專利名稱：大葉秦艽花提取物及其提取方法和在藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及大葉秦艽花提取物及其提取方法和在藥物中的應(yīng)用，特別是含量占 50%以上的萜類和黃酮類化合物在抗炎鎮(zhèn)痛和治療便秘的藥物中的應(yīng)用，屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
秦艽是我國重要的傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為中品，性味苦、平， 微寒，歸胃、肝、膽經(jīng)?？捎糜谥寡?，消腫，清腹熱、膽熱、脈熱，在我國有近2000年的藥 用歷史。秦艽是龍膽科龍膽屬植物，2010年版《中國藥典》收載同屬4個(gè)種大葉秦艽 Gentiana macrophylla Pall, λ0 ^^^/ tiana straminea Maxim.、耜著秦究Gentiana crassicanlis Duthie ex Burk.禾口小秦充dahurica Fisch.作為藥用，其中豐艮 為藥典規(guī)定藥用部位。藏醫(yī)稱秦艽為“解吉那?！?、麻花秦艽為“解吉嘎?！?，可止血，消腫， 清腹熱、膽熱脈熱。藏醫(yī)用全草治關(guān)節(jié)炎、肺病發(fā)燒、黃疸及二便不通。秦艽為多年生草本植物，分布在海拔600 4500m，以3000 4000m分布的種類 較多；生長在山地或高原的草地、林緣或灌叢中，喜較濕潤與腐殖質(zhì)較豐富的土壤和陽光較 充足的地方。秦艽在我國的分布，北自大興安嶺，經(jīng)內(nèi)蒙古草原，沿祁連山北麓至天山一 線，東界太行山脈，向南到云貴高原西北緣，西達(dá)青藏高原東部。從資源分布的常見度來 看，黃土高原及青藏高原東緣是我國秦艽資源分布中心。位于該區(qū)的陜西、甘肅、青海、四 川、山西等省是秦艽的主要產(chǎn)區(qū)，其中陜西為秦艽的道地產(chǎn)區(qū)。目前秦艽藥材仍主要來源于野生資源，20世紀(jì)50、60年代野生資源尚多。據(jù)全國 中藥材資源普查統(tǒng)計(jì)，20世紀(jì)80年代初，野生秦艽蘊(yùn)藏量為3500萬kg左右，1987年被國 家醫(yī)藥局列為野生資源瀕危藥材。由于秦艽的生長區(qū)域狹窄，對環(huán)境要求苛刻，以及生長 周期長，一般生長4 5年才能成為藥材，為此有限的野生資源供不應(yīng)求。目前臨床均使用 秦艽全草入藥，而花部的摘除不影響植株的生長，因此尋找一種新的藥用部位來代替全草 能夠有助于秦艽藥材根部的生長以及藥材的充分利用是很有現(xiàn)實(shí)意義的。秦艽化學(xué)成分主要含有環(huán)烯醚萜類化合物主要有龍膽苦苷、落干酸、獐芽菜苷、 獐芽菜苦苷等；黃酮類化合物主要有異葒草苷、異葒草素、牡荊黃素、異牡荊黃素等；三萜 類、甾體類化合物主要有櫟癭酸、谷留醇、胡蘿卜苷、齊墩果酸等；苯甲酸及其衍生物類 成分主要有紅白金花內(nèi)酯、紅白金花酸、苯甲酰胺和苯甲酸等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對大葉秦艽花的化學(xué)成分及藥理作用的研究，提供一種大葉 秦艽花提取物及其提取方法，為秦艽藥材的臨床使用提供一種新的藥用部位。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)過程如下
大葉秦艽花提取物，萜類和黃酮類化合物含量占50%以上，
大葉秦艽花提取物的提取方法大葉秦艽花經(jīng)粉碎，過20目篩，室溫下用乙醇-水溶液滲漉，滲漉液減壓濃縮至無醇味后于80° C水浴中蒸干即得大葉秦艽花提取物。甲醇、95%乙醇和70%乙醇(體積百分含量)提取效果無明顯差別，75%乙醇具有好 的溶出率，從經(jīng)濟(jì)和安全方面考慮采用75%乙醇作為提取溶劑。本發(fā)明利用秦艽新的藥用部位一大葉秦艽花，有利于保護(hù)為數(shù)不多的秦艽野生資 源；大葉秦艽花提取物提取方法簡單，提取物可用于制備治療抗炎鎮(zhèn)痛和潤腸通便藥物。


圖1為大葉秦艽花樣品HPLC色譜圖。
具體實(shí)施例方式一、提取物的制備
本實(shí)驗(yàn)用藥材購自陜西隴縣，由西北大學(xué)孫文基教授鑒定為大葉秦艽(fefliia/^ macrophylla Mil.)花部。取大葉秦艽花，粉碎，過20目篩，于60° C下用75%乙醇滲漉， 滲漉液減壓濃縮至無醇味后于80° C水浴中蒸干，即得大葉秦艽花提取物(此法得膏率為
28%) 。干燥大葉秦艽花2. 5kg粉碎，過20目篩，用少量75%乙醇拌樣并放置過夜，使其充 分潤漲，裝入滲漉桶中。用75%乙醇進(jìn)行滲漉，TLC檢視，直至薄層板上幾乎看不出斑點(diǎn)時(shí) 停止?jié)B漉。合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，得浸膏約700 g，密封保存?zhèn)溆?。?50g浸膏用適量蒸餾水溶解，依次用石油醚、乙酸乙醋、水飽和的正丁醇進(jìn)行 萃取，分別減壓回收溶劑得到石油醚層浸膏、乙酸乙酷層浸膏和正丁醇層浸膏。經(jīng)正、反相硅膠柱層析、葡聚糖等色譜手段綜合使用，得到龍膽苦苷、落干酸、異葒 草苷、6’-ο-β -D-glu-龍膽苦苷、異葒草苷-4’-o-glu、β -谷留醇、胡蘿卜苷、牡荊黃素、異 牡荊黃素、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷共Ii個(gè)化合物，并經(jīng)uv、頂、1HNMI^13CNMR鑒定結(jié)構(gòu)，HPLC 檢測，面積歸一化法計(jì)算純度均大于99%?；衔锏暮繙y定
采用高效液相色譜法進(jìn)行測定。色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)
色譜柱=Diamosil C18 (250 mmX4. 6 mm，5 μ m)柱；流動(dòng)相乙腈-0. 1%醋酸水溶液 (10 90)梯度洗脫；流速0. 2 mL · miiT1 ；檢測波長254nm ；柱溫35 V ；進(jìn)樣量20 μ 。在 此條件下，樣品的色譜圖見圖1。理論塔板數(shù)按龍膽苦苷峰計(jì)算不低于3000，落干酸峰計(jì)算 不低于；3500。供試品溶液的制備
取大葉秦艽花樣品粉末約0.4 g，精密稱定，置具塞三角瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱 定重量，超聲處理(500W，40kHz)0. 5 h，放置至室溫，加甲醇至原重量，搖勻，放置。精密吸取 上清液10 mL，蒸干，用適量10%甲醇溶解，置5 mL量瓶中，以10%甲醇稀釋至刻度，搖勻，用 0. 45 Mm濾膜濾過，即得。測定法
取供試品溶液20μ1，注入高效液相色譜儀，測定。大葉秦艽花提取物中落干酸質(zhì)量百分含量1. 30 2. 28%,6' -ο-β-D-glu-龍膽苦苷0. 82 1. 45%，獐牙菜苦苷0. 84 1. 49%，龍膽苦苷3. 53 6. 29%,獐牙菜苷1. 10 1. 97%，異葒草苷-4，-o-glu 0. 49 0. 86%,異葒草苷1. 24 2. 20%,牡荊黃素0. 40 0. 71%。顯然，與大葉秦艽根中相應(yīng)成分含量明顯有區(qū)別。2010版《中國藥典》規(guī)定干燥品含落干酸(C16H24Oltl)不得少于0. 2%，含落干酸 (C16H24O10)和龍膽苦苷(C16H2tlO9)之和不得少于2. m。本發(fā)明提取物符合要求。二、在藥物中的應(yīng)用
對大葉秦艽花提取物在藥物中的應(yīng)用，本發(fā)明主要針對其在抗炎鎮(zhèn)痛和治療便秘兩方 面的治療效果，申請人于陜西省生物醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)，使用上述方法制得的 浸膏作為以下藥理實(shí)驗(yàn)使用，各種實(shí)驗(yàn)情況如下 (一)抗炎鎮(zhèn)痛
探討大葉秦艽花提取物抗炎鎮(zhèn)痛的效果，為臨床用藥及新藥開發(fā)提供客觀依據(jù)。實(shí)驗(yàn)藥物及試劑
大葉秦艽花浸膏，提取方法見本發(fā)明制備方法；阿司匹林(aspirin)，陜西白鹿原制藥 有限公司，生產(chǎn)批號070808。二甲苯，天津市大茂化學(xué)儀器供應(yīng)站提供；角叉菜膠，和光純 藥工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn)；冰醋酸，天津市科貿(mào)歐化學(xué)儀器供應(yīng)站提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
健康ICR品系小白鼠，雌性112只，體質(zhì)量If 22g，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 中心。合格證號醫(yī)動(dòng)字第08-004。健康SD品系雄性大白鼠80只，體質(zhì)量20(T220g，購自 西交大醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。合格證號醫(yī)動(dòng)字第08-005。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)條件一致。實(shí)驗(yàn)條件
室溫2(T25°C，相對濕度為389Γ41%，人工照明，明暗各12h，供固體飼料和自來水，自由 攝食飲水，良好通風(fēng)。每日打掃室內(nèi)衛(wèi)生2次，保持室內(nèi)沒有明顯的氨臭味。實(shí)驗(yàn)儀器
灌胃針頭、注射器、分析天平(BS223S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、30ul的移液 器、YLS-Q4耳腫打耳器(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)設(shè)備站生產(chǎn))3LS-7B足趾容積測量儀(山東省醫(yī)學(xué) 科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn))、YLS-6B智能熱板儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn))、YLS-12A鼠尾光 照測痛儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)備站生產(chǎn))。實(shí)驗(yàn)方法 1.抗炎實(shí)驗(yàn)
1.1對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響
取雌性小鼠75只，隨機(jī)分成5組，每組15只。每天一次，每次每只老鼠給藥0. 6mL，連 續(xù)給藥7d。分別灌胃給予下列藥物。空白對照組(NC):蒸餾水0. 6mL/只；陽性對照組阿司 匹林；給藥組大葉秦艽大劑量3. 3660g/kg ；大葉秦艽中劑量1. 6830g/kg ；大葉秦艽小劑 量0. 8415g/kg。末次給藥40min后于右耳郭正、反兩面均勻涂抹二甲苯20ul/只，15min后 拉頸處死，沿耳郭基線剪下兩耳，分別稱質(zhì)量。以兩耳片質(zhì)量之差為腫脹度，并求出抑制率。 抑制率=[(對照組腫脹度平均值-給藥組腫脹度平均值)/對照組腫脹度平均值]xioo%。1.2對大鼠角叉菜膠足趾腫脹的影響
取雄性大鼠50只，隨機(jī)分成5組，每組10只。每天1次，每次每只老鼠給藥2. 2mL，連 續(xù)7d，分別灌胃給予下列藥物?？瞻讓φ战M蒸餾水2. 2mL/只；陽性對照組阿司匹林；給藥組大葉秦艽大劑量2. 8g/lkg ；大葉秦艽中劑量1. 4g/lkg ；大葉秦艽小劑量0. 70g/lkg。 末次給藥后，先用YLS-7B足趾容積測量儀測定其右足體積，作為給藥前體積Vtl，立即在右足 掌皮下注射0. lmLl%角叉菜膠。在給藥后1、2、3、4、5、他分別測定其右足體積Vs，并計(jì)算 腫脹率。腫脹率=[(Vs-Vtl)/VJ X100%。鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)
2.1小鼠熱板法痛閾時(shí)間的測定
選取(55 土 0.5) °C熱板上篩選合格雌性小白鼠(5s〈舔后足時(shí)間<30s=96只，按痛閾 值隨機(jī)分成5組，每組12只。每天一次，連續(xù)給藥7d。分別灌胃給予的藥物和藥物的各組 劑量同1. 1。末次給藥45min、90min、120min后分別測定小鼠舔后足的時(shí)間(大于60s以60s 計(jì)，并且小鼠每跳4次，時(shí)間減掉Is)。2.2醋酸扭體法小鼠扭體次數(shù)的測定
選取雌性小鼠75只，隨機(jī)分成5組，每組15只。每天一次，連續(xù)給藥7d。分別灌胃給 予的藥物和藥物的各組劑量同1. 1。末次給藥后45min腹腔注射0. 7%冰醋酸0. lml/10g, 記錄注射后20min內(nèi)的扭體次數(shù)。2. 3光照甩尾法測定小鼠甩尾潛伏期
選取雌性小鼠75只，隨機(jī)分成5組，每組15只。每天一次，連續(xù)給藥7d。分別灌胃給 予的藥物和藥物的各組劑量同1. 1。于末次給藥45min后測定小鼠甩尾時(shí)間(2s〈甩尾時(shí)間 <16s為合格數(shù)據(jù))。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
所有資料數(shù)據(jù)先進(jìn)行組間Lev-ene’ s方差齊性檢驗(yàn)，然后采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn) 行均值顯著性統(tǒng)計(jì)，其結(jié)果以χ士s表示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.抗炎實(shí)驗(yàn)
1. 1對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響
大葉秦艽花大、中劑量組、陽性對照阿司匹林組與空白對照組相比，均能顯著地減少二 甲苯所致耳腫脹度，與對照組(174. 6%)相比腫脹度抑制率分別為97. 8%,90. 4%,59. 77%。1. 2大葉秦艽對大鼠角叉菜膠足趾腫脹的影響
結(jié)果見表1，與對照組比，大葉秦艽大劑量在給藥池和4h后能明顯減少足趾腫脹率，中 劑量和小劑量在給藥4h和證后能明顯減少足趾腫脹率。表明藥物隨劑量增大，其藥效持 續(xù)時(shí)間延長。陽性對照司匹林組在給藥Ih后非常顯著地減少足趾腫脹率。
權(quán)利要求
1.大葉秦艽花提取物，其特征在于萜類和黃酮類化合物含量占50%以上；大葉秦艽花提取物通過以下方法得到大葉秦艽花經(jīng)粉碎，過20目篩，室溫下用乙 醇-水溶液滲漉，滲漉液減壓濃縮至無醇味后蒸干即得大葉秦艽花提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大葉秦艽花提取物，其特征在于大葉秦艽花提取物中落 干酸質(zhì)量百分含量1.30 2. 28%,6' -ο-β-D-glu-龍膽苦苷0. 82 1.45%，獐牙菜苦 苷0. 84 1. 49%，龍膽苦苷3. 53 6. 29%,獐牙菜苷1. 10 1. 97%，異葒草苷_4，-o-glu 0. 49 0. 86%,異葒草苷1. 24 2. 20%,牡荊黃素0. 40 0. 71%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大葉秦艽花提取物，其特征在于乙醇-水溶液中乙醇體積 比為75%。
4.權(quán)利要求1所述的大葉秦艽花提取物的提取方法，其特征在于大葉秦艽花經(jīng)粉碎， 過20目篩，室溫下用乙醇-水溶液滲漉，滲漉液減壓濃縮至無醇味后蒸干即得大葉秦艽花 提取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的大葉秦艽花提取物的提取方法，其特征在于乙醇-水溶液 中乙醇體積比為75%。
6.權(quán)利1所述的大葉秦艽花提取物在制備治療抗炎鎮(zhèn)痛藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利1所述的大葉秦艽花提取物在制備治療潤腸通便藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了大葉秦艽花提取物及其提取方法和在藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明大葉秦艽花提取物，萜類和黃酮類化合物含量占50%以上，提取方法為大葉秦艽花經(jīng)粉碎，過20目篩，室溫下用乙醇-水溶液滲漉，滲漉液減壓濃縮至無醇味后于80℃水浴中蒸干即得大葉秦艽花提取物。本發(fā)明利用秦艽新的藥用部位—大葉秦艽花，有利于保護(hù)為數(shù)不多的秦艽野生資源；大葉秦艽花提取物提取方法簡單，提取物可用于制備治療抗炎鎮(zhèn)痛和潤腸通便藥物。
文檔編號A61P1/10GK102125602SQ201110046179
公開日2011年7月20日 申請日期2011年2月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月25日
發(fā)明者孫文基, 謝人明, 賈娜 申請人:西北大學(xué)