專利名稱：一種三金制劑的質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種藥物制劑的質(zhì)量控制方法，特別是涉及一種中藥制劑，三金片的質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
三金制劑是由金櫻根、金剛刺(菝葜)、金沙藤、羊開口、積雪草等五味中藥經(jīng)過提取加工制成的中藥制劑，市場上已有銷售，其藥理作用為抗菌，抗炎，消腫，清熱，利尿，鎮(zhèn)痛，抗氧自由基，提高機(jī)體免疫力等。功能主治為清熱解毒，利濕通淋，益腎。用于下焦?jié)駸?、熱淋，小便短赤，淋浙澀痛；急、慢性腎盂腎炎、膀胱炎、尿路感染屬腎虛濕熱下注證者。 三金片的配方和質(zhì)量控制方法已經(jīng)列入2000年版中國藥典。并于2003年修訂增加了含量測定項(xiàng)，修訂后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中對三金片的描述如下處方金櫻根、菝葜、羊開口、金沙藤、積雪草制法以上五味，加水煎煮二次，第一次2小時(shí)，第二次1小時(shí)，合并煎液，濾過，濾液濃縮成相對密度為1. 15 1. 20(50 60°C )的清膏，干燥；加入輔料適量，混勻，制成顆粒，壓制成1000片(小片)或600片(大片)，包衣，即得。性狀本品為糖衣片或薄膜衣片，除去包衣后，顯棕色至黑褐色；味酸、澀、微苦。鑒別(1)取本品15片(小片)或10片(大片)，除去包衣，研細(xì)，加乙醇15ml， 超聲處理20分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?. 01mol/L的氫氧化鈉溶液20ml，微熱使溶解，用乙醚IOml振搖提取，棄去乙醚提取液，水層再用醋酸乙酯IOml振搖提取，醋酸乙酯提取液濃縮至lml，作為供試品溶液(水層備用)。另取金櫻根對照藥材2. 5g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μ 1， 分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇(17 3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯一個(gè)以上相同的斑點(diǎn)。(2)取鑒別(1)項(xiàng)下的水層，用水飽和的正丁醇15ml提取，分取正丁醇層，用正丁醇飽和的水5ml洗滌，棄去水層，正丁醇液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶液。另取積雪草苷對照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μ 1，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(7 3 0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中， 在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。檢查應(yīng)符合片劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定(中國藥典2000年版一部附錄ID)含量測定取本品50片(小片)或30片(大片)，除去包衣，精密稱取，研細(xì)，取約2. 5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇100ml，密塞，精密稱定，超聲處理(功率160W，頻率50kHz) 45分鐘，放冷，精密稱定，加甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密吸取續(xù)濾液50ml，蒸干，殘?jiān)?. 05mol/L的氫氧化鈉溶液30ml，使溶解，用水飽和的正丁醇提取3次，每次20ml，棄去水層，合并正丁醇層，用正丁醇飽和的水洗滌兩次，每次IOml，棄去水層，正丁醇液減壓蒸發(fā)至干，殘?jiān)舆m量甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，作為供試品溶液。另取積雪草苷對照品適量，加甲醇制成每Iml含Img的溶液， 作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI B)進(jìn)行掃描，波長λ S =550nm，測量供試品吸收度積分值與對照品吸收度積分值，計(jì)算，即得。本品每片含積雪草以積雪草苷(C48H78O19)計(jì)，小片不得少于0. ISmg ；大片不得少于 0. 30mg。功能與主治清熱解毒，利濕通淋，益腎。用于下焦?jié)駸幔瑹崃?，小便短赤、淋浙澀痛；急、慢性腎盂腎炎，膀胱炎，尿路感染屬腎虛濕熱下注證者。用法與用量口服，大片一次3片，小片一次5片，一日3 4次。規(guī)格(1)小片相當(dāng)于原藥材2.lg(2)大片相當(dāng)于原藥材3. 5g貯藏密封。由于上述標(biāo)準(zhǔn)采用的質(zhì)量控制含量測定方法是傳統(tǒng)的薄層色譜法(TLCS法)，存在精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較差，顯色不穩(wěn)定、測定偏差大的不足。申請?zhí)枮?00510200471. 8的中國專利申請涉及一種治療泌尿系統(tǒng)等疾病的三金藥物制劑及制備方法和質(zhì)量控制方法，它是將金櫻根、菝葜、羊開口、金沙藤、積雪草制成藥劑學(xué)上可以接受的劑型，得到的制劑崩解性好，生物利用度高，特別是它們的輔料用量都比較少，特別適合老年人及吞服藥片或膠囊有困難的患者服用，本發(fā)明還提供了這種制劑的質(zhì)量控制方法，能夠保證制備的制劑質(zhì)量并方便工業(yè)化生產(chǎn)的要求；與現(xiàn)有技術(shù)相比，提供的藥物制劑用于對急、慢性腎盂腎炎，慢性尿路感染等疾病的治療，有比較好的效果；本發(fā)明提供的制備工藝先進(jìn)，簡單易行；而且本發(fā)明提供的這些制劑不良反應(yīng)小、可供病人長期使用。該申請中所涉及的質(zhì)量控制方法包括(1)金櫻根藥材、積雪草苷、薯蕷皂苷元的薄層色譜鑒別測試方法；( 三金制劑中積雪草苷、羥基積雪草苷全部或部分成分的含量測試方法。該方法依舊采用了薄層色譜法(TLCS法)，依舊存在精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性較差，顯色不穩(wěn)定、測定偏差大的不足。由于上述缺陷，申請人于2004年7月2日提出了申請?zhí)枮?00410050066. 8的中國專利申請，并授予了發(fā)明專利權(quán)。該專利公開了一種三金制劑的新的質(zhì)量控制方法，該方法包括含量測定項(xiàng)，含量測定采用的是HPLC-ELSD法。本發(fā)明人在此基礎(chǔ)上又進(jìn)行了大量的研究，并經(jīng)系統(tǒng)的分離研究發(fā)現(xiàn)，野薔薇苷與薔薇苷為金櫻根的特征性活性成分，而金櫻根又是三金制劑的必須組分，故增加野薔薇苷與薔薇苷為控制三金制劑質(zhì)量的指標(biāo)成分是十分必要的。而現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制方法均不含野薔薇苷和/或薔薇苷含量的測定，可見，現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及質(zhì)量控制方法對三金制劑的質(zhì)量檢測不夠全面，對質(zhì)量控制依舊存在著一定的缺陷，勢必存在一定的用藥風(fēng)險(xiǎn)。鑒于此，本發(fā)明人提供一種新的質(zhì)量控制方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種三金制劑的質(zhì)量控制方法，在ZL200410050066. 8的基礎(chǔ)上改進(jìn)了含量測定方法，通過有效成分野薔薇苷和/或薔薇苷的HPLC-ELSD法含量測定，更加準(zhǔn)確的把握有關(guān)藥品的質(zhì)量，降低用藥風(fēng)險(xiǎn)，提高產(chǎn)品質(zhì)量。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案一種三金制劑的質(zhì)量控制方法，包括采用HPLC-ELSD法測定羥基積雪草苷和/或積雪草苷含量的步驟，其中，該方法還包括采用HPLC-ELSD法測定野薔薇苷和/或薔薇苷含量的步驟。本發(fā)明人經(jīng)系統(tǒng)的分離研究發(fā)現(xiàn)，野薔薇苷與薔薇苷為金櫻根的特征性活性成分，而金櫻根又是三金制劑的必須組分，故增加野薔薇苷與薔薇苷為控制三金制劑質(zhì)量的指標(biāo)成分是十分必要的。本發(fā)明首次引入野薔薇苷和/或薔薇苷的質(zhì)量含量，從而使三金制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)更加全面。根據(jù)前述的質(zhì)量控制方法，其中，所述的采用HPLC-ELSD法測定野薔薇苷和/或薔薇苷含量的步驟包括色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)、對照品溶液的制備、供試品溶液的制備、 野薔薇苷和/或薔薇苷的含量測定。根據(jù)前述的質(zhì)量控制方法，其中，所述色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；體積比為48 52的甲醇-水為流動相；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，理論板數(shù)按野薔薇苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。根據(jù)前述的質(zhì)量控制方法，其中，所述對照品溶液的制備采用以下方法分別取野薔薇苷與薔薇苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml各含0. 5mg的混合溶液，即得。本發(fā)明所述野薔薇苷與薔薇苷對照品采用如下方法自制將金櫻根的根莖，粉碎，用提取溶劑提取后，將提取液減壓濃縮，進(jìn)行溶劑萃取或上大孔樹脂吸附，并依次用水、 30 %、40 90 %乙醇洗脫，收集40 90 %乙醇洗脫物，回收溶劑，再將萃取物或洗脫物經(jīng)過柱層析分離，或?qū)⑻崛∫簼饪s至干后，直接經(jīng)過柱層析分離；將含有野薔薇苷和薔薇苷的餾分再次經(jīng)過硅膠柱層析分離，收集含有野薔薇苷和薔薇苷的餾分，得野薔薇苷和薔薇苷粗晶，再加入重結(jié)晶試劑反復(fù)重結(jié)晶即得。根據(jù)前述的質(zhì)量控制方法，其中，所述供試品溶液的制備采用以下方法取三金片30片小片或20片大片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約1. 5g，精密稱定，精密加入甲醇 50ml，稱定重量，在功率250W、頻率40kHz條件下超聲處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次15ml，取正丁醇液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙猓D(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。根據(jù)前述的質(zhì)量控制方法，其中，所述野薔薇苷和/或薔薇苷的含量測定的步驟中，含量測定采用以下方法，分別精密吸取對照品溶液5 μ 1、10 μ 1與供試品溶液10 20 μ 1，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程分別計(jì)算野薔薇苷、薔薇苷的含量， 即得；本品每片含金櫻根以野薔薇苷(C36H58Oltl)計(jì)，小片不得少于0. IOmg;大片不得少于 0. 16mg ；含金櫻根以薔薇苷(C36H58Oltl)計(jì)，小片不得少于0. IOmg ；大片不得少于0. 16mg。根據(jù)前述的質(zhì)量控制方法，其中所述采用HPLC-ELSD法測定羥基積雪草苷和/或積雪草苷含量包括如下步驟照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；體積比為 48 52的甲醇-水為流動相；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測或使用紫外檢測器檢測，檢測波長210nm，理論板數(shù)按羥基積雪草苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000 ；對照品溶液的制備分別取羥基積雪草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每 Iml分別含0. 2mg的溶液和每Iml含0. 6mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取本品30小片或20大片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約 1. 5g，精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，在功率250W、頻率40kHz的條件下超聲處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml， 回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次15ml，取正丁醇液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法分別精密吸取上述兩種濃度的對照品溶液各10 μ 1與供試品溶液5 10μ 1，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，即得；本品每片含積雪草以羥基積雪草苷(C48H78O2tl)計(jì)，小片不得少于0. 22mg ；大片不得少于0. 35mg。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，采用HPLC-ELSD法測定野薔薇苷和/或薔薇苷的含量的過程其供試品溶液的制備與采用HPLC-ELSD法測定羥基積雪草苷和/或積雪草苷含量時(shí)其供試品溶液的制備方法完全一樣，在采用HPLC-ELSD法測定羥基積雪草苷和/或積雪草苷含量的基礎(chǔ)上不需要另外配制供試品溶液，從而簡化了質(zhì)量控制過程，節(jié)約了成本。本發(fā)明所述的質(zhì)量控制方法還進(jìn)一步包括對三金制劑進(jìn)行鑒別的步驟。所述鑒別采用薄層色譜法。所述的薄層色譜法包括如下步驟(1)取三金片15小片或10大片，除去包衣，研細(xì)，加乙醇15ml，超聲處理20分鐘， 濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?. 01mol/L氫氧化鈉溶液20ml，微熱使溶解，用乙醚IOml振搖提取， 棄去乙醚液，水液再用乙酸乙酯IOml振搖提取，水溶液備用；乙酸乙酯液濃縮至約1ml，作為供試品溶液；另取金櫻根對照藥材2. 5g，同法制成對照藥材溶液；照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(17 3)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯兩個(gè)或兩個(gè)以上相同顏色的主斑點(diǎn)；(2)取(1)項(xiàng)下的水溶液，用水飽和的正丁醇15ml提取，分取正丁醇液，用正丁醇飽和的水5ml洗滌，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶液； 另取積雪草苷對照品，加甲醇制成每Iml含Img的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法 (中國藥典2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(7 3 0. 5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%的硫酸乙醇溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)；(3)取三金片10小片或6大片，除去包衣，研細(xì)，加乙醇50ml，超聲處理30分鐘， 濾過，濾液加鹽酸5ml，加熱回流2小時(shí)，放冷，用40%氫氧化鈉溶液調(diào)至中性，蒸至無醇味， 殘?jiān)訜崴?0ml使溶解，用二氯甲烷振搖提取2次(40ml，30ml)，合并二氯甲烷提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶液；另取菝葜對照藥材5g，同法制成對照藥材溶液；再取薯蕷皂苷元對照品，加甲醇制成每Iml含0. 5mg的溶液，作為對照品溶液；照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯G 1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105°C加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈365nm下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上，顯兩個(gè)或兩個(gè)以上相同顏色的熒光斑點(diǎn)；在與對照品色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；(4)取三金片15小片或10大片，研細(xì)，加甲醇100ml，超聲處理20分鐘，濾過，濾液濃縮至約10ml，加在100 200目、5g、內(nèi)徑Icm的中性氧化鋁柱上，用甲醇50ml洗脫，收集流出液與洗脫液，蒸干，殘?jiān)铀?0ml溶解，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次15ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状糏ml使溶解，作為供試品溶液；另取羊開口對照藥材5g，加水 100ml，加熱回流1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?0ml，同法制成對照藥材溶液；照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5 10 μ 1，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-水(6 14 1)為展開劑，展開，取出，晾干， 置紫外光燈365nm下檢視；供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。本發(fā)明所述方法不僅可檢測三金片，還可以檢測三金制劑的任何其他劑型，如糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖齊U、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧齊U、滴劑、貼劑。本發(fā)明的制劑，優(yōu)選的是口服劑型，如膠囊劑、片劑、口服液、顆粒劑、丸劑、 散劑、丹劑、膏劑等。還可以檢測以積雪草、薔薇苷、野薔薇苷為原料的制劑、積雪草藥材及其提取物、薔薇苷藥材及其提取物、野薔薇苷及其提取物。本發(fā)明的特點(diǎn)在于1、本發(fā)明在HPLC-ELSD法測定羥基積雪草苷含量的基礎(chǔ)上增加了 HPLC-ELSD法測定野薔薇苷和/或薔薇苷的含量，使三金制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)更加全面；2、本發(fā)明方法精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好。


圖1為野薔薇苷對照品線性回歸方程，其回歸方程為Y = 0. 6482Χ-7. 3328，r = 0. 9992 ；圖2為薔薇苷對照品線性回歸方程，其回歸方程為Y = 0. 8516Χ-8. 9913, r = 0. 9993 ；圖3為野薔薇苷與薔薇苷混合對照液相色譜圖(ELSD)，其中野薔薇苷Rt = 42. 394min ；薔薇苷 Rt = 32. 135min ；圖4為樣品液相色譜圖(ELSD)，其中野薔薇苷Rt = 42.256min ；薔薇苷Rt = 32.086min ；圖 5 為三金片 0910136 批(ELSD)；圖6 為三金片 0910144 批(ELSD)；圖 7 為三金片 0910160 批(ELSD)；圖 8 為三金片 0910167 批(ELSD)；圖 9 為三金片 0910175 批(ELSD)；
圖 10 為三金片 0910181 批(ELSD)；圖 11 為三金片 0910183 批(ELSD)；圖 12 為三金片 0910191 批(ELSD)；圖 13 為三金片 0910192 批(ELSD)；圖 14 為三金片 0911005 批(ELSD)；圖 15 為三金片 0911006 批(ELSD)；圖 16 為三金片 0911021 批(ELSD)；圖17為野薔薇苷與薔薇苷混合對照液相色譜圖(UV)，其中野薔薇苷Rt = 42. 394min ；薔薇苷 Rt = 32. 135min ；圖 18 為三金片 0910136 批(UV)；圖19 為三金片 0910144 批(UV)；圖 20 為三金片 0910160 批(UV)；圖 21 為三金片 0910167 批(UV)；圖 22 為三金片 0910175 批(UV)；圖 23 為三金片 0910181 批(UV)；圖 24 為三金片 0910183 批(UV)；圖25 為三金片 0910191 批(UV)；圖 26 為三金片 0910192 批(UV)；圖 27 為三金片 0911005 批(UV)；圖 28 為三金片 0911006 批(UV)；圖四為三金片0911021批(UV)。
具體實(shí)施例方式以下為本發(fā)明的具體實(shí)施方式
，所述的實(shí)施例是為了進(jìn)一步描述本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1野薔薇苷與薔薇苷含量測定為新增的含量測定標(biāo)準(zhǔn)。金櫻根為三金片方中主要藥味，本發(fā)明人經(jīng)系統(tǒng)的分離研究發(fā)現(xiàn)，野薔薇苷與薔薇苷為金櫻根的特征性活性成分，故增加野薔薇苷與薔薇苷為控制本品質(zhì)量的指標(biāo)成分是十分必要的。本標(biāo)準(zhǔn)在羥基積雪草苷含量測定的基礎(chǔ)上增加了 HPLC-ELSD法測定野薔薇苷與薔薇苷的含量，使三金片的質(zhì)量控制指標(biāo)更加全面。1、儀器與試劑儀器=Waters 2695高效液相色譜儀，蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech-ELSD2000)， (紫外檢測器為Waters 996)，Empower色譜工作站。試劑甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。對照品自制，因《中國藥典》未收載野薔薇苷與薔薇苷化學(xué)對照品，故本發(fā)明人對野薔薇苷與薔薇苷進(jìn)行了分離制備，并按《中藥新藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究用對照品研究技術(shù)要求》 進(jìn)行了結(jié)構(gòu)確證和純度檢查，在選定的色譜條件下測定，按歸一化法計(jì)算含量為98. 5%，結(jié)果表明所制備的野薔薇苷和薔薇苷化學(xué)對照品符合含量測定用對照品要求。
野薔薇苷與薔薇苷對照品采用如下方法自制將金櫻根的根莖，粉碎，用提取溶劑提取后，將提取液減壓濃縮，進(jìn)行溶劑萃取或上大孔樹脂吸附，并依次用水、30%、40 90 %乙醇洗脫，收集40 90 %乙醇洗脫物，回收溶劑，再將萃取物或洗脫物經(jīng)過柱層析分離，或?qū)⑻崛∫簼饪s至干后，直接經(jīng)過柱層析分離；將含有野薔薇苷和薔薇苷的餾分再次經(jīng)過硅膠柱層析分離，收集含有野薔薇苷和薔薇苷的餾分，得野薔薇苷和薔薇苷粗晶，再加入重結(jié)晶試劑反復(fù)重結(jié)晶即得。具體地說采用如下方法自制取新鮮金櫻根根莖10Kg，粉碎，用60%乙醇回流提取2次，每次2小時(shí)，濾過，濃縮得浸膏。浸膏加蒸餾水IOOOmL使均勻分散，加同樣體積乙酸乙酯萃取三次，合并乙酸乙酯，濃縮回收溶劑，得乙酸乙酯浸膏。乙酸乙酯浸膏用硅膠柱層析粗分離，以氯仿/甲醇(10 0 0 10)梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫3000mL，TLC檢測合并相同部分，得到9個(gè)主要部分。其中富含野薔薇苷和薔薇苷的餾分，以氯仿/甲醇(10 1) 為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析，收集富含野薔薇苷的餾分，在體積比為10 1的氯仿/甲醇混合溶液中重結(jié)晶，得白色不定型固體，即野薔薇苷；收集富含薔薇苷的餾分，以55%甲醇為洗脫劑反復(fù)進(jìn)行中壓反相柱層析，在體積比為10 1的氯仿/甲醇混合溶液中重結(jié)晶，得白色不定型固體，即薔薇苷。2、色譜條件的選擇色譜柱Nova_pakC18 (3. 9 X 150mm, 4um)；流動相甲醇-水(48 52)；流速0. 8ml/min ；漂移管溫度90°C ；氣體流速2. 4L/min ；在流動相選擇中，試驗(yàn)了不同比例的甲醇-水系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果以甲醇-水 (48 52)為最佳，保留時(shí)間適宜，分離效果能滿足要求。在選定的條件下，三批供試品的野薔薇苷與薔薇苷色譜峰的分離度、理論板數(shù)的結(jié)果見表1。表1、野薔薇苷與薔薇苷理論板數(shù)和分離度的結(jié)果
““~ 野薔薇苷薔薇苷~ I"~ 供試品批號分離度 __理論板數(shù)理論板數(shù)__0910020312530381.585
0910021261325191.566
0910022__2347__2407__1.588野薔薇苷與左側(cè)薔薇苷峰分離度=R1 = 2 (tE-tE1) / (W+A)tE-為相鄰兩峰中后一峰的保留時(shí)間tE1-為相鄰兩峰中前一峰的保留時(shí)間W、W1此相鄰兩峰的峰寬根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，考慮到儀器、色譜柱、流動相的配制和溫度等系統(tǒng)因素的影響，規(guī)定理論板數(shù)按野薔薇苷峰計(jì)算，應(yīng)不低于2000。3、線性范圍的考察對照品溶液的制備取經(jīng)105°C干燥至恒重的野薔薇苷與薔薇苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml各含Img的混合溶液(野薔薇苷實(shí)取54. 25mg，薔薇苷實(shí)取 51. 20mg，定容至 50ml，即分別為 1. 085mg/ml、l. 024mg/ml)，即得。測定分別精密吸取混合對照品溶液溶液1、2μ 1、4μ 1、6μ 1、8μ 1、10μ 1注入液相色譜儀，測定峰面積，以峰面積的自然對數(shù)為橫坐標(biāo)，以進(jìn)樣量的自然對數(shù)為縱坐標(biāo)，回歸計(jì)算，得線性方程，測定結(jié)果見表2，表3。表2、野薔薇苷對照品線性考察結(jié)果
序號進(jìn)樣量峰面積進(jìn)樣量取對數(shù)峰面積取對數(shù) ^ g
11.085884990.081611.39
22.172857350.774712.56
34.348178191.467913.61
46.5114493021.873314.19
58.6823889262.161014.69
610.8530100622.384214.92以上結(jié)果表明，在進(jìn)樣量1. 085 10. 85 μ g范圍內(nèi)，野薔薇苷峰面積的自然對數(shù)與進(jìn)樣量的自然對數(shù)有良好的線性關(guān)系。表3、薔薇苷對照品線性考察結(jié)果
序號進(jìn)樣量yg峰面積進(jìn)樣量取對數(shù)峰面積取對數(shù)
11.024389480.023710.57
22.048904170.716911.4134.0962099851.410012.25
46.1443149991.815512.66
58.1924793812.103213.08
610.245634362.326313.24以上結(jié)果表明，在進(jìn)樣量1. 024 10. M μ g范圍內(nèi)，薔薇苷峰的自然對數(shù)與進(jìn)樣量的自然對數(shù)有良好的線性關(guān)系。4、供試品溶液制備方法的研究(1)提取溶劑的選擇分別考察50%甲醇，80%甲醇，甲醇，乙醇作為提取試劑，對比不同溶劑對提取效果的影響。具體方法為取本品(批號0910021) 60片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，分別取約1.5g，精密稱定，精密加入不同提取溶劑50ml，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率40kHz) 45分鐘，放冷，再稱定重量，用相應(yīng)的提取溶劑補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次15ml，取正丁醇液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進(jìn)樣10 μ 1，結(jié)果見表4。表4、提取溶劑的選擇
權(quán)利要求
1.一種三金制劑的質(zhì)量控制方法，包括采用HPLC-ELSD法測定羥基積雪草苷和/或積雪草苷含量的步驟，其特征在于，該方法還包括采用HPLC-ELSD法測定野薔薇苷和/或薔薇苷含量的步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述的采用HPLC-ELSD法測定野薔薇苷和/或薔薇苷含量的步驟包括色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)、對照品溶液的制備、供試品溶液的制備、野薔薇苷和/或薔薇苷的含量測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)是用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；體積比為48 52的甲醇-水為流動相；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測，理論板數(shù)按野薔薇苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述對照品溶液的制備采用以下方法分別取野薔薇苷與薔薇苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml各含0. 5mg的混合溶液，即得。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述野薔薇苷與薔薇苷對照品采用如下方法自制將金櫻根的根莖，粉碎，用提取溶劑提取后，將提取液減壓濃縮，進(jìn)行溶劑萃取或上大孔樹脂吸附，并依次用水、30%、40 90%乙醇洗脫，收集40 90%乙醇洗脫物，回收溶劑，再將萃取物或洗脫物經(jīng)過柱層析分離，或?qū)⑻崛∫簼饪s至干后，直接經(jīng)過柱層析分離；將含有野薔薇苷和薔薇苷的餾分再次經(jīng)過硅膠柱層析分離，收集含有野薔薇苷和薔薇苷的餾分，得野薔薇苷和薔薇苷粗晶，再加入重結(jié)晶試劑反復(fù)重結(jié)晶即得。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述供試品溶液的制備采用以下方法取本品30片小片或20片大片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約1. 5g，精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，在功率250W、頻率40kHz條件下超聲處45分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，回收溶劑至干，殘?jiān)铀?20ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次15ml，取正丁醇液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙猓D(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述野薔薇苷和/或薔薇苷的含量測定的步驟中，含量測定采用以下方法分別精密吸取對照品溶液5μ 1、10μ 1與供試品溶液10 20μ 1，注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程分別計(jì)算野薔薇苷、薔薇苷的含量，即得；本品每片含金櫻根以野薔薇苷(C36H58Oltl)計(jì)，小片不得少于0. IOmg ；大片不得少于0. 16mg ；含金櫻根以薔薇苷(C36H58Oltl)計(jì)，小片不得少于0. IOmg ；大片不得少于 0. 16mg0
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述采用HPLC-ELSD法測定羥基積雪草苷和/或積雪草苷含量包括如下步驟照高效液相色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI D)測定；色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；體積比為48 52 的甲醇-水為流動相；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測或使用紫外檢測器檢測，檢測波長210nm， 理論板數(shù)按羥基積雪草苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2000 ；對照品溶液的制備分別取羥基積雪草苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml分別含0. 2mg的溶液和每Iml含0. 6mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取本品30小片或20大片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約1. 5g， 精密稱定，精密加入甲醇50ml，稱定重量，在功率250W、頻率40kHz的條件下超聲處理45分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25ml，回收溶劑至干，殘?jiān)铀?0ml使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15ml，合并正丁醇提取液，用氨試液洗滌2次，每次15ml，取正丁醇液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得；測定法分別精密吸取上述兩種濃度的對照品溶液各10 μ 1與供試品溶液5 10 μ 1， 注入液相色譜儀，測定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對數(shù)方程計(jì)算，即得；本品每片含積雪草以羥基積雪草苷(C48H78O2tl)計(jì)，小片不得少于0. 22mg ；大片不得少于0. 35mg。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種三金制劑的質(zhì)量控制方法，包括采用HPLC-ELSD法測定羥基積雪草苷和/或積雪草苷含量的步驟，其中，該方法還包括采用HPLC-ELSD法測定野薔薇苷和/或薔薇苷含量的步驟。本發(fā)明在HPLC-ELSD法測定羥基積雪草苷含量的基礎(chǔ)上增加了HPLC-ELSD法測定野薔薇苷和/或薔薇苷的含量，使三金制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)更加全面；本發(fā)明方法精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性好。
文檔編號A61P31/04GK102526561SQ20111002831
公開日2012年7月4日 申請日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月31日
發(fā)明者云強(qiáng), 周艷林, 鄒節(jié)明 申請人:桂林三金藥業(yè)股份有限公司