專利名稱：多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米生物材料領(lǐng)域。尤其涉及一種新型的可用于骨移植或者殘損修復(fù) 的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
由于交通意外、運(yùn)動創(chuàng)傷、社會老齡化等問題的日益突出以及對高水平生活質(zhì)量 的追求，人們對醫(yī)療器械以及生物醫(yī)用材料的需求與日俱增，目前臨床上廣泛使用的骨移 植或者殘損修復(fù)材料是不銹鋼、鈦金屬或者鈦金屬及其合金的表面涂覆材料，但其應(yīng)力屏 蔽效應(yīng)、有害的離子溶出現(xiàn)象以及骨誘導(dǎo)特性和抗腐蝕能力差等往往會導(dǎo)致植入失敗。特 別是植入材料表面不能很好的為細(xì)胞的增殖和分化提供生長場所，并且生物相容性較差， 大大的降低了材料的利用率和使用效果。羥基磷酸鈣(( (PO4)3OH; HA)是高級脊椎動物的骨骼、牙齒的主要無機(jī)成分，具 有良好的生物相容性，植入人體后易與新生骨結(jié)合，但由于HA性脆使得在臨床上很少單獨(dú) 使用HA作為承載的生物材料。近年來，在骨移植或殘損修復(fù)手術(shù)中應(yīng)運(yùn)而生的是將金屬材 料高的強(qiáng)度和韌性以及HA良好的生物相容性相結(jié)合的金屬表面涂敷HA生物支架材料。然 而，這類材料力學(xué)性能偏低，表面孔隙殘缺，成形加工較難、價(jià)格高等問題，使其進(jìn)一步的應(yīng) 用受到限制。理想的人造骨移植或者殘損修復(fù)生物支架材料至少必須具備一下性能(1)它必 需像羥基磷酸鈣那樣在化學(xué)上具有生物相容性；(2)它必需能提供一定的結(jié)構(gòu)完整性，表 面具有像人體自身硬組織一樣的發(fā)達(dá)的微孔結(jié)構(gòu)；(3)它必需可以將生物分子或者藥物導(dǎo) 入該人造材料之中，所說的生物分子例如可以是促進(jìn)形成骨頭的成骨細(xì)胞的骨生長蛋白 質(zhì)，所說藥物例如可以是細(xì)胞的生長因子或者殺菌因子?，F(xiàn)在，從結(jié)構(gòu)和功能化仿生角度出發(fā)，研發(fā)表面具有發(fā)達(dá)微孔結(jié)構(gòu)，良好機(jī)械性 能、加工性能、生物形容性和力學(xué)性能優(yōu)異的生物支架材料已成為當(dāng)前生物材料前沿領(lǐng)域 中的一大研究熱點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生 物支架材料及其制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是該多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的 鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材料是由鈦酸鹽納米線生長于鈦金屬基片上構(gòu)成網(wǎng)格狀微孔 結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線，所述鈦基鈦酸鹽納米線的表面生長有多孔羥基磷酸鈣納米顆粒涂層。本發(fā)明多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材料的制備 方法包括如下步驟(1)將鈦金屬基片于室溫下依次在丙酮、無水乙醇溶液中超聲清洗，后用蒸餾水沖洗干 凈后將該鈦金屬基片轉(zhuǎn)移到含有NaOH和Ba(OH)2 . SH2O的混合溶液的聚四氟乙烯反應(yīng)釜 中密封反應(yīng)，使鈦金屬基片上生長鈦酸鹽納米線得到鈦基鈦酸鹽納米線，該鈦基鈦酸鹽納 米線呈網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)；將鈦基鈦酸鹽納米線用去離子水沖洗至中性，并在空氣中干燥；
(2)恒電流或恒電壓模式下，在三電極反應(yīng)池中，以步驟(1)最終得到的鈦基鈦酸鹽納 米線為工作電極，以類體液為沉積液進(jìn)行沉積以使所述鈦基鈦酸鹽納米線的表面生長多孔 羥基磷酸鈣納米顆粒，得到多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材 料。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述NaOH和Ba (OH)2 . 8H20的混合溶液的濃度是0. 1 10 mol/ L0進(jìn)一步地，本發(fā)明所述步驟(1)的密封反應(yīng)時(shí)間為1 16 h、反應(yīng)溫度為100 280 ° C。進(jìn)一步地，本發(fā)明步驟(2)中，所述類體液(SBF)的組成為NaCl: 8. Og/L、 CaCl2: 0. 14 g/L、KCl: 0. 40 g/L、NaHCO3: 0. 35 g/L、Glucose: 1. 00 g/L、KH2PO4: 0. 10 g/L、MgCl2 · 6H20: 0. 10 g/L, Na2HPO4 · 2H20: 0. 06 g/L、MgSO4 · 7H20: 0. 06 g/L。進(jìn)一步地，本發(fā)明步驟(2)中，所述沉積液的pH為8.0 12. 6，沉積溫度為室溫 90 ° C，沉積電流為-50 50 mA，沉積電壓為-4. 0 4. 0 V，沉積時(shí)間為0. 5 12 h。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所獲得的鈦基鈦酸鹽納米線具有 類骨狀網(wǎng)格微孔結(jié)構(gòu)，鈦基鈦酸鹽納米線表面得到了多孔羥基磷酸鈣納米顆粒的修飾，此 生物支架材料表面發(fā)達(dá)的微孔結(jié)構(gòu)能夠?yàn)榧?xì)胞的增殖和分化提供場所，羥基磷酸鈣納米顆 粒的修飾更加有利于細(xì)胞的增殖和分化，使得其能夠更好地和新生骨結(jié)合，有優(yōu)異的生物 相容性，并且多孔羥基磷酸鈣表面和內(nèi)部存在的大量孔隙結(jié)構(gòu)使本發(fā)明生物支架材料具有 良好的機(jī)械性能，有利于藥物或細(xì)胞生長因子的加載和控制釋放，能夠促進(jìn)新生骨的進(jìn)一 步長入，從而實(shí)現(xiàn)藥物治療和骨移植或殘損修復(fù)的雙重功效。這種材料達(dá)到了結(jié)構(gòu)和功能 化仿生的目的，可作為新一代的骨移植或者殘損修復(fù)的生物支架材料。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明制備方法所需的設(shè)備投資少，原料 低廉且利用率高、生產(chǎn)費(fèi)用低、工藝簡單、易于操作、反應(yīng)條件溫和、便于自動化大量生產(chǎn)以 及所得材料污染少，達(dá)到了現(xiàn)代技術(shù)對于綠色環(huán)保的要求，是一種非常具有前景的制備粒 徑和形狀可控的納米微粒的可行方法，通過本發(fā)明方法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修 飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材料，是本發(fā)明方法優(yōu)點(diǎn)的集中體現(xiàn)。


圖1為本發(fā)明中電化學(xué)法制備多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米 線生物支架材料的裝置的結(jié)構(gòu)簡圖，其中，IM6是提供恒流/恒壓的裝置，WE為工作電極， RE為參比電極，CE為對極。圖2為本發(fā)明中溶鹽合成法制備的具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線的 掃描電子顯微鏡(SEM)圖。圖3為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架的SEM圖。
圖4為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架的X射線能量散射(EDX)圖譜。圖5為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架的X射線衍射(XRD)圖譜。圖6為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架在450 ° C (下曲線)和550 ° C (上曲線)煅燒池后的X射線衍射 (XRD)圖譜。圖7為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架的透射電子顯微鏡(TEM)圖。圖8為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架的高分辨透射電子顯微鏡(HRTEM)圖。圖9為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架的傅里葉變換紅外光譜一衰減全反射(FTIR-ATR)圖譜。圖10為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架在450 ° C (下曲線)和550 ° C (上曲線)煅燒池后的傅里葉變換紅 外光譜-衰減全反射(FTIR-ATR)圖譜。圖11為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架做細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究的掃描電子顯微鏡(SEM)圖。其中，A、B、C、D 分別為MG63細(xì)胞在此生物支架材料上培養(yǎng)1、3、5、7天SEM圖，對應(yīng)的插入圖分別為MG63 細(xì)胞在微孔和多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾過的鈦酸鹽納米線上的培養(yǎng)1、3、5、7的生長 狀態(tài)圖。圖12為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架做細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究的熒光顯微鏡圖。其中，A、B、C、D分別為MG63 細(xì)胞在此生物支架材料上培養(yǎng)1、3、5、7天MG63細(xì)胞生長狀態(tài)圖，對應(yīng)的插入圖分別為MG63 在此生物支架材料上細(xì)胞培養(yǎng)1、3、5、7天細(xì)胞核的熒光顯微鏡圖片。圖13為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架做細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究的四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法測定的直方圖。圖14為本發(fā)明中電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架做細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究的堿性磷酸酶(ALP)活性測定的直方圖。
具體實(shí)施例方式圖1是以下實(shí)施例中使用電化學(xué)沉積法制備多孔狀羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的 鈦基鈦酸鹽納米線生物支架的裝置結(jié)構(gòu)簡圖。如圖1所示，電化學(xué)沉積法制備多孔羥基磷 酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線的裝置結(jié)構(gòu)總體由三部分組成電腦機(jī)用戶控制圖 形軟件部分(例如Time-Controlled DC-Measurements軟件)、核心IM6恒電流/恒電壓輸 出部分、反應(yīng)池部分。以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實(shí)施例1 本實(shí)施例按以下步驟進(jìn)行
(1)溶鹽法制備具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線。具體制備方法是鈦金屬基片于室溫下依次在丙酮和無水乙醇溶液中超聲清洗20分鐘，后用蒸餾水沖洗4次，風(fēng)干 后將此鈦金屬基片轉(zhuǎn)移到含有0. 1 mol/L NaOH和Ba(OH)2 . 8H20的混合溶液的聚四氟乙 烯反應(yīng)釜中密封，在觀0 ° C下反應(yīng)16 h后，得到具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米 線，將鈦基鈦酸鹽納米線用去離子水沖洗至中性，并在空氣中干燥。(2)電化學(xué)沉積法制備多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物 支架。具體制備過程如下在三電極反應(yīng)池中，采用IM6恒電流/恒電壓輸出模式，以步驟 (1)溶鹽法合成的具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線為工作電極，鉬電極為對極，飽 和甘汞電極為參比電極，類體液作為沉積液。類體液(SBF)的組成為NaCl: 8. 0g/L、CaCl2: 0. 14 g/L、KCl: 0. 40 g/L、NaHCO3: 0. 35 g/L、Glucose: 1. 00 g/L、KH2PO4: 0. 10 g/L、 MgCl2 · 6H20: 0. 10 g/L、Na2HPO4 · 2H20: 0. 06 g/L、MgSO4 · 7H20: 0. 06 g/L。沉積液的溫 度為室溫，沉積液的pH為8.0，沉積電流為-50 mA，沉積電壓為-4.0 V，沉積時(shí)間為12 h 條件下得到多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾鈦基鈦酸鹽納米線生物支架。采用日本HITACHI S-4800掃描電子顯微鏡在10 kV高壓下對鈦基鈦酸鹽納米線 形貌進(jìn)行觀察分析。由圖2可見，由溶鹽法制備的具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米 線的微孔在5 50 ym之間，形狀規(guī)則且分布均勻。采用日本HITACHI S-4800掃描電子顯微鏡在10 kV高壓下對多孔羥基磷酸鈣納 米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架的形貌進(jìn)行觀察分析。圖3為多孔羥基磷酸鈣納 米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架的SEM圖。由圖3可見，多孔羥基磷酸鈣納米顆粒 生長在鈦酸鹽納米線上呈現(xiàn)“珍珠項(xiàng)鏈”狀的形貌，多孔羥基磷酸鈣納米顆粒大小在50 500 nm之間，分布均勻，形狀規(guī)則且鈦基鈦酸鹽納米線的微孔結(jié)構(gòu)未受影響。采用隨日本HITACHI S-4800掃描電子顯微鏡附配的X射線能譜(EDX)對多孔羥基 磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架所含有的元素進(jìn)行分析。圖4為多孔羥 基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架的EDX圖。由圖4可見，此生物支架材 料含有鈉、鎂、鈣、磷、鈦、氧元素，含有羥基磷酸鈣和鈦酸鹽納米線所必須的所有元素組成。采用德國Bruker AXS D8 Discover X射線衍射儀以Cu Ka射線(波長λ =0. 15405 nm,掃描步速0. 020° /s)為衍射光源在室溫下對多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦 酸鹽納米線生物支架作X射線衍射(XRD)分析。圖5為多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦 基鈦酸鹽納米線生物支架的XRD圖。由圖5可見，X射線衍射譜圖中2 θ在10° 90°有 羥基磷酸鈣和鈦酸鹽納米線相對應(yīng)的衍射峰，其中，□代表鈦酸鹽納米線對應(yīng)的衍射峰，· 代表羥基磷酸鈣對應(yīng)的衍射峰，羥基磷酸鈣所有的衍射峰均可指標(biāo)為六方晶型，具有作3/歷 的面對稱結(jié)構(gòu)，位置都與標(biāo)準(zhǔn)粉末衍射卡(JCPDS 72-1Μ3)的結(jié)果相一致。圖6為多孔羥 基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架經(jīng)過450 ° C (下曲線)和550 ° C (上曲線)煅燒池后的X射線衍射(XRD)圖譜。由圖6可見，其XRD圖譜并沒有發(fā)生明顯的 變化，由此可見由電化學(xué)法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物 支架其結(jié)構(gòu)性能穩(wěn)定，并不需要煅燒，而現(xiàn)有的大部分制備方法所制備的羥基磷酸鈣基本 上都要經(jīng)過煅燒過程，與現(xiàn)有技術(shù)相比此法在一定程度上簡化了工藝，降低了成本。采用日本JEM 2100F透射電子顯微鏡(TEM)在200 kV高壓下對其多孔羥基磷酸 鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線的形貌進(jìn)行觀察。圖7為多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修 飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架的TEM圖。由圖7可見，多孔羥基磷酸鈣納米顆粒大小約為100 nm，且呈現(xiàn)多孔狀，這進(jìn)一步的為多孔羥基磷酸鈣藥物或細(xì)胞生長因子的加載和控 制釋放提供了依據(jù)。圖8為多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架的 HRTEM圖。由圖8可見，六方的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒的晶格條紋間距0.409 nm和0.345 nm分別對應(yīng)的是其(200)和(002)晶面。采用美國Nicolet 5700 FIlR光譜儀在4000 400 cm —1范圍里面對多孔羥基磷 酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架作FTIR-ATR分析。圖9為多孔羥基磷酸 鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架的FTIR-ATR圖。由圖9可見，1041 cnT1處為 P043_的ν 3震動峰，3698 cnT1處為0H_組分的吸收震動峰，872 cnT1處可能為CO:的V2震 動峰，其〃3震動峰在1453 cnT1 and 1417 cnT1處，1540 cnT1處C032_震動峰的缺失可能表 明有B型取代的HA的生成，即CO:取代羥基磷酸鈣里面的Po/—，這種取代使得此種生物支 架材料更接近于生物體自身的羥基磷酸鈣，使得此生物支架能夠更好地被生物體本體細(xì)胞 和組織接受。圖10為多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架經(jīng)過450 ° C (下曲線)和550 ° C (上曲線)煅燒3h后的FTIR-ATR圖。由圖10可見，其FTIR-ATR 圖譜并沒有發(fā)生明顯的變化，由此可見由電化學(xué)沉積法制備的多孔狀羥基磷酸鈣納米顆粒 修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架具有很好的熱穩(wěn)定性。為了更好地了解本發(fā)明電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦 基鈦酸鹽納米線生物支架的生物相容性，進(jìn)一步對此生物支架還做了細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究。 具體方法如下將此生物支架材料，置于無菌培養(yǎng)板之中，加入體積分?jǐn)?shù)為75%酒精溶液消 毒處理30 min, PBS緩沖液(pH 7. 4)充分浸泡1 h，中間每隔15分鐘進(jìn)行換液，以保證交換 出所有殘留酒精，然后置于紫外燈下照射1.5 h，自然風(fēng)干，滅菌后的生物支架材料用DMEM 培養(yǎng)液(20%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 Pg/mL鏈霉素)浸泡M h，移入對孔無菌培 養(yǎng)板。取500 μ MG63細(xì)胞懸液(1. 0 X IO5個(gè)/mL)接種于含生物支架的培養(yǎng)板中，在37 ° C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)池后，將長方形試樣翻轉(zhuǎn)，向另一側(cè)接種相 同濃度的細(xì)胞懸液500 μ ,繼續(xù)培養(yǎng)2 h。然后每孔加入1 mL DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)板置于 37 ° C、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5% 0)2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，次日換液，以后隔天換培養(yǎng)液一次，共培 養(yǎng)7天。為了了解本發(fā)明電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架上細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞的生長狀態(tài)情況，進(jìn)一步對此生物支架上的細(xì)胞進(jìn)行 掃描電子顯微鏡研究分析。具體方法如下取培養(yǎng)1天的含有樣品的培養(yǎng)板，用PBS緩沖液 (pH 7. 4)清洗樣品2次，吸出清洗液，用體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、50%、60%、70%、80%、90%的 酒精溶液對培養(yǎng)細(xì)胞后的生物支架進(jìn)行梯度脫水處理，每個(gè)體積分?jǐn)?shù)下脫水處理20分鐘， 最后用無水乙醇脫水處理3 5次，每次15分鐘，吸出酒精，自然風(fēng)干后即可進(jìn)行SEM的掃 描。與此類似，3、5、7天的培養(yǎng)細(xì)胞后的生物支架也照上述步驟進(jìn)行操作。為了了解本發(fā)明電化學(xué)沉積法制備的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸 鹽納米線生物支架上細(xì)胞培養(yǎng)后細(xì)胞的生長狀態(tài)情況，進(jìn)一步對此生物支架上的細(xì)胞進(jìn)行 熒光顯微鏡研究分析。具體方法如下取培養(yǎng)1天的含有生物支架的培養(yǎng)板，用PBS緩沖 液(pH 7. 4)清洗樣品2次，每次5分鐘，后吸出清洗液，在室溫下，加入500 μ 1 2. 5%的戊 二醛固定細(xì)胞10分鐘，用含0. 1% Triton X_100的PBS洗滌樣品3次，每次5分鐘，后吸出 洗滌液，加入500 μ 1 Actin-Tracker Green (微絲綠色熒光探針)在培養(yǎng)箱中放置60分鐘，后用含0. 1% Triton X-100的PBS洗滌生物支架3次，每次5分鐘，后吸出洗滌液，加 入500 μ 1 DAPI染色液，室溫下放置10分鐘，用含0. 1% Triton X-100的PBS洗滌樣品 3次，每次5分鐘，完成后即可進(jìn)行熒光顯微鏡的拍攝。與此類似，3、5、7天的樣品也照上述 步驟進(jìn)行操作。為了更好地了解本發(fā)明多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物 支架的細(xì)胞活性和生物相容性，進(jìn)一步對此生物支架做四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法和堿 性磷酸酶(ALP)活性測定分析。MTT法測定過程如下生物支架分別在細(xì)胞接種培養(yǎng)1、3、 5、7天后，用無血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液沖洗該生物支架，以去除未貼壁的細(xì)胞，并將細(xì)胞 /支架材料復(fù)合物移入新的無菌培養(yǎng)板中。每孔加入1 mL無血清的培養(yǎng)液和500 μ MTT 貯存液(5 mg/mL),37 ° C培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，在此過程中有紫色物質(zhì)在支架上形成， 小心吸取培養(yǎng)液，加入500 μ DMS0，并不斷振蕩，使紫色沉淀全部溶解，取200 μ 溶解液轉(zhuǎn) 入對孔板中，酶標(biāo)儀測定其在570 nm處的光密度值(0D)。以純DMEM培養(yǎng)液(即無生物 支架材料)培養(yǎng)時(shí)的0D570為基準(zhǔn)，計(jì)算細(xì)胞增殖能力，每次均做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)試樣，取其平 均值。ALP法測定過程如下將接種培養(yǎng)1、3、5、7天后的生物支架從培養(yǎng)液中取出，用 PBS緩沖液(pH 7. 4)沖洗2次，加入700 μ 消化液靜置5分鐘，用吸管輕輕吹打數(shù)次，后 再加入含血清培養(yǎng)基終止消化，充分?jǐn)D出生物支架中液體后，離心收集細(xì)胞。以PBS緩沖 液(pH 7. 4)漂洗細(xì)胞，再加入500 μ TritonX-IOO (2%)細(xì)胞裂解液，反復(fù)凍融3次裂解 細(xì)胞。用分光光度儀測定細(xì)胞裂解液在520 nm處的光密度值(OD)后，計(jì)算ALP活性。每 次均做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)試樣，取其平均值。
其中，ALP (金氏單位U/100 mL)=(測定管OD/標(biāo)準(zhǔn)管0D) X標(biāo)準(zhǔn)管含酚量(0.005 mg) X (100 mL/0. 05 mL)
采用日本HITACHI S-4800掃描電子顯微鏡在10 kV高壓下對細(xì)胞培養(yǎng)后的多孔羥基 磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架上的細(xì)胞的形貌進(jìn)行觀察分析。圖11 為多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架做細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究的掃 描電子顯微鏡(SEM)圖。A、B、C、D分別為MG63細(xì)胞在此支架材料上培養(yǎng)1、3、5、7天 的SEM圖，相對應(yīng)插入圖為MG63細(xì)胞在此生物支架的微孔和羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦 酸鹽納米線上的生長狀態(tài)圖。由圖11可見，MG63經(jīng)過7天的培養(yǎng)后在此生物支架材料上 鋪展的很開，基本上將羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦酸鹽納米線所包裹，MG63細(xì)胞在此支 架材料上具有良好的粘附、增殖能力。采用美國1X71，Olympus倒置熒光顯微鏡在藍(lán)光(激發(fā)波長420 485 nm)和綠光 (激發(fā)波長460 550 nm)下對MG63細(xì)胞在此生物支架材料上的生長形貌進(jìn)行觀察分析。 圖12為多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架做細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究 的倒置熒光顯微鏡圖。A、B、C、D分別為MG63細(xì)胞在此支架材料上培養(yǎng)1、3、5、7天 MG63細(xì)胞生長狀態(tài)圖，對應(yīng)的插入圖為MG63細(xì)胞核的熒光顯微鏡圖片。由圖12可見，MG63 經(jīng)過7天的培養(yǎng)后在此生物支架材料上有很好的增殖和分化現(xiàn)象，與SEM細(xì)胞電鏡圖片結(jié) 果一致。采用美國Bio-RAD Model680酶標(biāo)儀對樣品進(jìn)行標(biāo)定，計(jì)算其MTT值和ALP值。圖 13細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究的MTT比色法測定直方圖，圖14為細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究的ALP活性測定直方圖，其中，TN代表鈦基鈦酸鹽納米線，HA-TN代表多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基 鈦酸鹽納米線生物支架。由圖13和圖14可見，與單純的鈦基鈦酸鹽納米線相比，MG63細(xì) 胞在多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架上具有良好的粘附、增殖 能力，并可引起早期的骨分化。實(shí)施例2 本實(shí)施例按以下步驟進(jìn)行
(1)溶鹽法制備的具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線。具體制備方法是鈦金 屬基片于室溫下依次在丙酮和無水乙醇溶液中超聲清洗20 min，后用蒸餾水沖洗4次，風(fēng) 干后將此鈦金屬基片轉(zhuǎn)移到含有5. 0 mol/L NaOH和Ba(OH)2 . 8H20的混合溶液的聚四氟 乙烯反應(yīng)釜中密封，在200 ° C下反應(yīng)8 h后，得到具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米 線，將鈦基鈦酸鹽納米線用去離子水沖洗至中性，并在空氣中干燥。(2)電化學(xué)沉積法制備多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支 架。制備過程如下在三電極反應(yīng)池中，采用IM6恒電流/恒電壓輸出模式，以步驟(1)溶 鹽法合成的具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線為工作電極，鉬電極為對極，飽和甘 汞電極為參比電極，以類體液(SBF)作為沉積液(類體液的組成與實(shí)施例1相同)，沉積液溫 度為37 ° C，沉積液的pH為9. 6，沉積電流為-10 mA，沉積電壓為-2. 0 V，沉積時(shí)間為5 h條件下得到多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架。對所得的具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線采用與實(shí)施例1相同的掃描 電子顯微鏡進(jìn)行觀察分析，所得的結(jié)果和實(shí)施例1相同，其微孔在5 50 ym之間，形狀規(guī) 則且分布均勻。對所得的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架采用與實(shí) 施例1相同的SEM、XRD、TEM、HRTEM、FTIR-ATR研究分析，所得的結(jié)果和實(shí)施例1相同。對所得的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架采用與實(shí) 施例1相同的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究以及相應(yīng)的SEM、熒光顯微鏡和MTT、ALP實(shí)驗(yàn)研究分析，所 得的結(jié)果和實(shí)施例1相同。實(shí)施例3 本實(shí)施例按以下步驟進(jìn)行
(1)溶鹽法制備的具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線。具體制備方法是鈦金屬 基片于室溫下依次在丙酮和無水乙醇溶液中超聲清洗20 min，后用蒸餾水沖洗4次，風(fēng)干 后將此鈦金屬基片轉(zhuǎn)移到含有10 mol/L NaOH和Ba(OH)2 . 8H20的混合溶液的聚四氟乙烯 反應(yīng)釜中密封，在100 ° C下反應(yīng)1 h后，得到具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線， 將鈦基鈦酸鹽納米線用去離子水沖洗至中性，并在空氣中干燥。(2)電化學(xué)沉積法制備多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支 架。制備過程如下在三電極反應(yīng)池中，采用IM6恒電流/恒電壓輸出模式，以步驟(1)溶 鹽法合成的具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線為工作電極，鉬電極為對極，飽和甘 汞電極為參比電極，以類體液(SBF)為沉積液(類體液的組成與實(shí)施例1相同)，沉積液溫度 為90 ° C，沉積液的pH為12. 6，沉積電流為50 mA，沉積電壓為4. 0 V，沉積時(shí)間為0. 5 h 條件下得到多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架。對所得的具有網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線采用與實(shí)施例1相同的掃描 電子顯微鏡進(jìn)行觀察分析，所得的結(jié)果和實(shí)施例1相同，其微孔在5 50 ym之間，形狀規(guī) 則且分布均勻。
對所得的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架采用與實(shí) 施例1相同的SEM、XRD、TEM、HRTEM、FTIR-ATR研究分析，所得的結(jié)果和實(shí)施例1相同。對所得的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架采用與實(shí) 施例1相同的細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究以及相應(yīng)的SEM、熒光顯微鏡和MTT、ALP實(shí)驗(yàn)研究分析，所 得的結(jié)果和實(shí)施例1相同。
權(quán)利要求
1.一種多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材料，其特征是 它是由鈦酸鹽納米線生長于鈦金屬基片上構(gòu)成網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線，所述 鈦基鈦酸鹽納米線的表面生長有多孔羥基磷酸鈣納米顆粒涂層。
2.一種多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材料的制備方法， 其特征是，包括如下步驟(1)將鈦金屬基片于室溫下依次在丙酮、無水乙醇溶液中超聲清洗，后用蒸餾水沖洗干 凈后將該鈦金屬基片轉(zhuǎn)移到含有NaOH和Ba(OH)2 . SH2O的混合溶液的聚四氟乙烯反應(yīng)釜 中密封反應(yīng)，使鈦金屬基片上生長鈦酸鹽納米線得到鈦基鈦酸鹽納米線，該鈦基鈦酸鹽納 米線呈網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)；將鈦基鈦酸鹽納米線用去離子水沖洗至中性，并在空氣中干燥；(2)恒電流或恒電壓模式下，在三電極反應(yīng)池中，以步驟(1)最終得到的鈦基鈦酸鹽納 米線為工作電極，以類體液為沉積液進(jìn)行沉積以使所述鈦基鈦酸鹽納米線的表面生長多孔 羥基磷酸鈣納米顆粒，得到多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材 料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支 架材料的制備方法，其特征是所述NaOH和Ba (OH)2 . SH2O的混合溶液的濃度是0. 1 10 mol/L0
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物 支架材料的制備方法，其特征是所述步驟(1)的密封反應(yīng)時(shí)間為1 16 h、反應(yīng)溫度為 100 280 ° C。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物 支架材料的制備方法，其特征是步驟(2)中，所述類體液(SBF)的組成為NaCl: 8. Og/L、 CaCl2: 0. 14 g/L、KCl: 0. 40 g/L、NaHCO3: 0. 35 g/L、Glucose: 1. 00 g/L、KH2PO4: 0. 10 g/L、MgCl2 · 6H20: 0. 10 g/L, Na2HPO4 · 2H20: 0. 06 g/L、MgSO4 · 7H20: 0. 06 g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支 架材料的制備方法，其特征是步驟(2)中，所述沉積液的pH為8. 0 12. 6，沉積溫度為室 溫 90 ° C，沉積電流為-50 50 mA,沉積電壓為-4. 0 4. 0 V，沉積時(shí)間為0. 5 12 h。
全文摘要
本發(fā)明公開一種多孔羥基磷酸鈣納米顆粒修飾的鈦基鈦酸鹽納米線生物支架材料及其制備方法，屬于納米生物材料領(lǐng)域。該生物支架材料是由鈦酸鹽納米線生長于鈦金屬基片上構(gòu)成網(wǎng)格狀微孔結(jié)構(gòu)的鈦基鈦酸鹽納米線，所述鈦基鈦酸鹽納米線的表面生長有多孔羥基磷酸鈣納米顆粒涂層。本發(fā)明通過在鈦基鈦酸鹽納米線上修飾多孔羥基磷酸鈣納米顆粒，可以有效地提高鈦基鈦酸鹽納米線的生物相容性和生物誘導(dǎo)性；同時(shí)，多孔的羥基磷酸鈣表面和內(nèi)部存在大量孔隙，不僅有利于藥物或細(xì)胞生長因子的加載和控制釋放，而且能夠促進(jìn)新生骨的進(jìn)一步長入，從而實(shí)現(xiàn)藥物治療和骨移植或殘損修復(fù)的雙重功效。
文檔編號A61L27/06GK102100927SQ20111002427
公開日2011年6月22日 申請日期2011年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月22日
發(fā)明者董文鈞, 趙海新 申請人:浙江理工大學(xué)