專利名稱：六味地黃湯總提取物組合物、制備方法及在制備應激反應心、腦、睪丸并發(fā)癥藥物中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥組合物，具體涉及一種六味地黃湯總提取物組合物、這種六味地黃湯總提取物組合物制備方法，以及這種六味地黃湯總提取物組合物在制備治療應激性反應的心臟、腦、睪丸等并發(fā)癥的藥物中的應用。
背景技術(shù)：
六味地黃湯源于宋代醫(yī)學家錢乙的《小兒藥證直訣》，該方是由熟地黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓共六味中藥組成，是中醫(yī)“滋補腎陰”的基礎(chǔ)方劑。其配方具有三補三瀉的特點六味地黃湯重用熟地滋陰補腎，填精益髓，為君藥。山茱萸補養(yǎng)肝腎，并能澀精，取肝腎同源之意，山藥補益脾陰，亦能固腎，共為臣藥。三藥配合，腎肝脾三陰并補，是為三補，但熟地黃用量是山茱萸和山藥之和，故仍以補腎為主。澤瀉利濕而泄腎濁，并能減熟地黃之滋膩，茯苓淡滲脾濕，并助山藥之健運，與澤瀉共瀉腎濁，助真陰得復其位，牡丹皮清泄虛熱，并制山茱萸之溫澀。三藥稱為三瀉，均為佐藥。六味合用，三補三瀉，其中補藥用量重于瀉藥，是以補為主，肝脾腎三陰并補，以補腎陰為主。該方被譽為補腎方藥之祖，主要用于腎陰虛引起的腰膝酸軟、頭暈耳鳴、手腳心發(fā)熱、遺精盜汗等癥狀。經(jīng)過現(xiàn)代藥理學研究表明，六味地黃湯具有改善腎功能、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗腫瘤、抗疲勞、抗低溫、耐缺氧、降血脂、降血壓、降血糖和促進新陳代謝等作用。六味地黃制劑在中醫(yī)臨床中廣泛應用，并獲得了良好的治療效果。但是目前該方在實際應用中存在明顯不足，就是用藥劑量大，用藥不方便，因此，改進其制備工藝就有其重要意義。據(jù)文獻報道，六味地黃制劑中的脂溶性成分對糖尿病模型具有良好的降血糖作用參考文獻韓璟超，季暉，薛城鋒，等.山茱萸總萜的降血糖作用.中國天然藥物，2006，4
(2): 125-129。專利申請?zhí)枴?00410058600. X”的專利中六味地黃制劑的制備方法考慮了六味地黃湯中多糖類和糖苷類有效成分，但在制備過程中忽略了六味地黃制劑中的脂溶性有效部位。專利申請?zhí)枴?00410062502. 3”的專利中六味地黃制劑的制備方法考慮到了多糖類成分和脂溶性成分，但該法僅是六味地黃處方中部分藥采用了醇提取，并不是整體提取，丟失了部分脂溶性有效成分。文獻報道，茯苓的活性多糖的分子量為3. 8X IO4左右參考文獻陳春霞.羧甲基茯苓多糖的化學研究.中國食用菌，1994，(05): 35，山藥多糖分子量為4. 22 X IO4左右參考文獻熊平，蔣靈芝，余俊龍，等.山藥多糖研究評述.中醫(yī)藥學刊，2003，(11):53，山茱萸多糖的分子量為2. 47X IO4左右參考文獻楊云，劉翠平，王浴銘，等.山茱萸多糖的化學研究.中國中藥雜志，1999，24 (10):615],丹皮降血糖的活性多糖的分子量為1.3X104左右參考文獻陳彥，沈業(yè)壽，趙幟平，等.丹皮多糖PSM2b的純化及其理化性質(zhì)研究.激光生物學報，2004，13 (3):237-241，可見六味地黃活性多糖部位的分子量多集中在I萬 5萬之間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種六味地黃湯總提取物組合物、這種六味地黃湯總提取物組合物的制備方法，以及這種六味地黃湯總提取物組合物在制備治療應激性反應的心臟、腦、睪丸等并發(fā)癥的藥物中的應用。本發(fā)明將克服現(xiàn)有技術(shù)忽略六味地黃湯總提取物脂溶性有效成分的不足，通過提取工藝，得到六味地黃湯總提取物的更完備的組分構(gòu)成，并使得采用這種組合物治療應激性反應的心臟、腦、睪丸等并發(fā)癥成為可能。本發(fā)明基于六味地黃湯的治療新適應癥和新靶點應激狀態(tài)是一種復雜的病理生理狀態(tài)。其中，NADPH氧化酶的激活是最重要來源。六味地黃湯的“三補三泄”的藥理作用，可能源于抑制NADPH氧化酶的激活，從而，可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子，減輕無疊合蛋白質(zhì)反應(Unfolded protein response, UPR)六味地黃湯治療應激性反應的心臟、腦、睪丸等并發(fā)癥，由于抑制NADPH氧化酶。完成上述發(fā)明任務的方案是，一種六味地黃湯總提取物組合物，原料藥由熟地 黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照10. 4 7. 6 :5. 2 2. 8 :5. 2 2. 8 :3. 9 2. I
3.9^2. I :3. 9^2. I的重量比組成，其特征在于，所述的組合物中包括有六味地黃湯總提取物揮發(fā)油3 -環(huán)糊精包合物組分，六味地黃湯總提取物多糖組分，味地黃湯總提取物糖苷類組分，以及六味地黃湯總提取物脂溶性組分。上述原料藥的優(yōu)化比例是熟地黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比組成。上述原料藥中，所述的地黃、山茱萸及山藥可以分別選擇生品；也可分別選擇制品(炮制品)。(I)水煎液的制備
將由熟地黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3處方投料，水煎煮2次，同時回收揮發(fā)油，合并水煎液，水煎液濃縮至清膏，清膏的相對密度1. 10 I. 25(50°C)，藥渣備用；
(2)揮發(fā)油P -環(huán)糊精包合物組分的制備
采用3 -環(huán)糊精飽和水溶液法包合六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油，將六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油緩緩滴入￠-環(huán)糊精飽和水溶液中并不斷攪拌，冷藏(4°C)靜置48小時后抽濾，40°C干燥，即得揮發(fā)油￠-環(huán)糊精包合物組分。(3)水煎液的乙醇沉淀
將步驟(I)中的清膏中加入乙醇并不斷攪拌至乙醇濃度為70%，冷藏(4°C)靜置48小時，分離得到上清液和沉淀；
(4)多糖組分的制備
將步驟(3)中的沉淀與水配成混懸液，離心，除去不溶物，采用截留分子量為5萬的超濾膜過濾，棄去膜上液，除去相對分子量大于5萬的大分子物質(zhì)，膜下液再用截留分子量值為I萬的超濾膜過濾，除去相對分析量低于I萬的小分子物質(zhì)，收集膜上液，濃縮得到相對分子量I萬 5萬分子量的物質(zhì)，噴霧干燥得到多糖組分；
(5)糖苷類組分的制備
將步驟(3)中的上清液經(jīng)大孔樹脂柱層析，依次以水、20%、40%、65%乙醇的梯度洗脫，分別收集流分，合并40%和65%乙醇部分濃縮至無醇味，噴霧干燥得到糖苷類組分；
(6)脂溶性組分的制備
將步驟(I)中的藥渣干燥后，加入乙醇回流提取2次，每次I小時，濾過，合并濾液，濾液回收乙醇，濃縮至無醇味后，噴霧干燥得到脂溶性組分；
(7)六味地黃湯總提取物的制備
將步驟(4)中 多糖組分、步驟(5)中糖苷類組分、步驟(6)中脂溶性組分及步驟(2)中的揮發(fā)油β -環(huán)糊精包合物組分混合，即得六味地黃湯總提取物組合物。以上組合物的進一步限定，具有以下特征
(1).六味地黃湯總提取物組合物的紅外圖譜的特征峰IRH^r (cm^1) :3396,2926,2855、1711、1615、1516、1453、1376、1203、1163、1078、1030、765、714、573 ;或者，
六味地黃湯總提取物組合物的二階導數(shù)(Second Derivative,簡稱SD,下同)紅外光譜的特征峰SD-IR (600 1800cm-1) : 1740、1710、1687、1606、1515、1467、1377、1316、1276、1204、1154、1077、1027、794、768、742、715 ；
(2).六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的紅外光譜的特征峰IRv=(cm1) :3400、2930、1718、1618、1417、1372、1238、1152、1079、1024、868、766、604、575、527 ;或者，
六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的二階導數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR(600 1800CHT1) :1731、1609、1561、1522、1506、1471、、1372、1230、1205、1153、1125、1106、1079、1056、1023、995、963、913、866、835、819、799、759、704、658、643、616、604 ；
(3).六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的紅外圖譜的特征峰=IRHSr(cm-1)3398、2934、1709、1610、1533、1516、1450、1383、1278、1205、1073、1038、837、765、715、627 ；
或者，
六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的二階導數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR(600 1800cm-1) : 1747、1715、1653、1631、1603、1534、1515、1490、1468、1451、1418、1396、1384、1349、1316、1280、1202、I176、II19、1098、1072、1038、1005、940、918、897、872、853、821、767、741、715；
(4).六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的紅外圖譜的特征峰=IRv3^r(cm-1) 339U2928、1729、1668、1408、1385、1349、1226、1146、1075、920、868、817、777、629、590、422 ；或者，
六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的二階導數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR(600 lSOOcnT1) :1736、1667、1609、1560、1523、1498、1457、1419、1384、1341、1315、1195、1150、1105、1079、1054、1026、977、962、917、891、865、817、799、779、700、673、661、631。以上所述的本組合物的圖譜特征，是指同類組合物的圖譜，其相似度不小于O. 85。換言之，以上組合物的圖譜特征是
(I).六味地黃湯總提取物組合物的紅外指紋圖譜符合A，圖8六味地黃湯提取物組合物的紅外光譜圖，其相似度不小于O. 85 ;或B，圖9六味地黃湯提取物組合物的二階導數(shù)紅外光譜 (2).六味地黃湯提取物的多糖組分的紅外圖譜符合:A，圖2六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的紅外光譜圖；或8，圖3六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的二階導數(shù)紅外光譜 (3).六味地黃湯提取物中糖苷類組分的紅外圖譜符合:A，圖4六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的紅外光譜圖；或8，圖5六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的二階導數(shù)紅外光譜 (4).六味地黃湯提取物脂溶性組分的紅外圖譜符合:A，圖6六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的紅外光譜圖；或8，圖7六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的二階導數(shù)紅外光譜圖。

本發(fā)明通過對傳統(tǒng)的六味地黃湯進行科學的處理，在中醫(yī)整體觀理論的指導下，保持原六味地黃湯各藥藥效的基礎(chǔ)上，增加了六味地黃中脂溶性的有效部位。如前文“背景技術(shù)”所述茯苓活性多糖的分子量為3. 8 X IO4左右，山茱萸多糖的分子量為2. 47 X IO4左右，牡丹皮降血糖的活性多糖的分子量為I. 3X IO4左右，可見六味地黃活性多糖部位的分子量多集中在I萬 5萬之間；因此本方法采用超濾法提取精制了六味地黃I萬 5萬分子量的活性多糖類部位。本方法采用大孔樹脂柱層析法提取精制了六味地黃中的糖苷類活性成分，大大降低了六味地黃湯的使用體積。完成本申請第2個發(fā)明任務的方案是上述六味地黃湯總提取物組合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)水如液的制備
將由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3處方投料，水煎煮，同時回收揮發(fā)油，合并水煎液，水煎液濃縮至清膏，藥渣備用；
(2)揮發(fā)油P-環(huán)糊精包合物組分的制備
采用3 -環(huán)糊精飽和水溶液法包合六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油，將六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油緩緩滴入3 -環(huán)糊精飽和水溶液中并不斷攪拌，冷藏靜置后抽濾，干燥，即得揮發(fā)油￠-環(huán)糊精包合物組分。(3)水煎液的乙醇沉淀
將步驟(I)中的清膏中加入乙醇并不斷攪拌至乙醇重量比濃度為70%，冷藏靜置，分離得到上清液和沉淀；
(4)多糖組分的制備
將步驟(3)中的沉淀與水配成混懸液，離心，除去不溶物，采用截留分子量為5萬的超濾膜過濾，棄去膜上液，除去相對分子量大于5萬的大分子物質(zhì)，膜下液再用截留分子量值為I萬的超濾膜過濾，除去相對分析量低于I萬的小分子物質(zhì)，收集膜上液，濃縮得到相對分子量I萬 5萬分子量的物質(zhì)，噴霧干燥得到多糖組分；
(5)糖苷類組分的制備
將步驟(3)中的上清液經(jīng)大孔樹脂柱層析，依次以水、不同濃度的乙醇的梯度洗脫，分別收集流分，合并乙醇部分濃縮至無醇味，噴霧干燥得到糖苷類組分；
(6)脂溶性組分的制備
將步驟(I)中的藥渣干燥后，加入乙醇回流提取，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至無醇味后，噴霧干燥得到脂溶性組分；
(7)六味地黃湯總提取物的制備
將步驟(4)中多糖組分、步驟(5)中糖苷類組分、步驟(6)中脂溶性組分及步驟(2)中的揮發(fā)油β -環(huán)糊精包合物組分混合，即得六味地黃湯總提取物組合物。除了以上所述的步驟以外，為提高制備工藝過程的可控性、中間體與成品的質(zhì)量其穩(wěn)定性，在工藝中還可以增加制藥上可接受的輔料等步驟。以上方案更具體和更優(yōu)化地說
步驟(I)中，所述的水煎液是水煎煮2次；所述的水煎液濃縮至清膏，是濃縮至清膏50°C的相對密度1. 10 I. 25 ；
步驟(2)中，所述的冷藏，是指4°C冷藏靜置48小時；所述的干燥，是在40°C干燥； 步驟(3)中，水煎液的乙醇沉淀所述的冷藏，是指4°C冷藏靜置48小時；
步驟(5)中，所述的梯度洗脫，是依次以水、重量比濃度20%、40%、65%的乙醇的梯度洗脫，分別收集流分，合并重量比濃度40%和65%乙醇部分；
步驟(6)中，所述的乙醇回流提取，是指乙醇回流提取2次，每次I小時，合并濾液，再回收乙醇,濃縮。本發(fā)明六味地黃湯提取物制備工藝流程見圖I。具體來講，將六味地黃處方中的六味藥以8:4:4:3:3:3的比例投料，水煎煮2次，同時回收揮發(fā)油，過濾，合并水煎液，將水煎液濃縮至清膏，清膏的相對密度1. 10 I. 25(50°C)，藥渣備用。環(huán)糊精制成飽和水溶液后，將揮發(fā)油緩緩滴入環(huán)糊精飽和水溶液中并不斷攪拌，冷藏(4°C)靜置48小時后抽濾，40°C干燥，即得揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物。清膏中加入乙醇并不斷攪拌至乙醇濃度為70%，冷藏(4°C)靜置48小時，分離得到上清液和沉淀；沉淀經(jīng)過多次醇沉處理后，沉淀與水配成混懸液，離心，除去不溶物，采用截留分子量為5萬的超濾膜過濾，棄去膜上液，除去相對分子量大于5萬的大分子物質(zhì)，膜下液再用截留分子量值為I萬的超濾膜過濾，除去相對分析量低于I萬的小分子物質(zhì)，收集膜上液，濃縮得到相對分子量I萬 5萬分子量的物質(zhì)，噴霧干燥得到部位A。將上清液濃縮回收乙醇后，經(jīng)大孔樹脂柱層析，依次以水、20%、40%和65%乙醇的梯度洗脫，分別收集洗脫液，水和20%乙醇部分棄去，合并40%和65%乙醇部分，濃縮后噴霧干燥或冷凍干燥后得到部位B。藥渣干燥后，加入乙醇回流提取2次，過濾，合并濾液，濃縮回收乙醇后，噴霧干燥得到部位C。將A、B、C部位及揮發(fā)油環(huán)糊精包合物合并，即為六味地黃湯總提取物。根據(jù)本發(fā)明六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)主要由I萬 5萬分子量多糖成分組成。根據(jù)本發(fā)明六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)主要由糖苷類成分組成。根據(jù)本發(fā)明六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)主要由脂溶性成分組成。完成本申請第3個發(fā)明任務的方案分別是
上述六味地黃湯總提取物組合物在制備治療應激性反應的心臟并發(fā)癥的藥物中的應用。上述六味地黃湯總提取物組合物在制備治療應激性反應的腦并發(fā)癥的藥物中的應用。上述六味地黃湯總提取物組合物在制備治療應激性反應的睪丸并發(fā)癥的藥物中的應用。六味地黃湯的治療新適應癥和新靶點
六味地黃湯的應用十分廣泛，銷售量很大，與之相比較，對臨床適應癥和藥理學的研究顯得十分不足，主治不明，機制不清。臨床大量使用與藥理學研究與當代分子生物學和生物醫(yī)學的研究脫節(jié)。因此，對它的藥理作用認識，和對疾病的主治，作用主要靶點應予以深入研究。劇烈的應激性(體力性或精神性)常導致心臟功能突然惡化，血管功能損害，腦損害，短時間內(nèi)會嚴重損害機體，危及生命。阻斷急性嚴重的應激反應引起的心腦血管病變，是保障人民健康的重要措施。另外，中老年人群中，男性性功能低下的發(fā)病高，呈現(xiàn)增長趨勢。在急性緊張的狀態(tài)下，對睪丸的性激素生成會出現(xiàn)明顯的抑制狀態(tài)，血中性激素含量明顯降低。提示對男性健康明顯影響。尼日利亞軍隊報道，緊張的軍事訓練，能使男性士兵的血中睪酮的含量明 顯降低，證明過于繁重的軍事訓練，會損害睪丸的功能。應激狀態(tài)是一種復雜的病理生理狀態(tài)。包含體內(nèi)活性氧類(reactive oxygenspecies, R0S)的生成和釋放量大大增加。體內(nèi)氧自由基的生成有多種來源，其中，NADPH氧化酶的激活是最重要來源。六味地黃湯的“三補三泄”的藥理作用，可能源于抑制NADPH氧化酶的激活，從而，可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子，減輕無疊合蛋白質(zhì)反應(Unfolded proteinresponse, UPR)；我們發(fā)現(xiàn)六味地黃湯治療應激反應的多種并發(fā)癥，主要在于抑制NADPH氧化酶的活性。近年來發(fā)現(xiàn),無折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)增多的早期,它是補償性反應，隨著病情發(fā)展，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子不斷增加，細胞核轉(zhuǎn)錄生成的炎性物質(zhì)和促炎性物質(zhì)愈來愈多。最終細胞無法克服，導致細胞死亡。蛋白質(zhì)中肽鏈要進行-SH，-SH鍵的縮合，形成3度空間的立體構(gòu)象，才獲得生物活性。蛋白質(zhì)的疊合反應對氧自由基十分敏感，過多氧自由基干擾蛋白質(zhì)的疊合反應。應激反應通過激活NADPH氧化酶活性，使ROS生成急劇上升，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，細胞遭受嚴重的傷害。六味地黃湯通過阻斷NADPH氧化酶的激活，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，使應激性病變明顯緩解或完全抑制。六味地黃湯阻斷NADPH氧化酶，就有可能制止嚴重應激性心、腦等損害的發(fā)生，或是明顯緩解。六味地黃湯緩解應激性反應的心血管并發(fā)癥，由于抑制NADPH氧化酶
NADPH氧化酶在病理條件下，成為生成ROS的主要來源。NADPH氧化酶的結(jié)構(gòu)，可分為二大部分催化亞單位N0X2, N0X4,等,和調(diào)控亞單位p22phox,p47phox, p67phox,等。應激狀態(tài)，以及糖尿病，NADPH氧化酶被高度激活，產(chǎn)生眾多R0S，造成組織損害；應激性反應引起心肌病，血管病，腎病，睪丸病和腦病。NADPH氧化酶是六味地黃湯的主要的靶點，由NADPH氧化酶激活所介導的諸多疾病,六味地黃湯均可有效。NADPH氧化酶的激活，還會引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能之一，合成具有生物活性的蛋白質(zhì)。如有較多ROS存在，蛋白質(zhì)無法正常地疊合，或錯誤疊合，生成的蛋白質(zhì)無活性。稱之為無蛋白質(zhì)置合反應(UPR)。此時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞核間的對話異常，生成大量ER stress的分子，如PERK，Bip，CHOP，等，促使大量生成炎癥因子，或促炎癥因子。引起細胞凋亡，細胞死亡，出現(xiàn)心血管病，腦病，腎病，睪丸病等。引起ER應激的主要機制，是由于NADPG氧化酶的激活。
本發(fā)明，首次發(fā)現(xiàn)六味地黃湯對NADPH氧化酶的很強阻斷作用，是它的藥理作用基礎(chǔ)，對抗應激性和糖尿病和它的并發(fā)癥。本發(fā)明使用工具藥選擇性NADPH氧化酶阻斷劑乙酰香草素(APO)作為陽性對照，APO只是在藥理學研究中的一種工具藥，APO不是臨床使用的藥物。用它對比只是說明六味地黃湯制劑的藥效是通過阻斷NADPH氧化酶的機制。六味地黃湯制劑的作用于APO相仿，證明通過同一作用機制。這是首次證明六味地黃湯制劑所具有的作用和機制。因此，六味地黃湯制劑可抑制氧自由基產(chǎn)生的源頭，以及可控制所有氧自由基損害所形成的病變。通過六味地黃湯的治療，對很強的應激性反應中，抑制激活的NADPH氧化酶，對抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，使器官的各項觀察指標，均回到或接近正常的狀態(tài)。療效實例
抑制NADPH氧化酶，治療應激性心肌損害。 SD大鼠，異丙腎上腺素注射引起應激性心肌損害，心力衰竭。用新工藝制作的六味地黃湯制劑給藥治療，模型組和治療組皮下注射異丙腎上腺素lmg/kg，每天一次，給藥10天；第6天至第10天，治療組分別給藥乙酰香草素(皮下注射，10mg/kg)或六味地黃湯制齊[J，在O. 5% CMC-Na制成混懸液灌胃，二個劑量組1. 2g/kg，和2. 4g/kg。正常組皮下注射生理鹽水。第11天烏拉坦麻醉，手術(shù)做心內(nèi)插管，測血流動力學，和心肌中肌漿網(wǎng)的鈣調(diào)控蛋白，等觀察糖尿病心肌病對心功能，心肌氧化應激，肌漿網(wǎng)鈣調(diào)控蛋白的影響，和ΑΡ0，六味地黃湯制劑的治療作用。方法
40只清潔級SD大鼠隨機分為5組正常組，使用異丙腎上腺素制作應激性損傷的病理模型組(ISO, SC, lmg/kg, 10天)，乙酰香草素(Apocynin, ΑΡ0)選擇性阻斷NADPG氧化酶為陽性藥治療組(APO，sc, 10mg/kg，5天)，六味地黃湯的中、高劑量組(1.2g/kg (LM)，
2.4g/kg (LH)六味地黃湯的干浸膏)，分別相當于生藥材7g/kg和14g/kg)。正常組皮下注射生理鹽水，模型組第6-10天以O(shè). 5%CMC-Na溶液灌胃。主要結(jié)果(舉例)
一、治療應激性心肌損害
I.抑制心肌中氧化應激
黃嘌呤氧化酶(XOD) (A)活性，MDA (B)和iNOS (C)在糖尿病心肌病中升高，六味地黃湯的二個劑量，均使明顯降低，與選擇性NADPH氧化酶抑制劑APO—致。(數(shù)據(jù)mean 土
S.D. , η = 6. **/Χ0·01 F5.正常組，#/Χ0·05，#V<0. 01 ks. ISO 應激性損害的未治療組，下同I。2.恢復應激性損害的心功能
見圖12-A 圖12-D : LM, LH,為六味地黃湯的中，高二個組。糖尿病組的LVSP (A)，LV+dp/dtmax (B), LV-dp/dtmin (C)降低，LVEDP上升(D);六味地黃湯使恢復到正常狀態(tài)，與APO的作用相同。
3.恢復心肌中鈣調(diào)控蛋白FKBP12.6(穩(wěn)鈣蛋白)(A)，及CAQS2 (儲鈣蛋白)(B):見圖 13-A、13-B)
4.抑制應激反應引起的心肌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激
見圖14-A、圖14-B):心肌中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子PERK上調(diào)mRNA(A)，蛋白(B)，六味地黃湯抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，使恢復到正常，與APO—致。5.修復心肌細胞間的隙縫蛋白的通信連接
見圖15-A、15-A B)心肌細胞間的隙縫連接蛋白Cx43 (connexin 43)在應激性心臟損傷時，明顯降低mRNA (A),蛋白(B)。細胞間通信不暢，構(gòu)成心功能損害的重要病理改變之一。大劑量的六味地黃湯的恢復Cx43的藥效與APO相同。
6.抑制心肌中NADPH氧化酶
見圖16-A 圖16-D):應激性心肌病變中，NADPH氧化酶明顯激活，六味地黃湯很明顯的抑制NADPH氧化酶p22phox的mRNA和蛋白表達，作用于APO相仿。7.恢復心臟中基質(zhì)金屬蛋白酶的正常表達
見圖17-A 圖17-D)，應激性心肌損害，使心肌中MMP2、9 (基質(zhì)金屬蛋白2，9)明顯上調(diào)，使心肌細胞的膠質(zhì)組分降解大增，損傷心肌細胞的組分，功能和形態(tài)，出現(xiàn)心功能降低。六味地黃湯的二個劑量組，使明顯恢復，與APO的效果相近。二、治療應激性腦損害
應激性腦損害，容易出現(xiàn)腦中風，腦組織損害，壞死等嚴重事件。六味地黃湯能有效地對抗應激性腦損害
I.抑制腦內(nèi)氧化應激
應激性腦損傷時，腦內(nèi)MDA，和iNOS增多，構(gòu)成氧化應激。六味地黃湯對應激性氧化應激具有很強的抑制作用。見圖18-A、圖18-B : MDA (A), iNOS (B)。作用與APO相同。2.抑制腦內(nèi)NADPH氧化酶
應激時，腦內(nèi)NADPH氧化酶顯著上調(diào)，六味地黃湯二個劑量，均有效地使恢復到正常狀態(tài)，藥效與APO相同。見圖19-A、圖19-B :
3.抑制腦細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激
與正常組相比，ISO組引起很強的應激反應時，腦組織中PERK mRNA (左)和蛋白(右)明顯上調(diào)。經(jīng)AP0、六味地黃湯中劑量和高劑量干預后，PERK mRNA及蛋白恢復到正常水平。見圖 20-A、圖 20-Bo4.調(diào)控腦內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶
反映在應激反應中的腦損害，腦組織的細胞中膠原成分降解增速，表現(xiàn)為MMP2(A，B)，MMP9 (C，D)的mRNA和蛋白上調(diào)。經(jīng)六味地黃湯和APO的治療，把異常的表達降到正常。見圖21-A 圖21-D。5.調(diào)控腦內(nèi)的內(nèi)皮素受體A (ETaR):
ISO組(應激組)中腦組織中ETaR的mRNA和蛋白，表達均明顯上升。ETaR與ROS偶聯(lián)，ETAR的作用有NADPH氧化酶所介導。ETaR參與腦內(nèi)應激反應，和損害。經(jīng)AP0、六味地黃湯中劑量和高劑量干預后，ETaR的mRNA (左)和蛋白(右)表達均下降到正常范圍。消除對腦細胞的損害。見圖22-A、圖22-B。
6.腦內(nèi)細胞間的縫隙信息溝通
腦內(nèi)的神經(jīng)元間由突觸的聯(lián)系溝通信息。另方面，在神經(jīng)元間，和神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞間，以及膠質(zhì)細胞間的信息溝通，尚可經(jīng)細胞間的縫隙的接觸，而實現(xiàn)小分子，水分，離子，和其他活性小分子的溝通和交換。此功能對維護腦的正常功能起到重要的作用。在這一家屬中，Cx40 (左)，Cx43 (右)的蛋白都下調(diào)，提不有腦功能的障害。TK味地黃湯_■個劑量和APO使明顯改善它們的表達。見圖23-A、圖23-B。三、六味地黃湯治療應激性睪丸損害
I.低睪酮血癥、及高FSH和LH水平
大鼠sc IS01mg/kg, 10天,在6_10天給藥干預5天六味地黃湯中，高二個劑量,及用APO做陽性對照同前。下丘腦-垂體-睪丸軸的功能，在ISO的應激反應中，出現(xiàn)明顯的性功能障礙。低睪酮血癥，同時，血中FSHjP LH降低。經(jīng)過六味地黃湯治療后，明顯提高睪酮，恢復了正常的FSH，LH。見圖24-A、圖24-B、圖24-C。左，血清睪酮；右，血清FSH;下，血清LH。
2.辜麗生物合成的相關(guān)基因表達異常
StAR, P450SCC和3β-HSD是膽固醇轉(zhuǎn)化為睪酮的三個重要基因和相應的蛋白，我們評價了它們的基因mRNA表達，發(fā)現(xiàn)ISO誘導的應激反應中，大鼠睪丸StAR、P450scc和3 β -HSD的mRNA表達明顯下降(P〈0. 01)，與血中睪酮含量降低一致，表明應激反應可導致大鼠的睪酮生物合成體系的破壞。六味地黃湯和APO治療后，有效恢復三個基因的表達水平(P<0. 01)見圖 25-A、圖 25-B、圖 25-C。3.睪丸中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激分子PERK的蛋白表達上調(diào)
ISO誘導的應激反應，損傷大鼠睪丸的捏分泌功能，病變睪丸的PERK基因及蛋白的水平顯著增強O°〈0. 01)。六味地黃湯和APO治療，可以有效減少PERK基因及其蛋白的表達水平 Ο°〈0· 01)見圖 26。4.睪丸NADPH氧化酶激活
NADPH氧化酶是睪丸ROS的一個重要來源，亞基的過表達可提示其活性增強。注射ISO后，大鼠病變的睪丸組織中發(fā)生明顯的氧化應激現(xiàn)象，其中p22phox, p47phox和p67phox蛋白表達的水平明顯上調(diào)(/XO. 01)。經(jīng)過六味地黃湯和APO治療后，NADPH氧化酶的各亞型恢復正常。見圖27-A、圖27-B、圖27-C。5. Cx40 及 Cx43 下調(diào)
ISO誘導應激性損傷大鼠睪丸病變中，Cx40及Cx43 mRNA表達明顯下調(diào)(/X0. 01)，表明睪丸細胞間的信號交流收到干擾。經(jīng)過六味地黃湯和APO治療后，恢復了 Cx40及Cx43的信息交流。見圖28-A、圖28-B。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)忽略六味地黃湯總提取物脂溶性有效成分的不足，通過提取工藝，得到六味地黃湯總提取物的更完備的組分構(gòu)成，并使得采用這種組合物治療應激性反應的心臟、腦、睪丸等并發(fā)癥成為可能。


圖I為六味地黃湯提取物制備工藝流程 圖2為六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的紅外光譜 圖3為六味地黃湯提取物的多糖組分(部位A)的二階導數(shù)紅外光譜 圖4為六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的紅外光譜 圖5為六味地黃湯提取物中糖苷類組分(部位B)的二階導數(shù)紅外光譜 圖6為六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的紅外光譜 圖7為六味地黃湯提取物脂溶性組分(部位C)的二階導數(shù)紅外光譜圖；圖8為六味地黃湯提取物組合物的紅外光譜 圖9為六味地黃湯提取物組合物的二階導數(shù)紅外光譜 圖10為10批次六味地黃湯提取物的紅外光譜疊加圖譜；
附圖中的縱坐標是吸光度(A)。圖11 圖28為本發(fā)明治療效果測試結(jié)果的柱狀圖。
具體實施例方式實施例I :六味地黃湯提取物的制備
將六味地黃湯中熟地黃、山茱萸(制)、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3比例投料(共1680g)，加入10倍量水，浸泡3h，煎煮兩次，同時回收揮發(fā)油，每次30min，用紗布過濾，減壓濃縮至清膏，清膏的相對密度為I. 10 I. 25 (50°C)，過濾后剩余的藥渣備用；^ -環(huán)糊精制成飽和水溶液后，將揮發(fā)油緩緩滴入3 -環(huán)糊精飽和水溶液中并不斷攪拌，冷藏(4°C)靜置48小時后抽濾，40°C干燥，即得揮發(fā)油￠-環(huán)糊精包合物(5.76g)。清膏中加入乙醇并不斷攪拌至乙醇的量為70%，將其置于冰箱4°C下冷藏48小時后，分離得到上清液和沉淀，沉淀用70%乙醇洗滌3次；沉淀除醇，沉淀與水配成混懸液，離心，除去不溶物，采用截留分子量為5萬的超濾膜過濾，棄去膜上液，除去相對分子量大于5萬的大分子物質(zhì)，膜下液再用截留分子量值為I萬的超濾膜過濾，除去相對分析量低于I萬的小分子物質(zhì)，收集膜上液，濃縮得到相對分子量I萬 5萬分子量的物質(zhì)，噴霧干燥得到部位A (108. 24g)。合并上清液減壓濃縮至清膏，經(jīng)過DlOl大孔樹脂柱層析，按照每千克生藥采用I. 5Kg的大孔樹脂的比例上樣，然后用水、20%乙醇、40%乙醇和65%乙醇依次洗脫，水和20%乙醇洗脫液棄去，合并40%乙醇和65%乙醇洗脫液減壓濃縮，噴霧干燥得到部位B( 16. 35g)。藥渣干燥后，加入5倍量乙醇回流提取2次，I小時/次，過濾，合并濾液，濃縮回收乙醇后，噴霧干燥得到部位C (19.73g)。合并A、B、C及揮發(fā)油￠-環(huán)糊精包合物，得到六味地黃湯總提取物。六味藥植物來源為中國藥典所規(guī)定的品種。實施例2，與實施例I基本相同，但有以下改變原料藥由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照10. 4 :5. 2 :5. 2 :3. 9 :3. 9 :3. 9的重量比組成，原料藥中，所述的地黃、山茱萸及山藥是選擇生品。實施例3，與實施例I基本相同，但有以下改變原料藥由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照7. 6 :2. 8 :2. 8 :2. I :2. I :2. I的重量比組成，原料藥中，所述的地黃、山茱萸及山藥是選擇制品。實施例4，與實施例I基本相同，但有以下改變原料藥由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照10. 4 :2. 8 :5. 2 :2. I :3. 9 :2. I的重量比組成，原料藥中，所述的地黃、山茱萸是選擇制品；山藥是選擇生品。實施例5，與實施例I基本相同，但有以下改變原料藥由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照7. 6 :5. 2 2.8 :3. 9 :2. I :3. 9的重量比組成，原料藥中，所述的山茱萸是選擇制品；地黃及山藥是選擇生品。實施例6，與實施例I基本相同，但有以下改變原料藥由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照10. 4 7. 6 :5. 2 2. 8 :3. 9 2. I :3. 9 2. I :3. 9 2. I :3. 9 2. I的重量比組成，原料藥中，所述的地黃、山茱萸及山藥是選擇生品；或是選擇制品。
實施例7，與實施例I基本相同，但有以下改變原料藥由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照10. 4 :5. 2 :3. 9 :2. I :2. I :2. I的重量比組成。實施例8，與實施例I基本相同，但有以下改變原料藥由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照7. 6 :2. 8 :2. I :3. 9 :3. 9 :3. 9的重量比組成。六味地黃湯提取物的紅外測定
采用Perkin Elmer公司的FTIR傅里葉變換紅外光譜儀，運用KBr壓片法測定得到各有效部位的紅外光譜圖。
各有效部位的紅外光譜圖采用Perkin Elmer公司Spectrum ν6· O操作軟件(平滑點數(shù)為13)得到各有效部位的二階導數(shù)光譜圖。通過采用紅外光譜軟件對10批六味地黃湯提取物的紅外光譜掃描數(shù)據(jù)進行相似度計算處理，最終所得的10批六味地黃湯提取物組合物的紅外光譜疊加圖譜(如圖10)，以六味地黃湯提取物(批號10111001)為參考，其余六味地黃湯提取物紅外光譜圖的相似度值見表，結(jié)果表明不同批次六味地黃湯提取物的相似度值均大于O. 85，表明該制備工藝比
較穩(wěn)定。六味地黃湯提取物紅外光譜圖的相似度表
批號I相似度
10111001I_
101110020Γ9901
101110030Γ9843
101110040Γ9822
101110050Γ9784
101110060Γ9571
10111007(1 9426
101110080Γ9275
101110090Γ9247
10111010|θ. 857權(quán)利要求
1.一種六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，原料藥由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照10. 4 7. 6 :5. 2 2. 8 :5. 2 2. 8 :3. 9 2. I :3. 9 2. I :3. 9 2. I的重量比組成，所述的組合物中包括有六味地黃湯總提取物揮發(fā)油β_環(huán)糊精包合物組分，六味地黃湯總提取物多糖組分，六味地黃湯總提取物糖苷類組分，以及六味地黃湯總提取物脂溶性組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，原料藥由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，原料藥中，所述的地黃、山茱萸及山藥是分別選擇生品；或是分別選擇制品。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2或3所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，所述的組合物是指通過以下方法制備得到的組合物 (1)水 Η液的制備 將由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3處方投料，水煎煮，同時回收揮發(fā)油，合并水煎液，水煎液濃縮至清膏，藥渣備用； (2)揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物組分的制備 采用β -環(huán)糊精飽和水溶液法包合六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油，將六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油緩緩滴入β -環(huán)糊精飽和水溶液中并不斷攪拌，冷藏靜置后抽濾，干燥，即得揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物組分； (3)水煎液的乙醇沉淀 將步驟(I)中的清膏中加入乙醇并不斷攪拌至乙醇重量比濃度為70%，冷藏靜置，分離得到上清液和沉淀； (4)多糖組分的制備 將步驟(3)中的沉淀與水配成混懸液，離心，除去不溶物，采用截留分子量為5萬的超濾膜過濾，棄去膜上液，除去相對分子量大于5萬的大分子物質(zhì)，膜下液再用截留分子量值為I萬的超濾膜過濾，除去相對分析量低于I萬的小分子物質(zhì)，收集膜上液，濃縮得到相對分子量I萬 5萬分子量的物質(zhì)，噴霧干燥得到多糖組分； (5)糖苷類組分的制備 將步驟(3)中的上清液經(jīng)大孔樹脂柱層析，依次以水、不同濃度的乙醇的梯度洗脫，分別收集流分，合并乙醇部分濃縮至無醇味，噴霧干燥得到糖苷類組分； (6)脂溶性組分的制備 將步驟(I)中的藥渣干燥后，加入乙醇回流提取，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至無醇味后，干燥得到脂溶性組分； (7)六味地黃湯總提取物的制備 步驟(2)中的揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物組分、步驟(5)中糖苷類組分及步驟(6)中脂溶性組分混合，按適當比例與步驟(4)中多糖組分混合制粒，干燥，壓片或灌封膠囊，即得六味地黃湯總提取物組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于， 步驟(I)中，所述的水煎液是水煎煮2 3次；所述的水煎液濃縮至清膏，是濃縮至清膏50°C的相對密度1. 10 I. 25 ；步驟(2)中，所述的冷藏，是指4°C冷藏靜置12 48小時；所述的干燥，是在30 60°C干燥； 步驟(3)中，水煎液的乙醇沉淀所述的冷藏，是指4°C冷藏靜置12 48小時； 步驟(5)中，所述的梯度洗脫中的固定相為制藥上可接受的大孔樹脂；梯度洗脫是依次以水、重量比濃度20%的乙醇洗脫，棄去洗脫液；用40% 75%的乙醇梯度洗脫，收集流分，合并洗脫液； 步驟(6)中，所述的乙醇回流提取，是指乙醇回流提取2次，每次I小時，合并濾液，再回收乙醇,濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5之一所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，所述的多糖組分由I萬 5萬分子量多糖成分組成。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的六味地黃湯總提取物組合物，其特征在于，所述的組合物具有以下特征 (1).六味地黃湯總提取物組合物的紅外光譜的特征峰IRH^r (cm-1) :3396、2926、2855、1711、1615、1516、1453、1376、1203、1163、1078、1030、765、714,573 ;或者， 六味地黃湯總提取物組合物的二階導數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR H^r (600 1800cm—1) :1740、1710、1687、1606、1515、1467、1377、1316、1276、1204、I154、1077、1027、794、768、742、715 ； (2).六味地黃湯提取物的多糖組分的紅外光譜的特征峰IRHS1 (cm—1) :3400,2930,1718、1618、1417、1372、1238、1152、1079、1024、868、766、604、575、527 ;或者， 六味地黃湯提取物的多糖組分的二階導數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR iC (600 1800cm—1) :1731、1609、1561、1522、1506、1471、、1372、1230、1205、I153、1125、I106、1079、1056、1023、995、963、913、866、835、819、799、759、704、658、643、616、604 ； (3).六味地黃湯提取物中糖苷類組分的紅外圖譜的特征峰=IRH^r(cnT1) :3398、2934、1709、1610、1533、1516、1450、1383、1278、1205、1073、1038、837、765、715、627 ;或者， 六味地黃湯提取物中糖苷類組分的二階導數(shù)紅外光譜的特征峰SD-IR (600 1800cm—1) : 1747、1715、1653、1631、1603、1534、1515、1490、1468、1451、1418、1396、1384、1349、1316、1280、1202、1176、1119、1098、1072、1038、1005、940、918、897、872、853、821、767、741、715 ； (4).六味地黃湯提取物脂溶性組分的紅外圖譜的特征峰IRV= (cm1) :3391,2928,1729、1668、1408、1385、1349、1226、1146、1075、920、868、817、777、629、590、422 ;或者， 六味地黃湯提取物脂溶性組分的二階導數(shù)紅外光譜的特征峰=SD-IR I: (600 1800cm-1) :1736、1667、1609、1560、1523、1498、1457、1419、1384、1341、1315、I195、I150、1105、1079、1054、1026、977、962、917、891、865、817、799、779、700、673、661、631。
8.權(quán)利要求I所述的六味地黃湯總提取物組合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)水 Η液的制備 將由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3處方投料，水煎煮，同時回收揮發(fā)油，合并水煎液，水煎液濃縮至清膏，藥渣備用； (2)揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物組分的制備 采用β -環(huán)糊精飽和水溶液法包合六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油，將六味地黃湯總提取物的揮發(fā)油緩緩滴入β -環(huán)糊精飽和水溶液中并不斷攪拌，冷藏靜置后抽濾，干燥，即得揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物組分； (3)水煎液的乙醇沉淀 將步驟(I)中的清膏中加入乙醇并不斷攪拌至乙醇重量比濃度為70%，冷藏靜置，分離得到上清液和沉淀； (4)多糖組分的制備 將步驟(3)中的沉淀與水配成混懸液，離心，除去不溶物，采用截留分子量為5萬的超濾膜過濾，棄去膜上液，除去相對分子量大于5萬的大分子物質(zhì)，膜下液再用截留分子量值為I萬的超濾膜過濾，除去相對分析量低于I萬的小分子物質(zhì)，收集膜上液，濃縮得到相對分子量I萬 5萬分子量的物質(zhì)，噴霧干燥得到多糖組分； (5)糖苷類組分的制備 將步驟(3)中的上清液經(jīng)大孔樹脂柱層析，依次以水、不同濃度的乙醇的梯度洗脫，分別收集流分，合并乙醇部分濃縮至無醇味，噴霧干燥得到糖苷類組分； (6)脂溶性組分的制備 將步驟(I)中的藥渣干燥后，加入乙醇回流提取，濾過，濾液回收乙醇，濃縮至無醇味后，噴霧干燥得到脂溶性組分； (7)六味地黃湯總提取物組合物的制備 步驟(2)中的揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物組分、步驟(5)中糖苷類組分及步驟(6)中脂溶性組分混合，按適當比例與步驟(4)中多糖組分混合制粒，干燥，壓片或灌封膠囊，即得六味地黃湯總提取物組合物。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的六味地黃湯總提取物組合物的制備方法，其特征在于， 步驟(I)中，所述的水煎液是水煎煮2 3次；所述的水煎液濃縮至清膏，是濃縮至清膏50°C的相對密度1. 10 I. 25 ； 步驟(2)中，所述的冷藏，是指4°C冷藏靜置12 48小時；所述的干燥，是在30 60°C干燥； 步驟(3)中，水煎液的乙醇沉淀所述的冷藏，是指4°C冷藏靜置12 48小時； 步驟(5)中，所述的梯度洗脫中的固定相為制藥上可接受的大孔樹脂；梯度洗脫是依次以水、重量比濃度20%的乙醇洗脫，棄去洗脫液；用40% 75%的乙醇梯度洗脫，收集流分，合并洗脫液； 步驟(6)中，所述的乙醇回流提取，是指乙醇回流提取2次，每次I小時，合并濾液，再回收乙醇,濃縮。
10.權(quán)利要求I所述的六味地黃湯總提取物組合物在制備治療應激性反應的心臟并發(fā)癥的藥物中的應用。
11.權(quán)利要求I所述的六味地黃湯總提取物組合物在制備治療應激性反應的腦并發(fā)癥的藥物中的應用。
12.權(quán)利要求I所述的六味地黃湯總提取物組合物在制備治療應激性反應的睪丸并發(fā)癥的藥物中的應用。
13.根據(jù)權(quán)利要求9、10、11所述的六味地黃湯總提取物組合物在制備治療應激性反應的心臟、腦、睪丸并發(fā)癥的藥物中的應用，其特征在于，大鼠實驗中的用量為 中劑量組1. 2g/kg六味地黃湯的干浸膏；高劑量組2. 4g/kg六味地黃湯的干浸膏,分別相當于生藥材7g/kg和14g/kg。
全文摘要
六味地黃湯總提取物組合物、其制備方法及其在制備治療應激性反應的心臟、腦、睪丸等并發(fā)癥藥物中的應用。六味地黃湯總提取物組合物，原料藥由熟地黃、制山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮和茯苓按照8:4:4:3:3:3的重量比組成，其特征在于，所述的組合物中包括有六味地黃湯總提取物揮發(fā)油β-環(huán)糊精包合物組分；六味地黃湯總提取物多糖組分；六味地黃湯總提取物糖苷類組分，以及六味地黃湯總提取物脂溶性組分。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)忽略六味地黃湯總提取物脂溶性有效成分的不足，通過提取工藝，得到六味地黃湯總提取物的更完備的組分構(gòu)成，并使得采用這種組合物治療應激性反應的心臟、腦、睪丸等并發(fā)癥成為可能。
文檔編號A61P39/00GK102652785SQ20111005238
公開日2012年9月5日 申請日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者叢曉東, 張云, 戴德哉, 戴茵, 王勝波 申請人:南京中敬醫(yī)藥科技研究所, 浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠