內皮細胞應用正常成人皮膚微血管內皮細胞(下文稱為HMVEC) (Kurabo)，用低血清增殖用培養(yǎng)基Humedia-MvG(Kurabo)進行培養(yǎng)，傳代數(shù)為5次的細胞用于實驗中。應用微陣列法的DSc、DPc、FBc的基因表達譜的比較
應用RNeasy Micro試劑盒(Qiagen)從DPc、DSc、FBc回收含mRNA的總RNA。應用agilent的方案將回收的RNA合成雙鏈cDNA,進一步地,繼續(xù)進行利用花青苷3、5標記的cRNA的合成。將標記的cRNA利用二色法在Agilent公司的微陣列芯片玻片(Agilent,全人基因組(4X44K)，G4110)中在65度雜交17小時。應用2個人的DS來源RNA各2種(共計4種)和2個人的DP來源RNA各2種(共計4種)、I個人的FB來源RNA各2種，在各芯片玻片上進行DSc與DPc、DPc與FBc、FBc與DSc各自2者間的基因表達水平的比較。洗滌玻片后，用雙激光微陣列掃描儀(Agilent)對芯片上的cRNA的熒光信號(花青苷3、5)成像。成像的數(shù)據(jù)利用Feature Extraction Software 9.I定量,此時將異常數(shù)值和與背景大致相同低的值標出，進行分析。對于(加標簽的)各表達量的比較，在2者間比較取得的信號的定量值。(微陣列數(shù)據(jù)的分析)
應用生物信息學方法分析各基因表達量，為了更詳細地分析，應用Gene Spring GX
7.3.1 軟件(Agilent)。應用 Feature Extraction Software 9.1 進行操作，將異常數(shù)值和與背景大致相同低的值標出，應用標出基因之外的基因進行分析。提取2者間的表達量有差異的基因，應用Gene ontology對其進行功能分類。(http://www.geneontology.0rg/)另外在此時，通過Fisher檢驗驗證在統(tǒng)計學上占多少優(yōu)勢。細胞染色
對于應用CD36抗體的細胞染色，在利用酸性膠原溶液(Koken)進行膠原表面處理的4孔室玻片(Nalgene nunc)中播種DSc后，培養(yǎng)I日 2日，應用得到的培養(yǎng)物。將培養(yǎng)物用PBS洗滌后，用4%PFA固定30分鐘，用PBS洗滌，在含0.1% TritonX-1OO的PBS溶液中處理10分鐘。隨后，用含3%BSA的PBS進行30分鐘封閉處理，用CD36抗體(Abeam, abl7044)在含1%BSA的PBS中50倍稀釋而成的初次抗體溶液反應I小時。用PBS洗滌4次后，用Alexa 594標記的抗小鼠IgG抗體(Invitrogen)在含1%BSA的PBS中200倍稀釋而成的二次抗體溶液反應I小時。在用于核染色的DAPI溶液中反應后，用PBS洗滌4次，通過防褪色劑Prolong Gold Antifade Reagent (Invitrogen)和蓋玻片封入。應用突光顯微鏡(Olympus)進行觀察。組織染色
將人頭皮組織用冷凍組織包埋劑OTC化合物(Sakura Finetek)包埋，用冷凍切片制備裝置恒冷切片機(Leica)制成冷凍切片。將切片用4%PFA固定15分鐘后，用PBS洗滌，用PBS中加入5%脫脂乳、1%猴血清、0.1% triton-ΧΙΟΟ的封閉溶液反應I小時。隨后，應用CD36抗體溶液(Abeam, abl7044)、⑶31抗體溶液(R&D，AF806)用封閉溶液各自50倍、100倍稀釋而成的初次抗體溶液，在常溫反應I小時或在4°C反應過夜。CD31抗體用于標記作為血管內細胞的標志物使用的⑶31。用PBS洗滌3次后，應用Alexa 594標記抗小鼠IgG抗體(Invitrogen)、Alexa 488標記抗兔IgG抗體(Invitrogen)用封閉溶液各自200倍稀釋而成的二次抗體溶液，在常溫反應I小時。用DAPI溶液反應后，用PBS洗滌3次，通過防褪色劑Prolong Gold Antifade Reagent和蓋玻片封入。應用突光顯微鏡(Olympus)進行觀察。毛囊整鋪片染色
將從人組織分離的毛囊在4%PFA中在4°C邊振蕩邊固定2小時。依次應用含25%、50%、75%乙醇的0.l%tween PBS (下文稱為PBST)各5分鐘、應用100%乙醇5分鐘，進行脫水處理。處理的樣品在乙醇中于_20°C保存。使用時，在相同乙醇系列PBST中進行再水化處理后，在含有5% tritonX-100的PBS中處理10分鐘。其后，應用組織染色中應用的封閉溶液，含有0)36抗體(Abcam，abl7044)、CD31抗體(R&D，AF806)的初次抗體溶液，含有Alexa594標記的抗小鼠IgG抗體、Alexa 488標記的抗兔IgG抗體的二次抗體溶液，DAPI溶液按順序反應?？贵w的反應操作期間以及染色后，應用0.1% tritonX-100 PBS各洗滌8次。反應條件是初次抗體溶液4°C過夜、二次抗體4°C下2 3小時。利用防褪色劑Prolong GoldAntifade Reagent與蓋玻片封入后,應用突光顯微鏡(Olympus)進行觀察。RT-PCR
應用TRIZ01 (Invitrogen)，利用提供的方案從細胞回收RNA。通過核酸定量裝置Nanodrop (Thermo scientific)測定回收的RNA的濃度。使比較對象群的RNA濃度一致,并且應用 invitrogen 的方案通過逆轉錄酶 Superscript III (Invitrogen)利用 oligo(dT)引物從RNA合成cDNA。以合成的cDNA為模板,利用反應試劑LightCycler(注冊商標)FastStart DNA MasterPLUS SYBR Green (Roche)、反應裝置 LightCycler (Roche)進行定量RT-PCR。組成條件根據(jù)Roche的方案進行。PCR的條件是，初期變性95°C 10分鐘、變性95°C 10秒、退火60°C 10秒、延伸72°C 10秒。應用的引物信息在下文中記述。G3PDH:
正向引物:5 ‘-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘(序列編號 I)
反向引物:5 ‘-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3 ‘(序列編號 2)
CD36:
正向引物:5 ‘-GAGGAACTATATTGTGCCTATTCTTTGGC-3 ‘(序列編號 3)
反向引物:5 ‘-CATAAAAGCAACAAACATCACCACACCAAC-3 ‘(序列編號 4)
CD31:
正向引物:5 ‘-ATGCCGTGGAAAGCAGATACTCTAG-3 ‘(序列編號 5)
反向引物:5 ‘-AATTGCTGTGTTCTGTGGGAGCAG-3 ‘(序列編號 6)
HGF:
正向引物:5 ‘-GAGGGAAGGTGACTCTGAATGAG-3 ‘(序列編號 7)
反向引物:5 ‘-AATACCAGGACGAITTGGAATGGCAC-3 ‘ (序列編號 8)。應用所附的軟件，測定各基因的表達量。G3TOH用作內部標準，在各基因分別定量時應用其校正對照組的cDNA量。細胞的分選
應用Cell Separation Magnet (BD Bioscience)對細胞分級分離。操作條件按照BDBioscience提示的方案進行。應用胰蛋白酶溶液剝離細胞后,將細胞懸浮液通過孔穴70um的Strainer (Falcon)，計數(shù)細胞數(shù)。用500ml的含3%胎牛血清的PBS溶液懸浮500 1000萬個細胞，其中加入CD36抗體(Abeam, abl7044)使其稀釋50倍，在冰上反應大致15分鐘。應用IXIMag Buffer (BD Bioscience)洗漆,用離心操作回收細胞后,用30ul的抗小鼠 IgGl Magnetic Particles (BD Bioscience)再懸浮，在冰上放置 30 分鐘。加入 500ul的 I X IMag Buffer (BD Bioscience),置于 Cell Separation Magnet (BD Bioscience)中，靜置8分鐘。邊注意不剝離通過磁體側面粘附的細胞邊回收上清，將其作為CD36陰性DSc。接著再次加入500ul的IXMag Buffer (BD Bioscience)，使側面粘附的細胞懸浮，置于Cell Separation Magnet中靜置4分鐘后，除去上清。再重復該步驟I次，將側面粘附的細胞作為CD36陽性DSc。用培養(yǎng)基-1懸浮回收的CD36陽性、陰性DSc后，在37。。、5%C02，應用膠原包被搖瓶T-25 (Iwaki)為培養(yǎng)容器培養(yǎng)2 4日，將得到的培養(yǎng)物用于隨后的實驗。共培養(yǎng)實驗
應用各樣品來源的CD36陽性、陰性DSc，以各自N=3，4進行實驗。將分級分離的CD36陽性、陰性DSc各自在膠原包被的T-25搖瓶中種植30萬個。其后，用培養(yǎng)基-1培養(yǎng)2天后，加入40萬個HMVEC，用Humedia-MvG(Kurabo)共培養(yǎng)I天。其后，將培養(yǎng)基替換為在血管內皮細胞基礎培養(yǎng)基Humedia-EB2 (Kurabo)中加入青霉素100單位/ml (效價)、鏈霉素
0.lmg/ml (效價)、兩性霉素B 0.25ug/ml (效價)0.1%BSA (Sigma)的培養(yǎng)基。再共培養(yǎng)I天后，用胰蛋白酶溶液剝離細胞，繼續(xù)應用FACS進行分析。用與CD36陽性細胞的分選同樣的方法，用70um的strainer(Falcon)處理,在含3%胎牛血清的PBS溶液中懸浮,應用作為初次抗體的⑶31抗體溶液(R&D，AF806)在冰上反應20分鐘。用含有3%胎牛血清的PBS溶液洗漆細胞后，使作為二 次抗體的Alexa 488標記抗兔IgG抗體(Invitrogen)在冰上反應20分鐘,將細胞在0.5ml的PBS溶液中再懸浮,應用Cell Lab Quanta SC(BeckmanCoulter)分析。應用BeckmanCoulter指定的方案和操作試劑，進行包含激光精度管理的設置。應用FLl通道(525nm)進行⑶31陽性細胞數(shù)的測定。應用不與⑶31抗體反應的內皮細胞，進行用于省略自身熒光的校正。測定后，基于得到的全細胞數(shù)值以及CD31陽性細胞的比例，算出⑶31陽性細胞數(shù)。(結果)
表I中示出血管相關因子的一部分的表達結果。得知血管相關因子在DS中表達性高，并得知其中⑶36和HGF在DS中特異性地高表達。圖2中示出各種血管相關因子在DS、DP、ORS、VEC(血管內皮細胞)中的表達。得知⑶36以及HGF在DS中極度特異性地表達。細胞染色結果中也確認到僅分離的DS培養(yǎng)細胞中存在CD36陽性細胞，得知DP和FB中不存在⑶36陽性細胞(數(shù)據(jù)未顯示)。表I
權利要求
1.用于再生毛囊的組合物，其含有CD36表達性結締組織鞘細胞(DSc)。
2.權利要求I所述的用于再生毛囊的組合物，其還含有毛乳頭細胞(DPc)。
3.權利要求2所述的組合物，其中⑶36表達性DSc與DPc的細胞數(shù)的比是約10:1 I 10o
4.權利要求2或3所述的組合物，其中⑶36表達性DSc以及DPc共同來自小鼠、或共同來自大鼠、或共同來自人。
5.權利要求2或3所述的組合物，其中⑶36表達性DSc以及DPc是異種細胞，分別來自小鼠、大鼠或人。
6.再生毛囊的方法，其中對人移植權利要求I 5中任一項所述的組合物。
7.再生毛囊的方法，其中對受體動物移植權利要求I 5中任一項所述的組合物。
8.權利要求7所述的方法，其中受體動物是免疫系統(tǒng)受抑制的動物。
9.權利要求7或8所述的方法，其中受體動物是選自裸鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(I 7 K I々7·)、裸大鼠的免疫系統(tǒng)受抑制的動物。
10.再生毛囊的方法，其中制備含有權利要求2 5中任一項所述的組合物的皮膚三維模型。
11.嵌合動物，其如下形成對受體動物移植權利要求I 5中任一項所述的組合物，并負載如此重建的毛囊。
12.權利要求11所述的嵌合動物，其中受體動物是免疫系統(tǒng)受抑制的動物。
13.權利要求11或12所述的嵌合動物，其中受體動物是選自裸鼠、嚴重聯(lián)合免疫缺陷小鼠(7 S :, F I ■> 裸大鼠的免疫系統(tǒng)受抑制的動物。
14.皮膚三維模型，其如下形成制備含有權利要求2 5中任一項所述的組合物的皮膚三維模型，并負載如此重建的毛囊。
全文摘要
公開了含有CD36表達性結締組織鞘細胞(DSc)的用于再生毛囊的組合物。
文檔編號A61K35/36GK103237554SQ20108006939
公開日2013年8月7日 申請日期2010年9月29日 優(yōu)先權日2010年9月29日
發(fā)明者吉田雄三, 相馬勤, 藤原重良 申請人:株式會社資生堂