專利名稱：一種中藥組合物在制備抗心肌細胞凋亡和/或抗心肌細胞凋亡相關疾病的藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及中藥領域，具體涉及一種中藥組合物在制備抗心肌細胞凋亡和/或抗心肌細胞凋亡相關疾病的藥物中的應用。
背景技術：
通脈養(yǎng)心丸是一種治療缺血性心臟病的中成藥，由生脈散與炎甘草湯加減而成，具有養(yǎng)心補血，通脈止痛的功效。通脈養(yǎng)心丸針對胸痹本虛標實的病理狀態(tài)重用生地黃滋陰養(yǎng)血為君，《名醫(yī)別錄》謂地黃“補五臟內傷不足，通血脈，益氣力”。方中炙甘草、黨參、大棗益氣，健脾；生地黃、阿膠、麥冬甘潤滋補心陰心血；桂枝、雞血藤溫通血脈，與益氣養(yǎng)陰 藥相配，亦可使氣血流通，脈道通利。諸藥相合可達陰血足而血脈充，陽氣復而心脈通，氣血充沛，血脈暢通則悸可定，脈可復。現(xiàn)代藥理學研究證實，地黃水提液具有降壓、抗炎等作用；其浸膏具有強心、利尿等作用。黨參具有抗氧化作用。麥冬、桂枝具有改善心肌收縮力的作用。雞血藤具有抗動脈粥樣硬化等藥理作用。臨床應用過程中顯示出了較強的心肌保護作用，但其作用機制研究尚不完善。研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡是心肌缺血過程中心肌組織壞死的機制之一。細胞凋亡信號的異常表達使心肌細胞數(shù)量不可逆地減少，引起心臟疾病發(fā)生或在原有疾病的基礎上導致病情加劇。細胞凋亡程序一旦啟動，使得相當一些原本可修復的心肌細胞也走向死亡過程，造成有功能的心肌細胞數(shù)目和功能下降、加重了心肌缺血損傷。其發(fā)生凋亡的機制可能與長時間缺氧產生細胞內鈣超載有關。鈣離子作為多種死亡信號轉導的第二信使與細胞線粒體凋亡有著錯綜復雜的關系，心肌缺血發(fā)生時，大量鈣離子內流，同時鈣離子的排出受到抑制，導致心肌細胞鈣超載。此時，線粒體可釋放CytC，CytC與脫氧腺普三磷酸相互作用，并與Apaf-I結合,激活白細胞介素-1,3轉化酶(Caspase-9),被激活的Caspase_9又激活Caspase-3，促使細胞發(fā)生凋亡。化學缺氧(疊氮化物)觸發(fā)的新生大鼠心肌細胞凋亡受鈣調節(jié)的蛋白酶調制，阻斷細胞外鈣流入或細胞內鈣釋放都可有效地抑制心肌細胞凋亡。

發(fā)明內容
本發(fā)明目的在于提供一種抗心肌細胞凋亡和/或抗心肌細胞凋亡相關疾病的藥物中的應用。本發(fā)明所述心肌細胞凋亡相關疾病包括，但不限于冠心病，心絞痛以及其它由于心肌細胞缺氧引起的心臟疾病。本發(fā)明所述的抗心肌細胞凋亡和/或抗心肌細胞凋亡相關疾病的應用，其中所述中藥組合物抗心肌細胞凋亡和/或抗心肌細胞凋亡相關疾病的作用是通過抑制心肌細胞鈣超載實現(xiàn)的。本發(fā)明所述的中藥組合物是由按照下述重量配比的中藥材制備而成地黃I 10份，雞血藤I 10份，麥冬I 7份，甘草I 7份，制何首烏I 7份，阿膠I 7份,五味子I 7份,黨參I 7份,龜甲I 5份,大率I 5份,桂枝O. I 2份。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的中藥組合物是由按照下述重量配比的中藥材制備而成地黃3 8份，雞血藤3 8份，麥冬2 5份，甘草2 5份，制何首烏2 5份，阿膠2 5份,五味子2 5份,黨參2 5份,龜甲I 3份,大率I 3份,桂枝O. 5 I. 5 份。最優(yōu)選地，本發(fā)明中藥組合物是按照下述重量配比的中藥材制備而成地黃5份，雞血藤5份，麥冬3份，甘草3份，制何首烏3份，阿膠3份，五味子3份，黨參3份，龜甲2份，大棗2份，桂枝I份。其中，為了達到更好的治療效果，所述的龜甲為醋制龜甲。因此，本發(fā)明的中藥組合物是由按照下述重量配比的中藥材制備而成 地黃I 10份，雞血藤I 10份，麥冬I 7份，甘草I 7份，制何首烏I 7份，阿膠I 7份，五味子I 7份，黨參I 7份，龜甲(醋制)I 5份，大棗I 5份，桂枝O. I 2份。優(yōu)選地，本發(fā)明的中藥組合物是由按照下述重量配比的中藥材制備而成地黃3 8份，雞血藤3 8份，麥冬2 5份，甘草2 5份，制何首烏2 5份，阿膠2 5份，五味子2 5份，黨參2 5份，龜甲(醋制)I 3份，大棗I 3份，桂枝O. 5 I. 5 份。最優(yōu)選地，本發(fā)明中藥組合物是由按照下述重量配比的中藥材制備而成地黃5份，雞血藤5份，麥冬3份，甘草3份，制何首烏3份，阿膠3份，五味子3份，黨參3份，龜甲(醋制)2份，大棗2份，桂枝I份。前述中藥組合物可以按照現(xiàn)有技術中任一常規(guī)的方法加工，得到的提取物皆具有抗心肌細胞缺氧損傷的作用。為了便于理解，現(xiàn)舉例如下，但對于本發(fā)明保護范圍不構成影響。方法一、本發(fā)明中藥組合物按照下述方法制備而成，包括步驟I、按照上述重量配比取11味藥材；步驟2、取龜甲加水煎煮后，加入雞血藤、黨參、大棗繼續(xù)煎煮，濾過，濾液濃縮后，加入乙醇進行沉淀，取適量上清液，加入阿膠后加熱使溶解，并入上述乙醇溶液中，混勻，靜置，濾過，濾液備用；步驟3、其余6味藥材，加入乙醇浸潰后，滲漉，收集滲濾液與步驟2中得到的提取液合并，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇，得到終產品。其中，在步驟2中，所述龜甲加水煎煮2小時后加入雞血藤等藥材；加入雞血藤、黨參和大棗等藥材后繼續(xù)煎煮2次，第一次4小時，第二次2小時；所述濾液濃縮至相對密度為I. 05 I. 15 (500C );加入80%乙醇進行沉淀，使乙醇含量達到60%;取適量上清液(以能夠完全溶解阿膠藥材為限)；靜置24小時。步驟3中，采用80%的乙醇浸潰48小時；靜置24小時。優(yōu)選地，本發(fā)明中藥組合物按照下述方法制備而成包括步驟I、按照上述重量配比取11味藥材；步驟2、取龜甲加水煎煮2小時后，加入雞血藤、黨參、大棗繼續(xù)煎煮2次，第一次4小時，第二次2小時，濾過，濾液濃縮至相對密度為1.05 I. 15 (500C )后，加入80%乙醇進行沉淀使含醇量達到60%，取適量上清液，加入阿膠后加熱使溶解,并入上述乙醇溶液中，混勻，靜置24小時，濾過，濾液備用；步驟3、其余6味藥材，加入80%乙醇浸潰48小時后，滲漉，收集滲濾液與步驟2中得到的提取液合并，靜置24小時，濾過，濾液減壓回收乙醇，得到終產品。方法二、本發(fā)明中藥組合物按照下述方法制備而成，包括步驟I、按照上述重量配比取11味藥材；步驟2、雞血藤、黨參、五味子、大棗、龜甲加水煎煮，合并濾液，濾過，濃縮成稠膏；步驟3、其余藥材6味藥分碎成細粉，加入步驟I得到的稠膏，均勻，干燥，分碎成細粉，得到終產品。其中，步驟2中，藥材煎煮2次，每次3小時。 優(yōu)選地，本發(fā)明中藥組合物按照下述方法制備而成包括步驟I、按照上述重量配比取11味藥材；步驟2、雞血藤、黨參、五味子、大棗、龜甲加水煎煮2次，每次3小時，合并濾液，濾過，濃縮成稠膏；步驟3、其余藥材6味藥分碎成細粉,加入步驟I得到的稠膏，均勻，干燥，分碎成細粉，得到終產品。本發(fā)明所述的中藥組合物，根據需要可以含有藥物可接受的載體，其中所述的化合物作為藥物活性成分，其在制劑中所占重量百分比可以是O. 01-99. 99%，其余為藥物可接受的載體。本發(fā)明的中藥組合物，以單位劑量形式存在，所述單位劑量形式是指制劑的單位，如片劑的每片，膠囊的每粒膠囊，口服液的每瓶，顆粒劑每袋，注射劑的每支等。本發(fā)明所述的中藥組合物可以是任何可藥用的劑型，這些劑型包括滴丸劑、片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、注射劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。本發(fā)明所述的中藥組合物，其口服給藥的制劑可含有常用的賦形劑，諸如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、調味劑和濕潤劑，必要時可對片劑進行包衣。適用的填充劑包括纖維素、甘露糖醇、乳糖和其它類似的填充劑。適宜的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物，例如羥基乙酸淀粉鈉。適宜的潤滑劑包括，例如硬脂酸鎂。適宜的藥物可接受的濕潤劑包括十二烷基硫酸鈉。可通過混合，填充，壓片等常用的方法制備固體口服組合物。進行反復混合可使活性物質分布在整個使用大量填充劑的那些組合物中?？诜后w制劑的形式例如可以是水性或油性懸浮液、溶液、乳齊U、糖漿劑或酏劑，或者可以是一種在使用前可用水或其它適宜的載體復配的干燥產品。這種液體制劑可含有常規(guī)的添加劑，諸如懸浮劑，例如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂肪，乳化劑，例如卵磷脂、脫水山梨醇一油酸酯或阿拉伯膠；非水性載體(它們可以包括食用油)，例如杏仁油、分餾椰子油、諸如甘油的酯的油性酯、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酯或對羥基苯甲酸丙酯或山梨酸，并且如果需要，可含有常規(guī)的香味劑或著色劑。對于注射劑，制備的液體單位劑型含有本發(fā)明的活性物質和無菌載體。根據載體和濃度，可以將此化合物懸浮或者溶解。溶液的制備通常是通過將活性物質溶解在一種載體中，在將其裝入一種適宜的小瓶或安瓿前過濾消毒，然后密封。輔料例如一種局部麻醉劑、防腐劑和緩沖劑也可以溶解在這種載體中。為了提高其穩(wěn)定性，可在裝入小瓶以后將這種組合物冰凍，并在真空下將水除去。本發(fā)明所述的中藥組合物，在制備成藥劑時可選擇性的加入適合的藥物可接受的載體，所述藥物可接受的載體選自甘露醇、山梨醇、焦亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、硫代硫酸鈉、鹽酸半胱氨酸、巰基乙酸、蛋氨酸、維生素C、EDTA 二鈉、EDTA鈣鈉，一價堿金屬的碳酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽或其水溶液、鹽酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化鈉、氯化鉀、乳酸鈉、木糖醇、麥芽糖、葡萄糖、果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纖維素及其衍生物、藻酸鹽、明膠、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、土溫80、瓊脂、碳酸鈣、碳酸氫鈣、表面活性劑、聚乙二醇、環(huán)糊精、β -環(huán)糊精、磷脂類材料、高嶺土、滑石粉、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等。本發(fā)明的中藥組合物在使用時可以根據病人的情況確定用法用量，本領域的普通技術人員可以很容易地確定?，F(xiàn)代藥理學實驗表明，本發(fā)明中藥組合物通過抗心肌細胞凋亡起到保護心肌的作用，其作用機制是抑制心肌細胞鈣超載。本發(fā)明的藥物組合物均可通過抑制心肌細胞鈣超載這種機制達到抗心肌細胞凋亡從而起到保護心肌的作用。以下僅以所述藥物組合物的最優(yōu)選實施方式為例，驗證本發(fā)明的藥物組合物的抗心肌細胞凋亡作用。試驗例本發(fā)明的中藥組合物(下稱“通脈養(yǎng)心丸”)對心肌細胞凋亡的影響
主要采用大鼠心肌細胞原代培養(yǎng)的方法獲得實驗用正常心肌細胞并建立缺氧損傷細胞模型，從抑制心肌細胞鈣超載的角度探討本發(fā)明的藥物組合物通脈養(yǎng)心丸抗細胞凋亡保護心肌的作用機理，為臨床應用提供科學依據。I實驗材料I. I實驗動物Wistar大鼠，50只，體重300±20g，雄性，購于中國醫(yī)學科學院協(xié)和動物研究所。Wistar大鼠，20只，1_3日齡，雌雄不拘，購于中國醫(yī)學科學院放射研究所。I. 2藥品與試劑本發(fā)明中藥組合物(下稱“通脈養(yǎng)心丸”，天津中新藥業(yè)集團股份有限公司樂仁堂制藥廠提供，按照本發(fā)明實施例I的方法制備，每10丸重lg，批號C107074) ；DMEM/F12培養(yǎng)基(Hyclone，NUHO180);胰蛋白酶(I 250，sigma) ;II 型膠原酶(Gibco，461699)；5’-溴脫氧尿苷(brdu, sigma) ；FLIPR Calcium 4Assay Kit (Molecular Devices, 122625)；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡試劑盒(BD，批號18354);其它試劑為國產分析純。I. 3主要儀器37°C 5% CO2 培養(yǎng)箱(THERM0，F(xiàn)0RMA3111 型，美國)；37°C 94% N2-5% CO2-I % O2 培養(yǎng)箱(THERMO，F(xiàn)0RMA3131型，美國)；倒置相差顯微鏡(LEICA DMIL，德國)；臺式高速低溫離心機(Biofuge primo R，美國)；多功能讀板機(Multiskan Ascent,THERM0LABSYSTEMS,美國);流式細胞儀(FACS，美國)。2實驗方法2. I含藥血清的制備將50只Wistar大鼠隨機分為空白對照組、通脈養(yǎng)心丸lg/kg、2g/kg、4g/kg、8g/kg(日給藥量)劑量組，連續(xù)給藥三天，于末次給藥Ih后腹主動脈取血，56 °C水浴孵育30min滅活補體,3000rpm離心15min后取血清,無菌條件下過濾分裝入凍存管中，-2(TC保
存?zhèn)溆谩?. 2心肌細胞原代培養(yǎng)及缺氧損傷模型的制備2. 2. I心肌細胞原代培養(yǎng)
參照文獻方法加以改良進行心肌細胞的原代培養(yǎng)取1-3日齡Wistar大鼠經75%酒精消毒30秒，無菌條件下取出心臟，預冷的D-Hanks液中洗去殘血，去除大血管，將心室肌剪成l_2mm3的組織塊，用O. I %膠原酶和O. 06%胰蛋白酶I : I混合液，37°C振搖消化5min，棄去上清，將剩余的組織塊如上法消化3-4次，分別收集細胞懸液200目網篩濾過，1000r/min，4°C離心lOmin，懸于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中，接種于75cm2培養(yǎng)瓶中，差速貼壁培養(yǎng)lh。收集未貼壁的細胞懸液并調整細胞濃度至5 X 105/ml，接種于培養(yǎng)板中，于5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時后換液。前3天用O. lmmol/L5’-溴脫氧尿苷(Brdu)以抑制非心肌細胞生長。2. 2. 2分組及缺氧損傷模型的制備取穩(wěn)定生長的單層心肌細胞，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)48h，使細胞生長同步化，并將細胞分為六組正常對照組、缺氧損傷組、通脈養(yǎng)心丸lg/kg、2g/kg、4g/kg、8g/kg劑量組。采用M0DEL3131型三氣培養(yǎng)箱，94% N2-5% CO2-I % O2條件下缺氧孵育24h，正常對照組于原條件下培養(yǎng)。
2. 3檢測指標2.3. IMTT比色法測定心肌細胞活力吸去細胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，每孔加入O. 5mg/ml MTT溶液ΙΟΟμΙ。于37°C，5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育4小時后，棄上清，每孔加入DMSOlOOy 1，待藍紫色結晶溶解后，于570nm波長下讀取OD值。以此作為缺氧損傷模型成功的標志。2. 3. 2心肌細胞胞漿內鈣離子濃度檢測取穩(wěn)定搏動的心肌細胞(約5 X IO4細胞/孔)，按組別分別加入用DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋后(濃度為10% )的含藥血清干預并于缺氧條件下培養(yǎng)(正常對照組加入空白血清并于正常條件下培養(yǎng))。24h后每孔加入100 μ LFLIPR Calcium 4熒光試劑，37°C繼續(xù)缺氧孵育lh，再向每孔分別加入50 μ L不同劑量組的含藥血清(濃度為50% )，實時檢測的各組細胞的熒光值變化(EX485nm、Em525nm)，檢測時程為5min。數(shù)據用每孔細胞再次加藥后熒光值占空白組熒光值的百分率)表示。2. 3. 3心肌細胞凋亡率檢測將種植于6孔板的心肌細胞每孔用O. 04% EDTA和O. 125%的胰蛋白酶混合液2ml消化2_3min，加含2%的FBS的PBS終止消化，將細胞懸液于4°C IOOOrpm離心5min，再將細胞重懸于PBS中IOOOrpm離心5min以除去細胞碎片等雜質，最后將細胞懸浮于連接緩沖液中，并加入含AnnexinV-Flous和PI的孵育緩沖液于4°C孵育15min。流式細胞儀檢測AnnexinV和PI標記的細胞，以不含AnnexinV和PI的孵育緩沖液的心肌細胞作陰性對照，計算凋亡細胞百分率(％ )。2. 4統(tǒng)計學處理數(shù)據用均數(shù)土標準差(X±S)表示，采用SPSS11.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比
較采用單因素方差分析。3實驗結果3. I通脈養(yǎng)心丸對心肌細胞活力的影響心肌細胞在缺氧條件下孵育后，其活力下降，與正常對照組比較差異極顯著(P< O. 01)。證明缺氧損傷模型建立成功。通脈養(yǎng)心丸各個劑量組均能不同程度提高缺氧損傷心肌細胞活力，其中l(wèi)g/kg劑量組與缺氧損傷組比較差異顯著(P<0.05);通脈養(yǎng)心丸2g/kg、4g/kg、8g/kg劑量組與缺氧損傷組比較差異極顯著(P < O. 01)。實驗結果見表I。
表I通脈養(yǎng)心丸對心肌細胞活力的影響
權利要求
1.一種中藥組合物在制備抗心肌細胞凋亡和/或抗心肌細胞凋亡相關疾病的藥物中的應用，其中所述中藥組合物是由按照下述重量配比的中藥材制備而成地黃I 10份，雞血藤I 10份，麥冬I 7份，甘草I 7份，制何首烏I 7份，阿膠I 7份，五味子I 7份,黨參I 7份,龜甲I 5份,大率I 5份,桂枝0. I 2份。
2.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述中藥組合物抗心肌細胞凋亡和/或抗心肌細胞凋亡相關疾病的作用是通過抑制心肌細胞鈣超載實現(xiàn)的。
3.如權利要求I或2所述的應用，其特征在于所述中藥組合物是由按照下述重量配比的中藥材制備而成地黃3 8份,雞血藤3 8份,麥冬2 5份,甘草2 5份,制何首烏2 5份,阿膠2 5份,五味子2 5份,黨參2 5份,龜甲I 3份,大率I 3份，桂枝0. 5 I. 5份。
4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述中藥組合物是由按照下述重量配比的中藥材制備而成地黃5份，雞血藤5份，麥冬3份，甘草3份，制何首烏3份，阿膠3份，五味子3份，黨參3份，龜甲2份，大棗2份，桂枝I份。
5.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述龜甲為醋制龜甲。
6.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述中藥組合物是按照下述方法制備而成的，包括 步驟I、按照權利要求I所述重量配比取11味中藥材； 步驟2、取龜甲加水煎煮后，加入雞血藤、黨參、大棗繼續(xù)煎煮，濾過，濾液濃縮后，加入乙醇進行沉淀，取適量，加入阿膠后加熱使溶解，并入上述乙醇溶液中，混勻，靜置，濾過，濾液備用； 步驟3、其余6味藥材，加入乙醇浸潰后，滲漉，收集滲濾液與步驟2中得到的提取液合并，靜置，濾過，濾液減壓回收乙醇，得到終產品。
7.如權利要求6所述的應用，其特征在于在步驟2中，所述龜甲加水煎煮2小時后加入雞血藤等藥材；加入雞血藤、黨參和大棗等藥材后繼續(xù)煎煮2次，第一次4小時，第二次2小時；所述濾液濃縮至在50°C時相對密度為I. 05 I. 15 ;加入80%乙醇進行沉淀，使乙醇含量達到60% ;靜置24小時；步驟3中，采用80%的乙醇浸潰48小時；靜置24小時。
8.如權利要求I所述的應用，其特征在于所述中藥組合物中藥組合物按照下述方法制備而成，包括 步驟I、按照權利要求I所述重量配比取11味藥材； 步驟2、雞血藤、黨參、五味子、大棗、龜甲加水煎煮，合并濾液，濾過，濃縮成稠膏； 步驟3、其余藥材6味藥分碎成細粉，加入步驟I得到的稠膏，均勻，干燥，分碎成細粉，得到終產品。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于步驟2中，藥材煎煮2次，每次3小時。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種中藥組合物在制備抗心肌細胞凋亡和/或抗心肌細胞凋亡相關疾病的藥物中的應用，其中所述中藥組合物是由按照下述重量配比的中藥材制備而成地黃1～10份，雞血藤1～10份，麥冬1～7份，甘草1～7份，制何首烏1～7份，阿膠1～7份，五味子1～7份，黨參1～7份，龜甲1～5份，大棗1～5份，桂枝0.1～2份。
文檔編號A61K35/36GK102670956SQ20111006416
公開日2012年9月19日 申請日期2011年3月17日 優(yōu)先權日2011年3月17日
發(fā)明者王磊 申請人:天津中新藥業(yè)集團股份有限公司樂仁堂制藥廠