專利名稱：甘草次酸的制備及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及甘草次酸的制備和用途。
背景技術(shù)：
甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch),屬豆科植物，生長(zhǎng)于溫帶及亞熱帶地區(qū)，主產(chǎn)于我國(guó)西部，作為常用中草藥首載于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》。中醫(yī)理論認(rèn)為甘草性平、味甘，具有和中緩急、潤(rùn)肺、解毒、止咳、通經(jīng)脈、利氣血等功效，甘草的主要成分為甘草酸和甘草次酸(GA)，甘草次酸又名甘草亭酸，收載于國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中，為白色結(jié)晶性粉末(C3tlH46O6)，熔點(diǎn)288-297°C，不溶于水。甘草次酸能夠抑制巴豆油誘發(fā)的小鼠耳腫脹和鳥氨酸脫羧酶(ODC)的活性，同時(shí)降低強(qiáng)致癌劑苯并芘引起的非程序DNA合成，對(duì)由苯并芘所誘發(fā)的DNA損傷有一定的保護(hù)作用。免疫系統(tǒng)的基本功能是識(shí)別外源抗原并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列反應(yīng)清除外源致病性物質(zhì)，以保持機(jī)體的穩(wěn)定。機(jī)體對(duì)病毒和細(xì)菌的初次免疫應(yīng)答一般認(rèn)為是非特異性的，然而TLR的發(fā)現(xiàn)徹底改變了這ー看法。美國(guó)免疫學(xué)家Janeway等將天然免疫細(xì)胞所識(shí)別的主要革E分子稱之為病原相關(guān)的分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，PAMPs是眾多微生物共有的ー種保守的模式分子，廣泛存在于病原體細(xì)胞表面，如內(nèi)毒素、膚聚糖、鞭毛蛋白、雙鏈RNA以及酵母細(xì)胞壁上的甘露糖等，識(shí)別PAMPs的受體稱為模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptors, PRRs)。Toll樣受體(Toll-like recptors, TLRs)是一類重要的模式識(shí)別受體(PRRs),Toll樣受體廣泛存在于昆蟲、脊椎動(dòng)物和植物中，通過識(shí)別病原微生物特定的病原相關(guān)分子模(PAMPs)，啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，構(gòu)成機(jī)體抵抗病原微生物入侵的第一道防線。至今，共發(fā)現(xiàn)了 11種人TLRs和13種小鼠TLRs，它們分別選擇性識(shí)別各種不同的PAMPs，井介導(dǎo)激活核因子 kappa B (nuclear factor-kappa B, NF- k B)和 MARKS 等信號(hào)通路。Toll 樣受體特異性結(jié)合自身配體后，通過MyD88(髓樣分化因子)依賴性或非依賴性途徑(TRIF)激活下游一系列蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)相應(yīng)的白細(xì)胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)以及干擾素(IFN)等因子的合成與釋放，啟動(dòng)機(jī)體抗感染免疫反應(yīng)。因此，TLRs不僅構(gòu)成機(jī)體抗感染免疫的“第一道防線”，在啟動(dòng)早期天然免疫應(yīng)答中起重要作用，更成為聯(lián)系天然免疫和獲得性免疫的“橋梁”，對(duì)獲得性免疫的發(fā)生和發(fā)生類型具有重要的調(diào)控作用。如上所述，Toll樣受體在機(jī)體抗感染防御反應(yīng)中的地位至關(guān)重要，而現(xiàn)有的研究表明，許多中藥可通過多種途徑或環(huán)節(jié)提高機(jī)體抗感染免疫力。由此推測(cè)中藥提高機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)病原體的識(shí)別和殺傷能力，以及誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)更有效的免疫防御反應(yīng)，與Toll樣受體及其相關(guān)的信號(hào)分子密切相關(guān)，二者之間必然存在著天然的聯(lián)系。研究抗感染中藥對(duì)Toll樣受體活性及其下游信號(hào) 分子的影響，評(píng)價(jià)Toll樣受體作為篩選抗感染中藥的靶標(biāo)分子的應(yīng)用價(jià)值，并建立以Toll樣受體為靶標(biāo)的篩選抗感染中藥的細(xì)胞模型
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種甘草次酸的制備和用途。本發(fā)明所提供的技術(shù)解決方案是ー種甘草次酸的制備，該方法是先進(jìn)行粗純化，再進(jìn)ー步制備和純化，得到高純度產(chǎn)品，首先用ADS-10大孔吸附樹脂吸附除去雜質(zhì)組分來純化粗甘草酸，將甘草粗提物用こ醇熱溶解，加氨水調(diào)PH8-9，濃縮回收こ醇后，加水溶解剰余物，將此溶液用ADS-10大孔吸附樹脂柱吸附溶液中的雜質(zhì)組分，而溶于水的甘草酸銨鹽不被樹脂吸附，將吸附流出液用鹽酸調(diào)pHl-2，加熱水解，溶液冷卻后，析出的固體物過濾后得到粗甘草次酸，其次，是甘草次酸的制備和純化，將粗甘草次酸用有機(jī)溶劑溶解，濾出不溶性雜質(zhì)，用堿水將甘草次酸堿化為甘草次酸鈉鹽，使之與非水溶性的雜質(zhì)分離；然后用酸酸化使其成為溶于有機(jī)溶劑的甘草次酸，再與水溶性雜質(zhì)分離，通過這樣的兩次分離，再經(jīng)兩次重結(jié)晶后即可獲得高純度產(chǎn)品；甘草次酸的用途，甘草次酸可用于制備具有抗病毒、細(xì)菌、增強(qiáng)免疫活性的抗感染藥物。本發(fā)明的有益效果提供了制備簡(jiǎn)單、方便，水溶性好，吸收好的甘草次酸制備方法，并提供了甘草次酸在制備具有抗病毒、細(xì)菌、增強(qiáng)免疫活性的抗感染藥物上的應(yīng)用。
實(shí)施例這種甘草次酸的制備是先進(jìn)行粗純化，再進(jìn)ー步制備和純化，得到高純度產(chǎn)品。首先用ADS-10大孔吸附樹脂吸附除去雜質(zhì)組分來純化粗甘草酸，將甘草粗提物用こ醇熱溶解，加氨水調(diào)PH8-9，濃縮回收こ醇后，加水溶解剰余物，將此溶液用ADS-10大孔吸附樹脂柱吸附溶液中的雜質(zhì)組分，而溶于水的甘草酸銨鹽不被樹脂吸附，將吸附流出液用鹽酸調(diào)pHl-2，加熱水解，溶液冷卻后，析出的固體物過濾后得到粗甘草次酸，其次，是甘草次酸的制備和純化，將粗甘草次酸用有機(jī)溶劑溶解，濾出不溶性雜質(zhì)，用堿水將甘草次酸堿化為甘草次酸鈉鹽，使之與非水溶性的雜質(zhì)分離；然后用酸酸化使其成為溶于有機(jī)溶劑的甘草次酸，再與水溶性雜質(zhì)分離，通過這樣的兩次分離，再經(jīng)兩次重結(jié)晶后即可獲得高純度產(chǎn)品。驗(yàn)證甘草次酸可用于制備具有抗病毒、細(xì)菌、增強(qiáng)免疫活性的抗感染藥物。(I)將甘草次酸用DMSO溶解，其儲(chǔ)存液終濃度為20mg/ml。(2)試驗(yàn)用細(xì)胞的準(zhǔn)備將試驗(yàn)用Ana-I小老鼠巨噬細(xì)胞株，RAW264. 7小老鼠巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞株，293T人胚腎細(xì)胞株(均來自中科院上海細(xì)胞生物研究所細(xì)胞庫)分別用含10% FBS的1640和DMEM培養(yǎng)基(100U/ml青霉素、鏈霉素)，37°C，5 % CO2，培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2-3天細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)傳代培養(yǎng)。(3)Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)及其下游信號(hào)分子基因的調(diào)取選擇Toll樣受體(TLR2、3、4、7、9)共計(jì)5個(gè)Toll樣受體分子和Toll樣受體的下游分子MyD88和TRIF以及IL-6、TNF-a和INF-0作為待檢分子，井分別對(duì)其部分基因序列進(jìn)行了引物的設(shè)計(jì)、合成與鑒定，為Real-Time PCR做準(zhǔn)備。(4)MTT藥物毒性試驗(yàn)Ana-l細(xì)胞鋪95孔板，IO4個(gè)細(xì)胞/孔(200ul)，試驗(yàn)設(shè)中藥感染組，DMSO陰性對(duì)照組,調(diào)零組,姆組設(shè)6個(gè)感染劑量梯度(即80ug/ml,60ug/ml,40ug/ml，20ug/ml，10ug/ml，5ug/ml)，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)，待藥物感染細(xì)胞24小時(shí)后，每孔加入5mg/ml的MTT20ul，于37°C反應(yīng)4小時(shí)后，每孔加入150ul的DMSO溶解活細(xì)胞與MTT反應(yīng)后產(chǎn)生的紫色結(jié)晶，于振蕩10分鐘待結(jié)晶完全溶解后選擇570nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔光吸收值，得出藥物濃度對(duì)細(xì)胞的抑制率，確定中藥感染細(xì)胞的最佳劑量。 (5)Real-Time PCR檢測(cè)中藥對(duì)Toll樣受體分子在mRNA水平上的影響初篩中藥，通過Real-Time PCR檢測(cè)中藥對(duì)Toll樣受體分子在mRNA水平上的影響、Real-Time PCR檢測(cè)中藥對(duì)Toll樣受體分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影響、Real-Time PCR檢測(cè)中藥對(duì)IL-6、TNF_a和INF-P等細(xì)胞因子的影響、Western Blot檢測(cè)Toll樣受體蛋白的表達(dá)，篩選出經(jīng)該中藥刺激后具有高表達(dá)的中藥品種。(6)利用雙熒光素酶報(bào)告基 因系統(tǒng)測(cè)定中藥刺激Toll樣受體后對(duì)其下游NF-KB和INF =Real-Time PCR檢測(cè)中藥對(duì)Toll樣受體分子下游分子MyD88和TRIF在mRNA水平上的影響；Real-Time PCR檢測(cè)中藥對(duì)IL_6、TNF-a和INF- ^等細(xì)胞因子的影響；WesternBlot檢測(cè)Toll樣受體蛋白的表達(dá)。(7)報(bào)告基因轉(zhuǎn)錄活性檢測(cè)，驗(yàn)證mTLR9介導(dǎo)的信號(hào)通路對(duì)下游轉(zhuǎn)錄因子NF- k B轉(zhuǎn)錄活性的影響。經(jīng)以上操作結(jié)果顯示，甘草次酸能夠明顯提高M(jìn)yD88和TRIF的mRNA的水平，顯著提高IL-6的mRNA的水平，表明甘草次酸可用于制備具有抗病毒、細(xì)菌、增強(qiáng)免疫活性的抗感染藥物。
權(quán)利要求
1.ー種甘草次酸的制備，其特征在于該方法是先進(jìn)行粗純化，再進(jìn)ー步制備和純化，得到高純度產(chǎn)品，首先用ADS-IO大孔吸附樹脂吸附除去雜質(zhì)組分來純化粗甘草酸，將甘草粗提物用こ醇熱溶解，加氨水調(diào)PH8-9，濃縮回收こ醇后，加水溶解剰余物，將此溶液用ADS-10大孔吸附樹脂柱吸附溶液中的雜質(zhì)組分，而溶于水的甘草酸銨鹽不被樹脂吸附，將吸附流出液用鹽酸調(diào)PH1-2，加熱水解，溶液冷卻后，析出的固體物過濾后得到粗甘草次酸，其次，是甘草次酸的制備和純化，將粗甘草次酸用有機(jī)溶劑溶解，濾出不溶性雜質(zhì)，用堿水將甘草次酸堿化為甘草次酸鈉鹽，使之與非水溶性的雜質(zhì)分離；然后用酸酸化使其成為溶于有機(jī)溶劑的甘草次酸，再與水溶性雜質(zhì)分離，通過這樣的兩次分離，再經(jīng)兩次重結(jié)晶后即可獲得聞純度廣品。
2.ー種甘草次酸的用途，其特征在于甘草次酸可用于制備具有抗病毒、細(xì)菌、增強(qiáng)免疫活性的抗感染藥物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及甘草次酸的制備和用途。本發(fā)明所提供的技術(shù)解決方案是一種甘草次酸的制備，該方法是先進(jìn)行粗純化，再進(jìn)一步制備和純化，得到高純度產(chǎn)品，甘草次酸可用于制備具有抗病毒、細(xì)菌、增強(qiáng)免疫活性的抗感染藥物。本發(fā)明的有益效果提供了制備簡(jiǎn)單、方便，水溶性好，吸收好的甘草次酸制備方法，并提供了甘草次酸在制備具有抗病毒、細(xì)菌、增強(qiáng)免疫活性的抗感染藥物上的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P37/04GK102653550SQ201110048039
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月1日
發(fā)明者史子學(xué), 彭麗娜, 徐永莉, 李力, 沈陽, 繆劍華, 袁經(jīng)權(quán), 谷穎樂, 邱亞峰, 邵東華, 馬志永 申請(qǐng)人:廣西壯族自治區(qū)藥用植物園