專利名稱：一種光敏劑結(jié)合蛋白/多肽及其在光動力基因治療中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于光動力學(xué)治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種光敏劑結(jié)合蛋白及多肽 (Photosensitizer binding Protein& P印tide，簡稱PBP)及其應(yīng)用。本發(fā)明主要涉及卟啉類光敏劑的結(jié)合蛋白(PBPr)為eEFlAl蛋白及與該蛋白序列同源性達(dá)70%以上的蛋白分子、光敏劑結(jié)合多肽(PBPe)為25aa殘基肽及與氨基酸序列同源性達(dá)70%以上的多肽。而 eEFlAl在某些光動力學(xué)治療范圍內(nèi)的腫瘤，如結(jié)腸癌、膀胱癌、食道癌，皮膚癌以及乳腺癌中特異高表達(dá)，為光動力學(xué)治療過程中光敏劑特異富集于腫瘤細(xì)胞提供合理的解釋，為開發(fā)光敏劑前藥物、設(shè)計特異靶向光敏劑提供有價值的參考，為光敏劑結(jié)合蛋白高表達(dá)介導(dǎo)的腫瘤光基因治療提供了全新的策略和方法。
背景技術(shù)：
腫瘤是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，但傳統(tǒng)治療效果十分有限。癌癥的光動力療法 (photodynamic therapy,PDT)是近年來頗受各國學(xué)者重視的一種癌癥新療法，這種療法是利用某些染料類光敏物質(zhì)在癌組織中積聚的濃度高于周圍的正常組織，在激光等照射下可產(chǎn)生對細(xì)胞有破壞作用的單線態(tài)氧及自由基的特性，從而干擾腫瘤細(xì)胞的生長并導(dǎo)致死亡 [An Yen, et al , 1993] 0至于光敏劑富集于腫瘤細(xì)胞的機(jī)理尚不很清楚，導(dǎo)致PDT療效受光敏劑在腫瘤與正常組織富集狀態(tài)差異及其被動靶向擴(kuò)散狀態(tài)的限制。因此，探索光敏劑富集于腫瘤細(xì)胞的機(jī)制，從而高效增強(qiáng)光敏劑與腫瘤細(xì)胞的特異親和力，是提高光動力學(xué)治療效果的關(guān)鍵。本發(fā)明從人cDNA噬菌體展示庫中發(fā)現(xiàn)一種與卟啉類光敏劑高度親和的蛋白 eEFlAl，它在蛋白質(zhì)翻譯中有重要作用，并在體內(nèi)外分別驗(yàn)證了其與光敏劑的高親和作用及存在關(guān)系，提示其作為光動力學(xué)治療中光敏劑富集腫瘤細(xì)胞的靶蛋白。同時，本發(fā)明首次提出光動力學(xué)治療與基因治療的聯(lián)合治療的方案，并為腫瘤的光動力學(xué)治療提供新型治療措施。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與卟啉類光敏劑高度親和的蛋白與多肽，以及其在光動力基因治療中的應(yīng)用。本發(fā)明首先提供從人cDNA噬菌體展示庫中篩選出的光敏劑結(jié)合噬菌體，利用PCR 擴(kuò)增噬菌體外源目的基因，經(jīng)測序其外源基因插入序列為SEQ ID NO. 1所示。該25aa殘基肽被命名為光敏劑結(jié)合肽(PBPe)，eEFlAl蛋白被命名為光敏劑結(jié)合蛋白(PBft·)。該噬菌體表面展示與卟啉類光敏劑結(jié)合的蛋白末端多肽。本發(fā)明還提供一種與卟啉類光敏劑高度親和的多肽一人類真核翻譯延伸因子 eEFlAl的25aa殘基。該多肽還包括與eEFlAl蛋白的25aa氨基酸序列同源性達(dá)70%以上的多肽。eEFlAl蛋白的25aa殘基的分子量為2. 5kDa，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示。
本發(fā)明還提供一種與卟啉類光敏劑高度親和的蛋白一人類真核翻譯延伸因子 eEFlAl。該蛋白還包括與人類翻譯延伸因子eEFlAl蛋白序列同源性達(dá)70%以上的蛋白分子，還包括為基因工程表達(dá)的具有與eEFlAl相似功能活性的融合蛋白。eEFlAl分子量為 49. 8kD，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 3所示。本發(fā)明提供光敏劑結(jié)合蛋白/多肽與光敏劑ELISA非競爭性抑制結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法， 其具體步驟如下
1、96孔板包被光敏劑結(jié)合蛋白/多肽，設(shè)不同的包被濃度梯度，每個濃度梯度分別重
復(fù)三孔。2、PBST洗去未包被于板上的蛋白或多肽，加入光敏劑，37°C孵育1. ，使之與蛋白或多肽充分結(jié)合。3、PBST洗去未結(jié)合的光敏劑，使用多功能酶標(biāo)儀M5熒光通道測定光敏劑熒光強(qiáng)度。4、以不同的蛋白/多肽包被濃度為橫坐標(biāo)，以所測得的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制曲線，獲得熒光強(qiáng)度和蛋白/多肽包被濃度的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，隨著光敏劑結(jié)合蛋白/多肽增加，結(jié)合的卟啉類光敏劑越多。本發(fā)明還提供了光敏劑結(jié)合蛋白/多肽與光敏劑親和實(shí)驗(yàn)的方法。其具體步驟如下
1、用Biacore分子互作儀檢測蛋白/多肽與光敏劑親和常數(shù)。2、使蛋白偶聯(lián)到CM5蛋白芯片上，通道1用乙醇胺封閉，通道2偶聯(lián)蛋白/多肽。3、不同濃度的光敏劑以流相通過芯片上固相蛋白，每一濃度以合適的結(jié)合和解離參數(shù)進(jìn)行結(jié)合和解離。4、采用芯片再生方法，從而測定不同濃度光敏劑與蛋白的結(jié)合解離曲線。5、根據(jù)不同濃度下的結(jié)合解離曲線，計算出親和常數(shù)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，光敏劑結(jié)合蛋白與光敏劑親和常數(shù)為2. 936 X 10_6，光敏劑結(jié)合多肽與光敏劑親和常數(shù)為4. 965 X ΙΟ"80本發(fā)明還提供體內(nèi)定性驗(yàn)證光敏劑結(jié)合蛋白高表達(dá)細(xì)胞富集更多光敏劑的實(shí)驗(yàn)方法，其具體步驟如下
1、構(gòu)建光敏劑結(jié)合蛋白/多肽真核高表達(dá)載體，使其與熒光蛋白(與光敏劑熒光顏色區(qū)分的熒光蛋白)融合表達(dá)。2、分別將光敏劑結(jié)合蛋白/多肽真核高表達(dá)載體與其對照組(不表達(dá)或低表達(dá)組) 轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞表達(dá)融合蛋白。3、轉(zhuǎn)染Mh-4 !后，加入光敏劑或其前體物質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間后，共聚焦顯微鏡熒光通道觀察熒光蛋白，光敏劑特定特長激發(fā)下觀察光敏劑分布情況。本發(fā)明還提供體內(nèi)定量驗(yàn)證光敏劑結(jié)合蛋白高表達(dá)細(xì)胞富集更多光敏劑的實(shí)驗(yàn)方法，其具體步驟如下
1、分別將光敏劑結(jié)合蛋白/多肽真核高表達(dá)載體與其對照組(不表達(dá)或低表達(dá)組)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞表達(dá)融合蛋白。2、24h后，采用流式細(xì)胞儀分別分選出每組細(xì)胞內(nèi)的GFP陽性細(xì)胞
3、將上述陽性細(xì)胞群分別按每孔一定數(shù)量的細(xì)胞(數(shù)量范圍2500-20000)，接種到96孔板內(nèi)，每組至少重復(fù)三孔，細(xì)胞在37°C 5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。4、待細(xì)胞貼壁生長后，加入光敏劑或其前體物質(zhì)，繼續(xù)培養(yǎng)一段時間，不超過48h， 在一定間隔時間，使用多功能酶標(biāo)儀M5儀器熒光通道(光敏劑相應(yīng)激發(fā)光和發(fā)射光波長下) 測定細(xì)胞內(nèi)光敏劑熒光強(qiáng)度。5、以加入光敏劑后不同時間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，以不同時間時測得的光敏劑光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制時間-熒光強(qiáng)度曲線。體內(nèi)驗(yàn)證(定性與定量驗(yàn)證)光敏劑富集于光敏劑結(jié)合蛋白高表達(dá)細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，于PSP高表達(dá)細(xì)胞組富集更多量的ΡρΙΧ。本發(fā)明還提供介導(dǎo)eEFlAl高表達(dá)的實(shí)驗(yàn)方法，其具體過程為構(gòu)建eEFlAl基因/ c基因片段到真核表達(dá)載體中，采用慢病毒、腺病毒、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或其他途徑協(xié)助eEFlAl轉(zhuǎn)染到細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)而使eEFlAl基因高表達(dá)。本發(fā)明還提供首創(chuàng)光基因治療方案，其具體方法為介導(dǎo)eEFlAl高表達(dá)，并使卟啉類光敏劑富集于腫瘤細(xì)胞、再實(shí)施光動力學(xué)治療，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞的治療方案。本發(fā)明還提供由光敏劑結(jié)合蛋白/多肽的抗體介導(dǎo)的介導(dǎo)的光敏劑吸附于細(xì)胞表面的光動力治療方案，其具體方法為首先制備光敏劑結(jié)合蛋白/多肽的多克隆抗體或單克隆抗體，然后通過物理或化學(xué)方法將其交聯(lián)到光敏劑上，再采用抗體交聯(lián)光敏劑進(jìn)行光動力學(xué)治療實(shí)施。綜上所述，本發(fā)明的光敏劑結(jié)合蛋白可以在體外和卟啉類光敏劑結(jié)合，在體內(nèi)具有富集卟啉類光敏劑的作用，并通過腺病毒或慢病毒或其他方式轉(zhuǎn)染該光敏劑結(jié)合蛋白基因于各種哺乳細(xì)胞，經(jīng)人工調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)后，產(chǎn)生較好的光動力學(xué)治療效果。另外，該光敏劑結(jié)合蛋白及多肽(PBP)在某些光動力學(xué)治療范圍內(nèi)的腫瘤，如結(jié)腸癌、膀胱癌、食道癌，皮膚癌以及乳腺癌等中特異高表達(dá)，為光動力學(xué)治療過程中光敏劑特異富集于腫瘤細(xì)胞提供合理的解釋，為開發(fā)光敏劑前藥物、設(shè)計特異靶向光敏劑提供有價值的參考，為光敏劑結(jié)合蛋白高表達(dá)介導(dǎo)的腫瘤光基因治療指明方向。


圖1為人工合成多肽的MS質(zhì)譜鑒定圖。圖2為eEFlAl蛋白/人工合成多肽與PpIX的ELISA結(jié)合曲線圖。圖3為eEFlAl蛋白與PpIX的Biacore結(jié)合解離曲線圖。圖4為eEFlAl蛋白25aa殘基人工合成多肽與PpIX的Biacore結(jié)合解離曲線圖。圖5為體內(nèi)定性驗(yàn)證光敏劑結(jié)合蛋白/多肽高表達(dá)細(xì)胞富集更多PpIX的實(shí)驗(yàn)組圖。圖6為體內(nèi)定量測定細(xì)胞內(nèi)光敏劑結(jié)合蛋白/多肽表達(dá)量與PpIX富集量的關(guān)系曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅以用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體的實(shí)驗(yàn)方法，均可按照常規(guī)方法進(jìn)行。如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(New York: Cold Spring Harbor LabortaryPress, 1989)中所述條件，或按照制造生產(chǎn)廠商的使用說明。實(shí)施例1
PCR擴(kuò)增噬菌體外源基因
以如專利2010105533095中所述方法從人肝cDNA噬菌體展示庫中篩選出的與光敏劑結(jié)合的噬菌體為PCR反應(yīng)模板，利用正向引物IectUP Primer和反向引物 T7SelectD0WN Primer,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得T7載體外源基因PCR產(chǎn)物。實(shí)施例2
光敏劑結(jié)合噬菌體的基因Blast分析
1、上述PCR產(chǎn)物與pMD-19T載體連接后，轉(zhuǎn)化克隆菌株XLl-Blue，挑取5_10個轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)，菌液PCR克隆篩選陽性轉(zhuǎn)化子，送英俊上海生物公司測序，分析T7klect載體其外源插入序列見SEQ ID NO. 1。2、T7Select載體外源插入序列經(jīng)NCBI Blast分析，確定其外源基因362堿基與 eEFlAl全長基因的1374-1735堿基序列完全一致，而其中編碼基因?yàn)?374-1452，并且插入序列與載體融合后的一種ORF與eEFlal的一種ORF編碼的氨基酸序列C端25aa —致， 25aa具體序列信息見SEQ ID NO. 2。實(shí)施例3
eEFlAl基因工程蛋白的獲得
如專利201010504169. 2中所述方法獲得，蛋白序列信息見SEQ ID NO. 3。實(shí)施例4
eEFlAl C末端25aa人工多肽的合成
上海格尼生物技術(shù)有限公司處合成25aa，合成純度為97%，MS質(zhì)譜鑒定結(jié)果見圖3。實(shí)施例5
eEFlAl基因工程蛋白與PpIX分子的親和實(shí)驗(yàn)
上述eEFlAl基因工程蛋白/人工合成光敏劑結(jié)合多肽與卟啉類光敏劑ELISA非競爭性抑制結(jié)合實(shí)驗(yàn)方法，其具體步驟如下
1、96孔板包被eEFlAl基因工程蛋白/人工合成多肽，包被濃度梯度為200ng，400ng， 600ng，800ng，lOOOng，每個濃度梯度分別重復(fù)三孔，包被液為NaC03 CpH 10. 0)緩沖液。2、PBST洗去未包被于板上的蛋白或多肽，每孔加入光敏劑PpIX 200ng，37°C孵育 1. 5h，使之與蛋白或多肽充分結(jié)合。3、PBST洗去未結(jié)合的光敏劑，使用多功能酶標(biāo)儀M5熒光通道(Ex400nm，Em620nm) 測定光敏劑熒光強(qiáng)度。4、M5測得的熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)，見圖3附表，eEFlAl蛋白/人工合成多肽與PpIX的 ELISA結(jié)合曲線，見圖3。實(shí)施例6
eEFlAl基因工程蛋白與PpIX分子的互作實(shí)驗(yàn)
用Biacore X100分子互作儀檢測eEFlAl與PpIX親和常數(shù)，具體操作步驟如下 1、蛋白偶聯(lián)buffer選擇蛋白以4(^g/ml濃度溶于醋酸鈉buffer(pH4. 0，4.5，5.0， 5. 5)，進(jìn)行預(yù)偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示醋酸鈉buffer (pH5. 5)進(jìn)行偶聯(lián)的效果較好。2、蛋白偶聯(lián)以醋酸鈉buffer (pH5. 5)溶解的4(^g/ml蛋白溶液，設(shè)置偶聯(lián)RU為10000,結(jié)果沒有偶聯(lián)成功。加大蛋白濃度至lOOPg/ml，設(shè)置偶聯(lián)RU為5000，結(jié)果偶聯(lián)成功。至此，CM5蛋白芯片通道1表面已成功偶聯(lián)eEFlAl蛋白，偶聯(lián)RU為5633。3、芯片再生條件選擇以2000ng/ml濃度的光敏劑進(jìn)樣后，分別用Gly-HCl (pHl. 5，2. 0，2. 5，3. 0)，進(jìn)行芯片再生，結(jié)果顯示Gly-HCl (pHl. 5)再生效果較好。4、乙醇胺封閉CM5蛋白芯片通道1，在光敏劑進(jìn)樣過程中發(fā)現(xiàn)PpIX與通道1 (空白通道)有非特異結(jié)合，因此采用乙醇胺封閉。5、光敏劑濃度梯度選擇光敏劑1，2，4，8，16，32μΜ。6,Biacore親和程序?qū)嶒?yàn)設(shè)置結(jié)合反應(yīng)條件為37°C，結(jié)合時間為200s，解離時間為600s，不同濃度的光敏劑分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣結(jié)束后，用Gly-HCl (pHl. 5)作為再生液，不同濃度的光敏劑與蛋白的結(jié)合解離曲線輸出到Biacore分析軟件。7、Biacore測得的PpIX與eEFlAl結(jié)合與解離曲線，見圖3 ；PpIX與eEFlAl親和常數(shù)kD值及其它常數(shù)值，見圖3附表。實(shí)施例7
eEFlAl C末端25aa人工多肽與PpIX分子的互作實(shí)驗(yàn)
用Biacore XlOO分子互作儀檢測eEFlAl C末端25aa人工合成多肽與PpIX親和常數(shù)， 具體操作步驟如下
1、多肽偶聯(lián)buffer選擇多肽以4(^g/ml濃度溶于醋酸鈉buffer(pH4.0，4.5，5.0， 5. 5)，進(jìn)行預(yù)偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示醋酸鈉buffer (pH5. 5)進(jìn)行偶聯(lián)的效果較好。2、多肽偶聯(lián)以醋酸鈉buffer (pH5. 5)溶解的4(^g/ml多肽溶液，設(shè)置偶聯(lián)RU為 10000，結(jié)果沒有偶聯(lián)成功。加大多肽濃度至lOOPg/ml，設(shè)置偶聯(lián)RU為5000，仍然沒有偶聯(lián)成功。至此，采用連續(xù)進(jìn)樣偶聯(lián)，使多肽最大限度的達(dá)到偶聯(lián)飽和狀態(tài)，結(jié)果成功偶聯(lián)多肽， 偶聯(lián)RU為1100。3、芯片再生條件選擇以2000ng/ml濃度的光敏劑進(jìn)樣后，分別用Gly-HCl (pHl. 5，2.0，2. 5，3.0)，進(jìn)行芯片再生，結(jié)果顯示Gly-HCl (pHl. 5)再生效果很差。后又嘗試0. 5mM NaOH再生，效果也不好，最后采用0. 5%SDS強(qiáng)再生溶液，再生效果很好。4、乙醇胺封閉CM5多肽芯片通道1。5、光敏劑濃度梯度選擇根據(jù)步驟3)中再生溶液的選擇，說明PpIX與多肽結(jié)合很強(qiáng)，因此選用光敏劑濃度為0. 5，1，1. 5，2，3，4μΜ。6,Biacore親和實(shí)驗(yàn)程序設(shè)置結(jié)合反應(yīng)條件為37°C，結(jié)合時間為200s，解離時間加長為1200s，不同濃度的光敏劑分別進(jìn)樣，每次進(jìn)樣結(jié)束后，用Gly-HCl (pHl. 5)作為再生液，不同濃度的光敏劑與多肽的結(jié)合解離曲線輸出到Biacore分析軟件。7、Biacore測得的PpIX與多肽結(jié)合與解離曲線，見圖4 ；PpIX與多肽親和常數(shù)kD 值及其它常數(shù)值，見圖4附表。實(shí)施例8
體內(nèi)定性驗(yàn)證光敏劑結(jié)合蛋白/多肽高表達(dá)細(xì)胞與PpIX富集關(guān)系細(xì)胞內(nèi)分別高表達(dá)光敏劑結(jié)合蛋白/多肽與其對照組相比，分別在共聚焦顯微鏡下觀察不同分組細(xì)胞內(nèi)PpIX分別情況，其具體步驟如下
1、分別將eEFlAl蛋白基因全長序列(簡稱a)，其C末端25aa序列(簡稱c)，以及缺省 C末端25aa序列的eEFlAl蛋白序列(簡稱b)，插入到pEGFP_Cl真核表達(dá)質(zhì)粒GFP表達(dá)序列后，構(gòu)成GFP融合表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-Cl-a，pEGFP-Cl-b和pEGFP-Cl_c，使其分別表達(dá)融合蛋白 GFP-a，GFP-b 和 GFP_c。2、用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)!fepG2細(xì)胞，培養(yǎng)條件為37°C 5% CO2培養(yǎng)箱。3、分別將上述三種重組質(zhì)粒pEGFP-Cl-a，pEGFP_Cl_b和pEGFP-Cl_c以及對照質(zhì)粒pEGFP-Cl轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞H印G2內(nèi)，使細(xì)胞分別表達(dá)GFP_a，GFP-b和GFP_c以及GFP蛋白。4、轉(zhuǎn)染24h后，改換不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并加入光敏劑PpIX在體內(nèi)轉(zhuǎn)化的前體物質(zhì)5-ALA (ImM),細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)Mi后，共聚焦顯微鏡綠色熒光通道觀察GFP， 紅色熒光通道觀察PpIX分布情況，見圖6。實(shí)施例9
體內(nèi)定量測定光敏劑結(jié)合蛋白/多肽高表達(dá)細(xì)胞與PpIX富集關(guān)系細(xì)胞內(nèi)分別高表達(dá)光敏劑結(jié)合蛋白/多肽與其對照組相比，分別用多功能酶標(biāo)儀M5儀器檢測細(xì)胞內(nèi)PpIX富集量，不同其具體步驟如下
1、分別將上述三種重組質(zhì)粒pEGFP-Cl-a，pEGFP-Cl-b和pEGFP-Cl_c以及對照質(zhì)粒 pEGFP-Cl轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞H印G2內(nèi)，使細(xì)胞充分表達(dá)蛋白Mh。2、24h后，采用流式細(xì)胞儀分別分選出每組細(xì)胞內(nèi)的GFP陽性細(xì)胞，即得到分別表達(dá)GFP-a，GFP-b, GFP-c以及對照組GFP的100%陽性細(xì)胞群。3、將上述陽性細(xì)胞群分別按7000個細(xì)胞/孔的數(shù)量，接種到96孔板內(nèi)，每組至少重復(fù)三孔，細(xì)胞在37°C 5% CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。4、待細(xì)胞貼壁生長后( 他)，改換不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并向每孔分別加入光敏劑5-ALA (0. 75mM)，繼續(xù)培養(yǎng)，并在ai，4h，》i，12h, 24h時使用多功能酶標(biāo)儀 M5儀器熒光通道(Ex400nm，Em620nm)測定細(xì)胞內(nèi)PpIX熒光強(qiáng)度，測得數(shù)據(jù)見圖6附表。5、以加入光敏劑后不同時間點(diǎn)為橫坐標(biāo)，以不同時間時測得的PpIX光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制時間-熒光強(qiáng)度曲線，見圖6。圖2附表eEFlAl蛋白/人工合成多肽與PpIX的ELISA結(jié)合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
權(quán)利要求
1.一種與卟啉類光敏劑結(jié)合的人肝CDNA噬菌體單克隆，其特征在于，外源插入序列與噬菌體載體ORF對框，表達(dá)人eEFlAl蛋白的25aa殘基肽編碼序列，序列為SEQ ID NO. 1所示，該25aa殘基肽被命名為光敏劑結(jié)合肽，eEFlAl蛋白被命名為光敏劑結(jié)合蛋白。
2.一種卟啉類光敏劑結(jié)合蛋白，其特征在于，該蛋白為人類翻譯延伸因子eEFlAl蛋白及與其蛋白結(jié)構(gòu)70%相似度以上的蛋白分子，該結(jié)合蛋白為基因工程表達(dá)的具有與eEFlAl 相似功能活性的融合蛋白，eEFlAl分子量為49. 8kD，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 3所示。
3.一種卟啉類光敏劑結(jié)合多肽，其特征在于，該多肽為eEFlAl蛋白的C末端25aa 及與其氨基酸序列近70%以上相似度的多肽，分子量為2. 5kDa，其氨基酸序列為SEQ ID NO. 4。
4.一種用于介導(dǎo)如權(quán)利要求2所述eEFlAl高表達(dá)的方法，包括慢病毒轉(zhuǎn)染、腺病毒轉(zhuǎn)染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等其他協(xié)助eEFlAl轉(zhuǎn)染到細(xì)胞體內(nèi)進(jìn)而使eEFlAl基因高表達(dá)的手段。
5.一種如權(quán)利要求7所述用于介導(dǎo)eEFlAl高表達(dá)方法，使卟啉類光敏劑富集于腫瘤細(xì)胞、再實(shí)施光動力學(xué)治療，進(jìn)而殺死腫瘤細(xì)胞。
6.一種由權(quán)利要求2或3所述光敏劑結(jié)合蛋白或多肽的抗體介導(dǎo)的光敏劑吸附于細(xì)胞表面的光動力治療藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于光動力基因治療技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種光敏劑結(jié)合蛋白及多肽及其應(yīng)用。本發(fā)明通過從人肝cDNA噬菌體展示庫中篩選一種光敏劑結(jié)合蛋白。該結(jié)合蛋白為人類真核翻譯延伸因子eEF1A1蛋白及與其蛋白結(jié)構(gòu)相似70%～80%的蛋白分子，光敏劑結(jié)合多肽為eEF1A1C末端25aa及其70%～80%相似的氨基酸序列。該光敏劑結(jié)合蛋白可以在體外和卟啉類光敏劑結(jié)合，在體內(nèi)具有富集卟啉類光敏劑的作用，并通過腺病毒或慢病毒或其他方式轉(zhuǎn)染該光敏劑結(jié)合蛋白基因于各種哺乳細(xì)胞，經(jīng)人工調(diào)控誘導(dǎo)表達(dá)后，產(chǎn)生較好的光動力學(xué)治療效果。另外，該光敏劑結(jié)合蛋白及多肽(PSP)為開發(fā)光敏劑前藥物、設(shè)計特異靶向光敏劑提供有價值的參考。
文檔編號A61K38/17GK102174478SQ201110000898
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者朱乃碩, 郭艷榮, 魏勛斌 申請人:復(fù)旦大學(xué)