專利名稱：一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)用高分子材料與納米生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于冠心病 檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法。
背景技術(shù)：
冠心病是一種多發(fā)的心血管疾病，我國冠心病患者的數(shù)量以每年200-400萬的速 度增加，嚴重威脅著人們的健康安全。導(dǎo)致冠心病的首要原因是血管內(nèi)皮細胞發(fā)生病變，導(dǎo) 致該處血管逐漸形成斑塊即動脈粥樣硬化，預(yù)示患者進入冠心病中晚期；斑塊不但導(dǎo)致血 流障礙，嚴重時堵塞血管導(dǎo)致病人猝死。到目前為止，冠心病早期的診斷方法很少，主要原 因是難以確認病變的內(nèi)皮細胞層。冠心病中晚期患者目前主要采用藥物洗脫型血管支架來 治療，該治療雖然可以短期有效緩解了病情，但導(dǎo)致了血管支架置入部位血管內(nèi)皮細胞層 的更嚴重損傷，進而在術(shù)后一段時間內(nèi)引發(fā)支架內(nèi)血栓和再狹窄，嚴重影響血管支架術(shù)治 療的效果。最近幾年研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細胞可以快速修復(fù)內(nèi)皮細胞層。由此可見病變血管 內(nèi)皮細胞層的檢測對于冠心病的早期檢測和預(yù)防意義重大；病變內(nèi)皮細胞或損傷內(nèi)皮細胞 的快速修復(fù)，對冠心病患者的治療意義重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法。 該方法既能制出用于冠心病前期病變內(nèi)皮細胞的檢測和定位的磁性納米粒子，其檢測靈 敏、可靠；也能制出用于冠心病中后期治療磁性納米粒子；對冠心病的修復(fù)，治療效果好。本發(fā)明實現(xiàn)其發(fā)明目的，所采用的技術(shù)方案是一種用于冠心病檢測和治療的納 米磁性粒子的制備方法，包括以下步驟A、在磁核表面固定過渡層分子，所述的過渡層分子為同時含有氨基、羧基或巰基 及能與羥基進行反應(yīng)的基團的化合物；B、然后在固定了過渡層分子的磁核上固定具有延長納米粒子在血液中停留時間 的功能性分子；C、再在固定了功能性分子的磁核上固定內(nèi)皮祖細胞或病變內(nèi)皮細胞的特異性識 別配體，即得。本發(fā)明方法的機理是過渡層分子含有可以與羥基反應(yīng)的基團，而磁核表面帶有 大量的羥基，所以可以實現(xiàn)過渡層分子在磁核表面的固定。再利用過渡層分子上的羧基與 功能性分子的氨基，或過渡層分子上的氨基或巰基與功能性分子的羧基反應(yīng)實現(xiàn)固定連 接，進而提高磁性納米粒子在血液系統(tǒng)中的停留時間。最后通過功能性分子上的氨基與特 異性識別配體上的羧基，或功能性分子上的羧基與特異性識別配體上的氨基反應(yīng)實現(xiàn)固定 連接，實現(xiàn)磁性納米粒子對內(nèi)皮祖細胞或病變內(nèi)皮細胞的特異性識別。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是一、本發(fā)明制得的磁性納米粒子表面固定連接有病變內(nèi)皮細胞特異性識別配體，注射進入人體后，會與癌癥細胞(病變內(nèi)皮細胞)特異結(jié)合，使得磁性納米粒子集中富積 于病變內(nèi)皮細胞部位，顯著提高了冠心病病變部位的磁響應(yīng)成像強度，通過MRI (磁共振成 像)對定位磁性納米粒子的定位，可有效實現(xiàn)癌癥部位(病變內(nèi)皮細胞)的精確檢測與定 位，從而實現(xiàn)早期冠心病的診斷，對早期冠心病的檢測靈敏、可靠。或者本發(fā)明制得的磁性納米粒子表面固定連接有內(nèi)皮祖細胞特異性識別配體，進 入人體后，會與內(nèi)皮祖細胞特異性結(jié)合；從而使內(nèi)皮祖細胞具有磁響應(yīng)性，在外加磁場的磁 導(dǎo)向作用下，內(nèi)皮祖細胞會定向富集于指定的病變內(nèi)皮細胞部位，達到靶向治療的目的，實 現(xiàn)對病變內(nèi)皮細胞更快、更有效的修復(fù)，治療效果好。二、通過過渡層分子的固定，使磁核表面由帶有大量的羥基變?yōu)楸砻娓缓然?、?基或巰基，從而能固定大量的功能性分子；有效延長了注射進入血液中的磁性納米粒子在 血液中的停留時間，延長了磁性納米粒子的檢測和治療作用時間，提高了檢測的靈敏度和 可靠性，也提高了治療的效果。三、大量帶羧基、氨基或巰基的功能性分子的固定，也使本發(fā)明方法能固定更多的 內(nèi)皮祖細胞或病變內(nèi)皮細胞的特異性識別配體，進一步提高了冠心病早期檢測的靈敏度和 修復(fù)治療的療效。四、制備過程在溶液中進行，反應(yīng)條件溫和，無需復(fù)雜儀器，制備簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。上述的磁核為粒徑在5-50nm之間，具有順磁性或超順磁性，且成分為、_Fe203、 Fe3O4、MnFe2O4 或 Mn3O4 的粒子。5-50nm之間的納米粒子在體內(nèi)停留時間更長，順磁性或超順磁性既能保證磁成像 的有效實現(xiàn)，也能保證磁導(dǎo)向治療的實現(xiàn)，F(xiàn)e, Mn是人體必需的元素，毒副作用小。上述的過渡層分子為多巴胺、含有氨基、羧基或巰基的硅烷偶聯(lián)劑、檸檬酸、3-巰 基丙酸、巰基丁二酸、巰基乙酸、半胱氨酸、巰基丁酸、巰基戊酸、巰基己酸、二巰基丁二酸、 谷氨酸或賴氨酸。這些物質(zhì)既含有能與羥基進行反應(yīng)的基團，保證了與磁核的結(jié)合，又含有氨基、羧 基或巰基，也保證了在其表面能更有效的結(jié)合功能性分子。上述的功能性分子為HC00-PEG-C00H、NH2-PEG-NH2、NH2-PEG-C00H、0H-PEG-C00H 或 H00C-PEG-CH0中的一種聚乙二醇衍生物?；蛘吒叩馑嵫趸嗡?、高碘酸氧化殼聚糖、高碘酸氧化磺化殼聚糖。這些聚乙二醇衍生物，具有高活性的末端基團，可以高效與過渡層分子連接，本身 具有良好的生物相容性，可以保證不被血液中的免疫系統(tǒng)快速清除。而高碘酸氧化肝素、高 碘酸氧化殼聚糖、高碘酸氧化磺化殼聚糖均具有高活性的醛基，可以高效與過渡層分子連 接，本身也具有良好的生物相容性，可以保證不被血液中的免疫系統(tǒng)快速清除。上述的功能性分子為疏水多肽，其序列為AAAAAFFFFFAAAA或 Ac-AAAAAARRAAAAAA"CONH2 或 AC-AAAAAARRGGGGGG-CONH2。這些物質(zhì)，可以高效與過渡層分子連接，良好的疏水效果，可以保證不被血液中的 免疫系統(tǒng)快速清除。上述的內(nèi)皮祖細胞的特異性識別配體為與內(nèi)皮祖細胞特異性識別的抗體CDw90、CDl17、HLA-DR、Sca-U CD130、CD146、Tie-2、HAD-DR ；或者與內(nèi)皮祖細胞特異性識別的多肽序列THR PRO SER LEU GLU GLNARG THR VAL TYR ALA LYS、SER TYR GLN THR LEULYS GLN HIS LEYPRO TYR GLY或SER TRPASP ISO LEU LYS PRO ASN PRO GLN RPO LEU ；或者與內(nèi)皮祖細胞特異性識別的核酸序列tcg tcg ttt tgt cgt ttt gtc gt、 CCgCCg CCg CCg CCg CCg ccg、gcg gcg gcg CgC gcg gcg gcg、Cgg Cgg Cgg Cgg Cgg cggcgg、ttc ttc ttc ttc ttc ttc ttc、tta ggt tag gtt agg tta ggt tag g、get aga cgt tag cgt、gct aga get tag get>gat tgc ctg acg tea gag ag、ttc atg acg ttc ctg ate gt、 tcc atg act ttcctc agg tt、 tcc atg age ttc ctg atg ct、 tgc cgc ttt tgt get ttt gtg ctt、ccg egg cca ggc tagcta caa cga cct gga cga t、att gtg gtt ggt agt ata cat ttt tcc gcg gcc agg cta get aca acgacc tgg acg at> ctt taa tgc ggg gta att tct ttt cca taa tcg c、 tta ttt ccc ttc tgt ata tag atatgc taa ate ctt act t ；上述的病變內(nèi)皮細胞的特異性識別配體為多肽序列VHPKQHRGGSKGC或 CVHSPNKKC。這些已有的特異性識別配體能很好的與病變內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮祖細胞特異性結(jié)合、 標(biāo)識，且不影響細胞的功能。上述A步中磁核表面固定過渡層分子的具體作法是將磁核均勻分散在過渡層分 子水溶液體系中，磁核與過渡層分子的質(zhì)量比為1 0. 05 150，固定時間0. 5h 36h，磁 分離并去離子水清洗。上述B步在固定了過渡層分子的磁核上固定功能性分子的具體做法是去離子水 中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 形成催化體系，再在催化體系中加入固定了過渡層分子的磁核和功能性分子進行催化偶 聯(lián)反應(yīng)，最后磁分離并去離子水清洗；各物質(zhì)質(zhì)量比為固定了過渡層分子的磁核功能 性分子1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 1 100 0. 05 1 0. 05 1。上述C步在固定了功能性分子的磁核上固定特異性識別配體的具體做法是去離 子水中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 形成催化體系，再在催化體系中加入固定了功能性分子的磁核和特異性識別配體進行催化 偶聯(lián)反應(yīng)，最后磁分離并去離子水清洗；各物質(zhì)質(zhì)量比為固定功能性分子的磁核特異性 識別配體I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺NHS=I 1 100 0. 05 1 0. 05 1。下面結(jié)合附圖和具體實施方式
，對本發(fā)明做進一步的詳細說明。


圖1為含有內(nèi)皮祖細胞及用本發(fā)明方法固定了內(nèi)皮祖細胞特異性識別配體的磁 性納米粒子的培養(yǎng)液，體外模擬血流條件36小時后，內(nèi)皮祖細胞在未施加磁場的玻璃片表 面上的粘附情況圖。圖2為含有內(nèi)皮祖細胞及用本發(fā)明方法固定了內(nèi)皮祖細胞特異性識別配體的磁
6性納米粒子的培養(yǎng)液，體外模擬流動36小時后，內(nèi)皮祖細胞在施加了磁場的玻璃片表面上 的粘附情況圖。
具體實施例方式實施例1一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法，包括以下步驟A、在磁核表面固定過渡層分子，所述的為同時含有氨基、羧基或巰基及能與羥基 進行反應(yīng)的基團的化合物。本例的磁核為粒徑在5nm之間，具有順磁性，且成分為Y -Fe2O3的粒子，過渡層分 子為多巴胺。本例的A步中磁核表面固定過渡層分子的具體作法是將磁核均勻分散在的過渡 層分子水溶液體系中，磁核與過渡層分子的質(zhì)量比為1 0.05，固定時間0. ，磁分離并去 離子水清洗。B、然后在固定了過渡層分子的磁核上固定具有延長納米粒子在血液中停留時間 的功能性分子；本例的功能性分子為分子式為HC00-PEG-C00H的聚乙二醇衍生物。本例在固定了過渡層分子的磁核上固定功能性分子的具體做法是去離子水中 加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 形成催化體系，再在催化體系中加入固定了過渡層分子的磁核和功能性分子進行催化 偶聯(lián)反應(yīng)，最后磁分離并去離子水清洗；各物質(zhì)質(zhì)量比為固定了過渡層分子的磁核 功能性分子1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺= 1 1 0.05 0.05οC、再在固定了功能性分子的磁核上固定內(nèi)皮祖細胞或病變內(nèi)皮細胞的特異性識 別配體，即得。本例的特異性識別配體為內(nèi)皮祖細胞的特異性識別配體，更具體而言是內(nèi)皮祖細 胞的特異性識別抗體CDw90。CDw90本例在固定了功能性分子的磁核上固定特異性識別配體的具體做法是去 離子水中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)形成催化體系，再在催化體系中加入固定了功能性分子的磁核和特異性識別配體進 行催化偶聯(lián)反應(yīng)，最后磁分離并去離子水清洗；各物質(zhì)質(zhì)量比為固定功能性分子的磁核 特異性識別配體EDC NHS = 1 1 0. 05 0.05。實施例2-30實施例2-30的制備方法均與實施例1方法的操作相同，不同的僅僅是:A、各實施 例選用的磁核，過渡層分子、磁核/過渡層分子的質(zhì)量比及固定時間；B、功能性分子種類和 固定過渡層分子的磁核/功能性分子/EDC/NHS的質(zhì)量比；C、與內(nèi)皮祖細胞特異性識別的配 體種類和固定功能性分子的磁核/特異性識別配體/EDC/NHS的質(zhì)量比，均相應(yīng)更換為以下 表1所列的種類、質(zhì)量比、時間(為便于比較，表中也列出實施例1的數(shù)據(jù))。表1 實施例1-30各步選用的物質(zhì)種類、物質(zhì)比例及過渡層分子的固定時間實 施 例磁核過渡層分子功能性分子特異性識別配體種類固 定 時 間 (h)磁核 與過 渡層 分子 的質(zhì) 量比種類磁核/功能 性分子 /EDC/NHS 的質(zhì)量比種類固定功能性 分子的磁核/ 特異性識別 配 體 /EDC/NHS 的質(zhì)量比015nm, 超順磁 性， Y -Fe203多 巴 胺0.51:0.0 5聚乙二醇 衍生物 HCOO-PE G-COOH1:1:0.05:0.0 5抗體:CDw901:1:0.05:0.0 5025 Onm, 順磁性， Fe3O4含有 氨基 的硅 烷偶 聯(lián)劑361:15 0聚乙二醇 衍生物 NH2-PEG-NH21:100: 1:1抗體:CDl 171:100:1:10325nm 順磁性 MnFe2O4含有 羧基 的硅 烷偶 聯(lián)劑121:75聚乙二醇 衍生物 NH2-PEG-COOH1:1: 1:1抗 體 HLA-DR1:50:0.5:0.50415nm, 超順磁 性 ， Mn3O4含有 巰基 的硅 烷偶 聯(lián)劑101:25聚乙二醇 衍生物 OH-PEG-C OOH1:10:0.1:0.1抗體Sca-I1:10:0.1:0.105IOnm 超順磁 性 ， Mn3O4檸 檬 酸51:10聚乙二醇 衍生物 HOOC-PE G-CHO1:5:0.5:0.5抗體CD1301:5:0.5:0.506IOnm 超順磁3-巰 基丙31:5高碘酸氧 化肝素1:3:0.3:0.3抗體CD1461:3:0.3:0.權(quán)利要求
1.一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法，包括以下步驟A、在磁核表面固定過渡層分子，所述的過渡層分子為同時含有氨基、羧基或巰基及能 與羥基進行反應(yīng)的基團的化合物；B、然后在固定了過渡層分子的磁核上固定具有延長納米粒子在血液中停留時間的功 能性分子；C、再在固定了功能性分子的磁核上固定內(nèi)皮祖細胞或病變內(nèi)皮細胞的特異性識別配 體，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方 法，其特征在于所述的磁核為粒徑在5-50nm之間，具有順磁性或超順磁性，且成分為 Y -Fe203> Fe3O4, MnFe2O4 或 Mn3O4 的粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法， 其特征在于所述的過渡層分子為多巴胺、含有氨基、羧基或巰基的硅烷偶聯(lián)劑、檸檬酸、 3-巰基丙酸、巰基丁二酸、巰基乙酸、半胱氨酸、巰基丁酸、巰基戊酸、巰基己酸、二巰基丁二 酸、谷氨酸或賴氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法，其 特征在于，所述的功能性分子為HC00-PEG-C00H、NH2-PEG-NH2、NH2-PEG-C00H, 0H-PEG-C00H 或 H00C-PEG-CH0 中的一種 聚乙二醇衍生物；或者為高碘酸氧化肝素、高碘酸氧化殼聚糖、高碘酸氧化磺化殼聚糖中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備 方法，其特征在于所述的功能性分子為疏水多肽，其序列為AAAAAFFFFFAAAAA或 AC-AAAAAARRAAAAAA"CONH2 或 AC-AAAAAARRGGGGGG-CONH2。
6.根據(jù)權(quán)利要求書1所述一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法，其 特征在于所述的內(nèi)皮祖細胞的特異性識別配體為與內(nèi)皮祖細胞特異性識別的抗體CDw90、CD117、HLA-DR、ka_l、CD130、CD146、Tie_2、 HAD-DR ；或者與內(nèi)皮祖細胞特異性識別的多肽序列THR PRO SER LEU GLUGLN ARG THR VAL TYR ALALYS、SER TYR GLN THR LEU LYS GLN HISLEY PRO TYR GLY或SER TRP ASP ISO LEU LYS PRO ASN PRO GLN RPOLEU ；或者與內(nèi)皮祖細胞特異性識別的核酸序列:tcg tcg ttt tgt Cgt ttt gtc gt,CCgCCg CCg CCg CCg CCg ccg、gcg gcg gcg CgC gcg gcg gcg、cgg Cgg Cgg Cgg egg cggcgg、ttc ttc ttc ttc ttc ttc ttc>tta ggt tag gtt agg tta ggt tag g、gct aga cgt tag cgt、 get aga get tag get、gat tgc ctg acg tea gag ag、ttc atg acg ttc ctg ate gt、tcc atg act ttcctc agg tt、tcc atg age ttc ctg atg ct、tgc cgc ttt tgt get ttt gtg ctt、ccg egg cca ggc tagcta caa cga cct gga cga t、att gtg gtt ggt agt ata cat ttt tcc gcg gcc agg cta get aca acgacc tgg acg at> ctt taa tgc ggg gta att tct ttt cca taa tcg c、tta ttt ccc ttc tgt ata tag atatgc taa ate ctt act t ；
7.根據(jù)權(quán)利要求書1所述一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方 法，其特征在于所述的病變內(nèi)皮細胞的特異性識別配體為多肽序列VHPKQHRGGSKGC或CVHSPNKKC。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法，其 特征在于，所述A步中磁核表面固定過渡層分子的具體作法是將磁核均勻分散在過渡層 分子水溶液體系中，磁核與過渡層分子的質(zhì)量比為1 0. 05 150，固定時間0. 5h 36h， 磁分離并去離子水清洗。
9.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方 法，其特征在于，所述B步在固定了過渡層分子的磁核上固定功能性分子的具體做法是去 離子水中加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺 (NHS)形成催化體系，再在催化體系中加入固定了過渡層分子的磁核和功能性分子進行催 化偶聯(lián)反應(yīng)，最后磁分離并去離子水清洗；各物質(zhì)質(zhì)量比為固定了過渡層分子的磁核功 能性分子1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺N-羥基琥珀酰亞胺=1 1 100 0. 05 1 0. 05 1。
10.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方 法，其特征在于，所述C步在固定了功能性分子的磁核上固定特異性識別配體的具體做法 是去離子水中加入1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)_碳化二亞胺(EDC)/N-羥基琥珀酰 亞胺(NHS)形成催化體系，再在催化體系中加入固定了功能性分子的磁核和特異性識別配 體進行催化偶聯(lián)反應(yīng)，最后磁分離并去離子水清洗；各物質(zhì)質(zhì)量比為固定功能性分子的磁 核特異性識別配體1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺NHS=I 1 100 0. 05 1 0. 05 1。
全文摘要
一種用于冠心病檢測和治療的納米磁性粒子的制備方法，包括以下步驟A、在磁核表面固定過渡層分子，所述的過渡層分子為同時含有氨基、羧基或巰基及能與羥基進行反應(yīng)的基團的化合物；B、然后在固定了過渡層分子的磁核上固定具有延長納米粒子在血液中停留時間的功能性分子；C、再在固定了功能性分子的磁核上固定內(nèi)皮祖細胞或病變內(nèi)皮細胞的特異性識別配體，即得。該方法既能制出用于冠心病前期病變內(nèi)皮細胞的檢測和定位的磁性納米粒子，其檢測靈敏、可靠；也能制出用于冠心病中后期治療磁性納米粒子；對冠心病的修復(fù)，治療效果好。
文檔編號A61K49/18GK102085380SQ20111000085
公開日2011年6月8日 申請日期2011年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月30日
發(fā)明者冷永祥, 孫鴻, 曹建軍, 李全利, 楊蘋, 熊開琴, 王娟, 王進, 陳佳龍, 陳俊英, 陳卓玥, 黃楠 申請人:西南交通大學(xué)