專利名稱：含有重組人血清白蛋白-人粒細胞集落刺激因子融合蛋白的藥物制劑及其制備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種含重組人血清白蛋白-人粒細胞集落刺激因子融合蛋白(以下簡稱rHSA/G-CSF)的藥物制劑及其制備。
背景技術(shù)：
人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，是ー種來源于單核細胞和纖維組織母細胞的長鏈多肽糖蛋白，可誘導(dǎo)造血干細胞的增值和分化，促進血液中的中性粒細胞數(shù)増加；另外還具有刺激成熟中性粒細胞從骨髓中釋放出并激活中性粒細胞的功能。但是，天然或重組的G-CSF由于分子量較小，極易被腎小球過濾，在人體 內(nèi)的循環(huán)半衰期很短，只有2-4小時，每個化療周期需要每天注射1-2次，持續(xù)注射5-7天(Welte K等，Proc Nat Acad Sci USA，82 :1526-1530，1985 ;Frampton JE 等，Drugs，48 :731-760，1994)。延長G-CSF制劑體內(nèi)半衰期可以減少給藥次數(shù)。
人血清白蛋白(HSA)是血液循環(huán)中的ー個非常重要的天然蛋白，在體液循環(huán)中可存在20天以上。研究表明將治療性蛋白基因與人血清白蛋白基因融合所表達的融合蛋白可明顯降低體內(nèi)藥物的清除速率，延長生物半衰期。據(jù)此，本發(fā)明通過基因工程方法將人白蛋白與G-CSF融合表達獲得的rHSA/G-CSF，提高G-CSF在體內(nèi)的半衰期(Wendy Halpern等，PharmRes，19 :1720-1729，2002);該融合蛋白結(jié)構(gòu)中，人血清白蛋白位于N端，C末端可以直接與人粒細胞集落刺激因子的N端相連，也可以通過柔性的連接肽序列使兩個蛋白相連。本發(fā)明所涉及的rHSA/G-CSF的制備方法有許多文獻報道(Pharm Res. 19 1720-1729. 2002 ；Pichia Expression Kit A Manual of Methods for Expressionof RecombinantProteins in Pichia pastoris ；Catalog NO :K1710_01，InvitrogenCorporation. ;G_CSF融合蛋白突變體及其制備與應(yīng)用(中國專利申請?zhí)?00910199337. 9)等)，通過將人血清白蛋白的基因與人粒細胞集落刺激因子基因融合在一起，選擇合適重組表達方法即可獲得相應(yīng)的融合蛋白。融合后形成的重組人血清白蛋白-人粒細胞集落刺激因子融合蛋白克服了傳統(tǒng)的人粒細胞集落刺激因子治療過程中多次給藥的缺點；并具有以下幾個優(yōu)點1)延長人粒細胞集落刺激因子在體內(nèi)的存留時間；2)起最大的治療作用、減小傳統(tǒng)人粒細胞集落刺激因子的潛在副作用或毒性、還可提高療效。但是，作為蛋白藥物，rHSA/G-CSF其穩(wěn)定性還是無法與常規(guī)化學藥物相比，其活性在長期貯存時還是會受到多種環(huán)境因素的影響。例如對溫度和氧高度敏感。由于這些因素的作用，可能發(fā)生多種物理或化學變化，例如變性，降解，聚合或氧化等從而影響藥物均一性和活性，最終影響藥物療效，并帶來副作用。因此，研究出ー種能穩(wěn)定保存rHSA/G-CSF蛋白，并適合于實際臨床使用的藥物制劑是極其有意義的。但是，到目前為止，尚未有這方面的研究報道。本發(fā)明涉及的就是此方面內(nèi)容。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供ー種穩(wěn)定性良好的含重組人血清白蛋白-人粒細胞集落刺激因子融合蛋白(以下簡稱rHSA/G-CSF)的藥物制劑。本發(fā)明為了提高含有rHSA/G-CSF藥劑的穩(wěn)定性，選擇了凍干制品為制劑形式，并進行了深入的研究。從合適的輔料(如糖類，氨基酸及其衍生物、表面活性劑等)和無機鹽類中挑選至少ー種加入制劑中，并選擇合適的PH，可以有效達到這個目的。在rHSA/G-CSF藥劑穩(wěn)定性研究過程中，選取了外觀觀察，SDS-PAGE, SEC-HPLC高效液相色譜分析，生物活性檢測等作為考察指標，來觀察rHSA/G-CSF藥劑的變化情況。這些方法均可從《中國藥典，2005年版》獲得。本發(fā)明提供了ー種含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，為凍干制 劑，每支制劑中包括下列組分rHSA/G-CSF 蛋白l_30mg藥學上可接受的水溶性賦形劑IO-SOmg藥學上可接受的保護劑5_30mgpH 值調(diào)節(jié)劑5-50 μ mo I凍干制劑在臨用前用I. Oml注射用水溶解。 在rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑中添加合適的賦形劑和保護劑，可以顯著改善制品的穩(wěn)定性，同時也可使制劑處于合適的滲透壓，方便使用。所述的藥學上可接受的賦形劑可選自甘露醇、甘氨酸、PEG、海藻糖、山梨醇、蔗糖、木糖醇、乳糖、葡萄糖和果糖等，可以單獨添加，也可以聯(lián)合使用。優(yōu)選的為甘露醇，優(yōu)選的用量為10-80mg/支。所述的藥學上可接受的保護劑是可選自氨基酸、糖、金屬螯合劑、表面活性劑、白蛋白等。優(yōu)選的為氨基酸，氨基酸類保護劑可選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、色氨酸、賴氨酸、羥賴氨酸、組氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸等以及它們的衍生物。優(yōu)選的為精氨酸。所述保護劑的使用量是本領(lǐng)域常規(guī)的用量，優(yōu)選的用量為5-30mg/支。所述pH調(diào)節(jié)劑可以是至少ー種藥學上可接受用于調(diào)節(jié)pH值的常規(guī)或已知物質(zhì)?？梢允菈A性化合物或緩沖系統(tǒng)。所述的藥學上可接受的堿性化學物可以是通常在藥學上可接受的用于調(diào)節(jié)溶液PH值的堿性化合物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸三鈉、磷酸三鉀等。所述的緩沖系統(tǒng)可以是常用或已知的在藥學上可接受的用于調(diào)節(jié)溶液PH值的緩沖系統(tǒng)，優(yōu)選的為磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、巴比妥鹽、三羥甲基氨基甲烷、硼酸鹽、琥珀酸鹽等，更優(yōu)選的為磷酸鹽緩沖系統(tǒng)。所述緩沖體系溶液的PH范圍優(yōu)選為6. 0-7. 0，最優(yōu)的為6. 5。優(yōu)選的，本發(fā)明的含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，其每支凍干制劑中包括下列組分rHSA/G-CSF 蛋白l-30mg,最優(yōu)選為 5mg甘露醇10_80mg,最優(yōu)選30mg
精氨酸5_30mg,最優(yōu)選IOmg磷酸鹽5-50 μ mol,最優(yōu)選 10 μ mol
臨用前用I. Oml注射用水溶解。所述精氨酸為L-鹽酸精氨酸。進ー步的，前述各凍干制劑用I. Oml注射用水溶解后的滲透壓為250-400m0sm，pH為6. 0-7.0，最優(yōu)的pH為6. 5。 發(fā)明所述rHSA/G-CSF蛋白中，人血清白蛋白位于N端，C末端可以直接與人粒細胞集落刺激因子的N端相連，也可以通過柔性的連接肽序列使兩個蛋白相連，rHSA/G-CSF蛋白及其制備方法均為現(xiàn)有技術(shù)。在本發(fā)明藥物組合的基礎(chǔ)上改變其中組分的含量或加入其它物質(zhì)，但對提高rHSA/G-CSF穩(wěn)定性沒有顯著改變，仍被視為本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑可經(jīng)過下列方法制備獲得I)按配比將rHSA/G-CSF蛋白、藥學上可接受的水溶性賦形劑、藥學上可接受的保護劑及pH值調(diào)節(jié)劑與注射用水混勻并調(diào)節(jié)pH值至6. 0-7. O ；2)凍干制得凍干制劑。所述步驟2)具體為將步驟I配制好的藥液除菌過濾分裝于適宜大小的西林瓶中待凍干機板層溫度預(yù)先冷凍到-10°C以下，待凍干西林瓶樣品放入凍干箱，在-35°C以下保溫2小吋，開始抽真空，真空度低于SOPa后，升板層溫度到-15°C，維持真空度小于80Pa，當可見水線消失后開始升溫，最后升制品溫度到30°C并保持3 5小吋。所述凍干機板層溫度預(yù)先冷凍到-10°C以下，使待凍干制品進凍干箱后溫度迅速降低，形成細小的無定型狀態(tài)，易于水分的去除和減少對活性大分子結(jié)構(gòu)的破壞。所述升板層溫度到_15°C，維持真空度小于80Pa，可確保凍干制品外觀飽滿，顆粒細膩，同時縮短凍干周期，減少生產(chǎn)能耗。本發(fā)明的含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑溶解于注射用水后適用于皮下或靜脈等途徑給藥，通過注射適合劑量的此藥物制劑可治療中性粒細胞減少癥。

本發(fā)明考察了賦形劑、穩(wěn)定劑、pH、制備エ藝等因素對rHSA/G-CSF蛋白制品穩(wěn)定性的影響，篩選出了一個能保證制品在保存與運輸過程中性質(zhì)穩(wěn)定，便于臨床使用而又可以被人體所接受的制劑處方和エ藝。


圖I rHSA/G-CSF 于 ρΗ4· 5-8. O 37°C ニ周 SDS-PAGE 檢測圖
圖 2rHSA/G-CSF 于 ρΗ4· 5-8.0 37°C 四周 SDS-PAGE 檢測3rHSA/G-CSF 于 ρΗ6· 0-7. O 37°C ニ周 SDS-PAGE 檢測4rHSA/G-CSF 于 ρΗ6· 0-7. O 37°C 四周 SDS-PAGE 檢測圖
具體實施例方式為了進ー步闡明本發(fā)明，提供了下列例子，這些例子僅僅是為了進ー步說明本發(fā)明，并不意味著作為ー種限制。實施例I pH值對于rHSA/G-CSF制劑穩(wěn)定性的影響rHSA/G-CSF 參考 Halpern W 等所述(Pharm Re s. 19 :1720-1729. 2002)，將 HSA 與G-CSF基因融合后，構(gòu)建于表達質(zhì)粒pPIC9，并在畢赤氏酵母GS115(INVITR0GEN公司)中表
達獲得。本發(fā)明首先研究了 pH對rHSA/G-CSF穩(wěn)定性的影響。為了考察不同pH條件下制劑的穩(wěn)定性，按如下條件進行了不同pH對制劑穩(wěn)定性的影響實驗試驗1，rHSA/G-CSF蛋白含量為5. Omg，各組中含有不同pH的一定濃度的醋酸鹽或磷酸鹽緩沖液，PH4. 5到pH8. O,間隔O. 5，共設(shè)8個點。于37°C加速考察四周，每隔兩周取樣分析，檢測方法SDS-PAGE，10%分離膠，非還原。試驗表明，蛋白在酸性(pH4. 5-pH5. 5)和偏堿性條件(pH7. 5_pH8. O)經(jīng)4周時間會發(fā)生降解或結(jié)構(gòu)改變，而在pH6. 0-pH7. O范圍之間，相對較少，結(jié)果參見圖I和圖2。試驗2,縮小篩選范圍，選用磷酸緩沖液，設(shè)置pH如下①pH = 6. O ②pH =6. 2③pH = 6. 4④pH = 6. 5⑤pH = 6. 6⑥pH = 6. 8⑦pH = 7. O,取樣和檢測方法同試驗I。試驗表明，在pH6. 0-pH7. O范圍內(nèi)，蛋白降解情況差異不大，優(yōu)選pH6. 5，結(jié)果參見圖3和圖4。實施例2輔料對穩(wěn)定性的影響試驗本發(fā)明篩選了ー些適合于人體應(yīng)用的輔料如甘露醇、海藻糖、PEG4000、甘油、甘氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸和組氨酸等賦形劑和保護劑，研究其對rHSA/G-CSF穩(wěn)定性的影響。將輔料配制成高濃度的儲液，與pH6. 5的磷酸緩沖液高濃度儲液混合，然后加入含ρΗ6· 5的磷酸緩沖的高濃度rHSA/G-CSF蛋白溶液，再用lmol/L HCl或lmol/L NaOH調(diào)節(jié)PH值，以獲得一定體積含lOmmol/L pH6. 5的磷酸緩沖液，蛋白濃度為5. 0mg/ml的樣品溶液。樣品溶液過濾除菌后分裝于無菌西林瓶，裝量為I. 0ml，半加塞，凍干。將凍干的制品進行外觀檢查，并用SEC-HPLC分析凍干過程蛋白聚體的形成。結(jié)果表明，甘露醇和甘氨酸單獨作為賦形劑的制品外觀飽滿、顆粒細膩、水溶性都好，但經(jīng)SEC-HPLC檢測純度，發(fā)現(xiàn)聚體含量明顯增加，且甘氨酸做為輔料表面易結(jié)皮；海藻糖做為輔料凍干前后蛋白聚體含量増加不明顯，且凍干品顆粒細膩、水溶性好，但外觀稍有萎縮；PEG4000做為輔料蛋白的聚體含量増加不明顯，但部分產(chǎn)品會結(jié)塊開裂；組氨酸和精氨酸做為輔料凍干前后蛋白聚體含量増加也不明顯，但成型性很差，凍干后制品萎縮；其它如蛋氨酸、苯丙氨酸為輔料的制劑水溶性差。根據(jù)上述結(jié)果，最終選擇了海藻糖、甘露醇、精氨酸和組氨酸4種輔料進行進一歩篩選，并在25°C加速條件下連續(xù)觀察16周，考察其外觀、水溶性，純度和蛋白活性(效價保存率)。表I.幾種輔料不同組合制劑保存于25°C條件下檢測結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，為凍干制劑，每支制劑中包括下列組分 rHSA/G-CSF 蛋白l_30mg 藥學上可接受的水溶性賦形劑IO-SOmg 藥學上可接受的保護劑5-30mg pH值調(diào)節(jié)劑5-50 μ mol。
2.如權(quán)利要求I所述含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，其特征在于，所述的藥學上可接受的賦形劑選自甘露醇、甘氨酸、PEG、海藻糖、山梨醇、蔗糖、木糖醇、乳糖、葡萄糖和果糖中的ー種或多種；所述的藥學上可接受的保護劑選自氨基酸、糖、金屬螯合劑、表面活性劑和白蛋白；所述PH值調(diào)節(jié)劑為堿性化合物或緩沖系統(tǒng)。
3.如權(quán)利要求2所述含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，其特征在于，所述氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、色氨酸、賴氨酸、羥賴氨酸、組氨酸、精氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸和異亮氨酸以及它們的衍生物。
4.如權(quán)利要求2所述含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，其特征在于，所述堿性化學物選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、磷酸三鈉和磷酸三鉀，所述緩沖系統(tǒng)選自磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、巴比妥鹽、三羥甲基氨基甲烷、硼酸鹽和琥珀酸鹽緩沖體系，所述緩沖體系的pH范圍為6.0_7· O ο
5.如權(quán)利要求I所述含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，其特征在于，每支凍干制劑中包括下列組分 rHSA/G-CSF 蛋白l_30mg 甘露醇10_80mg 精氨酸5-30mg 磷酸鹽5-50 μ mol。
6.如權(quán)利要求5所述含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，其特征在于，其特征在于，每支凍干制劑中包括下列組分 rHSA/G-CSF 蛋白5mg 甘露醇30mg 精氨酸IOmg 磷酸鹽10 μ mol。
7.如權(quán)利要求5所述含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，其特征在于，所述精氨酸為L-鹽酸精氨酸。
8.如權(quán)利要求1-7任一所述含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，其特征在于，所述各凍干制劑用I. Oml注射用水溶解后的滲透壓為250-400m0sm，pH為6. 0-7. O。
9.如權(quán)利要求1-8任一所述含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑的制備方法，包括下列步驟 1)按配比將rHSA/G-CSF蛋白、藥學上可接受的水溶性賦形劑、藥學上可接受的保護劑及PH值調(diào)節(jié)劑與注射用水混勻并調(diào)節(jié)pH值至6. 0-7. O獲得藥液； 2)藥液凍干制得凍干制劑。
10.如權(quán)利要求9所述含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑的制備方法，其特征在于，所述步驟2)具體為將步驟I)配制好的藥液除菌過濾分裝于西林瓶中待凍干機板層溫度預(yù)先冷凍到-10°c以下，將待凍干西林瓶樣品放入凍干箱，在-35°C以下保溫2小吋，開始抽真空，真空度低于80Pa后，升板層溫度到-15°C，維持真空度小于80Pa，當可見水線消失后開始升 溫，最后升制品溫度到30 C并保持3 5小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有重組人血清白蛋白-人粒細胞集落刺激因子融合蛋白的藥物制劑及其制備。本發(fā)明的含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑，為凍干制劑，每支制劑中包括下列組分rHSA/G-CSF蛋白1-30mg；藥學上可接受的水溶性賦形劑10-80mg；藥學上可接受的保護劑5-30mg；pH值調(diào)節(jié)劑5-50μmol。本發(fā)明的含rHSA/G-CSF蛋白的藥物制劑溶解于注射用水后適用于皮下或靜脈等途徑給藥，通過注射適合劑量的此藥物制劑可治療中性粒細胞減少癥。
文檔編號A61K9/19GK102670522SQ20111006318
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月16日
發(fā)明者吳亦亮, 李虎, 王葉飛, 范敏, 陸游 申請人:江蘇泰康生物醫(yī)藥有限公司, 泰州貝今生物技術(shù)有限公司