專利名稱：索拉膠作為制備預(yù)防和治療便秘藥物的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及土壤桿菌Agrobacterium sp. ZX09的代謝產(chǎn)物(中文名索拉膠，英文 名Salecan)，特別是索拉膠在預(yù)防和治療便秘中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
便秘不是病，是由多種病理因素引起的一種臨床常見癥狀。由于正常的排便習(xí)慣 差異很大，攝食種類及習(xí)慣、生活習(xí)慣、環(huán)境因素、精神狀態(tài)都可以影響排便習(xí)慣。所以，迄 今為止，都很難給便秘下一個(gè)確切的定義。國際上有關(guān)功能性胃腸病，包括慢性便秘，在診斷、病理生理學(xué)以及治療方面相繼 推出羅馬I (1994年)和羅馬II (2000年)標(biāo)準(zhǔn)。便秘可以簡單的描述為以下三種障礙中的 任何一項(xiàng)排便次數(shù)的減少，排便困難或排便過硬。由于便秘很少導(dǎo)致住院或死亡，因此它 對健康的危害常被忽視。國內(nèi)陸續(xù)有一些便秘流行病學(xué)方面的報(bào)道，普遍認(rèn)為年齡、性別、 職業(yè)、文化程度、心理障礙、濫用瀉藥、不良排便習(xí)慣等是便秘的危險(xiǎn)因素。由于便秘嚴(yán)重影 響患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重者可引起心腦血管意外。便秘還是肛腸病發(fā)病的誘因。宿便堆積 在腸道里，壓迫腸壁，使腸粘膜受傷，腸蠕動(dòng)變慢。另外宿便產(chǎn)生的毒素被腸道吸收，通過血 液循環(huán)到達(dá)人體的各個(gè)部位，導(dǎo)致面色晦暗、皮膚粗糙、痤瘡、肥胖等。特別是中老年人由于 生理性衰退，腸道蠕動(dòng)能力下降。因此早期預(yù)防和合理治療會(huì)減輕便秘帶來的嚴(yán)重后果。目前，市場上有4大類的治療便秘藥物。刺激性瀉藥，藥物本身在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物 能夠刺激腸壁，使腸蠕動(dòng)加強(qiáng)而促進(jìn)排便，代表藥物有比沙可啶、雙醋酚汀，這類藥物作用 強(qiáng)烈，只能臨時(shí)應(yīng)用。潤滑性瀉藥，能潤滑并刺激腸壁，軟化大便，使糞便易于排出，例如開 塞露，但易產(chǎn)生依賴性，不宜長期使用。滲透性瀉劑，使腸內(nèi)容積的滲透壓升高，能吸收大量 水分并阻止腸道吸收水分，使腸中容積增大，刺激腸壁，反射性的增加腸蠕動(dòng)而導(dǎo)瀉，代表 藥物有硫酸鎂，乳果糖，但有器官疾病的人禁用，時(shí)常引起胃腸脹氣和腸絞痛。還有一類是 容積性瀉藥，吸水后增加容積，輕度刺激腸蠕動(dòng)，抵達(dá)結(jié)腸后被腸道內(nèi)細(xì)菌酵解，增加腸內(nèi) 滲透壓和阻止腸內(nèi)水分吸收，增強(qiáng)導(dǎo)瀉作用，此類藥物有羧甲基纖維素、車前子，但由于其 作用力較弱，臨床已少應(yīng)用(鄭麗華，賈蘭斯.治療便秘藥物的合理選擇.中國臨床醫(yī)生 雜，2007(4))。索拉膠是一種土壤桿菌Agrobacterium sp. ZX09分泌產(chǎn)生的胞外多糖，結(jié)構(gòu)為 β-葡聚糖(中國專利，201010146371. 2)(Xiu A, Kong Y, Zhou Μ, Zhu b，Wang S, Zhang J. October 15 2010. The chemical and digestive properties of a soluble glucan from Agrobacterium sp. ZX09. Carbohydrate Polymers, Vol. 82, No. 3, 623-628)。 經(jīng)過急性毒理學(xué)和慢性毒理學(xué)的評價(jià)，該膠無毒安全。它具有強(qiáng)大的吸水能力，且在人體腸 道中不被吸收的性質(zhì)。早在上世紀(jì)四十年代，就由圖倫大學(xué)Diluzio博士從酵母細(xì)胞壁中分離出β-葡 聚糖。在國際上已有研究報(bào)道說，β-葡聚糖和它的衍生物具有多種生物活性，比如抗氧 化劑，抗病毒，抗腫瘤，是激活免疫細(xì)胞的鑰匙(Sener，G.，Toklu, H. Ζ. , &Cetinel, S.2007. β -Glucanprotects against chronicnicotine—induced oxidative damage in rat kidney and bladder. Environmental Toxicology and Pharmacology, 23, 25 — 32)。 長時(shí)間食用含β-葡聚糖的食物能夠降低人的血脂和肝脂(Robert Nicolosi, Stacey J Bell, Bruce R Bistrian, Isaac Greenberg, R Armour Forse and George L Blackburn. August 1999. Plasma lipid changes after supplementation with β-glucan fiber from yeast. American Journal of Clinical Nutrition, Vol. 70，No. 2，208-212)。經(jīng)特 殊步驟萃取且不含內(nèi)毒素的β-葡聚糖在美國FDA已認(rèn)定是一種安全的物質(zhì)，可添加在一 般食品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新結(jié)構(gòu)的、吸水能力強(qiáng)的、不被人體腸道吸收的 β-葡聚糖索拉膠在制備預(yù)防或治療便秘藥物方面的應(yīng)用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)解決方案為索拉膠作為制備預(yù)防和治療便秘藥物的應(yīng) 用，索拉膠可直接服用或混于食物中服用，索拉膠在人體腸道中吸水膨脹而不被腸道吸收， 增加了糞便的體積，刺激了胃腸的蠕動(dòng)，提高糞便的數(shù)量、重量和含水率，加快排便，改善便 秘情況。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其顯著優(yōu)點(diǎn)(1)菌種的培養(yǎng)操作簡便，工藝簡單，培養(yǎng) 基為全合成培養(yǎng)基，成份明確，成本低，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)；(2)索拉膠產(chǎn)量大，提取方法簡 便，可直接溶于冷水；(3)索拉膠不被腸道吸收，具有強(qiáng)大的吸水能力，能夠有效地刺激腸 胃的蠕動(dòng)，提高糞便的數(shù)量、重量和含水率，改善便秘情況(4)通過慢性毒理學(xué)評價(jià)，索拉 膠安全無毒。


圖1是各組小 鼠糞便重量圖。
圖2是各組小 鼠糞便數(shù)量圖。
圖3是各組小 鼠糞便中含水率圖。
圖4是各組小 鼠胃蠕動(dòng)圖。
圖5是各組小 鼠腸道蠕動(dòng)圖。
圖6是各組小 鼠糞便中索拉膠含量圖。
圖7是各組小 鼠體重變化圖。
圖8是各組小 鼠器官肝、脾、心重圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。本發(fā)明索拉膠作為制備預(yù)防和治療便秘藥物的應(yīng)用，索拉膠可直接服用或混于食 物中服用，療程為單次或多次，視癥狀輕重，索拉膠在人體腸道中吸水膨脹而不被腸道吸 收，增加了糞便的體積，刺激了胃腸的蠕動(dòng)，提高糞便的數(shù)量、重量和含水率，加快排便，改 善便秘情況。以實(shí)驗(yàn)小鼠來說，劑量最佳服用量為300mg/kg左右，人類最佳服用量較實(shí)驗(yàn) 小鼠為低。
索拉膠結(jié)構(gòu)通式為
—⑶-beta-D-Glup- (1 — 3) - [beta-D-Glup- (1 — 3) -beta-D-Glup-] 3-alpha-D-Glup-(1 — 3)-alpha-D-Glup-(l}n ^
上述結(jié)構(gòu)中的η基指具有10(Γ10000個(gè)葡萄糖基相連的聚合物，本發(fā)明化合物是其中 η為100 200的化合物。利用土壤桿菌ΖΧ09生產(chǎn)索拉膠，其步驟如下
a、配置培養(yǎng)液:NaH2P04 0. 25%。_2%。，KN03 1. 5%。-4. 5%。，CaCl2 0. 05%。-0. 2%， MgCl2 0. 15%。-0. 55%。，F(xiàn)eS04 · 7H20 0. 004%。-0. 013%。，MnS04 0. 001% -0. 004% , ZnC12 0· 004%。-0· 008%。，NaCl 0-8%,蔗糖 1%_5%，H20 1000 mL, pH 5.5-11。b、將培養(yǎng)液加熱110-121 °C滅菌15-30分鐘；
C、向冷卻至30_37°C的培養(yǎng)液內(nèi)加入100-200μ 平皿菌落液 d>28 °C 30 °C發(fā)酵Μ-4 !形成種子培養(yǎng)液；
e、向冷卻至30-37°C的培養(yǎng)液內(nèi)加入3%-5%的種子培養(yǎng)液
f、在28V 30 °C發(fā)酵48 72 h ；
h、向發(fā)酵液內(nèi)注入超過兩倍體積的乙醇或丙酮，50-70° C抽真空干燥得到索拉膠粗
P
ΡΠ O下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1 索拉膠粗品的制備
配置培養(yǎng)液，NaH2P04 0. 25g, KN03 1.5 g, CaC12 0. 05g, MgCl2 0. 15g, FeS04 ·7Η20 0. 004 g, MnS04 0. 001 g, ZnC12 0. 004 g, NaCl IOg,蔗糖 10 g, H201000 mL, pH 5. 5， 將培養(yǎng)液加熱121°C滅菌15分鐘，冷卻至30°C接入菌落液200μ ，培養(yǎng)Mh，為種子液。 向滅過菌的培養(yǎng)液中加入3%的種子培養(yǎng)液，發(fā)酵48h。在該發(fā)酵液中加入兩倍體積的乙醇， 50°C抽真空干燥即得到索拉拉膠粗品。實(shí)施例2 索拉膠粗品的制備
配置培養(yǎng)液，NaH2P04 2g, KN034. 5 g, CaCl2 0. 2g, MgCl2 0. 55g, FeS04 · 7H20 0. 013 g, MnS04 0. 004 g, ZnC12 0. 008 g, NaCl 80g,蔗糖 50 g, H201000 mL, pH 10， 將培養(yǎng)液加熱121°C滅菌30分鐘，冷卻至37°C接入菌落液200μ ，30°C培養(yǎng)Mh，為種子液。 向滅過菌的培養(yǎng)液中加入5%的種子培養(yǎng)液，發(fā)酵48h。在該發(fā)酵液中加入兩倍體積的丙醇， 70°C抽真空干燥即得到索拉膠粗品。實(shí)施例3 索拉膠粗品的制備
配置培養(yǎng)液，NaH2P04 lg, KN032 g, CaCl2 0. lg, MgCl2 0. 3g, FeS04 · 7H20 0. 008 g, MnS04 0. 003 g, ZnC12 0. 006 g, NaCl 30g,蔗糖 30 g, H201000 mL, pH 7，將培養(yǎng)液 加熱121°C滅菌20分鐘，冷卻至32°C接入菌落液200μ ，30°C培養(yǎng)Mh，為種子液。向滅過 菌的培養(yǎng)液中加入4%的種子培養(yǎng)液，發(fā)酵48h。在該發(fā)酵液中加入兩倍體積的丙醇，60°C抽 真空干燥即得到索拉拉膠粗品。實(shí)施例4 索拉膠對便秘模型小鼠的實(shí)驗(yàn)研究
將索拉膠粗品按灌胃劑量溶解在蒸餾水中。48只C57BL/6J雄鼠購于上海，飼養(yǎng)在 23士 1°C，12小時(shí)光照一12小時(shí)黑暗循環(huán)的動(dòng)物房。一周后開始實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為6 組，每組8只。CK為正常對照組，vehicle為便秘對照組，Salecan-vL為極低劑量組(灌胃索拉膠粗品的劑量為200mg/kg)，Salecan-L為低劑量組(灌胃索拉膠粗品的劑量為300mg/ kg), Salecan-M為中劑量組(灌胃索拉膠粗品的劑量為500mg/kg)，Salecan-H為高劑量組 (灌胃索拉膠粗品的劑量為1，000mg/kg)。按組別分別灌胃試劑(CK組和vehicle組給予蒸 餾水)。1小時(shí)后，繼續(xù)給小鼠灌胃鹽酸洛哌丁胺(5mg/kg)水溶液(CK組給予蒸餾水)。然 后將小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，食物和水自由攝取。收集8小時(shí)內(nèi)各只小鼠的糞便，統(tǒng)計(jì)數(shù)量和重量。 再將糞便置于104°C烘箱烘48小時(shí)至恒重，測其糞便的含水率。還是將48只C57BL/6J雄鼠飼養(yǎng)在23士 1°C，12小時(shí)光照一12小時(shí)黑暗循環(huán)的動(dòng) 物房。一周后開始實(shí)驗(yàn)。將小鼠隨機(jī)分為6組，每組8只。CK為正常對照組，vehicle為便 秘對照組，Salecan-vL為極低劑量組(灌胃索拉膠粗品的劑量為200mg/kg)，Salecan-L為 低劑量組(灌胃索拉膠粗品的劑量為300mg/kg)，Salecan-M為中劑量組(灌胃索拉膠粗品 的劑量為500mg/kg)，Salecan-H為高劑量組(灌胃索拉膠粗品的劑量為l，000mg/kg)。按 組別分別灌胃試劑(CK組和vehicle組給予蒸餾水)。1小時(shí)后，繼續(xù)給小鼠灌胃鹽酸洛哌 丁胺(5mg/kg)水溶液(CK組給予蒸餾水)。20分鐘后，繼續(xù)給小鼠灌胃同體積的酚紅指示 劑(每50ml含25mg酚紅和5g阿拉伯樹膠)。20分鐘后，斷頸處死小鼠。開腹，取出胃和小 腸。胃剪碎后加入25ml 0. IN NaOH勻漿。然后每5ml勻漿液中加0. 5ml的20% Cw/ ν)三氯乙酸。3000rpm離心20分鐘后，取出上清液，每Iml上清液加入0. 5N NaOH。用 分光光度計(jì)在560nm測其吸光值。取一只小鼠在灌胃酚紅指示劑后立即斷頸處死的胃部 吸光值作為Y，其他小鼠胃部吸光值作為X，則按公式得到了 gastric emptying(GE) = (1-X/ Y)* 100%
小腸取出后，測量其總長為L和上端到食物前進(jìn)的最前端為d，按公式就得到了 small intestinal transt (SIT)=L/d*100% 實(shí)施例5 索拉膠腸道吸收實(shí)驗(yàn)研究
將 40 只 C57BL/6J 小鼠分為 4 組Salecan-vL, Salecan-L, Salecan-M, Salecan-H。各 組分別通過灌胃給予不同劑量的索拉膠粗品水溶液，分別為200mg/kg，300m/kg, 500mg/ kg, 1, 000mg/kgo每只小鼠分別飼養(yǎng)，自由攝取食物和水，然后收集各只小鼠8小時(shí)內(nèi)的糞 便。每份樣品取0.5g左右的樣重，加6M HCl研磨后轉(zhuǎn)移到20ml的尖頭分析管中，并定容 至8ml。然后置于100°C水浴加熱0.5小時(shí)使索拉膠多糖水解成單糖。冷卻至室溫后用6M NaOH中和至中性，用蒸餾水定容至20ml。取其Iml于離心管離心，用血糖儀測其上清液即 可得到單糖的含量(見圖6)。實(shí)施例6 索拉膠慢性毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究
將索拉膠粗品研磨至粉狀，按5%的比例添加的到動(dòng)物飼料中，捏成餅狀。40只ICR小 鼠購于南京，其中20雄鼠和20只雌鼠。將小鼠分為4組CKm(雄鼠正常對照組)，CKf (雌 鼠正常對照組)，GLm (雄鼠索拉膠組)，GLf (雌鼠索拉膠組)。前兩組喂以正常飼料，后兩組 喂以含5%索拉膠粗品的飼料。連續(xù)喂養(yǎng)3個(gè)月，期間跟蹤小鼠的體重。3個(gè)月后，將小鼠斷 頸處死，取其器官肝、脾、心，測其重量。與正常組比較，判斷索拉膠的慢性毒理。索拉膠粗品成分見表1。將48只C57BL/6J小鼠分為6組control, vehicle, Salecan-vL, Salecan-L, Salecan-M, Salecan-H。各組分別通過灌胃給予樣品。1小時(shí)后， 灌胃洛哌丁胺造便秘模型(見表2)。每只小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)，食物和水均自由攝取。分別收集每只小鼠在8小時(shí)內(nèi)的糞便，統(tǒng)計(jì)個(gè)數(shù)(見圖1)和重量(見圖2)。然后將糞便置于104士 1°C
烘箱，烘48小時(shí)至恒重，計(jì)算其糞便的含水率(見圖3)。
表1索拉膠粗品成分表
權(quán)利要求
1. 一種索拉膠作為制備預(yù)防和治療便秘藥物的應(yīng)用，其特征在于索拉膠可直接服用 或混于食物中服用，索拉膠在人體腸道中吸水膨脹而不被腸道吸收，增加了糞便的體積，刺 激了胃腸的蠕動(dòng)，提高糞便的數(shù)量、重量和含水率，加快排便，改善便秘情況。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種索拉膠作為制備預(yù)防和治療便秘藥物的應(yīng)用，索拉膠可直接服用或混于食物中服用，索拉膠在人體腸道中吸水膨脹而不被腸道吸收，增加了糞便的體積，刺激了胃腸的蠕動(dòng)，提高糞便的數(shù)量、重量和含水率，加快排便，改善便秘情況。索拉膠的制備操作簡便，工藝簡單，成本低，適宜于工業(yè)化生產(chǎn)；索拉膠具有強(qiáng)大的吸水能力，能夠有效地刺激腸胃的蠕動(dòng)，改善便秘情況的同時(shí)具有安全無毒的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P1/10GK102058616SQ20111002848
公開日2011年5月18日 申請日期2011年1月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月27日
發(fā)明者修愛慧, 周夢怡, 張建法, 朱斌, 詹亦貝 申請人:南京理工大學(xué)