專(zhuān)利名稱：一種明膠酶a抑制性多肽的修飾物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種明膠酶A抑制性多肽(M205C4)，具體涉及一種明膠酶A抑制性多肽 (M205C4)的修飾物及其制備方法。明膠酶A抑制性多肽的修飾物，簡(jiǎn)稱為M205C4-PEG。
背景技術(shù)：
局部侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，也是導(dǎo)致腫瘤患者較高死亡率的主要原因。目前的研究認(rèn)為在腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的破壞是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在參與破壞細(xì)胞外基質(zhì)的酶類(lèi)中基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi) (matrix metalloproteinases, MMPs)是最重要的蛋白水解酶，尤其是MMP2、MMP9在癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程中不僅可以酶解細(xì)胞間基質(zhì)成分，還能酶解基底膜的主要成分IV型膠原。 所以設(shè)計(jì)尋找針對(duì)MMPs拮抗藥物就尤為重要。目前已有人工合成的MMPs抑制物，如 Marimastat、Batimastat、Mtastat、BAY12-9566、AG-3340、CGS-27023A 和 SC-204092 等，正在進(jìn)行不同階段臨床試驗(yàn)。雖然這類(lèi)小分子化合物可以有效抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的酶解作用，但同時(shí)所產(chǎn)生的細(xì)胞毒作用會(huì)給試用者帶來(lái)強(qiáng)烈的副作用。由此研究人員把目光轉(zhuǎn)向了基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)的組織抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases， TIMPs)家族。TIMPs的主要功能是天然地抑制MMPs的活性，在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的代謝中起到了重要作用。其中TIMP-I被認(rèn)為是組織中MMPs活性主要調(diào)節(jié)者，控制著大多數(shù)的MMPs 家族成員。然而TIMPs對(duì)腫瘤卻是把雙刃劍，一方面，通過(guò)對(duì)抗MMPs蛋白的水解作用抑制腫瘤的浸潤(rùn)。但腫瘤也需要對(duì)抗自身的過(guò)度水解，所以TIMPs對(duì)腫瘤生長(zhǎng)同樣是必須的。另夕卜，還對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、血管形成等方面起到了關(guān)鍵作用，因此對(duì)腫瘤的發(fā)展具有雙向性。因此尋找結(jié)合了小分子化合物和TIMPs蛋白優(yōu)勢(shì)的新型藥物是我們的研究重點(diǎn)。多肽類(lèi)藥物具備高效、低毒和特異性強(qiáng)的顯著性優(yōu)勢(shì)。M205C4是通過(guò)噬菌體展示技術(shù)篩選的特異性MMP2抑制性結(jié)合肽，拮抗作用模擬了 TIMPs對(duì)MMPs活性調(diào)節(jié)的方式，可以有效的抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移并于2006年成功報(bào)批國(guó)家專(zhuān)利(ZL200610085779.7)。 經(jīng)后期實(shí)驗(yàn)證明，M205C4對(duì)多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及血管新生沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，符合我們的新藥篩選標(biāo)準(zhǔn)。但同時(shí)也存在肽類(lèi)藥物在體不穩(wěn)定、易降解的問(wèn)題，無(wú)法使藥物在體發(fā)揮其特有的生物學(xué)活性。而對(duì)于藥物的修飾同時(shí)要考慮到其自身空間結(jié)構(gòu)改變所導(dǎo)致的活性變化和體內(nèi)代謝行為兩個(gè)重要因素以外，修飾的工藝化問(wèn)題也是不容忽視的。所以修飾及其制備方法的選擇對(duì)于藥物的后期研究至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，本發(fā)明的目的是提供一種M205C4的修飾物， 修飾后藥物保留了原有生物學(xué)活性的同時(shí)，降低了免疫原性，延長(zhǎng)了其在生物體內(nèi)的半衰期。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種M205C4的修飾物的制備方法。技術(shù)方案為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
一種明膠酶A抑制性多肽的修飾物，為mPEG-sc對(duì)多肽M205C4組氨酸氨基端的單點(diǎn)修飾產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式為
O
. 11 CH3-f OCH2CH2-^O-C-HNWTRWLLHPDRGGCS ‘
分子量為11000 13000 ；結(jié)構(gòu)式中，CH3^OCH2CH2Ili為mPEG的結(jié)構(gòu)式， HNWTRffLLHPDRGGGS為多肽M205C4的氨基酸序列。一種制備明膠酶A抑制性多肽的修飾物的方法，包括以下步驟
(1)按摩爾比為1 Γ5分別稱取M205C4和mPEG-SC，定溶于ρΗ5· 0-8. O的PBS緩沖液中，M205C4的反應(yīng)濃度為100 uM ；在靜音混合器上，4°C反應(yīng)3h以上，制得M205C4-PEG混合液；
(2)采用SunfireTM C18 OBDTM 制備色譜柱(Waters 2545-2767-UV2489 制備液相系統(tǒng))對(duì)步驟(1)制得的M205C4-PEG混合液進(jìn)行液相分離和濃縮，制得濃縮液；對(duì)濃縮液進(jìn)質(zhì)譜檢測(cè)，將濃縮液分裝至2ml EP管中，在液氮中過(guò)夜保存；檢測(cè)純度在90%以上，分子量為 11000^13000 ；
(3)將過(guò)夜保存在液氮的制備樣品放入凍干儀中濃縮至凍干粉末，即可。步驟(1)中，優(yōu)選按摩爾比約為1 3分別稱取M205C4和mPEG -SC,定溶于pH7. 4 的PBS緩沖液中，M205C4的濃度為100 uM ；在靜音混合器上，4°C反應(yīng)3h。上述的明膠酶A抑制性多肽的修飾物在制備用于治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。有益效果本發(fā)明的明膠酶A抑制性多肽的修飾物，克服M205C4活性肽的穩(wěn)定性差和體內(nèi)代謝快的不足，其具有活性高、穩(wěn)定性好、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。PEG化的修飾方法，在生物制藥領(lǐng)域被認(rèn)為是改變蛋白多肽類(lèi)藥物生物、理化性質(zhì)的最佳方法之一，是專(zhuān)門(mén)用于改善藥代動(dòng)力學(xué)行為的一種緩釋方法，且PEG種類(lèi)多，來(lái)源廣泛，修飾方法簡(jiǎn)單易行，修飾后產(chǎn)物穩(wěn)定，易保存。通過(guò)對(duì)PEG種類(lèi)及大小的選擇，得到了活性高，穩(wěn)定性好，半衰期長(zhǎng)的修飾后產(chǎn)物M205C4-PEG，為其在體的治療應(yīng)用提供了重要基礎(chǔ)。


圖1是實(shí)施例2的SDS-PAGE電泳圖。圖2是實(shí)施例3的SDS-PAGE電泳圖。圖3是實(shí)施例4的SDS-PAGE電泳圖。圖4是實(shí)施例5的SDS-PAGE電泳圖。圖5是M205C4和M205C4-PEG的色譜圖及質(zhì)譜結(jié)果圖。圖6為基質(zhì)金屬蛋白酶II酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。P圖為修飾后的結(jié)果圖，Q圖為未修飾的結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋。以下實(shí)施例所使用的方法和藥品具體如下
M205C4活性肽為在中國(guó)專(zhuān)利ZL200610085779. 7公開(kāi)的活性肽，由上海吉爾生化公司合成，mPEG-SC (IOKD)購(gòu)于北京鍵凱公司。
SDS-PAGE電泳法將所要檢測(cè)的樣品與4X非還原性上樣緩沖液按3 1的體積比混合，室溫放置15分鐘后進(jìn)行電泳。膠體共分為3層，上層為濃縮膠(4%)，中層為間隔膠 (10%),下層為分離膠(16%)。首先采用80V恒壓進(jìn)行電泳，待樣品全部進(jìn)入濃縮膠并壓縮成直線后，改用120V恒壓繼續(xù)進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將膠體浸入固定液(50%甲醇+10%乙酸)中，室溫浸泡30分鐘后置于染色液(10%乙酸+0. 025%考馬斯亮藍(lán)R250)中，室溫下染色過(guò)夜，將膠體轉(zhuǎn)入脫色液(10%乙酸)中，室溫脫色至樣品條帶清晰為止。用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)Universal Hood II對(duì)凝膠進(jìn)行成像。凍干儀FreeZone(2. 5L)，購(gòu)于 LABC0NC0 公司； 其他沒(méi)有藥品和設(shè)備均為市售藥品或常用藥品和設(shè)備。實(shí)施例1
單修飾M205C4-PEG的制備
用分析天平分別精密稱取M205C4和mPEG-SC干粉Img及15mg (摩爾比約為1 3)，定溶于5ml PBS緩沖液(pH7.4)中，M205C4的工作濃度為100 uM，4°C反應(yīng)3h，整個(gè)反應(yīng)在靜音混合器上完成。制備液相分離和純化 M205C4-PEG 型號(hào)Waters 2545_2767_UV2489 ；柱子 SunfireTM C18 OBDTM制備色譜柱(30*150 mm, 5 μ m)；流動(dòng)相甲醇-水-三氟乙酸(60:40:0.1)；流速1.0ml/min ；柱溫25°C ；檢測(cè)器Waters 2489 (雙波長(zhǎng)，220nm 及 330nm)；
將回收的溶液濃縮并分裝至2ml EP管中，進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)后在液氮中過(guò)夜保存。M205C4-PEG凍干粉的制備將過(guò)夜保存在液氮的制備樣品放入凍干儀中濃縮至凍干粉末。如圖5所示，為M205C4和M205C4-PEG的色譜結(jié)果。A圖M205C4標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣；B圖M205C4和mPEG-SC的反應(yīng)樣品；C圖M205C4和mPEG_SC的反應(yīng)樣品的ELSD檢測(cè)結(jié)果；D圖制備的M205C4-PEG樣品直接進(jìn)樣；E圖M205C4_PEG質(zhì)譜結(jié)果，mPEG-SC為分子量9000-11000的長(zhǎng)鏈混合物，由此所得到的修飾后產(chǎn)物的分子量區(qū)間為1100(Γ13000， 峰值在12000左右。其中1號(hào)峰為M205C4，2號(hào)峰為M205C4-PEG，3號(hào)峰為PEG。mPEG-SC的分子量約為9000-11000，對(duì)多肽M205C4組氨酸氨基端的單點(diǎn)修飾產(chǎn)物為M205C4-PEG，其分子量為11000 13000。M205C4-PEG的結(jié)構(gòu)式為
O
.Il
CH3~fOCH2CH2hO — C—HNWTRWLLHPDRGGGS，
結(jié)構(gòu)式中，CH3I OCH2CH2^1S mPEG 的結(jié)構(gòu)式,HNWTRWLLHPDRGGGS 為多肽 M205C4 的氨
基酸序列。實(shí)施例2
方法與實(shí)施例1相同，修飾反應(yīng)分別在PH值為5. 0,6. 0,7. 0,8. 0的PBS緩沖液中進(jìn)行， 反應(yīng)結(jié)束后，各體系均吸取15ul反應(yīng)液進(jìn)行電泳檢測(cè)。圖1可以看出，在堿性條件下M205C4-PEG得率較高，游離的M205C4剩余較少，其中在pH7. 4和pH8. 0的體系中，修飾效率并無(wú)明顯差別。實(shí)施例3方法與實(shí)施例1相同，分別于41、151、251、371下反應(yīng)，精密吸取15ul反應(yīng)液進(jìn)行電泳檢測(cè)。從圖2中可以看出，在4°C到37°C之間，溫度對(duì)修飾效率并無(wú)明顯影響。實(shí)施例4
方法與實(shí)施例1相同，分別收取Oh,0. 5h、lh、2h、3h和4h的反應(yīng)產(chǎn)物，各15ul進(jìn)行電泳檢測(cè)。從圖3中可以看出，反應(yīng)進(jìn)行了 3小時(shí)后，M205C4-PEG的得率便已達(dá)到最大實(shí)施例5
方法與實(shí)施例1相同，分別按1 1、1 2、1 3、1 4、1 5的摩爾比混合M205C4和mPEG-SC， 取各15ul進(jìn)行電泳檢測(cè)。從圖4中可以看出，M205C4和mPEG-SC按1:3的投料比反應(yīng)即能得到最佳的修飾效率。實(shí)施例6
基質(zhì)金屬蛋白酶II酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
試劑盒:MMP-2 Fluorimetric Drug Discovery Kit (Biomol)。儀器熒光酶標(biāo)儀(MolecularDevices 公司、Gemini EM)。操作方法參照試劑盒說(shuō)明，結(jié)果如圖6所示，為基質(zhì)金屬蛋白酶II酶活檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖，由此可得，修飾后產(chǎn)物對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶II(MMP2)的半數(shù)抑制濃度(IC50)為 101. 4uM，是未修飾多肽的4. 1倍，即修飾后產(chǎn)物的生物學(xué)活性下降到24.3%。
權(quán)利要求
1. 一種明膠酶A抑制性多肽的修飾物，其特征在于為mPEG-SC對(duì)多肽M205C4組氨酸氨基端的單點(diǎn)修飾產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)式為分子量為11000 13000 ；結(jié)構(gòu)式中，C.H3^OCH2CH2^為mPEG的結(jié)構(gòu)式， HNWTRffLLHPDRGGGS為多肽M205C4的氨基酸序列。
2.一種制備權(quán)利要求1所述的明膠酶A抑制性多肽的修飾物的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)按摩爾比為1 Γ5分別稱取M205C4和mPEG-SC，定溶于ρΗ5· 0-8. 0的PBS緩沖液中，M205C4的反應(yīng)濃度為100 uM ；在靜音混合器上，4°C反應(yīng)2. 5h以上，制得M205C4-PEG混合液；(2)采用Sunfire C18 0BD 制備色譜柱對(duì)步驟(1)制得M205C4-PEG混合液進(jìn)行液相分離和純化，制得濃縮液；對(duì)濃縮液進(jìn)質(zhì)譜檢測(cè)后，將濃縮液分裝至anl EP管中，在液氮中過(guò)夜保存；(3)將過(guò)夜保存在液氮的制備樣品放入凍干儀中濃縮至凍干粉末，即可。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備權(quán)利要求1所述的明膠酶A抑制性多肽的修飾物的方法，其特征在于步驟(1)中，按摩爾比約為1 3分別稱取M205C4和mPEG -SC,定溶于pH7. 4 的PBS緩沖液中，M205C4的濃度為100 uM ；在靜音混合器上，4°C反應(yīng)池。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種明膠酶A抑制性多肽的修飾物及其制備方法。該明膠酶A抑制性多肽的修飾物分子量為11000~13000。該制備方法包括按摩爾比為1:1~5分別稱取M205C4和mPEG-SC，定溶于pH5.0-8.0的PBS緩沖液中，M205C4的反應(yīng)濃度為100μM；在靜音混合器上，4℃反應(yīng)3h，制得M205C4-PEG混合液；對(duì)混合液進(jìn)行液相分離、純化并制得凍干粉末。本發(fā)明的明膠酶A抑制性多肽的修飾物，克服M205C4活性肽的穩(wěn)定性差和體內(nèi)代謝快的不足，其具有活性高、穩(wěn)定性好、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。PEG種類(lèi)多，來(lái)源廣泛，修飾方法簡(jiǎn)單易行，修飾后產(chǎn)物穩(wěn)定，易保存。通過(guò)對(duì)PEG種類(lèi)及大小的選擇，得到了活性高，穩(wěn)定性好，半衰期長(zhǎng)的修飾后產(chǎn)物M205C4-PEG，為其在體的治療應(yīng)用提供了重要基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K38/10GK102153627SQ201110002879
公開(kāi)日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月7日
發(fā)明者喬楠, 孫玉潔, 朱云霞, 沙敏, 鄭馬慶, 韓曉, 高璐 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)