專利名稱：一種適用于介入式蝦類卵巢催熟的藥物及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種一種適用于介入式蝦類卵巢催熟的藥物及其制備方法與應(yīng)用。利用本發(fā)明的介入藥劑在某個(gè)時(shí)段解除眼柄對(duì)卵巢發(fā)育過(guò)程的神經(jīng)內(nèi)分泌抑制作用，達(dá)到促進(jìn)蝦類卵巢更好發(fā)育和人工催熟的目的。
背景技術(shù)：
生產(chǎn)實(shí)踐中普遍采取用于誘導(dǎo)經(jīng)濟(jì)甲殼動(dòng)物卵巢發(fā)育和性成熟的方法是移除眼柄及其衍生技術(shù)。這些技術(shù)包括(1)摘除眼柄(2)燒灼眼柄；(3)結(jié)扎或箍縮眼柄基部 (T. subramoniam, 1999)。移除眼柄一方面具有顯著的催熟效果，另一方面也無(wú)法避免以下一些負(fù)面的影響(1)移除眼柄(即使通過(guò)結(jié)扎或箍縮眼柄基部)后親本有很高的死亡率、 僥幸存活并產(chǎn)卵的個(gè)體也會(huì)產(chǎn)生永久的傷害，有些珍貴的親本資源無(wú)法重復(fù)利用(2)去除眼柄后，性腺持續(xù)發(fā)育，產(chǎn)出的卵和孵出的子代的質(zhì)量明顯下降(Laufer等1999)。所以， 尋求一種低死亡率的方法促進(jìn)性腺的健康成熟和產(chǎn)卵成為一種客觀需求，甲殼動(dòng)物繁殖的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)控機(jī)制一直都是研究熱點(diǎn)(Fingerman 1995 ；Subramoniam 1999 ；Nagaraju 2007)。MO是螯蝦卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵中發(fā)揮重要的內(nèi)分泌器官，分泌一種倍半萜類激素 MF (Nagaraju2007)。MO合成MF的活動(dòng)與促進(jìn)卵黃發(fā)生密切相關(guān)(趙維信等，2001)。MO合成MF接受眼柄內(nèi)神經(jīng)分泌因子的調(diào)節(jié)。目前，已經(jīng)從眼柄中分離鑒定出了培養(yǎng)MO實(shí)驗(yàn)中， 對(duì)MO具有抑制作用的兩種CHH家族神經(jīng)肽MOIH-I MOIH-II。DA和5-HT也被越來(lái)越多的證據(jù)證明在繁殖中發(fā)揮重要而肯定的作用 (Richardson 等，1991 ；KuIkarni 等，1992 ；Sarojini 等 1995 ；Vaca 等，2000 ；蔡生力等， 2000 ；葉海輝等，2003 ；崔青曼等.2005 ；葉海輝等.2006 ；Tinikul 等· 2008 ；Santhoshi 等.2009)。其中，5-HT對(duì)卵巢的發(fā)育和產(chǎn)卵具有促進(jìn)作用，DA對(duì)卵巢的發(fā)育和5-HT的功能有抑制作用。其中，眼柄是最重要的DA產(chǎn)生與分泌部位。介入法是一種前沿生理功能干擾的醫(yī)學(xué)方法。本發(fā)明通過(guò)采用特殊的介入的藥物部分封閉劑阻斷眼柄內(nèi)XO-SG分泌產(chǎn)物MOIH輸出，并同時(shí)緩釋DOM解除DA的抑制功能達(dá)到到促進(jìn)蝦類卵巢更好發(fā)育和人工催熟的目的。這種處理方法易于實(shí)施，處理后的親蝦成活率顯著高于移除眼柄，具有替代移除眼柄的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，利用中藥白芨的提取物的促血凝和能夠被生物體緩慢吸收的特性，作為不易擴(kuò)散的封閉劑和緩釋劑，在一定時(shí)段內(nèi)干擾眼柄內(nèi) XO-SG分泌產(chǎn)物大顎器抑制激素(MOIH)輸出，同時(shí)緩釋多潘立酮(DOM)解除多巴胺(DA)的抑制功能，達(dá)到到促進(jìn)蝦類卵巢更好發(fā)育成熟熟，并獲取極高的成活率的目的。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種適用于介入式蝦類卵巢催熟的藥物，其包括如下步驟(1)白芨多糖提取將干燥的白芨去皮，切成1. 2mm小塊，按體積/質(zhì)量比加入20 倍的三蒸水，于4°C下浸泡36小時(shí)，再置于70°C水浴中煎煮4-8h，用Imm濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液置于4°C下靜置，濾渣按體積/質(zhì)量比加入5倍體積三蒸水置于70°C中水浴2h，重復(fù)煎煮3 次，用Imm濾網(wǎng)過(guò)濾，合并濾液；將上述濾液以超聲波震蕩30min，然后6000g離心20min，收集上清液，并檢查上清液是否能通過(guò)30G注射器針頭；向所得的上清液中加入10倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌至全部生成細(xì)膩的白色絮狀物，靜置48h，抽濾，收集白色絮狀物，用500目鋼絲濾網(wǎng)擠干；用2倍體積的無(wú)水乙醇重復(fù)洗滌3次，抽濾，收集白色絮狀物，擠干，揉碎至 0. Imm粉末，于70°C下熱風(fēng)干燥，得到白芨多糖提取物，置4°C下保存，備用；(2)白芨多糖鹽溶膠制備按質(zhì)量計(jì)，取分析純NaC132g，分析純KC10. lg，分析純 MgCl2 · 6H20 0. 5g，分析純和HEPESO. 12g，溶解于IL三蒸水中，得到溶液1，向所述的溶液 1中加入步驟(1)制備的白芨多糖提取物80g，得到白芨多糖鹽溶膠；(3)卵巢催熟用介入藥劑的配制向步驟( 所述的白芨多糖鹽溶膠中每次使用前按體積比為1 50加入多潘立酮注射液，用超聲波混勻得到催熟用介入藥劑；其中步驟⑴和(3)所述的超聲波條件如下Φ25πιπι固定探頭，工作時(shí)間10s，間隙20s，振幅30um，容器置冰水混合物中。一種適用于介入式蝦類卵巢催熟藥物的制備方法，其包括如下步驟(1)白芨多糖提取將干燥的白芨去皮，切成1.2mm小塊，按體積/質(zhì)量比加入20 倍的三蒸水，于4°C下浸泡36小時(shí)，再置于70°C水浴中煎煮4-8h，用Imm濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液置于4°C下靜置，濾渣按體積/質(zhì)量比加入5倍體積三蒸水置于70°C中水浴2h，重復(fù)煎煮3 次，用Imm濾網(wǎng)過(guò)濾，合并濾液；將上述濾液以超聲波震蕩30min，然后6000g離心20min，收集上清液，并檢查上清液是否能通過(guò)30G注射器針頭；向所得的上清液中加入10倍體積的無(wú)水乙醇，攪拌至全部生成細(xì)膩的白色絮狀物，靜置48h，抽濾，收集白色絮狀物，用500目鋼絲濾網(wǎng)擠干；用2倍體積的無(wú)水乙醇重復(fù)洗滌3次，抽濾，收集白色絮狀物，擠干，揉碎至 0. Imm粉末，于70°C下熱風(fēng)干燥，得到白芨多糖提取物，置4°C下保存，備用；(2)白芨多糖鹽溶膠制備按質(zhì)量計(jì)，取分析純NaC132g，分析純KC10. lg，分析純 MgCl2 · 6H20 0. 5g，分析純和HEPESO. 12g，溶解于IL三蒸水中，得到溶液1，向所述的溶液 1中加入步驟(1)制備的白芨多糖提取物80g，得到白芨多糖鹽溶膠；(3)卵巢催熟用介入藥劑的配制向步驟( 所述的白芨多糖鹽溶膠中每次使用前按體積比為1 50加入多潘立酮注射液，用超聲波混勻得到催熟用介入藥劑；其中步驟⑴和(3)所述的超聲波條件如下Φ 25mm固定探頭，工作時(shí)間10s，間隙20s，振幅30um，容器置冰水混合物中。本發(fā)明的蝦類卵巢催熟藥物的給藥方法用27G-30G的針頭，以普通或高壓注射器將步驟A所得的催熟用介入藥劑注射至眼柄基部竇腺處。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是(1)本發(fā)明建立的方法穩(wěn)定顯著促進(jìn)卵巢同步發(fā)育成熟。(2)本發(fā)明建立的方法相對(duì)于移除眼柄能極顯著提高親蝦的養(yǎng)殖成活率。(3)原材料來(lái)源穩(wěn)定，方法簡(jiǎn)單易行，能夠作為移除眼柄的替代方法使用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但實(shí)施方式并不限于此。實(shí)施例1 卵黃未發(fā)生期克氏原螯蝦卵巢的催熟A、藥品制備1、將干燥白芨20g去皮，切成1. 2mm小塊，加入20倍(V/M)三蒸水，于4°C環(huán)境浸泡36小時(shí)后，置于70°C水浴煎煮4-8小時(shí)，以Imm濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液置于4°C環(huán)境靜置，濾渣在加入5倍(V/M)三蒸水置于70°C水浴2小時(shí)，重復(fù)煎煮3次，以Imm濾網(wǎng)過(guò)濾，合并濾液。2、將上述濾液以超聲波(超聲波條件如下Φ25πιπι固定探頭，工作時(shí)間10s，間隙 20s，振幅30um，容器置冰水混合物中)震蕩30分鐘，然后6000g離心20分鐘，收集上清液， 并檢查上清液是否能通過(guò)30G注射器針頭。3、向上清液中加入10倍體積無(wú)水乙醇，攪拌至全部生成細(xì)膩的白色絮狀物，靜置 48小時(shí)，抽濾，收集白色絮狀物，擠干。4、用2倍體積無(wú)水乙醇重復(fù)洗滌3次，抽濾，收集白色絮狀物，擠干，揉碎成0. Imm 小末，70°C熱風(fēng)干燥，置于4°C長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?、按照質(zhì)量計(jì)，取分析純NaC132g，分析純KC10. lg，分析純MgC12 · 6H20 0. 5g，分析純和HEPESO. 12g(購(gòu)自Sigma公司)，溶解于IL三蒸水中，得到溶液置于4°C保存待用。6、采用上述5的溶液50ML溶解白芨多糖提取物4g，制備白芨多糖鹽溶膠。7、每次使用前按體積比為1 50加入多潘立酮注射液(寧波第二激素廠產(chǎn)品)， 用超聲波處理10秒(條件同1)，將藥物混勻得到催熟用介入藥劑；B、親蝦選擇選體重為25士5g，體長(zhǎng)為7. 5士0. 5cm的體色青褐，體肢完整，無(wú)病無(wú)傷，活動(dòng)力強(qiáng)，體質(zhì)健壯，性腺發(fā)育處于卵黃未發(fā)生期的克氏原螯蝦，處理前預(yù)置于 50CmX60CmX 40cm塑料轉(zhuǎn)運(yùn)箱中l(wèi)_2d，密度為50只/箱，箱底加入2cm養(yǎng)殖用水保持處理克氏原螯蝦的腮絲濕潤(rùn)。C、親蝦處理使用30G針頭、普通注射器將本發(fā)明的催熟用介入藥劑注射至眼柄基部竇腺處。D、養(yǎng)殖親蝦放養(yǎng)，調(diào)節(jié)放養(yǎng)密度為36尾/m2，雌、雄性別比為2 1;每日按定時(shí)定點(diǎn)投喂，飽食，動(dòng)物性食物占70%，植物性食物占30%，每天換新鮮水30% (體積)，使養(yǎng)殖水質(zhì)符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)》，標(biāo)準(zhǔn)號(hào)GB11607-89。Ε、結(jié)果同等養(yǎng)殖條件下，本發(fā)明45天內(nèi)克氏原螯蝦親蝦的存活率和抱卵率 (84. 82% )明顯高于切除眼柄處理組(66.67%，)；本發(fā)明的方法處理一周內(nèi)死亡率為 1. 67%，相對(duì)于同等條件下切除雙側(cè)眼柄一周內(nèi)死亡率71. 67%和切除單側(cè)眼柄一周內(nèi)死亡率57. 5%，穩(wěn)定促進(jìn)了克氏原螯蝦親蝦卵巢同步發(fā)育成熟，P < 0. 01。表1介入式卵巢催熟法與切除眼柄卵巢催熟法對(duì)克氏原螯蝦45天內(nèi)抱卯和存活的效果比較
權(quán)利要求
1.一種適用于介入式蝦類卵巢催熟的藥物，其特征包括如下步驟(1)白芨多糖提取將干燥的白芨去皮，切成1.2mm小塊，按體積/質(zhì)量比加入20倍的三蒸水，于4°C下浸泡36小時(shí)，再置于70°C水浴中煎煮4- ，用Imm濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液置于4°C 下靜置，濾渣按體積/質(zhì)量比加入5倍體積三蒸水置于70°C中水浴池，重復(fù)煎煮3次，用Imm 濾網(wǎng)過(guò)濾，合并濾液；將上述濾液以超聲波震蕩30min，然后6000g離心20min，收集上清液， 并檢查上清液是否能通過(guò)30G注射器針頭；向所得的上清液中加入10倍體積的無(wú)水乙醇， 攪拌至全部生成細(xì)膩的白色絮狀物，靜置48h，抽濾，收集白色絮狀物，用500目鋼絲濾網(wǎng)擠干；用2倍體積的無(wú)水乙醇重復(fù)洗滌3次，抽濾，收集白色絮狀物，擠干，揉碎至0. Imm粉末， 于70°C下熱風(fēng)干燥，得到白芨多糖提取物，置4°C下保存，備用；(2)白芨多糖鹽溶膠制備按質(zhì)量計(jì)，取分析純NaC132g，分析純KC10.Ig,分析純 MgCl2 · 6H20 0. 5g，分析純和HEPESO. 12g，溶解于IL三蒸水中，得到溶液1，向所述的溶液 1中加入步驟(1)制備的白芨多糖提取物80g，得到白芨多糖鹽溶膠；(3)卵巢催熟用介入藥劑的配制向步驟( 所述的白芨多糖鹽溶膠中每次使用前按體積比為1 50加入多潘立酮注射液，用超聲波混勻得到催熟用介入藥劑；其中步驟(1)和(3)所述的超聲波條件如下Φ25πιπι固定探頭，工作時(shí)間10s，間隙 20s，振幅30um，容器置冰水混合物中。
2.一種適用于介入式蝦類卵巢催熟藥物的制備方法，其特征包括如下步驟(1)白芨多糖提取將干燥的白芨去皮，切成1.2mm小塊，按體積/質(zhì)量比加入20倍的三蒸水，于4°C下浸泡36小時(shí)，再置于70°C水浴中煎煮4- ，用Imm濾網(wǎng)過(guò)濾，濾液置于4°C 下靜置，濾渣按體積/質(zhì)量比加入5倍體積三蒸水置于70°C中水浴池，重復(fù)煎煮3次，用Imm 濾網(wǎng)過(guò)濾，合并濾液；將上述濾液以超聲波震蕩30min，然后6000g離心20min，收集上清液， 并檢查上清液是否能通過(guò)30G注射器針頭；向所得的上清液中加入10倍體積的無(wú)水乙醇， 攪拌至全部生成細(xì)膩的白色絮狀物，靜置48h，抽濾，收集白色絮狀物，用500目鋼絲濾網(wǎng)擠干；用2倍體積的無(wú)水乙醇重復(fù)洗滌3次，抽濾，收集白色絮狀物，擠干，揉碎至0. Imm粉末， 于70°C下熱風(fēng)干燥，得到白芨多糖提取物，置4°C下保存，備用；(2)白芨多糖鹽溶膠制備按質(zhì)量計(jì)，取分析純NaC132g，分析純KC10.Ig,分析純 MgCl2 · 6H20 0. 5g，分析純和HEPESO. 12g，溶解于IL三蒸水中，得到溶液1，向所述的溶液 1中加入步驟(1)制備的白芨多糖提取物80g，得到白芨多糖鹽溶膠；(3)卵巢催熟用介入藥劑的配制向步驟( 所述的白芨多糖鹽溶膠中每次使用前按體積比為1 50加入多潘立酮注射液，用超聲波混勻得到催熟用介入藥劑；其中步驟(1)和(3)所述的超聲波條件如下Φ25πιπι固定探頭，工作時(shí)間10s，間隙 20s，振幅30um，容器置冰水混合物中。
3.權(quán)利要求1所述的藥物在親蝦卵巢催熟中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于介入式蝦類卵巢催熟藥物及其制備方法與應(yīng)用，其特征包括提取白芨多糖作為載體，制備蝦類血淋巴液特征的白芨多糖溶膠，配制催熟用介入藥劑三步驟。試驗(yàn)表明，同等養(yǎng)殖條件下，對(duì)于卵黃發(fā)生前期的克氏原螯蝦，應(yīng)用本發(fā)明的藥物45天內(nèi)抱卵率不低于切除眼柄組。處理一周內(nèi)死亡率趨近于零。相對(duì)于同等條件下切除雙側(cè)眼柄的一周內(nèi)死亡率71.67％，及切除單側(cè)眼柄組的一周內(nèi)死亡率57.5％。本發(fā)明藥物處理卵黃發(fā)生期克氏原螯蝦45天后抱卵率為84.82％，一周內(nèi)死亡率僅為1.67％，穩(wěn)定且顯著降低死亡率，P＜0.01，并促進(jìn)卵巢同步發(fā)育成熟。本發(fā)明原材料來(lái)源穩(wěn)定，方法簡(jiǎn)單易行，具有作為移除眼柄催熟蝦類卵巢方法的替代方法應(yīng)用的前景。
文檔編號(hào)A61K31/454GK102579475SQ20111000482
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月10日
發(fā)明者劉勝利, 孫瑞杰, 李強(qiáng), 李金梅, 林郁蔥, 袁兆嘉, 袁漢文, 閆建林, 黃文虎, 龔世園, 龔文杰 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)