專(zhuān)利名稱(chēng)：重組人源腦紅蛋白的生物活性檢測(cè)方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及重組人源腦紅蛋白的生物活性檢測(cè)方法及其用途，特別是重組人源腦紅蛋白的清除自由基活性的檢測(cè)方法及其在制備具有清除自由基功能藥物中的用途。
背景技術(shù)：
腦紅蛋白(neuroglobin，Ngb)是2000年新發(fā)現(xiàn)的主要表達(dá)于神經(jīng)系統(tǒng)的第三類(lèi)攜氧珠蛋白，功能和性質(zhì)方面與肌紅蛋白類(lèi)似，與氧有很高的親和力(P5tl 2torr)。對(duì)于 Ngb蛋白檢測(cè)，現(xiàn)多集中在蛋白的免疫活性(蛋白印跡檢測(cè))和蛋白含量的檢測(cè)方面，針對(duì) Ngb蛋白的生物活性，尤其是清除自由基活性，目前尚無(wú)合適的檢測(cè)方法報(bào)道。申請(qǐng)人:在發(fā)明專(zhuān)利ZL200510059313. 5中公開(kāi)了重組全長(zhǎng)人源腦紅蛋白(rhNgb) 的制備方法，獲得了原核表達(dá)的rhNgb蛋白，為rhNgb蛋白在產(chǎn)業(yè)上大量生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。然而，產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)需要有相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)檢體系支持，由此，申請(qǐng)人在蛋白水平上對(duì) rhNgb的生物活性進(jìn)行系列深入研究，并有望將研究成果轉(zhuǎn)化為rhNgb蛋白生產(chǎn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)檢方法。目前，國(guó)內(nèi)外有很多關(guān)于Ngb抗自由基損傷的研究報(bào)道，已經(jīng)通過(guò)真核表達(dá)載體技術(shù)和轉(zhuǎn)基因等手段(而不是使用Ngb蛋白)，間接證明Ngb具有保護(hù)細(xì)胞抵抗自由基損傷的功會(huì)邑。如 Fordel 等(Neurosci Lett,Neuroglobin and cytoglobin overexpression protects human SH—SY5Y neuroblastoma cells against oxidative stress-induced cell death, 2006,410 (2) : 146-51)研究指出，過(guò)表達(dá)的Ngb能夠保護(hù)SH-SY5Y細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡；而Wang等(Stroke，Effects of neuroglobin overexpression on acute brain injury and long-term outcomes after focal cerebral ischemia，2008， 39(6) :1869-74)用過(guò)表達(dá)Ngb的轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Ngb過(guò)表達(dá)能夠減少機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生；Nayak 等(J Neurochem, Role of neuroglobin in regulating reactive oxygen species in the brain of the anoxia-tolerant turtle Trachemys scripta, 2009,110(2) :603-12)研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中Ngb能夠降低自由基的產(chǎn)生；Li 等(Brain Res, Neuroglobin protects PC 12 cells against oxidative stress,2008, 1190 :159-66)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)的Ngb能夠保護(hù)PC12細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激損傷。但是，以上研究只能說(shuō)明Ngb對(duì)自由基引起的細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，并不能說(shuō)明Ngb本身對(duì)自由基具有清除作用，也無(wú)法證明其抗氧化能力，因此文獻(xiàn)中所報(bào)道的內(nèi)容并不適合rhNgb生物活性的檢測(cè)；同時(shí)，目前僅有的直接從Ngb蛋白進(jìn)行的清除自由基研究(Neuro-and cytoglobin are found to show no appreciable superoxide dismutase, catalase, and peroxidase activities. (Gene, Neuroglobin and cytoglobin as potential enzyme or substrate, 2007,398(1-2) :103-1 )，卻并未發(fā)現(xiàn)Ngb具有超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT) 和過(guò)氧化物酶(POD)活性，尚未證明其具有能夠清除自由基的能力，導(dǎo)致對(duì)于Ngb生物活性的判定出現(xiàn)相互矛盾之處。這可能是由于檢測(cè)技術(shù)靈敏度不足所導(dǎo)致的。因此目前還沒(méi)有從蛋白水平直接檢測(cè)Ngb蛋白清除自由基活性的報(bào)道。自由基是機(jī)體正常代謝的中間產(chǎn)物(包括但不限于超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基等)。自由基在機(jī)體內(nèi)具有很強(qiáng)的氧化反應(yīng)能力，同時(shí)過(guò)量的自由基卻又易于在機(jī)體內(nèi)與各種生物大分子發(fā)生反應(yīng)而導(dǎo)致細(xì)胞和組織氧化損傷。機(jī)體內(nèi)過(guò)多的自由基是許多疾病產(chǎn)生的重要原因，因此清除過(guò)量自由基已成為防治多種疾病的重要方式。生理狀態(tài)下人體內(nèi)自由基處于產(chǎn)生與清除的動(dòng)態(tài)平衡中，而此平衡主要依靠機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行維持。機(jī)體內(nèi)過(guò)多的自由基是產(chǎn)生氧化應(yīng)激的重要因素，也是致病的重要原因，如神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、腦中風(fēng)、腫瘤等，因此清除體內(nèi)過(guò)多的自由基或防止過(guò)多自由基的產(chǎn)生已成為預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)疾病的重要途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種靈敏度較高的從蛋白水平直接檢測(cè)重組人源腦紅蛋白生物活性的方法。本發(fā)明所提供的重組人源腦紅蛋白的生物活性檢測(cè)方法，是通過(guò)重組人源腦紅蛋白清除自由基能力體現(xiàn)，以rhNgb清除超氧陰離子、過(guò)氧化氫和羥自由基的活性作為檢測(cè)指標(biāo)。具體來(lái)講，一種所述重組人源腦紅蛋白的系列生物活性檢測(cè)方法，針對(duì)rhNgb清除超氧陰離子活性進(jìn)行檢測(cè)，用NBT光還原法，可包括以下步驟(1)測(cè)定樣品吸收度向樣品組中加入樣品、反應(yīng)混合液、PBS和VB2,向空白對(duì)照組中加入雙蒸水，然后立即將待測(cè)樣品放于光照箱，室溫下光照15min，立即遮光終止反應(yīng)，測(cè)定560nm處吸光度； 所述反應(yīng)混合液為L(zhǎng)-Met NBT EDTA-Na2按體積比2 2 1比例混合的混合液；(2)計(jì)算清除超氧陰離子的活性按下式計(jì)算清除超氧陰離子活性SAA(%) = [1-A/AJX100，其中A為空白對(duì)照組吸光度，A0為樣品組吸光度。在上述NBT光還原法測(cè)定rhNgb清除超氧陰離子活性的方法中，所述各試劑濃度為L(zhǎng)-Met 39mM、NBT 0. 225mM 和 EDTA-Na2 3mM、VB2 0. 12mM、PBS (pH 7.2)。具體來(lái)講，另一種所述重組人源腦紅蛋白的系列生物活性檢測(cè)方法，針對(duì)rhNgb 清除過(guò)氧化氫活性進(jìn)行檢測(cè)，用過(guò)氧化氫滅活酶法進(jìn)行檢測(cè)，可包括以下步驟1)檢測(cè)(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定①取過(guò)氧化氫溶液至離心管中，加入過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液，混勻；然后加入顯色工作液，25°C孵育后測(cè)定A520 ；②計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)樣品測(cè)定①將樣品中加入到新的離心管中，然后加入過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液，混勻，再加入過(guò)氧化氫溶液，迅速混勻，25°C反應(yīng)；②向上述反應(yīng)體系中加入過(guò)氧化氫酶反應(yīng)終止液，混勻以終止反應(yīng)，并在終止反應(yīng)后15分鐘內(nèi)完成下一步；
③向新的塑料離心管內(nèi)加入過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液，然后加入已終止并混勻的上述反應(yīng)體系，混勻；再加入200 μ 1顯色工作液；25°C孵育后測(cè)定A520 ；2)清除過(guò)氧化氫活性的計(jì)算根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的k和b值計(jì)算實(shí)驗(yàn)中消耗的過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)；在上述過(guò)氧化氫酶檢測(cè)rhNgb清除過(guò)氧化氫活性的方法中，所述過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液、過(guò)氧化氫酶反應(yīng)終止液、顯色工作液均為過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒自帶試劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。具體來(lái)講，再一種所述重組人源腦紅蛋白的系列生物活性檢測(cè)方法，針對(duì)羥自由基的活性進(jìn)行檢測(cè)，用鄰二氮菲-Fe (II)比色法；所述鄰二氮菲-Fe (II)比色法可包括以下步驟1)待測(cè)樣品溶液準(zhǔn)備將待測(cè)rhNgb樣品配成0. 1，0. 5，lmg/ml的樣品溶液；2)四個(gè)離心管分別標(biāo)號(hào)f、0、χ、s，分別依次加入鄰二氮菲溶液，PBS, FeSO4溶液， f、0、s中加入雙蒸水，χ中加入等量的樣品溶液；再等量分別在f、x中加入H2O2，在0中加入雙蒸水，在s中加入樣品溶液；水浴后于536nm處測(cè)其吸光度，其值分別為Af、A0, Ax和As ；3)計(jì)算清除羥自由基活性按算式計(jì)算羥自由基清除率HRSA HRSA (% ) = [1-(As-Ax) / (A0-Af) ] X 100。以上三種檢測(cè)方法中，將10 μ g/ml的rhNgb清除超氧陰離子的比率>50%作為產(chǎn)品具有此清除活性的指標(biāo)；10 μ g的rhNgb清除過(guò)氧化氫的摩爾數(shù)> 5 μ mol為產(chǎn)品具有清除過(guò)氧化氫活性的指標(biāo)；100 μ g/ml的rhNgb清除羥自由基的比率> 10%作為產(chǎn)品具有該清除活性的指標(biāo)。對(duì)于被檢測(cè)的rhNgb產(chǎn)品，可以選用其中的任意一項(xiàng)作為檢測(cè)指標(biāo)，只要有一項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)達(dá)標(biāo)的產(chǎn)品即可認(rèn)為其具有清除自由基活性，作為合格產(chǎn)品，并可進(jìn)一步用于制備具有清除自由基功能的藥物的活性成分。上述重組人源腦紅蛋白的生物活性檢測(cè)方法在對(duì)rhNgb生物活性的跟蹤，rhNgb 生產(chǎn)制備、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程中rhNgb的活性確認(rèn)，含有rhNgb的生物制品的活性檢測(cè)，以及在建立rhNgb質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)檢體系中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。經(jīng)本發(fā)明的發(fā)明人證實(shí)，腦紅蛋白Ngb具有清除自由基功能，因而可以其為活性成份制備具有清除自由基功能的藥物。所述Ngb優(yōu)選為重組人源腦紅蛋白(rhNgb)。所述具有清除自由基功能的藥物包括治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的候選藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腦缺血/缺氧等引起機(jī)體自由基增加的相關(guān)疾病的藥物，還包括它們的醫(yī)藥產(chǎn)
P
ΡΠ O本發(fā)明用NBT光還原法、過(guò)氧化氫滅活酶法和鄰二氮菲-Fe(II)比色法等檢測(cè)技術(shù)證明rhNgb能夠清除自由基(包括但不限于超氧陰離子、過(guò)氧化氫、羥自由基等)，因而可以其為活性成份制備具有清除自由基功能的藥物，并以此建立了 rhNgb的生物活性的檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的活性檢測(cè)方法包括但不限于以rhNgb清除超氧陰離子、清除過(guò)氧化氫等能力作為檢測(cè)指標(biāo)。本發(fā)明的檢測(cè)方法穩(wěn)定，具有測(cè)定結(jié)果可靠、檢測(cè)數(shù)據(jù)重復(fù)性較高等優(yōu)點(diǎn)，測(cè)定的結(jié)果能較好地反映rhNgb蛋白的生物活性，并且在對(duì)rhNgb本身以及含有 rhNgb的生物制品的活性跟蹤方面具有廣泛用途，還可用于rhNgb生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量跟蹤， 對(duì)建立rhNgb質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)檢體系提供了保證，適合推廣和應(yīng)用。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為rhNgb清除超氧陰離子活性檢測(cè)結(jié)果圖2為rhNgb清除過(guò)氧化氫活性檢測(cè)結(jié)果圖3為rhNgb清除羥自由基活性檢測(cè)結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。本發(fā)明用下列實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步從清除自由基能力角度對(duì)rhNgb生物活性進(jìn)行檢測(cè)來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于實(shí)施例。實(shí)施例1 :rhNgb清除超氧陰離子活性檢測(cè)采用氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)-光還原法測(cè)定，該反應(yīng)中VBJP EDTA在光照下發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子，超氧陰離子與NBT發(fā)生反應(yīng)，在560nm處有最大吸收峰。在反應(yīng)中， VB2和EDTA在光照下發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生超氧陰離子，超氧陰離子與NBT發(fā)生反應(yīng)，加入rhNgb 后，rhNgb與超氧陰離子反應(yīng)，進(jìn)一步阻止了超氧陰離子與NBT的反應(yīng)，在560nm處吸收峰的值會(huì)發(fā)生變化。根據(jù)rhNgb與超氧陰離子反應(yīng)的程度可計(jì)算rhNgb清除超氧陰離子活性能力。實(shí)施例中清除超氧陰離子活性的測(cè)定方法分為試劑配制，樣品/對(duì)照品配制，測(cè)定樣品和對(duì)照品吸收度，計(jì)算清除超氧陰離子的活性四個(gè)步驟(1)試劑配制①39mM L-蛋氨酸(L-Met)、0. 225mM氯化硝基四氮唑蘭(NBT)、3mM乙二氨四乙酸二鈉(EDTA-Na2)的配制分別稱(chēng)取L_Met、NBT、EDTA-Na2 lOOmg，用雙蒸水溶解為39mM、 0. 225mM、3mM，避光保存，備用。②核黃素(VB2)的配制稱(chēng)取VB2 IOmg,用雙蒸水溶解為0. 12mM,避光保存，備用。③反應(yīng)混合液配制L-Met NBT EDTA-Na2按體積比2 2 1比例混合(避光操作)，反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用。④0. 05M 磷酸緩沖液(PBS)配制稱(chēng)取 NaCl 8g，KCl 0. 2g，Na2HPO4 1. 44g，KH2PO4 0. 24g，調(diào)pH值至7. 4，用雙蒸水定容至IOOOml，備用。(2)樣品和對(duì)照品的配制①rhNgb樣品溶液制備在已制備的rhNgb樣品基礎(chǔ)上，用雙蒸水將rhNgb配制成 0. 025,0. 05，0. 075,0. 1,0. 125mg/ml 不同濃度，4°C冰箱保存?zhèn)溆?。②?duì)照品維生素C(Vc)、還原型谷胱甘肽(GSH)、N_乙酰半胱氨酸(NAC)和血紅蛋白(Hb)溶液的制備同rhNgb制備，稱(chēng)取對(duì)照品10mg，用雙蒸水將其配制成lmg/ml，然后再將其分別稀釋為0. 025,0. 05，0. 075,0. 1,0. 125mg/ml，4°C冰箱保存?zhèn)溆谩?3)測(cè)定樣品和對(duì)照品吸收度向微量離心管(Eppendorf管)中依次加入反應(yīng)混合液0. 35ml和0. 12mM核黃素 (VB2)0. 1ml，然后向空白對(duì)照組中加入0. Iml雙蒸水，向樣品組中加入0. Iml的樣品溶液， 各組中加入0.45ml 0. 05 M PBS，最后各組中加入0. Iml VB2，立即將各組放于光照箱(日光燈，30W)，室溫下照光15min，立即遮光終止反應(yīng)，用美國(guó)Varian公司的Cary 50 UV-VIS 測(cè)定560nm處吸光度。以常見(jiàn)的抗氧化劑Vc、GSH、NAC和血紅蛋白(Hb)同濃度溶液作為對(duì)照。(4)計(jì)算清除超氧陰離子的活性清除超氧陰離子活性(superoxide anion scavenging activity, SAA)按下式計(jì)算SAA(% ) = [1-A/AJ X100。其中A為空白對(duì)照組吸光度，A0為樣品組或?qū)φ战M吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，rhNgb在測(cè)定濃度范圍內(nèi)對(duì)超氧陰離子有較強(qiáng)的清除能力，并且隨rhNgb濃度的增加，清除能力也明顯增加。分析發(fā)現(xiàn)，與Vc相比，rhNgb的清除能力相差不大，但比GSH和NAC強(qiáng)得多，比Hb強(qiáng)一些(圖1)。實(shí)施例2 :rhNgb清除過(guò)氧化氫活性檢測(cè)在過(guò)氧化氫相對(duì)充足的情況下，過(guò)氧化氫酶可催化過(guò)氧化氫產(chǎn)生水和氧氣。殘余的過(guò)氧化氫在過(guò)氧化物酶催化下可產(chǎn)生紅色的產(chǎn)物N-(4-安替比林基)-3_氯-5-磺酸基-對(duì)苯酉昆亞月安(N- (4-antipyryl) -3-chloro-5-sulfonate-p-benzoquinonemonoimine)， 其最大吸收波長(zhǎng)為520nm。rhNgb清除過(guò)氧化氫活性檢測(cè)使用碧云天生物技術(shù)研究所過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。1、試劑配制(l)rhNgb樣品溶液制備在已制備的rhNgb樣品基礎(chǔ)上，用雙蒸水將rhNgb配制成lmg/ml樣品溶液。(2)對(duì)照品維生素C(Vc)、還原型谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)和血紅蛋白(Hb)溶液的制備同rhNgb制備，稱(chēng)取對(duì)照品10mg，用雙蒸水將其配制成lmg/ml的對(duì)照品溶液。2、試劑盒檢測(cè)(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定①取0、12· 5、25、50或75 μ 1配制好的5mM過(guò)氧化氫溶液至1. 5ml或0. 5ml塑料離心管中，分別加入過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液至最后體積為100μ 1，混勻。②各取4μ 1，加入到塑料離心管內(nèi)，加入200μ 1顯色工作液。25°C至少孵育15分鐘(孵育時(shí)間不宜超過(guò)45分鐘)后測(cè)定A52tl(注本步驟可以和樣品測(cè)定步驟中的最后一步同時(shí)進(jìn)行)。③繪制過(guò)氧化氫濃度與A52tl的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線算式A52tl = k[過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)]+b計(jì)算出系數(shù)k和b的值(A52tl值與H2O2微摩爾數(shù)為對(duì)應(yīng)關(guān)系，0、12. 5、25、50μ 1的H202 (5mM)分別對(duì)應(yīng)固定的A52tl值)。(2)樣品測(cè)定①取10 μ 1樣品溶液加入到新的微量離心管(Eppendorf管)中，然后加入過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液至體積為20 μ 1，混勻；再加入10 μ 1 250mM過(guò)氧化氫溶液，用移液器迅速混勻，25 °C反應(yīng)1-5分鐘。②加入450 μ 1過(guò)氧化氫酶反應(yīng)終止液，顛倒混勻或渦旋(Vortex)混勻以終止反應(yīng)。需在終止反應(yīng)后15分鐘內(nèi)完成下面的步驟③和步驟④。③在一潔凈的塑料離心管內(nèi)加入40 μ 1過(guò)氧化氫酶檢測(cè)緩沖液，再加入10 μ 1已終止并混勻的上述反應(yīng)體系，混勻。④從上一步驟的50 μ 1體系中取10 μ 1加入到塑料離心管中，加入200 μ 1顯色工作液。⑤25°C至少孵育15分鐘(孵育時(shí)間不宜超過(guò)45分鐘)后，用美國(guó)Varian公司的 Cary50 UV-VIS 測(cè)定 A520。(3)、清除過(guò)氧化氫活性的計(jì)算在樣品測(cè)定中，可根據(jù)測(cè)定的A520數(shù)值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，得出反應(yīng)體系中剩余的H2A量即樣品的[過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)]，進(jìn)而得到實(shí)驗(yàn)體系中參加反應(yīng)的H2O2。①通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中殘余的H2A摩爾數(shù)。殘余H2A 微摩爾數(shù)=(A520-b) /k ；②清除H2O2摩爾數(shù)=空白對(duì)照殘余過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)-樣品殘余過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)。 按同樣方法進(jìn)行對(duì)照品的檢測(cè)與計(jì)算。實(shí)驗(yàn)結(jié)果參見(jiàn)圖2。顯示，rhNgb清除過(guò)氧化氫的活性較強(qiáng)，10 μ g/ml的樣品溶液清除過(guò)氧化氫> 7 μ M，與Vc等常規(guī)抗氧化劑比較，其清除能力更強(qiáng)(圖2)。實(shí)施例3 :rhNgb清除羥自由基活性的檢測(cè)采用鄰二氮菲-Fe2+比色法對(duì)rhNgb清除羥自由基的活性進(jìn)行測(cè)定。羥自由基通過(guò)芬頓(Fenton)反應(yīng)產(chǎn)生!^e2+和H2O2。1)用雙蒸水將rhNgb配制成0. 1,0. 5，lmg/ml不同濃度的樣品溶液，而血紅蛋白 (Hb)、Vc、還原型谷胱甘肽(GSH)、N-乙酰半胱氨酸(NAC)溶液的配制同rhNgb，4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?)向微量管(離心Eppendorf管)中依次加入0. 75mM的鄰二氮菲溶液100 μ 1， PBS (ρΗ7· 2) 200 μ 1,加入 0. 75mM 的 FeSO4 100 μ 1 和雙蒸水 50 μ 1，充分搖勻；3)加入0.01%的H2A 50μ 1，起始反應(yīng)，并置于37°C下水浴60min ；4)將混合液從水浴中取出后，于536nm處測(cè)其吸光度，其值稱(chēng)Af ；5)同1) -3)，用50 μ 1的雙蒸水代替50 μ 1的H2O2，測(cè)得的吸光度稱(chēng)A0 ；6)同1) -3)，用50 μ 1的rhNgb樣品溶液代替50 μ 1的雙蒸水，測(cè)得的吸光度稱(chēng) Ax ； 7)同1) -3)，將50 μ 1的rhNgb樣品溶液代替50 μ 1的H2O2，測(cè)得的吸光度稱(chēng)As ；8)清除羥自由基活性(hydroxyl radical scavenging activity, HRSA)計(jì)算方法為HRSA (% ) = [1-(As-Ax) / (A0-Af) ] X 100 ；按同樣方法進(jìn)行對(duì)照品的檢測(cè)與計(jì)算。結(jié)果如圖3所示，顯示在lmg/ml濃度下，rhNgb清除羥自由基的活性較強(qiáng)，高于 GSH和Hb，但與Vc和NAC相比較，其清除能力稍弱。實(shí)施例4 不同rhNgb產(chǎn)品的生物活性檢測(cè)1)樣品準(zhǔn)備
針對(duì)不同批次的rhNgb蛋白產(chǎn)品，用雙蒸水將rhNgb產(chǎn)品配制成lmg/ml的濃度， 后續(xù)根據(jù)需求進(jìn)行不同濃度的稀釋?zhuān)?)所需試劑及儀器試劑所用試劑參照實(shí)施例1-3所述進(jìn)行配制；儀器具有檢測(cè)使用波段的紫外分光光度計(jì)，如Cary 50UV-VIS ；3)檢測(cè)操作過(guò)程參照實(shí)施例1-3的具體操作步驟進(jìn)行測(cè)定。4)結(jié)果及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
權(quán)利要求
1.重組人源腦紅蛋白的生物活性檢測(cè)方法，包括以下步驟1)將待檢重組人源腦紅蛋白配制成設(shè)定濃度的樣品溶液；2)檢測(cè)樣品溶液清除自由基的能力；3)計(jì)算出檢測(cè)數(shù)據(jù)并與重組人源腦紅蛋白的生物活性標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)比較，得出檢測(cè)結(jié)果；其中所述清除自由基的能力包括但不限于以rhNgb對(duì)超氧陰離子清除率、rhNgb清除過(guò)氧化氫的量、和/或rhNgb對(duì)羥自由基的清除率作為檢測(cè)指標(biāo)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于針對(duì)rhNgb清除超氧陰離子活性進(jìn)行檢測(cè)，用NBT光還原法；所述NBT光還原法可包括以下步驟1)待測(cè)樣品溶液準(zhǔn)備將待測(cè)rhNgb樣品配成0.025 0. 125mg/ml的樣品溶液；2)顯色反應(yīng)向樣品溶液中加入反應(yīng)混合液、PBS和VB2,同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，其中加入與樣品溶液等量的雙蒸水；然后將待測(cè)樣品溶液和空白組溶液室溫下照光15min，立即遮光終止反應(yīng)；所述反應(yīng)混合液為L(zhǎng)-Met NBT EDTA-Nei2按體積比2 2 1比例混合的混合液；3)測(cè)定吸收度分別對(duì)待測(cè)樣品溶液和空白組溶液測(cè)定560nm處吸光度，得到待測(cè)樣品溶液吸光度值A(chǔ)tl，空白組溶液吸光度值A(chǔ) ；4)計(jì)算清除超氧陰離子的活性按下式計(jì)算超氧陰離子清除率SAA(% ) = [1-A/AJ X100，計(jì)算得到的百分?jǐn)?shù)即為待測(cè)樣品清除超氧陰離子活性數(shù)值。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述rhNgb清除超氧陰離子比率> 50%為重組人源腦紅蛋白具有清除超氧陰離子活性的標(biāo)準(zhǔn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于針對(duì)rhNgb清除過(guò)氧化氫活性進(jìn)行檢測(cè)，用過(guò)氧化氫滅活酶檢測(cè)法；所述過(guò)氧化氫滅活酶檢測(cè)法可包括以下步驟1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線按照過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒方法制作過(guò)氧化氫濃度與吸光度A5^1的標(biāo)準(zhǔn)曲線；由標(biāo)準(zhǔn)曲線算式A52tl = k[過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)]+b計(jì)算出系數(shù)k和b的值；2)將待測(cè)rhNgb樣品配成lmg/ml的樣品溶液；3)按照過(guò)氧化氫酶檢測(cè)試劑盒方法，測(cè)定樣品溶液的吸光度A52tl的數(shù)值，并代回標(biāo)準(zhǔn)曲線算式計(jì)算樣品溶液中的殘余過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)殘余H2A微摩爾數(shù)=(A520-b) /k ；4)利用以下算式計(jì)算得出待測(cè)rhNgb樣品清除H2A的摩爾數(shù)清除H2O2摩爾數(shù)=空白對(duì)照殘余過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)-樣品殘余過(guò)氧化氫微摩爾數(shù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述rhNgb清除過(guò)氧化氫的量> 5 μ mol為重組人源腦紅蛋白具有清除過(guò)氧化氫活性的標(biāo)準(zhǔn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于針對(duì)羥自由基的活性進(jìn)行檢測(cè)，用鄰二氮菲-Fe(II)比色法；所述鄰二氮菲-Fe (II)比色法可包括以下步驟1)待測(cè)樣品溶液準(zhǔn)備將待測(cè)rhNgb樣品配成0.1,0. 5，lmg/ml的樣品溶液；2)四個(gè)試管分別標(biāo)號(hào)f、0、χ、s，分別依次加入鄰二氮菲溶液，PBS,FeSO4溶液，f、0、s 中加入雙蒸水，χ中加入等量的樣品溶液；再等量分別在f、χ中加入H2O2，在0中加入雙蒸水，在s中加入樣品溶液；水浴后于536nm處測(cè)其吸光度，其值分別為Af、A0, Ax和As ；3)計(jì)算清除羥自由基活性按算式計(jì)算羥自由基清除率HRSA HRSA (% ) = [1-(As-Ax) / (A0-Af) ] XlOO0
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，其特征在于所述rhNgb羥自由基清除率>10% 為重組人源腦紅蛋白具有清除羥自由基活性的標(biāo)準(zhǔn)。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述方法在對(duì)rhNgb生物活性的跟蹤，rhNgb生產(chǎn)制備、儲(chǔ)存、 運(yùn)輸過(guò)程中rhNgb的活性確認(rèn)，含有rhNgb的生物制品的活性檢測(cè)中的應(yīng)用。
9.腦紅蛋白Ngb在制備具有清除自由基功能藥物中的應(yīng)用；所述Ngb為重組人源腦紅蛋白rhNgb。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述具有清除自由基功能的藥物包括治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的候選藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的藥物，治療氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腦缺血/缺氧等引起機(jī)體自由基增加的相關(guān)疾病的藥物，還包括它們的醫(yī)藥產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種重組人源腦紅蛋白的生物活性檢測(cè)方法及其用途，該檢測(cè)方法包括1)將待檢重組人源腦紅蛋白配制成設(shè)定濃度的樣品溶液；2)檢測(cè)樣品溶液清除自由基的能力，以rhNgb對(duì)超氧陰離子清除率、rhNgb清除過(guò)氧化氫的量、和/或rhNgb對(duì)羥自由基的清除率作為檢測(cè)指標(biāo)；3)計(jì)算出檢測(cè)數(shù)據(jù)并與重組人源腦紅蛋白的生物活性標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)比較，得出檢測(cè)結(jié)果。本發(fā)明還提出腦紅蛋白Ngb在制備具有清除自由基功能藥物中的應(yīng)用，為新藥研發(fā)提供了思路。本發(fā)明的檢測(cè)方法穩(wěn)定，具有測(cè)定結(jié)果可靠、檢測(cè)數(shù)據(jù)重復(fù)性較高等優(yōu)點(diǎn)，測(cè)定的結(jié)果能較好地反映rhNgb蛋白的生物活性，并且在對(duì)rhNgb本身以及含有rhNgb的生物制品的活性跟蹤方面具有廣泛用途。
文檔編號(hào)A61P25/00GK102175682SQ20111005396
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月8日
發(fā)明者吳永紅, 張成崗, 李偉光, 高艷 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所