專利名稱：一種hvem基因在制備肝癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的產(chǎn)品中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種HVEM基因的應(yīng)用，具體地說(shuō)，是HVEM基因在制備肝癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是我國(guó)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，目前已居我國(guó)腫瘤致死率的第二位，并有逐步增高的趨勢(shì)，嚴(yán)重危害我國(guó)人民的健康。肝癌的治療目前仍是以手術(shù)為主的綜合治療，但中晚期患者常失去手術(shù)機(jī)會(huì)。肝癌的惡性程度高，發(fā)展迅速，容易復(fù)發(fā)，致使目前總體療效仍不理想，每年死亡人數(shù)與新增病例數(shù)幾乎相等。駕馭免疫系統(tǒng)來(lái)攻克肝癌的想法很早以前就有人提出，但是到目前為止都沒(méi)有取得預(yù)期效果。目前的研究認(rèn)為，腫瘤細(xì)胞能通過(guò)變異和進(jìn)化躲避機(jī)體的免疫監(jiān)視，甚至抑制腫瘤特異的免疫應(yīng)答，最終進(jìn)入免疫逃逸階段。在該階段，腫瘤通過(guò)癌細(xì)胞本身和腫瘤間質(zhì)，直接和間接地利用多種機(jī)制形成一個(gè)免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，如同一個(gè)完善的免疫屏障，使得機(jī)體的抗腫瘤免疫無(wú)功而返。T淋巴細(xì)胞在活化時(shí)需要來(lái)自抗原受體即T細(xì)胞受體第一信號(hào)和由一系列表達(dá)于細(xì)胞表面的共刺激分子傳遞的第二信號(hào)。這些共刺激能調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞活化的程度、性質(zhì)和持續(xù)時(shí)間。皰疫病毒侵入介體(herpes virus entry mediator, HVEM)是腫瘤壞死因子受體超家族中的一員，同時(shí)也是屬于共刺激分子。HVEM主要表達(dá)于初始T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞和單核細(xì)胞，也可表達(dá)于一些非免疫細(xì)胞如肝細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等。人們發(fā)現(xiàn)HVEM能同淋巴毒素a (LTa)和LT a同源分子配體一LIGHT相互作用。由于LIGHT同時(shí)具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和共刺激T細(xì)胞活化的功能，它有希望為腫瘤的治療帶來(lái)新的方法。有研究表明，位于基質(zhì)細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞株表面的HVEM與LIGHT結(jié)合后，導(dǎo)致腫瘤局部免疫效應(yīng)細(xì)胞顯著增加，產(chǎn)生強(qiáng)烈的抗腫瘤免疫，最終清除原發(fā)和轉(zhuǎn)移的腫瘤。近年來(lái)肝癌的免疫治療研究也在不斷進(jìn)行，如細(xì)胞因子、自體淋巴細(xì)胞活化回輸、基于樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫治療和甲胎蛋白來(lái)源的多肽疫苗等。但是，這些試驗(yàn)的結(jié)果都不太理想。對(duì)于療效欠佳的原因，除了免疫治療措施本身在質(zhì)和量上存在缺陷之外，腫瘤細(xì)胞利用各種免疫逃逸機(jī)制來(lái)擺脫機(jī)體免疫監(jiān)視也為原因之一?；诖?，要想成功實(shí)現(xiàn)腫瘤免疫治療，探索腫瘤的免疫逃逸機(jī)制是極其關(guān)鍵的。由于HVEM擔(dān)當(dāng)著T細(xì)胞活化的開(kāi)關(guān)分子作用，對(duì)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)起著共刺激信號(hào)，所以HVEM的異常表達(dá)，可能在T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫增強(qiáng)中具有重要作用。絕大多數(shù)對(duì)HVEM免疫調(diào)節(jié)的研究，針對(duì)的是表達(dá)于免疫細(xì)胞表面的 HVHM分子。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN :101896198A公開(kāi)了一種治療血液惡性腫瘤和自身免疫疾病的HVEM配體，該發(fā)明涉及治療血液惡性腫瘤，尤其是慢性淋巴細(xì)胞型白血病，以及治療自身免疫性疾病的HVEM配體。中國(guó)專利文獻(xiàn)CN 1891714A公開(kāi)了一種單純皰疹病毒進(jìn)入介體HVEM的新配體(p30)，p30可用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答并可用于抑制皰疹病毒感染，也提供應(yīng)用該發(fā)明P30治療淋巴細(xì)胞疾病患者或患有或懷疑患有皰疹病毒感染的患者的方法。但是關(guān)于HVEM在實(shí)體腫瘤中的研究及其臨床意義，以及HVEM在抗腫瘤中的作用機(jī)制目前還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種HVEM基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述的診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR或免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品。所述的用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增HVEM基因的引物。所述的用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增HVEM基因的引物。所述的用免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品包括與HVEM蛋白特異性結(jié)合的抗體。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種HVEM基因在制備預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個(gè)的目的是，提供一種HVEM基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于
首次發(fā)現(xiàn)了 HVEM在實(shí)體瘤組織的異常表達(dá)，本發(fā)明的HVEM基因，可作為診斷肝癌和預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)更加準(zhǔn)確、快速，且為防治肝癌提供了新的治療靶點(diǎn)和有效新藥。


附圖I 是 Real-time PCR 結(jié)果圖。附圖2是實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果圖。附圖3 是 Western-blot 結(jié)果圖。附圖4是HVEM在肝癌組織顯著低表達(dá)。附圖5是HVEM在癌旁肝組織顯著高表達(dá)。附圖6是肝癌組織中HVEM表達(dá)較低者與較高者的無(wú)瘤生存率和總體生存率比較。附圖7是各細(xì)胞株HVEM的表達(dá)情況。附圖8是合成用于轉(zhuǎn)染HVEM的質(zhì)粒。附圖9是成功轉(zhuǎn)染SMMC-7721。附圖10是上調(diào)HVEM后的SMMC-7721增殖減低。附圖11是劃痕實(shí)驗(yàn)示轉(zhuǎn)HVEM組的肝癌細(xì)胞遷移能力明顯下降。附圖12是Transwell分析細(xì)胞侵襲能力。附圖13是上調(diào)HVEM后的SMMC-7721成瘤的HE染色。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式
作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例I HVEM在肝癌和癌旁的表達(dá)情況I.材料與方法 1.1實(shí)驗(yàn)材料 I. I. I組織標(biāo)本
免疫組織化學(xué)用組織來(lái)源103例肝癌(HCC)及相對(duì)應(yīng)的癌旁組織石蠟切片來(lái)自東方肝膽外科醫(yī)院病理科2004年I月-2004年6月行肝癌根治性切除術(shù)標(biāo)本。Realtime-PCR、Western_blot 用組織來(lái)源2009 年 I 月-2009 年 6 月東方肝膽外科醫(yī)院行肝癌根治性切除術(shù)的新鮮組織標(biāo)本。1.1.2主要試劑 ⑴免疫組織化學(xué)用試劑
一抗(所用濃度I :200)，HVEM (N-19，SC-7766)，Stanta公司；抗體稀釋液(長(zhǎng)島公司)；二抗(所用濃度I :200), HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG, ICL公司；用0. OlM PH7. 4 PBS稀釋；BSA(鼎國(guó)生物)；1%BSA (0. OlM PBSPH7.4 IOml+ BSA IOOmg)；
抗原修復(fù)液
原液 A 液(0. 1M) 21. 01 克 C6H807.H20 (枸櫞酸)+ 1000ML 雙蒸水B 液(0. 1M) 29. 14 克 C6H5Na307. 2H20(枸櫞酸鈉)+IOOOml 雙蒸水配液0. OlM枸櫞酸緩沖液PH =6. 0+0. I 6. 0-0. I，A液9ml，B液41ml450 ml雙蒸水，共500ml ；DAB顯色試劑盒DAK0公司，按說(shuō)明書(shū)操作；另外過(guò)程中浸洗所用PBS均為0. OlM PH7. 4溶液。(2) Realtime-PCR 試劑
5X RT緩沖液，2. 5 mM dNTP混合液，引物見(jiàn)表I。表I HVEM 和 act in mRNA RT-PCR 檢測(cè)引物
權(quán)利要求
1.一種HVEM基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的診斷肝癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR或免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的用RT-PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增HVEM基因的引物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的用實(shí)時(shí)定量PCR診斷肝癌的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增HVEM基因的引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的用免疫檢測(cè)診斷肝癌的產(chǎn)品包括與HVEM蛋白特異性結(jié)合的抗體。
6.一種HVEM基因在制備預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.—種HVEM基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HVEM基因在制備診斷肝癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供一種HVEM基因在制備預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的產(chǎn)品中的應(yīng)用和一種HVEM基因在制備治療肝癌的藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于首次發(fā)現(xiàn)了HVEM在實(shí)體瘤組織的異常表達(dá)，本發(fā)明的HVEM基因，可作為診斷肝癌和預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的特異標(biāo)志基因，使肝癌診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)更加準(zhǔn)確、快速，且為防治肝癌提供了新的治療靶點(diǎn)和有效新藥。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102653783SQ201110049470
公開(kāi)日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月2日
發(fā)明者夏勇, 李俊, 沈鋒 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院