專(zhuān)利名稱(chēng)：穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸制劑及其生產(chǎn)方法。本發(fā)明的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸制劑可為粉末、液體或分散體的形式。磷脂酰絲氨酸制劑可用作營(yíng)養(yǎng)制品 (nutriaceuticals)或功能性食品或藥物組合物的營(yíng)養(yǎng)制品添加劑。
背景技術(shù)：
在本申請(qǐng)中自始至終所提及的全部出版物以全文并入本文作為參考，包括其中所引的全部文獻(xiàn)。磷脂酰絲氨酸(PS)，為一種磷脂營(yíng)養(yǎng)物，在細(xì)胞膜內(nèi)具有活性，并且是腦細(xì)胞膜中主要的酸性磷脂組分。PS在許多與膜有關(guān)的神經(jīng)細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用。PS的主要目的是幫助保持適當(dāng)?shù)哪ち鲃?dòng)性，該性質(zhì)與大多數(shù)膜功能密切相關(guān)。PS已經(jīng)成為許多與記憶喪失、情緒、認(rèn)知行為和學(xué)習(xí)能力有關(guān)的人臨床試驗(yàn)的主題。許多研究表明PS可有助于那些患有年齡相關(guān)性記憶損傷的受試者。另外，PS甚至可有助于無(wú)認(rèn)知損傷的受試者的認(rèn)知最佳化。膳食的PS在腸中被有效地和迅速地吸收進(jìn)入血液，并容易地穿過(guò)血腦屏障到達(dá)腦內(nèi)的神經(jīng)細(xì)胞。PS可以提取自牛腦、植物，或可使用生物催化技術(shù)從大豆磷脂生產(chǎn)PS。通過(guò)使用磷脂酶D (PLDs)的磷脂酰基移轉(zhuǎn)(transphosphatidylation)反應(yīng)，可容易地對(duì)磷脂的頭基進(jìn)行修飾。因此，磷脂酰絲氨酸可從磷脂酰膽堿或任何其它磷脂混合物與絲氨酸通過(guò)PLD
催化生產(chǎn)。目前，生產(chǎn)和上市的PS為粉末和流體形式，濃度從10%到90%不等。流體形式的PS通常包括通常在中鏈甘油三酯(MCT)或大豆甘油三酯的油性介質(zhì)中的無(wú)色透明的磷脂酰絲氨酸溶液。該形式通常用于軟膠囊形式的食物增補(bǔ)劑。PS增補(bǔ)劑屬于營(yíng)養(yǎng)制品 (nutraceuticals)范疇，營(yíng)養(yǎng)制品的定義是任何作為食品、食品的一部分并提供醫(yī)學(xué)和/ 或健康益處(包括疾病的預(yù)防和治療)的物質(zhì)。在較寬定義范圍內(nèi)，認(rèn)為食物增補(bǔ)劑和功能性食品都屬于營(yíng)養(yǎng)制品。磷脂酰絲氨酸制劑(特別是液體形式)的主要問(wèn)題之一是其由于迅速分解而穩(wěn)定性低。分解的確切原因尚未完全了解。有許多關(guān)于這一現(xiàn)象的原因的假設(shè)，盡管大部分未經(jīng)過(guò)系統(tǒng)地驗(yàn)證或證明。普遍的觀點(diǎn)認(rèn)為分解主要由殘余生物催化活性和/或與水或甘油以及其它醇部分的副反應(yīng)所致。這些反應(yīng)當(dāng)PS制劑為流體并且被裝入軟膠囊內(nèi)時(shí)顯得特別重要。軟膠囊裝囊通常導(dǎo)致少量的水和/或甘油移動(dòng)并隨后并入膠囊的內(nèi)含物中。其中存在PLD殘余生物催化活性的PS制劑，特別是流體制劑，可能容易發(fā)生由磷脂?；妻D(zhuǎn)作用(其除去絲氨酸頭基)所致的PS生物催化降解，導(dǎo)致PS活性成分喪失。該磷脂?；妻D(zhuǎn)活性可導(dǎo)致在流體PS制劑本身或裝囊后的流體制劑中發(fā)現(xiàn)的利用水而發(fā)生的水解。水解將形成磷脂酸(PA)。當(dāng)磷脂?；妻D(zhuǎn)作用利用了在流體PS制劑本身或裝囊后的流體制劑中可找到的甘油或其它醇部分時(shí)，其可引起絲氨酸頭基被其它醇置換，得到磷脂酰甘油(PG)或其它相應(yīng)的磷脂衍生物。其它降解路徑也是可能的。這些包括化學(xué)降解，例如絲氨酸羧基的脫羧基，得到產(chǎn)物如磷脂酰乙醇胺(PE)或其它衍生物。脂質(zhì)過(guò)氧化作用在PS降解中也起作用。PS可通過(guò)磷脂脂肪酸的完全或部分水解而降解，相應(yīng)地得到脫?；疨S (GPQ或溶血PS (LPQ。在 PS磷酸基(phosphate)除去的情況中，無(wú)論是通過(guò)具有磷脂酶C (PLC)樣活性的酶進(jìn)行酶促進(jìn)行、還是通過(guò)化學(xué)方式進(jìn)行，可產(chǎn)生甘油二酯，也可導(dǎo)致PS活性成分減少?？朔到獾囊粋€(gè)方法已經(jīng)在WO 03/088949中提出，其中將磷脂嵌入硬的或糊狀基質(zhì)中。除了上述建議的方法之外，其它降解路徑似乎合理并且可能是市售制劑中PS明顯降解的原因。因此本發(fā)明的目的是提供粉末、液體或分散體形式的PS穩(wěn)定制劑。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述PS穩(wěn)定制劑的生產(chǎn)方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述穩(wěn)定制劑在普通食物增補(bǔ)劑、特別是在軟膠囊形式的食物增補(bǔ)劑中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供所述穩(wěn)定制劑用作獨(dú)立的營(yíng)養(yǎng)制品、或用作食品或藥物組合物的添加劑的應(yīng)用。本發(fā)明的這些及其它目的通過(guò)后面的說(shuō)明將變得顯而易見(jiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服磷脂酰絲氨酸的不穩(wěn)定性問(wèn)題，本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)并在此提出了更穩(wěn)定的PS組合物。還提及了該穩(wěn)定的PS的應(yīng)用和生產(chǎn)方法。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了包括約1到約99% (w/w)磷脂酰絲氨酸的穩(wěn)定的 PS組合物。在本發(fā)明組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包括約1到約99% (w/w)的PS， 優(yōu)選約2. 5到80% (w/w)的PS,^ 1到約99% (w/w)的其它功能性成分，優(yōu)選約5到90% (w/w)的其它功能性成分，約1到約99% (w/w)的磷脂酰膽堿(PC)，優(yōu)選約1到25% (w/w) 的磷脂酰膽堿(PC)，優(yōu)選約1到約99% (w/w)的磷脂酰乙醇胺(PE)，優(yōu)選約1到10% (w/w) 的磷脂酰乙醇胺(PE)，約0. 1到約99% (w/w)的磷脂酰肌醇(PI)，優(yōu)選約0. 5到10% (w/ w)的磷脂酰肌醇(PI)，約1到約99% (w/w)的ω-3源，優(yōu)選約10到90% (w/w)的ω-3 源，約1到約99% (w/w)的ω-6源，優(yōu)選約10到90% (w/w)的ω-6源，和/或約1到約 99% (w/w)的甾醇或甾醇酯，優(yōu)選約1到65% (w/w)的甾醇或甾醇酯。另外，本發(fā)明組合物的特征在于磷脂酸(PA)的含量不超過(guò)15%。優(yōu)選地，PA含量低于10%，更優(yōu)選為1-7%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物的特征在于不超過(guò)約1到約5%的磷脂酰絲氨酸在至少6個(gè)月，優(yōu)選至少12個(gè)月，更優(yōu)選至少M(fèi)個(gè)月的儲(chǔ)存期后分解。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，組合物基本上無(wú)磷脂酶活性，特別是磷脂酶D活性。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物為粉末形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中包括的PS為基本上可溶于有機(jī)溶劑的鹽的形式，特別是單價(jià)離子的鹽，優(yōu)選鈉鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中包括的PS為基本上不溶于有機(jī)溶劑的鹽的形式，特別是二價(jià)離子的鹽，優(yōu)選鈣鹽，或者，也可為鎂鹽。本發(fā)明的組合物可另外任選地包括生理學(xué)/藥學(xué)可接受的添加劑，如助流動(dòng)劑、 乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、著色劑、消泡劑和抗結(jié)塊劑，以及稀釋劑、賦形劑和載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物用作食物增補(bǔ)劑、營(yíng)養(yǎng)食品 (nutraceutical food)和/或用作藥品添加劑。在第二方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸液體藥劑，其中PS以基本上可溶于有機(jī)溶劑的、溶于油優(yōu)選中鏈甘油三酯中的鹽的形式存在。優(yōu)選地，所述的溶于油的PS為鈉鹽形式。在一個(gè)第一實(shí)施方案中，本發(fā)明的液體制劑包括約1到約90% (w/w)、優(yōu)選約2. 5 到約55% (w/w)的磷脂酰絲氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸液體制劑的特征在于不超過(guò)約1到約5 %的磷脂酰絲氨酸在至少6個(gè)月，優(yōu)選至少12個(gè)月，更優(yōu)選至少M(fèi)個(gè)月的儲(chǔ)存期后分解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的液體磷脂酰絲氨酸制劑進(jìn)一步包括另外的生物功能性成分，優(yōu)選卵磷脂、磷脂、維生素、抗氧化劑、礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)或肽、留醇和其它衍生物、營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物及其衍生物、氨基酸、植物提取物、發(fā)酵產(chǎn)品、甘油酯衍生物(甘油一酯和甘油二酯)、多不飽和脂肪酸、和ω-3和/或ω-6脂質(zhì)中的至少一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸液體制劑用作食物增補(bǔ)劑、營(yíng)養(yǎng)食品和/或用作藥品添加劑。在第三方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸組合物的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸分散體，其中PS以基本上不溶于有機(jī)溶劑的、分散在液基中的鹽的形式存在。 優(yōu)選地，所述鹽為鈣鹽。因此，穩(wěn)定的PS分散體為在液基中分散的PS的鈣鹽，所述液基優(yōu)選為脂質(zhì)，更優(yōu)選為油基?；蛘?，穩(wěn)定的PS分散體為在液基中分散的PS的鎂鹽，所述液基優(yōu)選為脂質(zhì)，更優(yōu)選為油基。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂基可為油、脂肪酸酯、游離脂肪酸和其它衍生物。優(yōu)選地，所述的本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸分散體包括約1到約70% (w/w)的磷脂酰絲氨酸，最優(yōu)選約5到45% (w/w)的磷脂酰絲氨酸。在本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸分散體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述油基為甘油三酯基，特別是中鏈甘油三酯基或植物油。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸分散體進(jìn)一步包括另外的生物功能性成分，優(yōu)選卵磷脂、磷脂、維生素、抗氧化劑、礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)或肽、留醇和其它衍生物、營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物及其衍生物、氨基酸、植物提取物、發(fā)酵產(chǎn)品、甘油酯衍生物(甘油一酯和甘油二酯)、多不飽和脂肪酸、和ω-3和/或ω-6脂質(zhì)中的至少一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸分散體用作食物增補(bǔ)劑、營(yíng)養(yǎng)食品和/或用作藥品添加劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括以本發(fā)明提供的任一種形式，S卩，磷脂酰絲氨酸組合物、PS液體制劑或PS分散體形式存在的PS的食品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述食品任選地進(jìn)一步包括至少一種另外的生物功能性成分，例如上述的那些生物功能性成分。在以下方面中，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括以本發(fā)明提供的任一種形式， 即，磷脂酰絲氨酸組合物、PS液體制劑或PS分散體形式存在的PS作為活性劑，并且任選地進(jìn)一步包括至少一種另外的活性劑和/或至少一種藥學(xué)可接受的添加劑、稀釋劑、載體或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可包括另外的藥學(xué)活性劑。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了含有以本發(fā)明提供的任一種形式，S卩，磷脂酰絲氨酸組合物、PS液體制劑或PS分散體形式存在的PS的膠囊。所述膠囊優(yōu)選為軟明膠膠囊。本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的任一種PS制劑，即，磷脂酰絲氨酸組合物、PS液體制劑或PS分散體作為認(rèn)知行為和學(xué)習(xí)能力的增強(qiáng)劑的應(yīng)用。本發(fā)明隨后的方面提供以本發(fā)明提供的任一種形式，即，磷脂酰絲氨酸組合物、PS 液體制劑或PS分散體形式存在的PS在預(yù)防記憶喪失特別是年齡相關(guān)性記憶喪失中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供生產(chǎn)穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸組合物的方法，該方法包括步驟(a)在固定化磷脂酶的存在下，將L-絲氨酸和任選的適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑以及卵磷脂的水性混合物培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段，得到磷脂酰絲氨酸；(b)取出含有磷脂酰絲氨酸的上層；(c)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從所述取出的上層獲得磷脂酰絲氨酸；(d)用適當(dāng)?shù)乃芤合礈煸诓襟E(C)中獲得的磷脂酰絲氨酸，以除去過(guò)量的L-絲
氨酸；(e)任選地用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑優(yōu)選乙醇在高溫下洗滌在步驟(d)中獲得的磷脂酰絲氨酸；和(f)干燥在步驟(e)中獲得的磷脂酰絲氨酸。在本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述磷脂酶優(yōu)選為磷脂酶D。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ讷@得的磷脂酰絲氨酸中使任何殘余磷脂酶活性滅活的步驟。在本發(fā)明方法的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述磷脂酶固定在不溶性基質(zhì)上并任選地涂有表面活性劑，并且，在步驟(a)后，使反應(yīng)混合物靜置直到磷脂酶沉淀。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸油基液體制劑的方法，該方法包括將本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物溶于適當(dāng)?shù)挠突械牟襟E，其中 PS以基本上可溶于有機(jī)溶劑的、溶于油優(yōu)選中鏈甘油三酯中的鹽的形式存在。優(yōu)選地，所述溶于油的PS為鈉鹽形式。優(yōu)選地，所述油基為中鏈甘油三酯或植物油。在最后的方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸液基分散體的方法，該方法包括將本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物分散在適當(dāng)?shù)挠突?yōu)選甘油三酯基并且特別是中鏈甘油三酯或植物油中的步驟，在本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物中，PS以基本上不溶于有機(jī)溶劑的、溶于油優(yōu)選中鏈甘油三酯中的鹽的形式存在，并且其中優(yōu)選所述溶于油的PS為鈣鹽形式。應(yīng)當(dāng)注意，可向液體制劑中加入另外的成分，以增濃混合物。本發(fā)明還提供了無(wú)論何時(shí)通過(guò)上述任一種方法生產(chǎn)的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸組合物。發(fā)明詳述在本說(shuō)明書(shū)中自始至終使用以下縮寫(xiě)-EDTA 乙二胺四乙酸-GC 氣相色譜法-GPS 脫?；?PS-HPLC 高效液相色譜法-HPTLC 高效薄層色譜法-LPS 溶血 PS-MCT 中鏈甘油三酯-匪R核磁共振-PA 磷脂酸-PC:磷脂酰膽堿-PE 磷脂酰乙醇胺-PG 磷脂酰甘油-PI 磷脂酰肌醇-PLC 磷脂酶 C-PLD 磷脂酶 D-PS 磷脂酰絲氨酸-RH 相對(duì)濕度-RT 室溫如上所述，磷脂酰絲氨酸(PQ為細(xì)胞膜的基本成分，其在腦細(xì)胞充分發(fā)揮作用方面特別重要，已知與記憶、情緒、認(rèn)知行為和學(xué)習(xí)能力有關(guān)。因?yàn)槠渚哂兄匾δ?，因此希望在人的膳食中增補(bǔ)PS。盡管在市場(chǎng)上確實(shí)存在增補(bǔ)劑，但是它們?cè)趯?shí)際對(duì)消費(fèi)者遞送的量方面存在問(wèn)題，因?yàn)樵谝话闳巳耗壳翱色@得的組合物中存在PS變質(zhì)和分解的固有問(wèn)題。通常已知PS是不穩(wěn)定的。即使純的干粉末在冷條件下儲(chǔ)存也易于發(fā)生高速率的降解。而且，具有高濃度PS的組合物，以及純的PS通常更傾向于不穩(wěn)定性問(wèn)題。已經(jīng)描述了純的PS易于以每天0. 5% w/w的速率降解[Sigma Catalog]。降解的確切原因或機(jī)制尚未完全明了。在很多情形中，歸因?yàn)樗饣蛄字；妻D(zhuǎn)反應(yīng)；然而，在很多情形中，分離不出這些反應(yīng)的產(chǎn)物。為了克服這一不穩(wěn)定性問(wèn)題，本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)并在此提出了更穩(wěn)定的PS組合物。還提及了所述穩(wěn)定的PS的應(yīng)用和生產(chǎn)方法。通過(guò)各種方法提供了增強(qiáng)的穩(wěn)定性，特別是解決了 PS穩(wěn)定性下降的幾個(gè)潛在的原因，所述原因在下文詳細(xì)描述。本文使用的術(shù)語(yǔ)“穩(wěn)定”或“穩(wěn)定的”同義。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了包括約1到約99% (w/w)磷脂酰絲氨酸的穩(wěn)定的 PS組合物。
如已經(jīng)提及的，PS不穩(wěn)定性的主要已知原因是在PS制劑中的殘余酶活性，以及PS 的化學(xué)降解，如脫羧基、脂質(zhì)過(guò)氧化、和磷脂脂肪酸的水解。因此，本發(fā)明提供的穩(wěn)定的PS組合物沒(méi)有或具有最小的酶活性，其具有化學(xué)穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性。這些屬性在以下實(shí)施例中進(jìn)行清楚地說(shuō)明。在本發(fā)明組合物的一個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物包括約1到約99% (w/w)的PS， 優(yōu)選約2. 5到80% (w/w)的PS,^ 1到約99% (w/w)的其它功能性成分，優(yōu)選約5到90% (w/w)的其它功能性成分，約1到約99% (w/w)的磷脂酰膽堿(PC)，優(yōu)選約1到25% (w/w) 的磷脂酰膽堿(PC)，優(yōu)選約1到約99% (w/w)的磷脂酰乙醇胺(PE)，優(yōu)選約1到10% (w/w) 的磷脂酰乙醇胺(PE)，約0. 1到約99% (w/w)的磷脂酰肌醇(PI)，優(yōu)選約0. 5到10% (w/ w)的磷脂酰肌醇(PI)，約1到約99% (w/w)的ω-3源，優(yōu)選約10到90% (w/w)的ω-3 源，約1到約99% (w/w)的ω-6源，優(yōu)選約10到90% (w/w)的ω-6源，和/或約1到約 99% (w/w)的甾醇或甾醇酯，優(yōu)選約1到65% (w/w)的甾醇或甾醇酯。另外，本發(fā)明組合物的特征在于磷脂酸(PA)的含量不超過(guò)15%。優(yōu)選地，PA的含量低于10%，更優(yōu)選為1到7%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物的特征在于不超過(guò)約1到約5%的磷脂酰絲氨酸在至少6個(gè)月，優(yōu)選至少12個(gè)月，更優(yōu)選至少M(fèi)個(gè)月的儲(chǔ)存期后分解。換句話說(shuō)，本發(fā)明組合物的初始PS含量的至少95%在至少6個(gè)月，優(yōu)選至少12個(gè)月，更優(yōu)選至少M(fèi)個(gè)月的儲(chǔ)存期后得以保存。優(yōu)選地，初始PS含量的至少97%在所述儲(chǔ)存期后得以保存，更優(yōu)選初始PS含量的至少99%得以保存。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，組合物基本上無(wú)磷脂酶活性，特別是磷脂酶D 活性。“基本上無(wú)”是指在本發(fā)明組合物中可發(fā)現(xiàn)的最大殘余酶活性小于1單位/毫升，優(yōu)選低于0. 1單位/毫升或甚至0. 05單位/毫升。實(shí)際上，這一數(shù)量的殘余酶活性如此微不足道，以至于其在可測(cè)量極限內(nèi)幾乎檢測(cè)不到，如表3所述結(jié)果所證明的。在所述的PS生產(chǎn)中使用的磷脂酶D(PLD)(磷脂酰膽堿phosphatidohydrolase， EC 3. 1.4.4)可從動(dòng)物、微生物、真菌或植物來(lái)源獲得。例子為卷心菜PLD，鏈霉菌屬 (Streptomyces sp. ) PLD,色褐鏈霉菌(Streptomyces chromofuscus)等等。通過(guò)使用本發(fā)明人的固定化PLD制劑能夠使得在最終的PS產(chǎn)品制劑中該酶的存在最小化或避免其存在， 因此使由加工酶所致的持續(xù)的PS降解的風(fēng)險(xiǎn)最小化或避免該風(fēng)險(xiǎn)。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物為粉末形式。如實(shí)施例 1中所述的，通過(guò)本發(fā)明人使用的合成法獲得的PS制劑為粉末形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中包括的PS為基本上可溶于有機(jī)溶劑的鹽的形式，特別是單價(jià)離子的鹽，優(yōu)選鈉鹽。以酶促方式生產(chǎn)的磷脂酰絲氨酸制劑通常生產(chǎn)為二價(jià)金屬的鹽，最優(yōu)選Ca+2鹽的形式。這些鹽不溶于許多有機(jī)溶劑，如油、己烷甚至醇中?？赏ㄟ^(guò)各種技術(shù)使二價(jià)鹽可溶于有機(jī)溶劑中，如使用溶劑的復(fù)合混合物，使用不同的添加劑和進(jìn)行鹽交換。在后者中，二價(jià)金屬離子與單價(jià)金屬離子如Na+交換。在有利于交換的條件下，使PS 二價(jià)鹽與過(guò)量的單價(jià)離子接觸而完成鹽交換。另外，可使用選擇性金屬螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)或EGTA。 這些螯合劑由于其與二價(jià)金屬特別是Ca+2的高結(jié)合常數(shù)而使平衡發(fā)生移動(dòng)。螯合劑在過(guò)量的鈉離子的存在下清除Cf2離子，鈉離子取代Cf2離子進(jìn)入PS的鹽中。這在環(huán)境條件和任選的高溫下使用具有1到3當(dāng)量的金屬螯合劑在水性環(huán)境中進(jìn)行。得到的鈉鹽更容易溶于有機(jī)溶劑?；旧峡扇苡谟袡C(jī)溶劑是指可行的并且形成透明溶液的、PS含量為1 % w/w到 40% w/w、甚至60% w/w的溶液。有機(jī)溶劑為，例如己烷、石油醚、甲苯、乙醇、油和脂類(lèi)(甘油三酯)、脂肪酸乙酯、寸寸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中包括的PS為基本上不溶于有機(jī)溶劑的鹽的形式，特別是二價(jià)離子的鹽，優(yōu)選鈣鹽。或者，其也可為鎂鹽。本發(fā)明的組合物可另外任選地包括生理學(xué)/藥學(xué)可接受的添加劑，如助流動(dòng)劑、 乳化劑、穩(wěn)定劑、防腐劑、著色劑、消泡劑和抗結(jié)塊劑，以及稀釋劑、賦形劑和載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物用作食物增補(bǔ)劑、營(yíng)養(yǎng)食品和/或用作藥品添加劑。在第二方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸液體制劑，其中PS以基本上可溶于有機(jī)溶劑的、溶于油優(yōu)選中鏈甘油三酯中的鹽的形式存在。優(yōu)選地，所述溶于油的PS為鈉鹽形式。在一個(gè)第一實(shí)施方案中，本發(fā)明的液體制劑包括約1到約90% (w/w)、優(yōu)選約2. 5 到約55% (w/w)的磷脂酰絲氨酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸液體制劑的特征在于不超過(guò)約1到約5 %的磷脂酰絲氨酸在至少6個(gè)月，優(yōu)選至少12個(gè)月，更優(yōu)選至少M(fèi)個(gè)月的儲(chǔ)存期后分解。同樣地，對(duì)于本發(fā)明的組合物，是指本發(fā)明的液體PS制劑的初始PS含量的至少 95 %在至少6個(gè)月，優(yōu)選至少12個(gè)月，更優(yōu)選至少M(fèi)個(gè)月的儲(chǔ)存期后得以保存。優(yōu)選地， 初始PS含量的至少97%在所述儲(chǔ)存期后得以保存，更優(yōu)選初始PS含量的至少99%在所述儲(chǔ)存期后得以保存。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸液體制劑進(jìn)一步包括另外的生物功能性成分，優(yōu)選卵磷脂、磷脂、維生素、抗氧化劑、礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)或肽、留醇和其它衍生物、營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物及其衍生物、氨基酸、植物提取物、發(fā)酵產(chǎn)品、甘油酯衍生物(甘油一酯和甘油二酯)、多不飽和脂肪酸、和ω-3和/或ω-6脂質(zhì)中的至少一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸液體制劑用作食物增補(bǔ)劑、營(yíng)養(yǎng)食品和/或藥品添加劑。在第三方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸組合物的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸分散體，其中PS以基本上不溶于有機(jī)溶劑的、分散在液基中的鹽的形式存在。 優(yōu)選地，所述鹽為鈣鹽。因此，穩(wěn)定的PS分散體為在液基中分散的PS的鈣鹽，所述液基優(yōu)選為脂質(zhì)，更優(yōu)選為油基?；蛘撸€(wěn)定的PS分散體為在液基中分散的PS的鎂鹽，所述液基優(yōu)選為脂質(zhì)，更優(yōu)選為油基。在一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)基可為油、脂肪酸酯、游離脂肪酸和其它衍生物。磷脂酰絲氨酸在脂質(zhì)或有機(jī)載體中的分散體的特征在于這種載體不能使PS完全溶解。這種載體可以是食用油(如甘油三酯基產(chǎn)品如植物油、魚(yú)油等等)，有機(jī)聚合物，碳水化合物及其衍生物，蛋白質(zhì)和肽制劑，等等。
發(fā)現(xiàn)不可溶于所述載體中的PS為晶體形式，具有不同的粒徑。在該結(jié)晶形式下， PS較少受到分解因素如水、甘油、殘余酶、和任何其它要求與PS分子或其取代基之一在分子水平上進(jìn)行反應(yīng)的因素的影響。PS分散體也可以固體或半固體(極高粘性形式)的形式獲得。固體性質(zhì)進(jìn)一步抑制或延遲任何可導(dǎo)致PS活性成分的水平減少的化學(xué)或酶催降解過(guò)程，僅僅是由于在固相中這種過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模式具有實(shí)質(zhì)上更低的速率常數(shù)。或者，液基不是脂質(zhì)，并且可是有機(jī)或無(wú)機(jī)液體聚合體，液體碳水化合物等。優(yōu)選地，所述的本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸分散體包括約1到約70% (w/w)的磷脂酰絲氨酸，最優(yōu)選約5到45% (w/w)的磷脂酰絲氨酸。本發(fā)明人已經(jīng)生產(chǎn)出含有40% PS的PS分散體或流體PS，如實(shí)施例中所示的。常見(jiàn)的用于食物增補(bǔ)劑的產(chǎn)品為在MCT油中具有20% w/w PS的流體PS。這使得可生產(chǎn)具有IOOmg PS的500mg軟膠囊，其是目前市場(chǎng)上可獲得的標(biāo)準(zhǔn)的和最常見(jiàn)的用于日常給用的PS形式。對(duì)于軟膠囊裝囊，其至今是最普及形式之一，其在環(huán)境條件或在不超過(guò) 35°C的溫度下必須具有流體制劑。這些限制起因于軟膠囊裝囊技術(shù)和機(jī)器設(shè)備。到目前為止，還不可能生產(chǎn)PS含量超過(guò)20 %的流體PS。看來(lái)生產(chǎn)具有更高濃度PS的流體PS是有利的，因?yàn)槠淇色@得較小的膠囊尺寸或可向膠囊中加入其它成分，而無(wú)需增大膠囊尺寸或增加人攝取所需的膠囊日服數(shù)。這從經(jīng)濟(jì)觀點(diǎn)，和對(duì)顧客更適口的觀點(diǎn)考慮，都是有利的。本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了具有上述優(yōu)點(diǎn)的流體PS，而不損害其穩(wěn)定性。在本發(fā)明中， PS鈉鹽在己烷中增溶化，并被加入到油載體優(yōu)選MCT中。不加入PC或卵磷脂和MCT的用量改變，導(dǎo)致更濃形式的PS。該濃度高于PS鈉鹽在MCT中的溶解性，因此，PS的一部分沉淀。因此，在獲得的制劑中存在的PS，一部分可溶，一部分分散，從而獲得流體特性、易于處理和劑量給藥，以及獲得高度穩(wěn)定性。在本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸分散體的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述油基為甘油三酯基，特別是中鏈甘油三酯基或植物油。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸分散體進(jìn)一步包括另外的生物功能性成分，優(yōu)選卵磷脂、磷脂、維生素、抗氧化劑、礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)或肽、留醇和其它衍生物、營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物及其衍生物、氨基酸、植物提取物、發(fā)酵產(chǎn)品、甘油酯衍生物(甘油一酯和甘油二酯)、多不飽和脂肪酸、和ω-3和/或ω-6脂質(zhì)中的至少一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸分散體用作食物增補(bǔ)劑、營(yíng)養(yǎng)食品和/或藥品添加劑。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括以本發(fā)明提供的任一種形式，S卩，磷脂酰絲氨酸組合物、PS液體制劑或PS分散體形式存在的PS的食品。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述食品任選地進(jìn)一步包括至少一種另外的生物功能性成分，例如上述的那些生物功能性成分。在隨后的方面，本發(fā)明提供了藥物組合物，其包括以本發(fā)明提供的任一種形式， 即，磷脂酰絲氨酸組合物、PS液體制劑或PS分散體形式存在的PS作為活性劑，并且任選地進(jìn)一步包括至少一種另外的活性劑和/或至少一種藥學(xué)可接受的添加劑、稀釋劑、載體或賦形劑。本發(fā)明的藥物組合物可包含另外的藥學(xué)活性劑。藥物組合物的生產(chǎn)在本領(lǐng)域中是公知的并且已經(jīng)在許多文章和教科書(shū)中有描述，參見(jiàn)，例如Remington' s Pharmaceutical Sciences,Gennaro A. R. ed. ,Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 1990，特別是其中的第 1521-1712 頁(yè)。本發(fā)明的藥物組合物可制成劑量單位形式，該劑型也可含有持續(xù)釋放裝置。組合物可通過(guò)藥學(xué)領(lǐng)域公知方法的任一種制備而成。這些劑型包括生理學(xué)可接受的載體，其固有地?zé)o毒性并且屬于非治療學(xué)的。這些載體的例子包括離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽、或電解質(zhì)如硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態(tài)二氧化硅、三硅酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、纖維素基物質(zhì)、和PEG?？诜o藥是遞送本發(fā)明藥物組合物的優(yōu)選途徑，盡管其它給藥途徑也是可行的。藥物組合物可對(duì)需要的受試者給用，以單次或多次給用。本發(fā)明組合物的“有效治療量”通過(guò)疾病狀況的嚴(yán)重程度結(jié)合治療學(xué)目的、給藥途徑和患者的一般條件(年齡、性別、體重及主治醫(yī)師已知的其它考慮因素)進(jìn)行確定。因此，治療學(xué)家有必要確定劑量并根據(jù)需要修改給藥途徑，從而獲得最佳療效。在又一個(gè)方面，本發(fā)明提供了包括以本發(fā)明提供的任一種形式，S卩，磷脂酰絲氨酸組合物、PS液體制劑或PS分散體形式存在的PS的膠囊。所述膠囊優(yōu)選為軟明膠膠囊。如上所述，PS已知與情緒和記憶的改善、以及認(rèn)知行為和學(xué)習(xí)能力的改善有關(guān)。因此，本發(fā)明提供了以本發(fā)明提供的任一種形式，S卩，磷脂酰絲氨酸組合物、PS液體制劑或PS分散體形式存在的PS作為認(rèn)知行為和學(xué)習(xí)能力增強(qiáng)劑的應(yīng)用。本發(fā)明隨后的方面提供以本發(fā)明提供的任一種形式，即，磷脂酰絲氨酸組合物、PS 液體制劑或PS分散體形式存在的PS在預(yù)防記憶喪失特別是年齡相關(guān)性記憶喪失中的應(yīng)用。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸組合物的方法，該方法包括(a)在固定化磷脂酶的存在下，將L-絲氨酸和任選的適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑以及卵磷脂的水性混合物培養(yǎng)適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段，得到磷脂酰絲氨酸；(b)取出含有磷脂酰絲氨酸的上層；(c)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從所述取出的上層獲得磷脂酰絲氨酸；(d)用適當(dāng)?shù)乃芤合礈煸诓襟E(C)中獲得的磷脂酰絲氨酸，以除去過(guò)量的L-絲
氨酸；(e)任選地用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑優(yōu)選乙醇在高溫下洗滌在步驟(d)中獲得的磷脂酰絲氨酸；和(f)干燥在步驟(e)中獲得的磷脂酰絲氨酸。在本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述磷脂酶優(yōu)選為磷脂酶D。在本發(fā)明方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包含通過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄔ讷@得的磷脂酰絲氨酸中使任何殘余磷脂酶活性滅活的步驟。所述適當(dāng)?shù)姆椒蔀?a)EDTA處理，(b)進(jìn)一步與有機(jī)溶劑優(yōu)選甲醇、乙醇或丙醇進(jìn)行培養(yǎng)，(c)熱滅活，和/或(d)加入PLD抑制劑。在本發(fā)明方法的又一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述磷脂酶固定在不溶性基質(zhì)上并任選地涂有表面活性劑，并且，在步驟(a)之后，使反應(yīng)混合物靜置直到磷脂酶沉淀。
當(dāng)在有機(jī)或水性介質(zhì)中、或在其混合物(又名兩相系統(tǒng))中進(jìn)行所述方法時(shí)，可使用固定化PLD制劑。在上述方法的步驟(a)中，任選在適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑的存在下，向L-絲氨酸的水溶液中加入卵磷脂，所述適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑幫助卵磷脂原料在反應(yīng)混合物中的分散和/或增溶?；旌衔飪?yōu)選攪拌適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段，優(yōu)選約1小時(shí)，以使磷脂均一分散在反應(yīng)介質(zhì)中。酶促反應(yīng)本身進(jìn)行適當(dāng)?shù)臅r(shí)間段，優(yōu)選至少12小時(shí)，同時(shí)攪拌，然后靜置反應(yīng)混合物。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如離心、過(guò)濾、壓濾、傾濾等獲得含有磷脂級(jí)分的反應(yīng)物上層。得到的磷脂酰絲氨酸進(jìn)一步用適當(dāng)?shù)乃芤合礈欤猿ト魏芜^(guò)量的L-絲氨酸，干燥，以獲得基本上無(wú)磷脂酶活性的磷脂酰絲氨酸。當(dāng)固定化PLD制劑用于PS的生產(chǎn)時(shí)，最終的PS制劑，無(wú)論是粉末還是流體制劑， 同市場(chǎng)上可買(mǎi)到的PS制劑相比，表現(xiàn)出優(yōu)異的穩(wěn)定性，如通過(guò)最小殘余酶活性所證明的。 從固定制劑的酶滲漏是非常常見(jiàn)的現(xiàn)象，這是由于基質(zhì)的機(jī)械降解或固定不充分。為了避免這一問(wèn)題，本發(fā)明人已經(jīng)使用了另外的步驟，使最終PS中存在的任何酶活性滅活。這些另外的步驟包括⑴在高溫(最高120°c)下，通過(guò)與有機(jī)溶劑，優(yōu)選甲醇、乙醇或丙醇、或任何其它能使酶滅活的有機(jī)溶劑進(jìn)行培養(yǎng)而進(jìn)行酶滅活；(ii)熱滅活；(iii)加入使酶滅活的添加劑，類(lèi)似例如EDTA處理；(ν)加入PLD抑制劑。使用酶抑制劑或使用選擇性除去酶輔因子如Cf2離子的試劑處理PS制劑優(yōu)選在水性介質(zhì)中進(jìn)行，以確保這些抑制劑或試劑可接觸殘余酶或水溶性輔因子。用選擇性金屬離子螯合劑如但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)及其相應(yīng)的鹽和衍生物的處理導(dǎo)致選擇性地結(jié)合Ca+2離子，使得Ca+2離子很難接近任何殘余酶。因此，即使殘余酶存在于制劑中，其由于缺乏基本的輔因子而不會(huì)發(fā)揮任何磷脂?；妻D(zhuǎn)或水解活性。用適當(dāng)?shù)腅DTA鹽處理的PS制劑進(jìn)一步用新鮮的水溶液洗滌并且通過(guò)過(guò)濾及其隨后干燥獲得。優(yōu)選地，PS制劑通過(guò)相對(duì)于有機(jī)介質(zhì)進(jìn)行提取獲得。所述有機(jī)介質(zhì)可以由如下物質(zhì)組成有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑的混合物或脂質(zhì)體系，如油、脂肪酸乙酯、游離脂肪酸、部分水解的甘油三酯，等等。另外，所述有機(jī)介質(zhì)可以含有不同比例的有機(jī)溶劑和脂質(zhì)載體。 通常MCT用作脂質(zhì)載體。在有機(jī)溶劑如碳?xì)浠衔镉袡C(jī)溶劑用于提取被處理的PS制劑的情況中，所述溶劑進(jìn)一步通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)除去。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸的穩(wěn)定磷脂酰絲氨酸油基液體制劑的方法，該方法包括將本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物溶于適當(dāng)?shù)挠突械牟襟E，其中PS 以基本上可溶于有機(jī)溶劑的、溶于油優(yōu)選中鏈甘油三酯中的鹽的形式存在。優(yōu)選地，所述溶于油的PS為鈉鹽形式。優(yōu)選地，所述油基為中鏈甘油三酯或植物油。在最后的方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸的液基分散體的方法，該方法包括將本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物分散在適當(dāng)?shù)挠突?、?yōu)選甘油三酯基并且特別是中鏈甘油三酯或植物油中的步驟，在本發(fā)明的磷脂酰絲氨酸組合物中，PS以基本上不溶于有機(jī)溶劑的、溶于油優(yōu)選中鏈甘油三酯中的鹽的形式存在，并且其中優(yōu)選所述溶于油的PS 為鈣鹽形式。應(yīng)當(dāng)注意，可向液體制劑中加入另外的成分，以增濃混合物。例如，磷脂酰膽堿含量可通過(guò)加入更多的卵磷脂而增加。因此，通過(guò)本發(fā)明方法生產(chǎn)的PS以磷脂酰絲氨酸的穩(wěn)定的粉末形式或穩(wěn)定的油基液體制劑的形式獲得，兩者基本上無(wú)磷脂酶活性。本發(fā)明還提供了無(wú)論何時(shí)通過(guò)上述任一種方法生產(chǎn)的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸組合物?？傊瑩?jù)信已知的和未知的若干種機(jī)制是PS降解的原因。在已知機(jī)制中，強(qiáng)調(diào)了以下的幾種，(1)酶水解和磷脂?；妻D(zhuǎn)，產(chǎn)生PA或PG; ( 磷脂脂肪酸的部分或完全水解，產(chǎn)生相應(yīng)的溶血PS或脫?；疨S (GPQ ； (3)磷酸基的除去，產(chǎn)生甘油二酯(DAG) ； (4) L-絲氨酸羧酸基(carboxylate group)的脫羧基，產(chǎn)生PE或其它更復(fù)雜的產(chǎn)物；( 磷脂氫過(guò)氧化；和(6)L-絲氨酸頭基的伯胺基的氧化，該氧化由空氣、光等引起。關(guān)于胺，特別是伯胺，它們對(duì)氧化高度靈敏。這些氧化的產(chǎn)品數(shù)量大并且?guī)缀醪豢赡茏R(shí)別他們。因此，能經(jīng)得住胺氧化的穩(wěn)定的PS通過(guò)引入添加劑生產(chǎn)而成，所述添加劑的特征在于它們具有保護(hù)敏感化學(xué)基免被氧化的能力。這些具有抗氧化特性的添加劑被加入到粉末PS以及流體PS中，特別是加入到裝囊到軟膠囊中的流體PS中。后者極易發(fā)生PS降解。使用的抗氧化劑包括0-5000ppm的迷迭香提取物、生育酚和抗壞血酰棕櫚酸酯，和0-200ppm的BHA、BHT和TBHQ。其它抗氧化劑或抗氧化劑的混合物，無(wú)論是人造的或天然的，被引入到本發(fā)明中。用于保護(hù)PS不發(fā)生降解的抗氧化劑的量為至少lOOppm，優(yōu)選 1000-3000ppm。這些膠囊，及其它們的散裝材料，在室溫下進(jìn)行分析，并且通過(guò)測(cè)定其穩(wěn)定性的加速試驗(yàn)。散裝材料在室溫下避光儲(chǔ)存在密封容器中。總之，本發(fā)明的穩(wěn)定的PS制劑在酶催降解方面表現(xiàn)出特別的穩(wěn)定性，通過(guò)使用固定化生物催化劑、殘余酶滅活作用以及使用酶抑制劑而實(shí)現(xiàn)。通過(guò)本文所述方法生產(chǎn)的PS的穩(wěn)定性通過(guò)監(jiān)控上述各降解路徑的不同降解產(chǎn)物進(jìn)行分析。這些產(chǎn)物的存在通過(guò)31P-NMR,和常用的色譜法(HPTLC、HPLC-ELSD和GC)法測(cè)量。在所有情況下，未檢測(cè)到所述降解標(biāo)志物存在量的升高，因此得出結(jié)論這些降解路徑中的任何一種都不能發(fā)生，得到高度穩(wěn)定的PS。因此，本發(fā)明提供了以組合物、液體或分散體這三種形式的任一種存在的穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸制劑，其能夠抵抗由以下路徑的至少一種所致的降解酶水解和磷脂?；妻D(zhuǎn)、磷脂脂肪酸的部分或完全水解、磷酸基的除去、L-絲氨酸羧酸基的脫羧基、磷脂氫過(guò)氧化、L-絲氨酸頭基的伯胺基的氧化。如公開(kāi)和描述的，可以理解本發(fā)明不局限于本文所列的特定的例子、方法步驟、材料，因?yàn)檫@些方法步驟和原料多少可發(fā)生改變。也可以理解，本文使用的術(shù)語(yǔ)僅用于特定實(shí)施方案的描述，而并非限于這些實(shí)施方案，因?yàn)楸景l(fā)明的保護(hù)范圍僅由權(quán)利要求及其等價(jià)物限定。必須指出，除非清楚地說(shuō)明，否則本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用的單數(shù)形式“一”和 “所述的”包括復(fù)數(shù)形式。在本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)的自始至終，除非上下文要求之外，術(shù)語(yǔ)“包含”及其變體如“包括”和“含有”可理解為暗示了包括所述整數(shù)或步驟、或一組整數(shù)和步驟，然而并不排除任何其它的整數(shù)或步驟、或一組整數(shù)和步驟。以下例子是本發(fā)明在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明各方面時(shí)所用的示例性技術(shù)。應(yīng)該理解為，盡管這些技術(shù)對(duì)于實(shí)踐本發(fā)明是示例性的優(yōu)選方案，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)閱讀本說(shuō)明書(shū)，可以認(rèn)識(shí)到可進(jìn)行多種改變而不脫離本發(fā)明的精神和保護(hù)范圍。實(shí)施例實(shí)施例1-用固定化酶制劑制備粉末形式的磷脂酰絲氨酸穩(wěn)定制劑1.固定化酶的制劑在本發(fā)明中，本發(fā)明人利用了幾種市場(chǎng)上可買(mǎi)到的PLDs，如來(lái)自鏈霉菌屬、卷心菜、和色褐鏈霉菌的磷脂酶D。在所有情況下，這些酶表現(xiàn)出高反應(yīng)性，并合成高質(zhì)量的PS。 最重要地是，磷脂酸的水平通常較低(數(shù)據(jù)未示出)。通過(guò)不同技術(shù)并使用不同的不溶性基質(zhì)作為載體對(duì)幾種PLD進(jìn)行固定化處理?；|(zhì)-固定化的磷脂酶，優(yōu)選涂覆表面活性劑的磷脂酶根據(jù)W000/56869所述方法制備，所述專(zhuān)利作為參考并入本文。也可使用市場(chǎng)上可買(mǎi)到的設(shè)計(jì)用于酶促共價(jià)固定的不溶性基質(zhì)， 如 Eupergit 環(huán)氧活化基質(zhì)(Rohm and Haas, Germany)。簡(jiǎn)而言之，將粗品PLD酶(300毫克/升蛋白質(zhì))溶于IL的含有4g不溶性無(wú)機(jī)或有機(jī)基質(zhì)(Celite、硅膠、氧化鋁或聚丙烯)的Tris緩沖液(pH 6. 5)中。溶液用磁力攪拌器在25°C劇烈攪拌30分鐘。對(duì)于涂覆表面活性劑的固定化酶制劑，向攪拌的酶溶液中滴加非離子型表面活性劑。涂覆表面活性劑的固定化磷脂酶和未固定的粗品磷脂酶進(jìn)行聲波處理10分鐘，然后在25°C攪拌8小時(shí)。得到的沉淀物通過(guò)過(guò)濾或離心(12，OOOrpm, 40C )收集，然后在-20°C冷凍過(guò)夜并進(jìn)行冷凍干燥。如表1所示，這些PLD固定化制劑成功地通過(guò)卵磷脂與L-絲氨酸的磷脂?；妻D(zhuǎn)產(chǎn)生磷脂酰絲氨酸，D-絲氨酸也可用于這些制劑。PS收率總是高于30%?？筛鶕?jù)不同的卵磷脂原材料生產(chǎn)不同級(jí)別的PS。最重要地是，固定化的PLD制劑表現(xiàn)出高活性，無(wú)論所述方法中使用了哪種卵磷脂原材料(數(shù)據(jù)未示出)。2.穩(wěn)定的PS制劑將250g L-絲氨酸(Rexim，F(xiàn)rance)置于1升的裝有750ml含有200mM CaCl2的適當(dāng)?shù)木彌_液(PH 3.5-7)例如檸檬酸鹽緩沖液的反應(yīng)器中。在絲氨酸完全溶解后，加入53g 的分級(jí)處理的大豆卵磷脂(Solae Company，USA)，其任選地與其它有機(jī)溶劑如己烷、乙酸乙酯、二乙醚等等一起加入，以幫助磷脂分散?；旌衔镌?0-60°C的溫度攪拌0. 5-2小時(shí)，使磷脂均一分散在反應(yīng)介質(zhì)中，向反應(yīng)介質(zhì)中加入1. 25g的酶制劑(反應(yīng)2，PLD2，表1)，反應(yīng)混合物攪拌M小時(shí)，然后停止攪拌直到酶制劑沉淀到反應(yīng)器的底部，從反應(yīng)器移出含有磷脂級(jí)分的上層。從該級(jí)分獲得磷脂酰絲氨酸，并用適當(dāng)?shù)乃芤合礈煲猿ミ^(guò)量的絲氨酸，獲得的磷脂酰絲氨酸實(shí)際上沒(méi)有酶痕量，這主要是由于酶被固定。從該制劑中，獲得純度超過(guò)30%的47g磷脂酰絲氨酸。使用表1所示的酶制劑重復(fù)該過(guò)程(分別為1、2、3和4)。記錄第一批的收率。固定化酶制劑再用于另外的批次(分別為第一、第二、第三和第四批)，得到的結(jié)果也概括在表1中。表1-固定化PLD制劑、反應(yīng)條件和PS收率
權(quán)利要求
1.穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸(PQ分散體，其包括分散在油基中的磷脂酰絲氨酸組合物，所述組合物包含1-99% (w/w)磷脂酰絲氨酸，其中所述磷脂酰絲氨酸為二價(jià)金屬陽(yáng)離子鹽的形式。
2.權(quán)利要求1的磷脂酰絲氨酸分散體，其中所述油基為食用油。
3.權(quán)利要求1或2的磷脂酰絲氨酸分散體，其中所述組合物包含1到70%(w/w)的磷脂酰絲氨酸，1到99% (w/w)的其它功能性成分，所述其它功能成分可為1到99% (w/w) 的磷脂酰膽堿(PC)，1到99% (w/w)的磷脂酰乙醇胺(PE)，1到99% (w/w)的磷脂酰肌醇 (PI)，1 到 99% (w/w)的 ω-3 源，1 到 99% (w/w)的 ω-6 源，和 1 到 99% (w/w)的甾醇或甾醇酯中的至少一種。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的磷脂酰絲氨酸分散體，其中所述鹽為鈣鹽或鎂鹽。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的磷脂酰絲氨酸分散體，其中所述油基為甘油三酯基，特別是中鏈甘油三酯基、植物油或魚(yú)油。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的磷脂酰絲氨酸分散體，其進(jìn)一步包括另外的生物功能性成分，優(yōu)選卵磷脂、磷脂、維生素、抗氧化劑、礦物質(zhì)、營(yíng)養(yǎng)蛋白質(zhì)或肽、留醇和其它衍生物、營(yíng)養(yǎng)性碳水化合物及其衍生物、氨基酸、植物提取物、發(fā)酵產(chǎn)品、甘油酯衍生物(甘油一酯和甘油二酯)、多不飽和脂肪酸、和ω-3和/或ω-6脂質(zhì)中的至少一種。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的磷脂酰絲氨酸分散體，其用作食物增補(bǔ)劑、營(yíng)養(yǎng)食品和/或藥品添加劑。
8.包括權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)的磷脂酰絲氨酸分散體、以及任選地進(jìn)一步包括至少一種另外的活性成分的食品。
9.包括權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的磷脂酰絲氨酸分散體、以及任選地進(jìn)一步包括至少一種另外的生物功能性成分和/或至少一種藥學(xué)可接受的添加劑、稀釋劑、載體或賦形劑的藥物組合物。
10.含有權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的磷脂酰絲氨酸分散體的膠囊，其中所述膠囊優(yōu)選為軟明膠膠囊。
11.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的磷脂酰絲氨酸分散體，其用作認(rèn)知行為和學(xué)習(xí)能力的增強(qiáng)劑。
12.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的磷脂酰絲氨酸分散體，其用于預(yù)防記憶喪失、特別是年齡相關(guān)性記憶喪失。
全文摘要
穩(wěn)定的磷脂酰絲氨酸制劑，本發(fā)明公開(kāi)了粉末、液體和分散體形式的穩(wěn)定的PS制劑，及其生產(chǎn)方法。重要地是，穩(wěn)定的PS制劑特別地?zé)o殘余磷脂酶D活性，并且本發(fā)明還公開(kāi)了消除所述活性的方法，并且公開(kāi)了這些PS制劑用于營(yíng)養(yǎng)制品或作為藥物組合物的活性劑的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K9/10GK102160651SQ201110043969
公開(kāi)日2011年8月24日 申請(qǐng)日期2004年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月25日
發(fā)明者A·舒爾曼, D·普拉特, G·本迪羅, N·沙恩曼, R·朱比, Y·特威托 申請(qǐng)人:酶學(xué)技術(shù)有限公司