專利名稱：抗原性改變的腸毒素c2突變體及編碼基因與制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說，是涉及一種具有藥用前景的抗原性改變的腸毒素C2突變體及編碼基因與制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
超抗原(superantigen, SAg)是一組由細菌或病毒編碼的，并在極低濃度下對T淋巴細胞產(chǎn)生極強免疫刺激活性的蛋白質(zhì)分子。與傳統(tǒng)抗原不同，超抗原不需要抗原遞呈細胞的遞呈作用，在抗原遞呈細胞外側(cè)的抗原結(jié)合區(qū)與MHC 11(組織相容性復合物)分子和T 細胞V P區(qū)結(jié)合形成復合物，從而激發(fā)大量的T淋巴細胞增殖，進而導致在體外或體內(nèi)釋放大量的細胞因子和其它效應(yīng)分子。正因為超級抗原存在這種特殊的生物活性和作用機理，使其可以作為一種臨床上的免疫調(diào)節(jié)劑和抗腫瘤藥物，用于腫瘤疾病的臨床治療。金黃色葡萄球菌腸毒素C2 (Staphylococcal enterotoxin C2, SEC2)是一類典型的細菌超抗原。由于其極強的T細胞激活功能，近年來受到人們的廣泛關(guān)注。但是作為一種異源毒素蛋白，野生型SEC2在刺激肌體免疫系統(tǒng)的同時，也誘導B細胞產(chǎn)生大量抗體，這些抗體可特異性的識別并結(jié)合于野生型SEC2的抗原表位，使其被血清抗體中合，從而導致其體內(nèi)刺激激活T淋巴細胞的能力大大降低，因此影響了其臨床治療效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是針對上述問題，提供了一種抗原性改變的腸毒素C2突變體及編碼基因與制備和應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案，腸毒素C2突變體具有序列表SEQ ID NO 3中的氨基酸序列。腸毒素C2突變體的編碼基因具有序列表SEQ ID NO : I中的堿基序列。腸毒素C2突變體的制備方法為，I)以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用特異性PCR引物sec2-F 5’ -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2_R :5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 擴增出SEC2全基因sec2 ；2)在此基礎(chǔ)上，以sec2為模板，采用引物對sec2_F和R-Mutant :5’ -CATCATATAATACTTTCGTATTACCCATCG-3’；引物對 sec2_R 和 F-Mutant :5’-GGGTAATACGAAAGTATTATATGATGATC-3’分別擴增獲得突變位點上游和下游的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點上游和下游的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQ ID NO 1中堿基序列的SEC2(Y26V)突變基因；3)將以上突變基因SEC2(Y26V)克隆于表達載體pET_28a，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)為宿主菌，構(gòu)建成異源表達抗原表位改變的腸毒素C2突變體的基因工程菌，經(jīng)IPTG誘導表達并純化制得相應(yīng)抗原表位改變的腸毒素C2突變體純品?；蚱瑪嗟腜CR反應(yīng)體系為50iil :10XPfu DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5 ill、dNTP4uL、上下游引物各lOpmol、模板25ng、Pfu DNA聚合酶1U，無菌超純水補齊體積至50 yl。基因片段的PCR反應(yīng)條件為第一階段95°C，5分鐘；第二階段94°C，30秒；55°C，30秒；72°C，90秒；共30個循環(huán)；第三階段72°C，10分鐘。步驟3)中采用Ni親合層析柱對目的產(chǎn)物進行純化，純化時以0. 5ml/min速度上樣于預(yù)先平衡好的Ni親合層析柱；以含40mM咪唑的平衡緩沖液洗滌10個柱體積，洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最后以洗脫緩沖液洗脫下目的產(chǎn)物，并對洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃縮。所述的洗脫緩沖液的組成為20mM Tirs-HCl, 0. 5M NaCl，250mM咪唑，溶液的pH=7. 9。所述的腸毒素C2突變體可作為抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)藥物的活性成份。 所述的腸毒素C2突變體具有良好的免疫刺激活性和腫瘤抑制活性，應(yīng)用于抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)藥物中，其抗原表位較野生型有顯著改變，可有效規(guī)避人體內(nèi)野生型金黃色葡萄球菌腸毒素C2特異性抗體的識別和結(jié)合，減少體內(nèi)血清清除反應(yīng)。本發(fā)明的有益效果I.本發(fā)明為人工構(gòu)建的編碼抗原表位改變的腸毒素C2突變體的核苷酸序列，獲知其基因全序列的組成。2.本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，突變構(gòu)建了編碼抗原表位改變的腸毒素C2突變體的核苷酸基因，并在大腸桿菌中高效表達，獲得的抗原表位改變的腸毒素C2突變體經(jīng)檢驗具有較好的超抗原活性和較高的腫瘤抑制活性。3.本發(fā)明獲得的抗原表位改變的腸毒素C2突變體較野生型腸毒素C2相比，其抗原表位有顯著差異，其對野生型腸毒素C2特異性抗體的親合能力有顯著下降，因此可以避免長期使用野生型腸毒素C2患者體內(nèi)抗體的中合作用和血清清除效應(yīng)，更具有腫瘤臨床治療的前景。


圖I為本發(fā)明中編碼抗原表位改變的腸毒素C2突變體基因的PCR產(chǎn)物核酸電泳圖譜(其中M代表DL2000 marker ; I代表具有序列表SEQ ID NO : I中堿基序列的突變基因的 PCR 產(chǎn)物 SEC2 (Y26V)。圖2為本發(fā)明中抗原表位改變的腸毒素C2突變體純品的電泳圖譜(其中M代表蛋白marker ；1代表具有序列表SEQ ID NO 1中堿基序列的突變體SEC2(Y26V))。圖3為本發(fā)明中抗原表位改變的腸毒素C2突變體純品的超抗原活性檢測實驗結(jié)果圖(橫坐標為劑量梯度；縱坐標為增值指數(shù))。圖4為本發(fā)明中抗原表位改變的腸毒素C2突變體純品的體外抑制Hepal-6腫瘤細胞生長能力的檢測結(jié)果圖(其中橫坐標為突變體的劑量梯度；縱坐標為抑瘤率)。圖5為本發(fā)明中抗原表位改變的腸毒素C2突變體體外對野生型SEC2特異性抗體的親合能力檢測結(jié)果圖(其中橫坐標為蛋白濃度；縱坐標為吸光度)圖6為本發(fā)明抗原表位改變的腸毒素C2突變體SEC2 (Y26V)的三維結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施例方式
實施例I具有序列表SEQID NO 1堿基序列的一種抗原表位改變的腸毒素C2突變體的編碼基因序列(參見序列表)001GAGAGTCAACCAGACCCTACGCCAGATGAG TTGCACAAAT041CAAGTGAGTTTACTGGTACGATGGGTAATATGAAAGTATT081ATATGATGATCATTATGTATCAGCAACTAAAGTTATGTCT121GTAGATAAATTTTTGGCACATGATTTAATTTAIAACATTA161GTGATAAAAAACTAAAAAATTATGACAAAGTGAAAACAGA201GTTATTAAATGAAGATTTAGCAAAGAAGTACAAAGATGAA241GTAGTTGATGTGTATGGATCAAATTACTATGTAAACTGCT281ATTTTTCATCCAAAGATAATGTAGGTAAAGTTACAGGTGG321TAAAACTTGTATGTATGGAGGAATAACAAAACATGAAGGA361AACCACTTTGATAATGGGAACTTACAAAATGTACTTAIAA401GAGTTTATGAAAATAAAAGAAACACAATTTCTTTTGAAGT441GCAAACTGATAAGAAAAGTGTAACAGCTCAAGAACTAGAC481ATAAAAGCTAGGAATTTTTTAATTAATAAAAAAAATTTGT521ATGAGTTTAACAGTTCACCATATGAAACAGGATATATAAA561ATTTATTGAAAATAACGGCAATACTTTTTGGTATGATATG601ATGCCTGCACCAGGCGATAAGTTTGACCAATCTAAATATT641TAATGATGTACAACGACAATAAAACGGTTGATTCTAAAAG681TGTGAAGAIAGAAGTCCACCTTACAACAAAGAATGGA(a)序列特征*長度717堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)具有序列表SEQID NO 3氨基酸序列的一種抗原表位改變的腸毒素C2突變體序列(參見序列表)001ESQPDPTPDELHKSSEFTGTMGNMKVLYDDHYVSATKVMS041VDKFLAHDLIYNISDKKLKNYDKVKTELLNEDLAKKYKDE081VVDVYGSNYYVNCYFSSKDNVGKVTGGKTCMYGGITKHEG121NHFDNGNLQNVLIRVYENKRNTISFEVQTDKKSVTAQELD161IKARNFLINKKNLYEFNSSPYETGYIKFIENNGNTFffYDM20IMPAP⑶KFDQSKYLMMYNDNKTVDSKSVKIEVHLTTKNGSEQ ID NO. 3的信息(參見序列表)
(a)序列特征*長度239個氨基酸*類型肽鏈*鏈型單鏈(b)分子類型成熟肽鏈(C)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)實施例2一種抗原表位改變的腸毒素C2突變體的制備方法①金黃色葡萄球菌基因組DNA的提取接種金黃色葡萄球菌單菌落于5ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床過夜培養(yǎng)，取I. 5ml的培養(yǎng)物離心收集菌體。提取金黃色葡萄球菌基因組DNA (基因組DNA提取操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R. E.金斯頓，D. D.穆爾，J. G塞德曼，J. A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學實驗指南》美國紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40)。②PCR引物設(shè)計及反應(yīng)條件分別設(shè)計合成PCR引物序列如下sec2-F:5， -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’sec2-R:5， -TCGCTCGAGTTATCCATCTTTGTTG-3，F(xiàn)-Mutant :5’ -GGGTAATACGAAAGTATTATATGATGATC-3’R-Mutant :5，-CATCATATAATACTITCGTATTACCCATCG-3，；所有引物均由 invitrogen生物技術(shù)公司合成。以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用特異性PCR引物sec2-F和sec2-R擴增出具有列表SEQ ID NO. 2堿基序列的SEC2全基因sec2 ；SEC2全基因的制備，具有SEQ ID NO 2所示的序列SEQ ID NO. 2的信息(參見序列表)001GAGAGTCAAC CAGACCCTAC GCCAGATGAG TTGCACAAAT041CAAGTGAGTT TACTGGTACG ATGGGTAATA TGAAATATTT081ATATGATGAT CATTATGTAT CAGCAACTAA AGTTATGTCT121GTAGATAAAT TTTTGGCACA TGATTTAATT TATAACATTA161GTGATAAAAA ACTAAAAAAT TATGACAAAG TGAAAACAGA201GTTATTAAAT GAAGATTTAG CAAAGAAGTA CAAAGATGAA 241GTAGTTGATG TGTATGGATC AAATTACTAT GTAAACTGCT281ATTTTTCATC CAAAGATAAT GTAGGTAAAG TTACAGGTGG321TAAAACTTGT ATGTATGGAG GAATAACAAA ACATGAAGGA361AACCACTTTG ATAATGGGAA CTTACAAAAT GTACTTATAA401GAGTTTATGA AAATAAAAGA AACACAATTT CTTTTGAAGT441GCAAACTGAT AAGAAAAGTG TAACAGCTCA AGAACTAGAC481ATAAAAGCTA GGAATTTTTT AATTAATAAA AAAAATTTGT
521ATGAGTTTAA CAGTTCACCA TATGAAACAG GATATATAAA561ATTTATTGAA AATAACGGCA ATACTTTTTG GTATGATATG601ATGCCTGCAC CAGGCGATAA GTTTGACCAA TCTAAATATT641TAATGATGTA CAACGACAAT AAAACGGTTG ATTCTAAAAG681TGTGAAGATA GAAGTCCACC TTACAACAAA GAATGGA(a)序列特征*長度717堿基對
*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結(jié)構(gòu)線性(b)分子類型cDNA(c)假設(shè)否(d)反義否(e)最初來源金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)在此基礎(chǔ)上，以SEC2全基因sec2為模板，采用引物sec2_F :5’ -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 R-Mutant :5’ -CATCATATAATACTTTCGTATTACCCATCG-3’ ；采用引物 sec2-R :5’ -TCGCTCGAGTTATCCAITCITTGTTG-3’ 和 F-Mutant :5’ -GGGTAATACGAAAGTATTATATGATGATC-3’分別擴增獲得突變位點上游和下游的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2_F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點上游和下游的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQID NO 1中堿基序列SEC2(Y26V)突變基因；各基因片斷的PCR反應(yīng)體系均為50iU :10XPfu DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5 ill、dNTP 4uL、上下游引物各lOpmol、模板金黃色葡萄球菌基因組DNA25ng、Pfu DNA聚合酶1U，無菌超純水補齊體積至50 ii I?；蚱蔚腜CR反應(yīng)條件為第一階段95°C，5分鐘；第二階段94°C，30秒；55°C，30秒；72°C，90秒；共30個循環(huán)；第三階段72°C，10分鐘；③抗原表位改變的腸毒素C2突變體編碼基因的鑒定片斷PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)I. 2%瓊脂糖凝膠電泳分析并分離(參見圖I)，分別切下大小為717bp的基因片段，按博大泰克生物技術(shù)公司膠回收試劑盒使用說明書進行膠回收；抗原表位改變的腸毒素C2突變體表達載體的構(gòu)建以上SEC2(Y26V)的PCR回收產(chǎn)物經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切，再行膠回收，以T4DNA連接酶連接入經(jīng)同樣雙酶切的pET-28a表達載體，構(gòu)建成表達載體pET-28a-SEC2 (Y26V) -SEQID NO 1轉(zhuǎn)化E. coli BL21 (DE3)感受態(tài)細胞(轉(zhuǎn)化操作按F.奧斯伯，R.布倫特，R. E.金斯頓，D.D.穆爾，J.G.塞德曼，J.A.史密斯，K.斯特拉爾《精編分子生物學實驗指南》美國紐約John Wiley & Sons出版社1995年第三版P39-40),篩選陽性克隆并以Sanger雙脫氧末端終止法測定DNA序列(DNA測序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成)。抗原表位改變的腸毒素C2突變體的表達及純化接種測序結(jié)果正確的BL21(DE3)克隆于含50 y g/ml卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，過夜活化培養(yǎng)，以1% (V/V)接種量轉(zhuǎn)接下一級，37°C搖床培養(yǎng)至0D_為0. 5，加入終濃度I. OmmoI/L的IPTG(購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，30°C誘導表達4小時。
離心收集菌體，并將收集的菌體重懸于1/5體積的平衡緩沖液(IOmMTirs-HCl，0. 5M NaCl, 20mM咪唑，pH7. 9)，常規(guī)超聲波破碎菌體，過濾除沉淀，采用Ni親合層析柱對各目的產(chǎn)物進行純化，即獲得具有序列表SEQ ID NO :3中氨基酸序列的抗原表位改變的腸毒素C2突變體；純化時以0. 5ml/min速度上樣于預(yù)先平衡好的Ni親合層析柱；以含40mM咪唑的平衡緩沖液洗滌10個柱體積，洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最后以洗脫緩沖液(20mMTirs-HCl, 0. 5M NaCl，250mM咪唑，pH7. 9)洗脫下目的產(chǎn)物，并對洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃縮。通過SDS-PAGE電泳鑒定蛋白大小及純度(參見圖2，如圖所示，大腸桿菌BL21(DE3)重組表達菌株經(jīng)過IPTG誘導，并經(jīng)Ni-親合層析柱純化后，獲得了高純度的突變體，能夠滿足進一步的實驗需要)。
實施例3抗原表位改變的腸毒素C2突變體的超抗原活性檢測取SPF級純系小鼠Balb/c，通過頸椎處死后在無菌條件下取其脾臟，輕輕壓碎后過200目篩網(wǎng)。然后將過篩網(wǎng)后的細胞懸液在1000rpm/min轉(zhuǎn)速下離心5min收集細胞沉淀，用5mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置5min后于1000rpm/min離心5min。再以不含血清的1640培養(yǎng)基(購自Gibco公司)清洗細胞1-2次，最后用含10% (體積百分比)小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液(購自Gibco公司)調(diào)節(jié)細胞濃度，以8X IO5Cells/孔加到96孔板中。將經(jīng)純化的突變體以10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml、10000ng/ml的終濃度加入各孔，每個濃度設(shè)3個復孔，SEC2野生蛋白作為陽性對照。培養(yǎng)72h后，加入25ul/孔的MTT液(購自Sigma公司)。繼續(xù)培養(yǎng)4h，1500r/min離心5分鐘后棄上清培養(yǎng)液，收集細胞，加入濃度為120ul/well的二甲基亞砜溶液(DMSO)，溶解15min后，通過酶標儀以測定波長570nm、參比波長630nm條件下測吸光值。最后以增殖指數(shù)(Proliferation Index, PI)表示增值能力，PI =實驗組吸光值/陰性對照組吸光值(參見圖3，突變體在不同濃度范圍均能夠有效地刺激小鼠T細胞增殖)。實施例4抗原表位改變的腸毒素C2突變體的抗腫瘤活性檢測將小鼠肝癌細胞H印al-6傳代培養(yǎng)后用胰蛋白酶-EDTA消化液消化，用含含10%(體積百分比)小牛血清的1640培養(yǎng)基稀釋成濃度為5X IO5ceIlsAiL的單細胞懸液，然后以2. 5X IO4Cells/孔培養(yǎng)在96孔板。將按實施例3中方法分離獲得的小鼠脾淋巴細胞以5X105cells/well加入到上述含有H印al-6細胞的96孔板中，使效靶比達到20 I。然后將純化的突變體分別以10、100、1000ng/mL的終濃度加入各孔。以牛血清白蛋白(BSA)作為陰性對照，SEC2野生蛋白作為陽性對照，并設(shè)腫瘤細胞對照孔、淋巴細胞自然釋放孔、空白對照孔及調(diào)零孔，每個濃度設(shè)3個復孔，按常規(guī)條件培養(yǎng)72h，加入25ul/Well的MTT液。繼續(xù)培養(yǎng)4h，1000r/min離心收集細胞，加入DMS0120ul/well，溶解15min后，在酶標儀上以測定波長570nm，參比波長630nm測定各孔的吸光值。腫瘤抑制率計算公式如下100-[(蛋白實驗孔吸光值-淋巴細胞自然釋放孔吸光值)/ (腫瘤細胞對照孔吸光值-空白對照孔吸光值)]X 100% (參見圖4，突變體均對Hepal-6細胞具有一定體外抑制能力)。實施例5抗原表位改變的腸毒素C2突變體的抗原表位分析
該分析中所使用的抗體均由中國藥品生物制品檢定所提供。將野生型腸毒素C2和抗原表位改變的腸毒素C2突變體以含20 % (體積百分比)吐溫80的PBS緩沖液(PBS-T20)分別稀釋成25ng/ml、50ng/ml和100ng/ml后加入到事先包被有抗野生型腸毒素C2抗體的96孔板中(100 ill每孔)。37°C培養(yǎng)2小時后去除培養(yǎng)孔中的液體并用PBS-T20清洗各孔。向各孔中加入100 ill抗SEC2酶聯(lián)抗體繼續(xù)37°C培養(yǎng)I. 5小時，除去各孔中的液體并用PBS-T20清洗，向各反應(yīng)孔中加入100 ill鄰苯二胺37°C培養(yǎng)0. 5小時，再向各反應(yīng)孔中加入50 u I 2mol/L的H2SO4終止反應(yīng)并在450nm波長下測定各孔的吸光值(參見圖5，突變體對野生型SEC2抗體的識別結(jié)合能力顯著下降，說明其抗原表位顯著改變)。實施例6抗原表位改變的腸毒素C2突變體的分子三維結(jié)構(gòu)分析 經(jīng)過Ni親和層析純化的系列SEC2突變體純品SEC2 (Y26V)，經(jīng)分子排阻和離子交換法再次純化并超濾濃縮(方法參考分子克隆實驗指南第三版(薩姆布魯克著，黃培堂等譯，科學出版社出版)。在室溫下通過懸滴法獲得突變體的晶體。以稀疏矩陣采樣法確定結(jié)晶條件。最終的結(jié)晶條件如下SEC2(Y26V)蛋白溶液(20mg/ml)和等體積的母液(0. IMTris-HCKpH 7. 4)，0. 08M醋酸鎂，26% (w/v)聚乙二醇6000)混合，約15-18天時出現(xiàn)晶體。用多波長反常散射法(MAD)確定位相，MAD數(shù)據(jù)在ADSC Quantum_4R C⑶探測器上收集，所有數(shù)據(jù)用DPS軟件包進行統(tǒng)一，用CCP4軟件包進行坐標修正與處理。模型用XtalView4. 0軟件在Silicon Graphics OCTANE上構(gòu)建和校正，用REFMAC程序進行精化。突變體SEC2(Y26V)的三維結(jié)構(gòu)參見圖6，結(jié)果顯示，該突變體結(jié)構(gòu)整體上為橢圓體蛋白分子，包含兩個相對獨特的結(jié)構(gòu)域，N端結(jié)構(gòu)域主要為P卷筒結(jié)構(gòu)，C端結(jié)構(gòu)域主要為P發(fā)夾結(jié)構(gòu)。整體分子的二級結(jié)構(gòu)主要由a-螺旋和￠-折疊組成。
權(quán)利要求
1.抗原性改變的腸毒素C2突變體，其特征在于，其氨基酸序列如序列表SEQID N03所示。
2.—種權(quán)利要求I所述的腸毒素C2突變體的編碼基因，其特征在于，其堿基序列如序列表SEQ ID NO 1所示。
3.—種權(quán)利要求I所述的腸毒素C2突變體的制備方法，其特征在于，制備步驟為， 1)以金黃色葡萄球菌基因組DNA為模板，采用特異性PCR引物sec2-F5’ -CGGAATTCGAGAGTCAACCAGA-3’ 和 sec2_R :5’ -TCGCTCGAGTTATCCATTCTTTGTTG-3’ 擴增出SEC2全基因sec2 ； 2)在此基礎(chǔ)上，以sec2為模板，采用引物對sec2-F和R-Mutant:5’ -CATCATATAATACTTTCGTATTACCCATCG-3，；引物對 sec2_R 和 F-Mutant :5，-GGGTAATACGAAAGTATTATATGATGATC-3’分別擴增獲得突變位點上游和下游的重疊PCR產(chǎn)物，然后以sec2-F和sec2-R為引物，采用上述獲得突變位點上游和下游的重疊PCR產(chǎn)物為模板進行PCR擴增擴得具有序列表SEQID NO 1中堿基序列的SEC2 (Y26V)突變基因； 3)將以上突變基因SEC2(Y26V)克隆于表達載體pET_28a，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)為宿主菌，構(gòu)建成異源表達抗原表位改變的腸毒素C2突變體的基因工程菌，經(jīng)IPTG誘導表達并純化制得相應(yīng)抗原表位改變的腸毒素C2突變體純品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟(I)和步驟(2)中所述的PCR反應(yīng)體系為50iU =IOXPfu DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液5iil、dNTP4uL、上下游引物各lOpmol、模板25ng、Pfu DNA聚合酶1U，無菌超純水補齊體積至50 yl ; PCR反應(yīng)條件為第一階段95°C，5分鐘；第二階段94°C，30秒；55°C，30秒；72°C，90秒；共30個循環(huán)；第三階段72°C，10分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟3)中采用Ni親合層析柱對目的產(chǎn)物進行純化，純化時以0. 5ml/min速度上樣于預(yù)先平衡好的Ni親合層析柱；以含40mM咪唑的平衡緩沖液洗滌10個柱體積，洗去非特異性結(jié)合的雜蛋白；最后以洗脫緩沖液洗脫下目的產(chǎn)物，并對洗脫產(chǎn)物經(jīng)透析法除鹽濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于所述的洗脫緩沖液的組成為20mMTirs-HCl, 0. 5M NaCl，250mM 咪唑，溶液的 pH = 7. 9。
7.—種權(quán)利要求I所述的腸毒素C2突變體的應(yīng)用，其特征在于所述的腸毒素C2突變體可作為抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)藥物的活性成份。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腸毒素C2突變體具有良好的免疫刺激活性和腫瘤抑制活性，應(yīng)用于抗腫瘤或免疫調(diào)節(jié)藥物中，由于其抗原表位較野生型有顯著改變，可有效規(guī)避人體內(nèi)野生型金黃色葡萄球菌腸毒素C2特異性抗體的識別和中合，減少體內(nèi)血清清除反應(yīng)。
全文摘要
抗原性改變的腸毒素C2突變體及編碼基因與制備和應(yīng)用涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，更具體的說，是涉及一種具有藥用前景的抗原性改變的腸毒素C2突變體及編碼基因與制備和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種抗原性改變的腸毒素C2突變體及編碼基因與制備和應(yīng)用?？乖愿淖兊哪c毒素C2突變體的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO3所示；腸毒素C2突變體的編碼基因的堿基序列如序列表SEQ IDNO1所示。
文檔編號A61P37/02GK102633867SQ201110041499
公開日2012年8月15日 申請日期2011年2月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月15日
發(fā)明者張惠文, 張成剛, 徐明愷, 李旭, 王洪波, 譚煥波 申請人:中國科學院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所