專利名稱：用于捕捉干細(xì)胞的生物材料及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于捕捉干細(xì)胞的生物材料及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞是一類具有自我更新能力，且具有多向分化潛能的細(xì)胞。通常，組織內(nèi)的干細(xì)胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，一旦組織發(fā)生損傷，這些靜止的干細(xì)胞迅速活化并遷移到損傷部位，幫助損傷組織的修復(fù)。干細(xì)胞對維持組織的自我平衡及損傷后組織的再生十分重要。因此， 干細(xì)胞被越來越多的應(yīng)用于多種疾病的治療中，包括大面積創(chuàng)傷或燒傷、心血管類疾病、神經(jīng)類疾病等，并取得了一定的修復(fù)效果，尤其對于心肌、神經(jīng)等再生能力有限的組織，干細(xì)胞治療無疑為患者帶來了治療的新希望。常用的干細(xì)胞主要有具有全系分化潛能的胚胎干細(xì)胞、多系分化潛能的成體干細(xì)胞，包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及一些組織特異性干細(xì)胞。外源性干細(xì)胞的體內(nèi)移植是干細(xì)胞治療的主要手段。然而，由于免疫排斥反應(yīng)，大部分移植的細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷凋亡或壞死，僅有 5%-8%的外源干細(xì)胞可在移植部位存活。再者，體內(nèi)組織的微環(huán)境往往與體外細(xì)胞培養(yǎng)的微環(huán)境相距甚遠(yuǎn)，不適宜外源干細(xì)胞的增殖與分化，是外源干細(xì)胞的移植效率通常較低的另一大原因。此外，胚胎干細(xì)胞的體內(nèi)治療還存在倫理道德方面的局限性，這些問題大大阻礙了干細(xì)胞移植在臨床治療上的應(yīng)用。由此可見利用外源性干細(xì)胞進(jìn)行損傷組織的修復(fù)在短期內(nèi)還面臨很多問題，而利用自體干細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)可以避免上述問題，在短期內(nèi)有可能實(shí)現(xiàn)臨床上的應(yīng)用。皮膚等再生能力較強(qiáng)的組織發(fā)生小面積損傷時(shí)，皮膚組織內(nèi)靜止的干細(xì)胞可自行修復(fù)受損的組織，為自體干細(xì)胞修復(fù)受損組織提供了一定的理論依據(jù)。然而，對于大面積損傷或是再生能力很差的組織，機(jī)體自行可動(dòng)員的干細(xì)胞數(shù)量極其有限，并不能有效的修復(fù)受損的組織。如何有效引導(dǎo)自體干細(xì)胞參與損傷修復(fù)及組織再生是擺在科研人員面前的一大難題。血液循環(huán)系統(tǒng)是體內(nèi)干細(xì)胞的一大儲(chǔ)存庫，其內(nèi)所含造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞等伴隨著血液的流動(dòng)到達(dá)全身各處，這些循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)的干細(xì)胞被認(rèn)為是自體干細(xì)胞治療的潛在的、理想的種子細(xì)胞。目前，自體干細(xì)胞治療的研究多集中于此。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)是一種干細(xì)胞動(dòng)員劑，對造血干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均具有廣泛的動(dòng)員效應(yīng)，被應(yīng)用于心肌、神經(jīng)等再生能力差的組織修復(fù)過程中。在一些心肌損傷動(dòng)物模型中，G-CSF注射后可見心肌細(xì)胞的增殖及心肌功能的恢復(fù)，但是其修復(fù)效果一直存在爭議。在臨床心肌梗塞的治療中，G-CSF注射后，心肌再生及功能恢復(fù)未見實(shí)質(zhì)性的改善。 究其緣由，雖然G-CSF可動(dòng)員自體的造血及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但是其動(dòng)員效應(yīng)并非特異。 干細(xì)胞被動(dòng)員后，廣泛分布于各組織內(nèi)，到達(dá)損傷部位的干細(xì)胞數(shù)量并未有顯著的提高，且隨著血液的流動(dòng)這些干細(xì)胞隨時(shí)可能被帶走，而并不能特異參與到受損組織的修復(fù)與再生過程中。此外，微環(huán)境對細(xì)胞的增殖分化也非常重要，一系列干細(xì)胞及微環(huán)境的相互作用對內(nèi)源自體干細(xì)胞的命運(yùn)決定及功能性分化亦是不可或缺的。干細(xì)胞微環(huán)境調(diào)控的重要手段之一是通過特異的生物材料來調(diào)節(jié)細(xì)胞命運(yùn)。此外，生物材料被廣泛應(yīng)用于組織的靶向修復(fù)過程中，它們不僅為藥物、細(xì)胞的靶向遞送提供載體，同時(shí)又能引導(dǎo)組織的三維重建。比如在心肌的損傷修復(fù)中，生物材料可代替受損的心肌組織或疤痕組織以引導(dǎo)心肌組織的再生，改善心肌功能。在神經(jīng)損傷修復(fù)中，生物材料亦可承載細(xì)胞或特異性生長因子作為靶向修復(fù)的有效載體。研究表明，應(yīng)用于心肌損傷治療的組織工程化心肌補(bǔ)片如細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)可在一定程度上改善心肌功能，然而僅有生物材料并不足以誘導(dǎo)細(xì)胞的浸潤、增殖及分化，其心肌修復(fù)能力也是有限的。而在神經(jīng)損傷修復(fù)中，承載了外源細(xì)胞的生物材料移植入體內(nèi)后，由于細(xì)胞仍帶有免疫原性，部分細(xì)胞仍會(huì)受到機(jī)體免疫分子的攻擊。因此，如果能在損傷部位的生物材料上捕捉足夠數(shù)量的自體干細(xì)胞必將在很大程度上推進(jìn)自體干細(xì)胞修復(fù)受損心肌組織的應(yīng)用，因?yàn)檫@既能消除外源干細(xì)胞帶來的免疫排斥反應(yīng)，另一方面又能克服自體干細(xì)胞治療時(shí)損傷部位干細(xì)胞數(shù)量不足的問題。抗體可與其抗原特異性結(jié)合，這一特性推動(dòng)了它在靶向治療中的應(yīng)用，目前大約有300種抗體類藥物被開發(fā)，且部分已進(jìn)入臨床評價(jià)階段。在腫瘤治療中，偶聯(lián)免疫相關(guān)抗原和腫瘤相關(guān)抗原的雙向抗體可直接募集免疫效應(yīng)細(xì)胞至腫瘤，并殺死腫瘤細(xì)胞。在心血管疾病治療中，偶聯(lián)造血干細(xì)胞特異標(biāo)志的CD45和心肌特異抗原MLC的雙向抗體可攜帶外源造血干細(xì)胞至心臟并幫助受損心肌的再生。膠原蛋白存在于體內(nèi)許多組織內(nèi)，是體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的主要組成成分之一。膠原材料為組織提供機(jī)械支撐，維持器官與組織的完整性。此外，膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，可作為細(xì)胞依附、生長的支架，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移、增殖及分化。Sca-I是Ly-6基因家族的一員，是小鼠造血干細(xì)胞的特異標(biāo)志物。有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞等也表達(dá)這一標(biāo)志物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于捕捉干細(xì)胞的生物材料的制備方法。本發(fā)明提供的用于捕捉干細(xì)胞的生物材料的制備方法，是將膠原材料與Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)，得到所述用于捕捉干細(xì)胞的生物材料。上述膠原材料為膠原凝膠、脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料或膠原膜。上述共價(jià)交聯(lián)是通過化學(xué)交聯(lián)劑作用完成的。上述化學(xué)交聯(lián)劑為Sulfo-SMCC 和 Traut’ s Reagent。上述共價(jià)交聯(lián)的步驟包括如下I)將Traut’ s Reagent與膠原材料一起反應(yīng)2小時(shí),獲得膠原-Traut’ s化合物； 將Sulfo-SMCC與Sca-I抗體孵育I小時(shí)，獲得抗體-Sulfo-SMCC化合物；2)再將上述步驟I)中獲得的膠原-Traut’ s化合物和抗體-Sulfo-SMCC化合物混合孵育，孵育的時(shí)間為O. 5-2小時(shí)，優(yōu)選為I小時(shí)，得到所述用于捕捉干細(xì)胞的生物材料。步驟I)中，上述膠原材料、Trautj s Reagent、SuIfo-SMCC和Sca-I抗體為如下
(1)-(3)中任一所述(I)膠原材料為膠原凝膠,膠原凝膠、Trautj s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的質(zhì)量比為 O. 2-0. 4mg O. 2-0. 3mg O. 4-0. 7 μ g 2-3 μ g ；(2)膠原材料為脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料，脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料、Traut’ sReagent、SuIfo-SMCC 和 Sca-I 抗體的比例為:1 簇:O. 3-0. 6mg I. 5-1. 8 μ g 4-6 μ g ； 所述I簇的規(guī)格是20-40mm3,優(yōu)選是30mm3 ；(3)膠原材料為膠原膜，膠原膜、Traut’ s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的比例為1簇O. 3-0. 6mg 3-4 μ g 8-12 μ g，所述I簇的規(guī)格是5_15_2，優(yōu)選是9mm2。其中，上述(I)中Traut’ s Reagent的濃度為2-3mg/ml, Sca-I抗體的濃度為 O. 4-0. 6 μ g/ μ 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 O. 4-0. 6mg/ml ；上述⑵中Traut’ s Reagent的濃度為4-6mg/ml, Sca-I抗體的濃度為
O.4-0. 6 μ g/ μ 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 O. 4-0. 6mg/ml ；上述(3)中Traut’ s Reagent的濃度為4-6mg/ml, Sca-I抗體的濃度為
O.4-0. 6 μ g/ μ 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 O. 4-0. 6mg/ml。上述共價(jià)交聯(lián)的步驟中各物質(zhì)的用量和濃度優(yōu)選為所述⑴中膠原凝膠、Traut’ sReagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的質(zhì)量比為
0.3mg : 0. 25mg : O. 58 μ g : 2. 5 μ g，所述 Traut，s Reagent 的濃度為 2. 5mg/ml, Sca-1 抗體的濃度為0. 5 μ g/ μ I, Sulfo-SMCC的濃度為O. 5mg/ml ；所述(2)中脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料、Traut’ s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的比例為1 簇0. 5mg : I. 66 μ g : 5 μ g,所述 Traut’ s Reagent 的濃度為 5mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 O. 5 μ g/ μ I, Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 5mg/ml ；所述(3)中膠原膜、Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC 和 Sca-1 抗體的比例為1 簇0. 5mg : 3. 32 μ g : 10 μ g,所述 Traut’s Reagent 的濃度為 5mg/ml, Sca_l 抗體的濃度為 O. 5 μ g/ μ 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 5mg/ml。上述的Sulfo-SMCC是溶解于一緩沖液中的，該緩沖液的配置方法如下將8g NaCl.O. 2g KCl、I. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶于 IL 蒸餾水，然后再將 4mmol 的 EDTA 溶于上述蒸餾水中，最后調(diào)pH至7. 2。上述的Traut’ s Reagent是溶解于另一緩沖液中的，該緩沖液的配置方法如下 將 8gNaCl、0. 2g KCl ,1. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶于 IL 蒸餾水，然后再將 4mmol 的 EDTA溶于上述蒸餾水中，最后調(diào)pH至8. O。上述的Sca-I抗體是溶解于又一緩沖液中的，該緩沖液的配置方法如下將8g NaCl.O. 2g KC1、1. 44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶于 IL 蒸餾水，調(diào) pH 至 7. O。上述制備方法得到的用于捕捉干細(xì)胞的生物材料也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述本發(fā)明方法制備得到的生物材料在制備組織修復(fù)材料中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體的組織修復(fù)材料可以是心肌補(bǔ)片。本發(fā)明是根據(jù)抗體可與細(xì)胞上的特異性抗原結(jié)合的特性，提出的一種新的功能性生物材料——偶聯(lián)干細(xì)胞特異性抗體的生物材料，以達(dá)到體內(nèi)在特定的損傷部位特異性捕捉自體干細(xì)胞的目的。本發(fā)明使用的膠原材料可以為一種免疫原性低、可降解及生物相容性良好的天然生物材料，能夠引導(dǎo)組織再生。本發(fā)明通過化學(xué)交聯(lián)的方法將Sca-I單克隆抗體錨定到膠原材料上。實(shí)驗(yàn)證明通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)交聯(lián)有Sca-I抗體的膠原材料可有效捕捉Sca-I 陽性的造血干細(xì)胞，且這種通過抗原抗體相互作用的捕捉方法并不影響干細(xì)胞的分化能力；通過肌肉包埋實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這種交聯(lián)了 Sca-I抗體的膠原材料亦可在體內(nèi)捕捉相當(dāng)數(shù)量的Sca-I陽性細(xì)胞；對本發(fā)明進(jìn)行了功能性評價(jià)，將這種交聯(lián)有Sca-I抗體的膠原材料作為心肌補(bǔ)片應(yīng)用于心肌修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，手術(shù)90天后可觀察到明顯的心肌再生且伴隨著心肌功能的恢復(fù)，取得了良好的修復(fù)的效果。由于血液循環(huán)系統(tǒng)遍及全身，因此本發(fā)明的生物材料不僅可應(yīng)用于心肌組織的修補(bǔ)，還可應(yīng)用于其它組織的損傷修復(fù)，如血供豐富的腦、肝臟、腎臟、皮膚、骨組織等。所以本發(fā)明的生物材料在組織器官損傷修復(fù)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例I使用的交聯(lián)反應(yīng)的示意圖。圖2為本發(fā)明的生物材料捕捉干細(xì)胞示意圖。圖3為不同處理下抗體在膠原材料上的存留量，圖中A，膠原為膠原凝膠時(shí)的結(jié)果；B，膠原為DBM膠原材料時(shí)的結(jié)果；C，膠原為膠原膜時(shí)的結(jié)果；C/PBS表示單純膠原組； C/Sca-Ι表示膠原和Sca-I抗體簡單吸附；CXBSA表示膠原和BSA蛋白共價(jià)交聯(lián)；CXSca_l 表示膠原和Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)。圖4為交聯(lián)Sca-I抗體的膠原凝膠體外捕捉Sca-I陽性細(xì)胞及鑒定，圖中A :交聯(lián)Sca-I抗體的膠原凝膠體外可捕捉大量細(xì)胞；圖中C/PBS :單純膠原組；C/Sca-1 :膠原/ Sca-I抗體簡單吸附；CXBSA :膠原/BSA蛋白共價(jià)交聯(lián)；CXSca_l :膠原/Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)；B :克隆形成實(shí)驗(yàn)；C :流式分選結(jié)果。圖5為肌肉包埋實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證交聯(lián)Sca-I抗體的膠原材料在體內(nèi)具有捕捉干細(xì)胞的能力，圖中CXBSA :膠原/BSA蛋白共價(jià)交聯(lián)；CXSca-l :膠原/Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)。圖6為手術(shù)4周后小鼠心肌修復(fù)的病理學(xué)檢測分析，圖中A，膠原和BSA交聯(lián)組的 HE染色；B，膠原和Sca-I抗體交聯(lián)組的HE染色；C，膠原和BSA交聯(lián)組的細(xì)胞數(shù)目；D，膠原和Sca-I抗體交聯(lián)組的細(xì)胞數(shù)目；E，膠原和BSA交聯(lián)組的血管數(shù)目；F，膠原和Sca-I抗體交聯(lián)組的血管數(shù)目；G，細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)；H，血管數(shù)目統(tǒng)計(jì)，G、H中CXBSA表示膠原/BSA蛋白共價(jià)交聯(lián)；CXSca-I表示膠原/Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)。圖7為手術(shù)12周后小鼠心肌修復(fù)的病理學(xué)及功能學(xué)檢測分析，圖中A，膠原和BSA 交聯(lián)組的HE染色；B，膠原和Sca-I抗體交聯(lián)組的HE染色；C，膠原和BSA交聯(lián)組的細(xì)胞數(shù)目；D，膠原和Sca-I抗體交聯(lián)組的細(xì)胞數(shù)目；E、G，膠原和BSA交聯(lián)組的肌纖維染色；F、H，膠原和Sca-I抗體交聯(lián)組的肌纖維染色；1，細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)；J，肌纖維陽性率的統(tǒng)計(jì)；K，超聲心動(dòng)射血分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)山，超聲心動(dòng)縮短分?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I、用于捕捉干細(xì)胞的生物材料的制備I、化學(xué)交聯(lián)劑準(zhǔn)備和共價(jià)交聯(lián)原理本實(shí)施例中選用的化學(xué)交聯(lián)劑是2-亞氨基噻吩(Traut’s Reagent,購自Sigma公司)和璜基琥珀酰亞胺4-[N-甲基馬來酸]-I-羧環(huán)乙烷(Sulfo-SMCC，購自Sigma公司)。共價(jià)交聯(lián)作用的原理通過共價(jià)交聯(lián)的方法用交聯(lián)劑2-亞氨基噻吩(Traut’sReagent)和璜基琥珀酰亞胺4_[N_甲基馬來酸]_1_羧環(huán)乙烷(Sulfo-SMCC)將細(xì)胞特異的抗體固定在膠原材料上，從而在體外和體內(nèi)捕捉干細(xì)胞。其中Traut’ s Reagent 是一種環(huán)形的交聯(lián)劑，可與膠原分子中N末端的氨基(-NH2)發(fā)生反應(yīng)，將巰基(-SH2)基團(tuán)添加到膠原分子上；而Sulfo-SMCC是一種雙功能交聯(lián)劑，分子兩端分別含有羥基琥珀酰亞胺基(N-hydroxysuccinimide ester group, NHS)和馬來酸亞胺基(maleimide group), Sulfo-SMCC中的NHS可與氨基(-NH2)反應(yīng)，而Sulfo-SMCC中的馬來酰亞胺基可與巰基 (-SH)反應(yīng)。本實(shí)施例中，Sulfo-SMCC通過一端的NHS基團(tuán)與Sca-I抗體的氨基反應(yīng)與抗體相連，而另一端的馬來酰亞胺基團(tuán)則可與含有巰基(-SH)基團(tuán)的膠原分子反應(yīng)，將Sca-I 抗體與膠原分子共價(jià)交聯(lián)在一起(如圖I所示)。其生物材料捕捉干細(xì)胞的狀態(tài)如圖2所示，A為未進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)干細(xì)胞特異性抗體的膠原材料捕捉干細(xì)胞的情況，B為本發(fā)明共價(jià)交聯(lián)了干細(xì)胞特異性抗體的生物材料捕捉干細(xì)胞的情況。本實(shí)施例中①Traut’ s Reagent :采用pH 8. O,含4mM EDTA的PBS緩沖液(配置方法如下將 8g NaCl.O. 2g KCl、1.44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶于 IL 蒸餾水， 然后再將4mmol的EDTA溶于上述蒸餾水中，最后調(diào)pH至8. 0)溶解，取2. 5mg和5mg的 Traut’ sReagent 分別溶于 Iml pH 8. O,EDTA 4mM PBS 緩沖液中，得到 2. 5mg/ml 和 5mg/ml 的Traut，s試劑。②Sulfo-SMCC :采用pH 7. 2，含4mM EDTA的PBS緩沖液(配置方法如下將8g NaCl.O. 2g KCl、1.44g Na2HP04和0. 24g KH2P04溶于 IL蒸餾水，然后再將4mmol 的EDTA溶于上述蒸餾水中，最后調(diào)PH至7. 2)溶解，取2mg的Sulfo-SMCC溶于4ml pH 7. 2,EDTA4mM PBS緩沖液，得到O. 5mg/ml的Sulfo-SMCC試劑。③Sca-I抗體購自RD公司(MAB1226)，500 μ g溶于Iml PBS緩沖液(配置方法如下將 8g NaCl.O. 2g KCl、1.44g Na2HP04 和 0. 24g KH2P04 溶于 IL 蒸餾水，調(diào) pH至 7· 0) 使其終濃度為0. 5 μ g/ μ I。2、用于捕捉干細(xì)胞的生物材料的獲得本實(shí)施例中設(shè)置了 3組實(shí)驗(yàn)，分別制備3種生物材料，該生物材料分別是膠原凝膠XSca-I抗體材料(即膠原凝膠與Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)的生物材料)、DBMXSca-I抗體材料(即DBM膠原材料與Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)的生物材料)和膠原膜XSca-I抗體材料 (即膠原膜與Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)的生物材料)。每組實(shí)驗(yàn)做3次平行，3組實(shí)驗(yàn)材料分別安排如下(I)膠原凝膠X Sca-I組實(shí)驗(yàn)所用的膠原凝膠由100 μ I，3mg/ml的I型膠原鋪 96孔板吹干而得到，其中I型膠原由鼠尾提取經(jīng)2M/L醋酸溶解得到(制備方法如下取新鮮大鼠尾，洗凈，在酒精中浸泡15分鐘消毒。將鼠尾用剪刀分成大約2cm的若干段。將鼠尾腱擠出，放于蒸餾水中，避免風(fēng)干。用PBS (pH =7. 0-7. 5,1. 5M NaCl)浸泡尾腱，4度處理 2天，換液4-6次。用預(yù)冷的2mol/L乙酸浸泡，體積根據(jù)最終需要的濃度掌握。4°C酸抽提 2天，4°C離心，2000g 10分鐘。上清即為鼠尾膠原。)。Traut’ s 試劑的濃度為 2. 5mg/ml,每個(gè)反應(yīng)取 100 μ I ； SuIfo-SMCC 的濃度為0. 5mg/ml,每個(gè)反應(yīng)取I. 16 μ ;Sca_l抗體濃度為0. 5yg/yl,每個(gè)反應(yīng)取5μ I。即膠原凝膠、Traut’ s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的質(zhì)量比為
0.3mg : 0. 25mg : 0. 58 μ g : 2. 5 μ g。
(2) DBMX Sca-I組膠原材料采用脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料(DBM膠原材料)(購自山東正海生物有限公司)，經(jīng)Co6ci滅菌，用量為I簇，規(guī)格是5X3X2mm，即30mm3 Jrauf s 試劑的濃度為5mg/ml，每個(gè)反應(yīng)取100 μ I ；SuIfo-SMCC的濃度為O. 5mg/ml,每個(gè)反應(yīng)取
3.32 μ I ；Sca-l抗體濃度為O. 5 μ g/μ 1，每個(gè)反應(yīng)取10 μ I。即脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料、 Traut’s Reagent、Sulfo-SMCC 和 Sca-1 抗體的比例為I 族O. 5mg : I. 66 μ g : 5 μ go(3)膠原膜XSca-I組膠原材料采用膠原膜(購自山東正海生物有限公司， I簇的規(guī)格是3X3mm,即9mm2),經(jīng)Co6°滅菌；Traut’ s試劑的濃度為5mg/ml,每個(gè)反應(yīng)取 100 μ I ；SuIfo-SMCC 的濃度為 O. 5mg/ml，每個(gè)反應(yīng)取 6. 64 μ I ;Sca_l 抗體濃度為 O. 5 μ g/ μ 1，每個(gè)反應(yīng)取20 μ I。即膠原膜、Traut’s Reagent、Sulfo_SMCC和Sca-1抗體的比例為 I 簇O. 5mg 3. 32μ g 10 μ g。按上述3組實(shí)驗(yàn)安排的膠原材料、化學(xué)交聯(lián)劑的濃度以及Sca-I抗體的用量進(jìn)行制備上述三種生物材料，具體步驟如下I)取Traut’ s試劑與膠原材料于室溫反應(yīng)2小時(shí)，生成膠原-Traut’ s化合物； 同時(shí)取Sulfo-SMCC試劑與Sca-I抗體孵育I小時(shí)，生成抗體-Sulfo-SMCC化合物。2)然后將上述步驟I)中得到的膠原-Traut’ s化合物和抗體-Sulfo-SMCC化合物混合于室溫孵育I小時(shí)，將Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)到膠原材料上，即得到本發(fā)明的用于捕捉干細(xì)胞的生物材料。通過Elisa檢測制備得到的三種生物材料(膠原凝膠XSca-I抗體材料、DBMX 抗體材料和膠原膜X Sca-I抗體材料)中Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)到膠原材料上的效率。具體方法為Sca-I抗體固定到材料后，5% BSA溶液(購自Sigma公司)室溫孵育I小時(shí)。加入 100 μ I抗大鼠堿性磷酸酶二抗(PBS緩沖液I : 20000稀釋)(購自Sigma公司)室溫孵育 I小時(shí)后PBS緩沖液清洗3次，加入溶于堿性磷酸酶緩沖液(IOOmM Tris-HCl ； IOOmM NaCl ； IOmM MgCl2, pH 9. 6)的2mg/ml的顯色底物對氧磷(p-NPP,購自Ameresco公司)進(jìn)行顯色。酶標(biāo)儀0D405nm進(jìn)行讀數(shù)，分別檢測了不同處理下抗體在膠原材料上的存留量。針對每種生物材料設(shè)置以下3個(gè)對照單純膠原組(C/PBS):膠原凝膠、DBM膠原材料、膠原膜分別在室溫下浸泡于PBS緩沖液中I小時(shí)。膠原材料簡單吸附Sca-I抗體組(C/Sca_l):膠原凝膠室溫下浸泡于含有
2.5 μ gSca-1抗體溶液中I小時(shí)；DBM膠原材料室溫下浸泡于含有5 μ g Sca-I抗體溶液中 I小時(shí)；膠原膜室溫下浸泡于含有10 μ g Sca-I抗體溶液中I小時(shí)。膠原XBSA蛋白材料(CXBSA):取Traut’s試劑與各個(gè)膠原材料(膠原凝膠、DBM 膠原材料或膠原膜)于室溫反應(yīng)2小時(shí)，生成膠原-Traut’s化合物；同時(shí)取Sulf0-SMCC試劑與和Sca-I抗體等摩爾數(shù)的BSA孵育I小時(shí)，生成抗體-Sulf0-SMCC化合物。然后將膠原-Traut’ s化合物和BSA蛋白-Sulfo-SMCC化合物混合于室溫孵育I小時(shí)，將BSA蛋白共價(jià)交聯(lián)到膠原材料上。其中，當(dāng)膠原材料為膠原凝膠時(shí)，除BSA以外的各物質(zhì)用量與上述
(I)膠原凝膠XSca-I組中的用量相同，BSA用量與(I)組中Sca-I抗體用量等摩爾；當(dāng)膠原材料為DBM膠原材料時(shí)，除BSA以外的各物質(zhì)用量與上述(2)DBMXSca-I組中的用量相同，BSA用量與(2)組Sca-I抗體等摩爾；當(dāng)膠原材料為膠原膜時(shí)，除BSA以外的各物質(zhì)用量與上述(3)膠原膜XSca-I組中的用量相同，BSA用量與(3)組中Sca-I抗體等摩爾。
結(jié)果如圖3所示，共價(jià)交聯(lián)后Sca-I抗體在各類膠原材料上存留顯著高于其它各組，可見共價(jià)交聯(lián)能夠有效的將抗體固定在膠原材料上。實(shí)施例2、用于捕捉干細(xì)胞的生物材料的功能檢測一、體外實(shí)驗(yàn)在體外驗(yàn)證固定有Sca-I抗體的膠原材料是否具有捕捉Sca-I陽性細(xì)胞的能力。 由于C57BL/6小鼠的骨髓腔是Sca-I陽性細(xì)胞的聚集處，可在體外分離C57BL/6的骨髓腔中的細(xì)胞，本實(shí)施例中具體采用C57BL/6小鼠全骨髓細(xì)胞，將C57BL/6小鼠全骨髓細(xì)胞加到功能材料上以驗(yàn)證體外情況下功能材料捕捉干細(xì)胞的能力。本實(shí)驗(yàn)所用的生物材料是膠原凝膠XSca-I抗體材料；同時(shí)以上述的C/PBS、C/ Sca-I和CXBSA為對照。具體實(shí)驗(yàn)如下將5%牛血清白蛋白(BSA)室溫孵育I小時(shí)，同時(shí)制備C57BL/6小鼠全骨髓細(xì)胞， 用含22號針頭的注射器將骨髓從C57BL/6小鼠的后腿的股骨和脛骨中沖出，隨后用紅細(xì)胞裂解液(1.5M NH4C1 UOOnM KHC03、10nM Na4EDTA)去除紅細(xì)胞，得到C57BL/6小鼠全骨髓細(xì)胞。BSA孵育材料完畢后，將IO5ceIls/孔的全骨髓細(xì)胞加入至不同處理的膠原凝膠(膠原凝膠XSca-I抗體材料、C/PBS、C/Sca-1或CXBSA)上，室溫?fù)u床孵育30分鐘，去除細(xì)胞懸液，PBS清洗3次。用O. 2%膠原酶將滯留在凝膠上的細(xì)胞消化下來，進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)并進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，在體外，交聯(lián)了 Sca-I抗體的膠原凝膠(即膠原凝膠XSca-I抗體材料)可富集大量細(xì)胞，而單純膠原組(C/PBS)、膠原材料簡單吸附Sca-I 抗體組(C/Sca-Ι)及BSA蛋白/膠原材料共價(jià)交聯(lián)蛋白組(CXBSA)細(xì)胞零星分布，說明對照組并不具有富集細(xì)胞的能力。隨后，將滯留在Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)膠原凝膠上的細(xì)胞進(jìn)行了克隆形成率實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞具有多向分化潛能，能夠分化為紅細(xì)胞系集落形成單位(CFU-E)、紅細(xì)胞裂解形成單位(BFU-E)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位(CFU-GM)、粒細(xì)胞-幼紅細(xì)胞-單核細(xì)胞-巨核細(xì)胞集落形成單位(CFU-GEMM)等克隆，而單純的全骨髓細(xì)胞主要形成CFU-GM。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，如圖4中C所示，Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)膠原組的細(xì)胞Sca-I的陽性率為69. 2±6. 5，而未分選的細(xì)胞陽性率為14. 5±1. 3，兩者具有極其顯著差。二、體內(nèi)驗(yàn)證在上述步驟一中的體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了共價(jià)交聯(lián)Sca-I抗體的膠原材料具有捕捉 Sca-I陽性細(xì)胞的能力之后，本步驟二中進(jìn)一步進(jìn)行了體內(nèi)驗(yàn)證。具體為首先，采用肌肉包埋的方法驗(yàn)證本發(fā)明的生物材料在體內(nèi)是否具有捕捉干細(xì)胞的能力，隨后，將本發(fā)明的生物材料以心肌補(bǔ)片的形式移植入小鼠心臟以驗(yàn)證其在心肌損傷上的修復(fù)效果。I、肌肉包埋實(shí)驗(yàn)取5X3X2mm的DBM膠原材料經(jīng)Co60滅菌，將Sca-1抗體及與Sca-1抗體等量的BSA蛋白經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)錨定在DBM膠原材料上，構(gòu)成DBMXSca-I抗體材料和DBMX BSA蛋白材料(CXBSA)對照。將C57BL/6小鼠大腿肌肉進(jìn)行橫斷，破壞其動(dòng)脈，隨后將制備好的 DBMXSca-I抗體材料或CXBSA對照移植入小鼠大腿肌肉內(nèi)。48小時(shí)后，將移植后的膠原支架取出，膠原酶消化后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，DBMXSca-I抗體材料包埋入C56/BL6小鼠肌肉內(nèi)2天后，膠原酶消化獲得細(xì)胞。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果，顯示DBMX Sca-I抗體材料內(nèi)Sca-I干細(xì)胞陽性率為11. 96±1. 62，而CXBSA對照膠原內(nèi)Sca-I干細(xì)胞陽性率為3. 59±1. 01，具有極顯
著性差異。2、心肌補(bǔ)片實(shí)驗(yàn)取3X3mm的膠原膜經(jīng)Co6°滅菌，將Sca-I抗體及與Sca-I抗體等量的BSA蛋白經(jīng)交聯(lián)反應(yīng)分別錨定在膠原膜上，構(gòu)成膠原膜XSca-I抗體材料和膠原膜XBSA蛋白材料。將C57/BL6小鼠麻醉后，進(jìn)行開胸手術(shù)。待心臟暴露后，在無血管左心室壁上切除 2X2. 5X0. 5mm心肌組織，將本發(fā)明生物材料(膠原膜XSca-I抗體材料或膠原膜XBSA蛋白材料對照)分別作為心肌補(bǔ)片縫合在傷口部位。手術(shù)后30天、90天取材進(jìn)行病理學(xué)切片分析，手術(shù)后90天進(jìn)行超聲心動(dòng)功能分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖6和圖7所示，在小鼠心肌補(bǔ)片手術(shù)4、12周后，將包埋有材料的心臟取出并進(jìn)行一系列病理學(xué)及功能學(xué)檢測分析。結(jié)果顯示，手術(shù)4周后，膠原Sca-I抗體交聯(lián)組中膠原已出現(xiàn)轉(zhuǎn)型重構(gòu)(remodeling)，膠原纖維排列有序，而膠原BSA交聯(lián)組中膠原排列雜亂無章。且膠原Sca-I抗體交聯(lián)組中材料內(nèi)浸潤的細(xì)胞數(shù)目明顯多于膠原BSA交聯(lián)組，具有顯著性差異。此外，我們還檢測了材料內(nèi)血管網(wǎng)絡(luò)的重建，發(fā)現(xiàn)膠原Sca-I抗體交聯(lián)組中材料內(nèi)的血管數(shù)目亦顯著多于膠原BSA交聯(lián)組(如圖5所示)。手術(shù)12周后，膠原 Sca-I抗體交聯(lián)組中膠原材料排列已完全降解，其排列與正常心肌組織類似，且出現(xiàn)心肌細(xì)胞的再生。而膠原BSA交聯(lián)組中膠原材料仍未全部降解，其排列雜亂無章，且?guī)缀跷匆娦募〖?xì)胞的再生。同時(shí)，我們通過超聲心動(dòng)檢測了心臟功能。膠原Sca-I抗體交聯(lián)組中，小鼠的左心室射血分?jǐn)?shù)及縮短分?jǐn)?shù)均高于膠原BSA交聯(lián)組(如圖7所示)。綜上，干細(xì)胞特異性抗體Sca-I抗體通過共價(jià)交聯(lián)的方法錨定在膠原材料上，得到的本發(fā)明的生物材料，無論在體外實(shí)驗(yàn)還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均可捕捉足夠數(shù)量的Sca-I陽性干細(xì)胞，且并不影響干細(xì)胞的活性。當(dāng)該功能性膠原材料移植入受損心肌部位，手術(shù)90天后可觀察到明顯的心肌再生且伴隨著心肌功能的恢復(fù)。
權(quán)利要求
1.用于捕捉干細(xì)胞的生物材料的制備方法，是將膠原材料與Sca-I抗體共價(jià)交聯(lián)，得到所述用于捕捉干細(xì)胞的生物材料。
2.如權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于所述膠原材料為膠原凝膠、脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料或膠原膜。
3.如權(quán)利要求I或2所述的制備方法，其特征在于所述共價(jià)交聯(lián)是通過化學(xué)交聯(lián)劑作用完成的。
4.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述化學(xué)交聯(lián)劑為Sulfo-SMCC和 Traut’ s Reagent。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的制備方法，其特征在于所述共價(jià)交聯(lián)的步驟包括如下1)將所述Traut’ s Reagent與所述膠原材料一起反應(yīng)2小時(shí),獲得膠原-Traut ’ s化合物；將所述Sulfo-SMCC與所述Sca-I抗體孵育I小時(shí)，獲得抗體-Sulf0-SMCC化合物；2)再將上述步驟I)中獲得的膠原-Traut’ s化合物和抗體-Sulfo-SMCC化合物混合孵育，所述孵育的時(shí)間為0. 5-2小時(shí)，優(yōu)選為I小時(shí)，得到所述用于捕捉干細(xì)胞的生物材料。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于步驟I)中，所述膠原材料、 Trautj sReagent、Sulfo-SMCC 和 Sca-I 抗體為如下(1)-(3)中任一所述(1)膠原材料為膠原凝膠，膠原凝膠、Trautjs Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-I抗體的質(zhì)量比為 0. 2-0. 4mg : 0. 2-0. 3mg : 0. 4-0. 7 u g ； 2-3 u g ；(2)膠原材料為脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料，脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料、Traufs Reagent、 Sulfo-SMCC 和 Sca-I 抗體的比例為:1 簇:0. 3-0. 6mg I. 5-1. 8u g 4-6 u g ;所述 I 簇的規(guī)格是20-40mm3,優(yōu)選是30mm3 ；(3)膠原材料為膠原膜，膠原膜、Traufs Reagent、Sulf0-SMCC和Sca-I抗體的比例為1 簇0.3-0.6mg 3-4 u g 8-12 y g，所述 I 簇的規(guī)格是 5_15mm2，優(yōu)選是 9mm2。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法,其特征在于所述(I)中Traut’s Reagent的濃度為 2_3mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 0. 4-0. 6 u g/ u I, Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 4-0. 6mg/ml ；所述(2)中 Traut’ s Reagent 的濃度為 4_6mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 0. 4-0. 6 u g/ U 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 4-0. 6mg/ml ；所述(3)中 Traut’ s Reagent 的濃度為 4_6mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 0. 4-0. 6 u g/ U 1，Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 4-0. 6mg/ml。
8.如權(quán)利要求6或7所述的制備方法，其特征在于所述⑴中膠原凝膠、Traut’ sReagent、Sulfo-SMCC和Sca-1抗體的質(zhì)量比為 0. 3mg : 0. 25mg : 0. 58 u g : 2. 5 u g,所述 Traut’ s Reagent 的濃度為 2. 5mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為0. 5U g/u I, Sulfo-SMCC的濃度為0. 5mg/ml ；所述(2)中脫細(xì)胞骨基質(zhì)膠原材料、Traut’ s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-I抗體的比例為1 族0. 5mg : I. 66 u g : 5 y g,所述 Traut’ s Reagent 的濃度為 5mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為0. 5U g/u I, Sulfo-SMCC的濃度為0. 5mg/ml ；所述⑶中膠原膜、Traut’ s Reagent、Sulfo-SMCC和Sca-I抗體的比例為1 簇0. 5mg : 3. 32 u g : 10 y g,所述 Traut’s Reagent 的濃度為 5mg/ml, Sca-I 抗體的濃度為 0. 5u g/u I, Sulfo-SMCC 的濃度為 0. 5mg/ml。
9.權(quán)利要求1-8中任一所述制備方法得到的用于捕捉干細(xì)胞的生物材料。
10.權(quán)利要求9所述的生物材料在制備組織修復(fù)材料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于捕捉干細(xì)胞的生物材料及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明提供的方法是將膠原材料與Sca-1抗體共價(jià)交聯(lián)，得到所述用于捕捉干細(xì)胞的生物材料。本發(fā)明是根據(jù)抗體可與細(xì)胞上的特異性抗原結(jié)合的特性，提出的一種新的功能性生物材料-偶聯(lián)干細(xì)胞特異性抗體的生物材料，以達(dá)到體內(nèi)在特定的損傷部位特異性捕捉自體干細(xì)胞的目的。本發(fā)明的生物材料不僅可應(yīng)用于心肌組織的修補(bǔ)，還可應(yīng)用于其它組織的損傷修復(fù)，如血供豐富的腦、肝臟、腎臟、皮膚、骨組織等。因此本發(fā)明的生物材料在組織器官損傷修復(fù)中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號A61L27/24GK102600505SQ20111002609
公開日2012年7月25日 申請日期2011年1月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月24日
發(fā)明者戴建武, 施春英, 肖志峰, 趙燕南, 陳冰 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所