專(zhuān)利名稱(chēng)：抗Met人源Fab及其阿霉素偶聯(lián)物和其制法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域，涉及一種抗細(xì)胞表面Met受體的人源Fab與化療藥物阿霉素的偶聯(lián)及其制備方法，以及偶聯(lián)后抗Met人源Fab在肝癌生物靶向治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
原發(fā)性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PLC)中 90%為肝細(xì)胞性肝癌 (hepatocellular carcinoma, HCC)。肝細(xì)胞性肝癌是世界第5位高發(fā)的腫瘤，由于缺乏有效的治療手段，目前是致死率第3位的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的生命和健康。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，為肝癌的生物治療開(kāi)辟了全新的領(lǐng)域，生物治療已成為繼手術(shù)、放療、化療后腫瘤治療的第4種模式，并顯示出了良好的應(yīng)用前景，主要包括分子靶向治療、免疫治療、基因治療、內(nèi)分泌治療、干細(xì)胞治療等。分子靶向治療是將靶向腫瘤細(xì)胞表面特異性分子的配體與藥物、放射性核素或生物毒素等偶聯(lián)，靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞，由于其能靶向作用于腫瘤局部，具有效率高副作用小等優(yōu)點(diǎn)。而基于化療藥物偶聯(lián)的分子靶向肝癌治療已成為新的研究熱點(diǎn)。HCC的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移與多種基因的突變、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路和新生血管增生異常等密切相關(guān)，其中多個(gè)關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，是進(jìn)行分子靶向治療的理論基礎(chǔ)和重要的潛在靶點(diǎn)?，F(xiàn)已知肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)/Met信號(hào)通路在原發(fā)性腫瘤的形成及繼發(fā)轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。Met是HGF的高親和性配體，在肺癌、結(jié)腸癌、肝癌、直腸癌、胃癌、卵巢癌、腎癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、黑素瘤、乳腺癌、前列腺癌等腫瘤組織中呈現(xiàn)出異常的高表達(dá)、突變或活性改變。有研究表明Met在侵襲型HCC組織中高表達(dá)，與臨床早期復(fù)發(fā)相關(guān)，在判斷肝癌預(yù)后和早期轉(zhuǎn)移中有重要作用。由于HGF/Met在肝癌的形成，侵襲，轉(zhuǎn)移等過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多阻斷HGF/Met信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑， 針對(duì)HGF/Met信號(hào)通路的各個(gè)環(huán)節(jié)。并且由于Met是許多腫瘤信號(hào)通路的交叉點(diǎn)，因此一旦以Met為靶標(biāo)阻斷肝癌細(xì)胞中的異?；罨腍GF/Met信號(hào)通路，可相對(duì)較容易地實(shí)現(xiàn)對(duì)許多通路的同時(shí)干擾，使細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)改變、增殖減緩、成瘤性降低、侵襲能力下降等一系列的變化。因此以Met為靶標(biāo)制備相應(yīng)抗體，并將其應(yīng)用到肝癌的抗體靶向生物治療中，將成為肝癌治療的一個(gè)新思路。阿霉素是臨床最早使用的腫瘤化療藥物之一，使用范圍廣，是肝癌化療的常用藥物之一，但是其毒副反應(yīng)較大，最常見(jiàn)的是心臟毒性和骨髓抑制，限制了其在臨床腫瘤治療中的應(yīng)用。將阿霉素和抗Met抗體偶聯(lián)，利用抗體的靶向性，有效的將藥物靶向到腫瘤部位，有希望降低阿霉素劑量，減輕化療不良反應(yīng)，最終提高化療效果。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明旨在提供抗Met人源Fab ；本發(fā)明的另一目的是制備抗Met人源Fab與阿霉素的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物不僅對(duì)體外培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞有殺傷作用，而且對(duì)皮下人肝癌細(xì)胞移植瘤的裸鼠模型有治療作用，最CN 102174106 A
說(shuō)明書(shū)
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終為其應(yīng)用到肝癌分子靶向治療提供基礎(chǔ)；本發(fā)明的另一目的在于提供抗Met人源Fab與阿霉素的偶聯(lián)方法，能制備出特異性結(jié)合肝癌細(xì)胞表面的Met受體蛋白的偶聯(lián)物。技術(shù)方案一種抗Met人源Fab，輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID No 1所示，重鏈的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。一種抗Met人源Fab，輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID No 3所示，重鏈的核苷酸序列如 SEQ ID No 4 所示。上述抗Met人源Fab與阿霉素偶聯(lián)后的產(chǎn)物。制備抗Met人源Fab與阿霉素偶聯(lián)后產(chǎn)物的方法，步驟為聚乙二醇100在高錳酸鉀酸性溶液的氧化下生成聚乙二醇二酸，然后于80°C下酰氯化，得聚乙二醇酰氯，聚乙二醇酰氯與阿霉素反應(yīng)，生成聚乙二醇化的DOX ；除去有機(jī)反應(yīng)溶劑，用PBS調(diào)整反應(yīng)溶液的pH 為7. 2，用二氯乙烷活化后，與Met抗體反應(yīng)Mh，透析，濃縮，并用葡聚糖凝膠GlOO進(jìn)行分離，既得到抗Met人源Fab與阿霉素偶聯(lián)后產(chǎn)物。上述抗Met人源Fab與阿霉素偶聯(lián)后產(chǎn)物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明從肝癌病人的外周全血中分離的B淋巴細(xì)胞中克隆了基因組所有的抗體重、輕鏈可變區(qū)基因，采取基因工程方法，構(gòu)建庫(kù)容量為7. 8X IO8的全人源免疫型Fab抗體庫(kù)，用純化的人Met蛋白對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選，分離篩選出了一株抗Met人源Fab 抗體。經(jīng)過(guò)流式檢測(cè)其能與Met陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞結(jié)合，而與Met陰性表達(dá)的細(xì)胞不結(jié)合。此外，該抗體片段具有較好的親和力并且能有效內(nèi)化。大量表達(dá)并純化抗Met人源Fab抗體片段蛋白；通過(guò)化學(xué)鍵合的方法與阿霉素偶聯(lián)；偶聯(lián)后通過(guò)免疫熒光的方法觀察到抗Met人源Fab與阿霉素的偶聯(lián)物與其親本抗體一樣能與表達(dá)Met的肝癌細(xì)胞特異性的結(jié)合，并且能將阿霉素靶向性的帶入Met表達(dá)的肝癌細(xì)胞中。細(xì)胞ELISA的結(jié)果表明偶聯(lián)物與其親本抗體一樣能與表達(dá)Met的肝癌細(xì)胞特異性的結(jié)合，而不與Met陰性表達(dá)的細(xì)胞結(jié)合。此為其可能應(yīng)用到肝癌分子靶向治療中提供了依據(jù)。有益效果體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明抗Met人源Fab與阿霉素的偶聯(lián)物與游離阿霉素均能有效殺傷Met陽(yáng)性表達(dá)肝癌細(xì)胞，而偶聯(lián)物對(duì)Met陰性表達(dá)細(xì)胞的毒性作用明顯小于游離阿霉素；體內(nèi)裸鼠皮下人肝癌細(xì)胞移植瘤治療實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明抗Met人源Fab與阿霉素的偶聯(lián)物與游離阿霉素均能有效抑制裸鼠皮下人肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，且偶聯(lián)物能明顯減輕化療藥物所致的小鼠體重降低的不良反應(yīng)。


圖 1 為人源抗 C-Met Fab 基因的合成；其中 M :DNA Marker, 1 :Fab,2 :Fd,3 :L,4 CHI, 5 :CL,6 :VL,7 :VH ；圖2為SDS-PAGE檢測(cè)protein L柱純化MetFab抗體蛋白結(jié)果，M 分子量Marker ； 1 純化后的MetFab ；圖3為免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察偶聯(lián)前后的MetFab與sk-fep-l細(xì)胞表面Met蛋白的結(jié)合能力(SK-H印-I-DOX-Meti^ab)；
圖4為免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察偶聯(lián)前的MetFab與sk-fep-l細(xì)胞表面Met蛋白的結(jié)合能力(SK-Hep-I-Meti^ab)；圖5為游離DOX和DOX-MetFab隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程的觀察結(jié)果(30分鐘)；圖6為游離DOX和DOX-MetFab隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程的觀察結(jié)果(1小時(shí))；圖7為游離DOX和DOX-MetFab隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程的觀察結(jié)果O小時(shí))；圖8為游離DOX和DOX-MetFab隨時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)入細(xì)胞過(guò)程的觀察結(jié)果(3. 5小時(shí))；圖9游離DOX及DOX-MetFab對(duì)肝癌細(xì)胞IfepG2的細(xì)胞毒性作用圖10游離DOX及DOX-MetFab對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC7721的細(xì)胞毒性作用圖11游離DOX及DOX-MetFab對(duì)肝癌細(xì)胞sk_H印_1的細(xì)胞毒性作用圖12藥物作用24h游離DOX及DOX-MetFab對(duì)NIH3T3的細(xì)胞毒性作用圖13藥物作用4 游離DOX及DOX-MetFab對(duì)NIH3T3的細(xì)胞毒性作用圖14藥物作用24h游離DOX及DOX-MetFab對(duì)L02的細(xì)胞毒性作用
圖15藥物作用4 游離DOX及DOX-MetFab對(duì)L02的細(xì)胞毒性作用圖16生理鹽水、游離DOX及DOX-MetFab處理后2種肝癌移植瘤的瘤重比較；圖17為DOX-MetFab的裸鼠體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)，A :HepG2細(xì)胞接種裸鼠，各種處理觀察對(duì)腫瘤體積的影響；圖18為DOX-MetFab的裸鼠體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)，B :HepG2細(xì)胞接種裸鼠，各種處理觀察對(duì)裸鼠體重的影響；圖19為DOX-MetFab的裸鼠體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)，C :sk-Hep-l細(xì)胞接種裸鼠，各種處理觀察對(duì)腫瘤體積的影響；圖20為DOX-MetFab的裸鼠體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)，D :sk_H印_1細(xì)胞接種裸鼠，各種處理觀察對(duì)裸鼠體重的影響；圖21小鼠肺臟的病理學(xué)觀察(HE，X200)，游離DOX處理組肺泡腔充血出血嚴(yán)重；圖22小鼠肺臟的病理學(xué)觀察(HE，X200)，DOX-MetFab處理組，肺泡結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯充血出血表現(xiàn)；圖23小鼠肺臟的病理學(xué)觀察(HE，X200)，生理鹽水處理組，肺泡結(jié)構(gòu)正常，無(wú)明顯充血出血表現(xiàn)；圖M小鼠腎臟的病理學(xué)觀察(HE，X200)，游離DOX處理組腎小球萎縮，可見(jiàn)萎縮變性的腎小球；圖25小鼠腎臟的病理學(xué)觀察(HE，X200)，DOX-MetFab處理組腎小球結(jié)構(gòu)基本正
常。無(wú)明顯萎縮變性表現(xiàn)；圖沈小鼠腎臟的病理學(xué)觀察(HE，X200)，生理鹽水處理組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常。 無(wú)明顯萎縮變性表現(xiàn)。圖27為MetFab與阿霉素通過(guò)化學(xué)鍵合的方法偶聯(lián)反應(yīng)式。
具體實(shí)施例方式1.全人源免疫型Fab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建從肝癌病人的外周全血中分離的B淋巴細(xì)胞中克隆了基因組所有的抗體重、輕鏈可變區(qū)基因，采取基因工程方法，構(gòu)建庫(kù)容量為7. 8 X IO8的全人源免疫型Fab抗體庫(kù)
2.抗Met人源Fab抗體篩選表達(dá)及活性鑒定用純化的Met蛋白對(duì)構(gòu)建的噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選，分離并純化了 1株抗Met 人源Fab。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)觀察該Fab抗體與Met陽(yáng)性及陰性表達(dá)細(xì)胞的結(jié)合能力的差異。3.抗Met人源Fab抗體分子與阿霉素的偶聯(lián)化學(xué)鍵合的方法將抗Met人源Fab抗體分子與阿霉素的偶聯(lián)，分離純化得到了抗 Met人源Fab抗體分子與阿霉素的偶聯(lián)物。4.偶聯(lián)后抗體活性的鑒定免疫熒光的方法及細(xì)胞ELISA觀察抗Met人源Fab與阿霉素的偶聯(lián)物是否與其親本抗體一樣能與表達(dá)Met的肝癌細(xì)胞特異性的結(jié)合，并且能將阿霉素靶向性的帶入Met表達(dá)的肝癌細(xì)胞中。5.抗Met人源Fab抗體與阿霉素偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的體外殺傷作用將偶聯(lián)物及游離的阿霉素分別作用與Met陽(yáng)性表達(dá)的肝癌細(xì)胞和Met陰性表達(dá)的細(xì)胞，觀察偶聯(lián)物是否同游離阿霉素一樣具有細(xì)胞毒性作用，并觀察二者對(duì)不同Met表達(dá)水平細(xì)胞的毒性作用的差異。6.抗Met人源Fab抗體與阿霉素偶聯(lián)物對(duì)裸鼠人肝癌移植瘤模型的體內(nèi)治療作用建立裸鼠的人肝癌移植瘤模型，分別應(yīng)用偶聯(lián)物和游離阿霉素進(jìn)行治療，觀察偶聯(lián)物與游離的阿霉素對(duì)腫瘤的體內(nèi)治療作用，比較二者化療不良反應(yīng)的差異。實(shí)施例1全人源免疫型Fab噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建采集肝癌病人外周全血40份，分離淋巴細(xì)胞，采用hvitrogen公司的Trizol抽提總RNA，用0lig0(dT)2Q為引物，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。然后利用特異性引物PCR分別擴(kuò)增其重、輕鏈可變區(qū)基因。經(jīng)Overlap PCR合成Fab基因(圖1)，與經(jīng)相同酶切的表達(dá)載體 pComb3XSS連接，構(gòu)建Fab的原核重組表達(dá)載體；電轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌XLl-Blue，構(gòu)建構(gòu)建了容量為6. 5 X IO8的全人源免疫型Fab抗體庫(kù)。所述構(gòu)建的Fab基因與pComb3xSS載體連接是指將純化定量后的Fab基因分別以SfiI內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切消化；純化、定量后與同樣雙酶切pComb3xSS載體連接；所述的轉(zhuǎn)化是指a)0. 2cm電轉(zhuǎn)杯，25 μ F，2. 5kV，200 Ω的電轉(zhuǎn)條件轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 XLl-Blue ；b)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物加入LB培養(yǎng)基后37°C振蕩培養(yǎng)2h，10倍梯度稀釋將菌液涂布于 SOBAG瓊脂板上，30°C過(guò)夜培養(yǎng)；c)次日計(jì)算平板上的克隆數(shù)，估算庫(kù)容為6. 5X IO8 ;d)將電轉(zhuǎn)化后菌液加入輔助噬菌體ΜΠΚ07超感染，離心沉淀菌體，用LB培養(yǎng)基重懸，37°C振蕩過(guò)夜，離心沉淀菌體，吸取上清即為Fab噬菌體表面展示文庫(kù)。實(shí)施例2抗Met人源Fab的篩選，表達(dá)及純化(1)噬菌體抗體庫(kù)的富集篩選用純化的人Met重組蛋白包被固相篩選ELISA板， 每孔1 μ g，洗滌，加封閉液，洗滌，加入噬菌體抗體庫(kù)抗體，洗滌去除未結(jié)合的噬菌體抗體； 加入胰蛋白酶，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體抗體，感染增值，輔助噬菌體Mi;3K07超感染；重復(fù)以上篩選步驟，共進(jìn)行三輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”富集篩選；O)ELISA鑒定陽(yáng)性克隆將最后一輪篩選且增值得到的噬菌體稀釋后鋪于培養(yǎng)板上培養(yǎng)過(guò)夜，挑取564個(gè)單菌落于細(xì)胞培養(yǎng)板中，振搖培養(yǎng)過(guò)夜；從第一塊板各孔中分別轉(zhuǎn)移5μ 1菌液至第二塊板，振搖培養(yǎng)；加輔助噬菌體Μ ;3Κ07超感染，振搖培養(yǎng)；離心，培養(yǎng)基重懸沉淀，振搖培養(yǎng)過(guò)夜。離心取上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，測(cè)定每孔450nm和650nm吸光值，
6按A450nm-A650nm計(jì)算每孔吸光值；當(dāng)P/N值(Positive/Negative)大于2. 1時(shí)，該菌株為陽(yáng)性單克隆噬菌體菌株；共得到32個(gè)陽(yáng)性克隆。陽(yáng)性克隆經(jīng)核酸序列分析后，發(fā)現(xiàn)有1株 Fab克隆與人Met重組蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合活性，F(xiàn)ab重、輕鏈可變區(qū)基因序列分析應(yīng)用以下兩個(gè)服務(wù)器http://imgt. cines. fr/IMGT_vquest/vquest ？ livret = 0&0ption = mouselghttp://blast, ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi核酸序列及氨基酸序列VHCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCA GCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGC AGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATT CCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAAC TGGGGATTTGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCCCTEVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFT ISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNWGFDYWGQGTLVTVSPVLGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTTACTCTCTGCATCTACAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTG TCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATC TATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTC ACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAGCAGAGTTACAGTACCCCTCACACTTTT GGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAELQMTQSPSLLSASTCDRVTISCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGT DFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHTFGQGTKLEIKR(3)陽(yáng)性克隆的大量表達(dá)和純化選擇ELISA檢測(cè)中吸光值最高的1株陽(yáng)性克隆噬菌體感染非抑制型ToplOF，，含有重組質(zhì)粒pComb3X-Fab的菌株接種IOmL的SB液體培養(yǎng)基中(含有100 μ g/mL的氨芐青霉素)，37°C搖床培養(yǎng)至0D600nm至0. 4-0. 6時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG，25°C誘導(dǎo)過(guò)夜。12000rpm離心收集菌體，超聲破菌后收集超聲裂解上清， 用0. 2 μ m濾膜過(guò)濾后，采用AKTA的FPLC蛋白純化儀，Protein L柱純化。該條件下，能從細(xì)菌超聲裂解上清中純化得到純度較高的MetFab，產(chǎn)率較高。所述的純化是指a)把ftOteinL親和層析柱安裝至蛋白質(zhì)純化儀上，b)用10個(gè)柱床體積的結(jié)合緩沖液(0. 05mol/L Na2HPO4,0. 05mol/L NaH2PO4,0. 35mol/LNaCl, pH 7.2) 平衡柱床，c)上樣品，流速為ImL/分鐘。d)用結(jié)合緩沖液洗滌柱床至A280nm吸光度到基線，用5-10個(gè)柱床體積的洗脫緩沖液(0. lmol/LGlycine,0. 15mol/LNaCl, pH 2. 7)洗脫目的蛋白，用SDS-PAGE鑒定(圖2)。實(shí)施例3MetFab與阿霉素偶聯(lián)MetFab與阿霉素通過(guò)化學(xué)鍵合的方法偶聯(lián)。首先，PEG100 (聚乙二醇100)在高錳酸鉀酸性溶液的氧化下生成聚乙二醇二酸O)。然后于80°C下酰氯化，得聚乙二醇酰氯 (3)。聚乙二醇酰氯與DOX反應(yīng)，生成聚乙二醇化的D0X。除去有機(jī)反應(yīng)溶劑，用PBS調(diào)整反應(yīng)溶液的pH為7. 2，用EDC活化后，與Met抗體反應(yīng)Mh。透析，濃縮，并用葡聚糖凝膠G100進(jìn)行分離，既得到目標(biāo)產(chǎn)物MET-D0X。經(jīng)過(guò)高效液相色譜分析，認(rèn)為抗體與阿霉素偶聯(lián)成功。 并將偶聯(lián)物命名為DOX-MetFab。(圖27)實(shí)施例4偶聯(lián)后抗體活性的鑒定(1)免疫熒光實(shí)驗(yàn)用SK-H印-12X104鋪96孔板，貼壁后用4%多聚甲醛固定，2% BSA封閉37度池，加入偶聯(lián)前后的MetFab為一抗(均含有MetFab40 μ g/mL)孵育2h，含 0. 5% Tween的PBST洗3次，再加入綠色熒光標(biāo)記的羊抗人Fab 二抗(1 16)孵育lh，熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞都能顯示綠色熒光，表明偶聯(lián)后的MetFab(DOX-MetFab)與其親本抗體一樣都能結(jié)合SK-H印-1細(xì)胞上的Met蛋白。并且由于阿霉素有自發(fā)的紅色熒光，所以可以觀察到DOX-MetFab作用的SK-Ifep-I細(xì)胞還呈現(xiàn)有紅色熒光(圖3_4)。(2)藥物作用細(xì)胞過(guò)程的觀察96孔板培養(yǎng)SK-H印-1，分別加入含20 μ g/mL阿霉素的游離阿霉素標(biāo)準(zhǔn)品和DOX-MetFab，在藥物作用30min，lh, 2h，3. 5h后分別熒光顯微鏡下觀察。相同條件下，將二者作用于不表達(dá)Met的NIH3T3細(xì)胞3. 5h，熒光顯微鏡下觀察熒光分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)阿霉素的紅色熒光逐漸增多；并且游離阿霉素作用下主要表現(xiàn)為在細(xì)胞核內(nèi)的紅色熒光，且很快呈現(xiàn)在核中；DOX-MetFab作用下阿霉素的紅色熒光在細(xì)胞膜-胞漿-核均有呈現(xiàn)，并且隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為的從細(xì)胞膜-胞漿-核的呈現(xiàn)過(guò)程。表明游離的阿霉素和DOX-MetFab的阿霉素進(jìn)入細(xì)胞的路徑不同，MetFab能將阿霉素通過(guò)細(xì)胞表面的特異性受體內(nèi)化而帶入細(xì)胞中。游離的阿霉素作用下，NIH3T3細(xì)胞的核上能觀察到紅色熒光，而DOX-MetFab作用時(shí)不能觀察到紅色熒光， 也證明了 DOX-MetFab只能結(jié)合Met表達(dá)的細(xì)胞，并將藥物帶入細(xì)胞中(圖5_8)。(3)細(xì)胞ELISA實(shí)驗(yàn)比較偶聯(lián)前后抗體結(jié)合能力SK_H印_1細(xì)胞包板，分別加入 MetFab, DOX-MetFab,能與HRP-羊抗人Fab結(jié)合的抗炭疽毒素的嵌合人IgG (陰性對(duì)照) 做為一抗，所含的抗體濃度均設(shè)40、20、10、5、1. 25,0. 31 μ g/mL 6個(gè)梯度；同時(shí)用NIH3T3 細(xì)胞包板，加入相同濃度梯度的DOX-MetFab ；空白對(duì)照不加一抗，二抗為HRP-羊抗人 Fab(l 2000)，TMB顯色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗炭疽毒素的嵌合人IgG不能與SK-H印-1細(xì)胞結(jié)合， DOX-MetFab也不能與NIH3T3細(xì)胞結(jié)合，而MetFab和DOX-MetFab均能與SK-Ifep-I細(xì)胞表面的Met受體特異性結(jié)合結(jié)合，具有濃度依賴性；且DOX-MetFab的結(jié)合能力略低于MetFab， 表明偶聯(lián)后仍保留了抗體特異性的結(jié)合能力，但是偶聯(lián)有可能對(duì)抗體的空間構(gòu)象有影響而在一定程度上影響了抗體的結(jié)合能力。實(shí)施例5偶聯(lián)后抗體對(duì)肝癌細(xì)胞的體外殺傷作用選用Met高表達(dá)的肝癌細(xì)胞H印G2，SK-Hep-1, SMMC-7721, 5000個(gè)/孔鋪96孔板， 設(shè)阿霉素組，DOX-MetFab組，MetFab組和不加藥物處理組，阿霉素組與DOX-MetFab組按照阿霉素的劑量設(shè) 0. 25、0· 5、1、2· 5、5、7· 5、10 μ g/mL 濃度組，MetFab 組給予 DOX-MetFab 組相同量的抗體蛋白，藥物作用48h，MTT觀察對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。同時(shí)選用不表達(dá)Met的NIH3T3和人正常肝細(xì)胞L02，用阿霉素，DOX-MetFab和 MetFab同樣條件分別處理細(xì)胞24h和48h，MTT觀察對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。結(jié)果表明MetFab對(duì)上述所有細(xì)胞均無(wú)殺傷作用。阿霉素和DOX-MetFab對(duì)腫瘤細(xì)胞均有殺傷作用，且有劑量依賴性，DOX-MetFab殺傷效果略低于阿霉素。阿霉素對(duì)不表達(dá)Met的NIH3T3和人正常肝細(xì)胞L02均有殺傷作用，藥物作用24h殺傷作用就非常明顯。 DOX-MetFab作用NIH3T3至4 仍無(wú)明顯殺傷作用，而作用L02細(xì)胞Mh時(shí)殺傷作用不明顯，作用48h時(shí)顯示出殺傷作用，但明顯弱于游離阿霉素的細(xì)胞殺傷作用(圖9-15)。實(shí)施例6D0X-MetFab的裸鼠體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)選用Met高表達(dá)的!fepG2及sk_H印_1細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，胰酶消化收集細(xì)胞，無(wú)血清的DMEM重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度，以IXlO6/只接種于4-6周齡的裸鼠背部皮下。10 天后待平均腫瘤體積為150mm3時(shí)分組給予治療生理鹽水組(只給等體積生理鹽水)； MetFab 組(含與 DOX-Meti^ab 組等量的 MetFab) ；DOX-MetFab 組(含 DOX 2mg/kg) ；DOX 組 (2mg/kg)。治療方法為隔天1次，尾靜脈注射，治療因DOX組的小鼠發(fā)生死亡而結(jié)束，共治療10次。隔天測(cè)量小鼠腫瘤長(zhǎng)短徑，按照公式V= 1/2 2計(jì)算腫瘤體積，隔天稱(chēng)量小鼠體重。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剝離腫瘤稱(chēng)量瘤重，取重要組織臟器進(jìn)行固定，行病理學(xué)觀察。治療結(jié)束時(shí)，生理鹽水組的腫瘤最大，而DOX組的腫瘤最小(圖16)；監(jiān)測(cè)小鼠體重時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，DOX組的小鼠體重明顯下降，最終發(fā)生嚴(yán)重惡液質(zhì)而死亡； 而其他3組小鼠體重未有明顯下降(圖17-20)；組織病理顯示DOX組的小鼠腎臟腎小球的萎縮嚴(yán)重，肺臟充血出血明顯，肺泡融合，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重，而其余組小鼠腎臟和肺臟的
青況明顯好于DOX組(圖21-26)。0086]序列表0087]<110>南京醫(yī)科大學(xué)0088]<120>抗Met人源Fab及其阿霉素偶聯(lián)物和其制法及應(yīng)用0089]<130>0090]<160>40091]<170>PatentIn version 3.30092]<210>10093]<211>1160094]<212>PRT0095]<213>Fab抗體庫(kù)0096]<400>10097]Glu Val Gln Leu ValGluSerGlyGlyGlyValValGlnProGlyArg0098]1 510150099]Ser Leu Arg Leu SerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr0100]2025300101]Ala Met His Trp ValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal0102]3540450103]Ala Val lie Trp TyrAspGlySerAsnLysTyrTyrAlaAspSerVal0104]5055600105]Lys Gly Arg Phe ThrlieSerArgAspAsnSerLysAsnThrLeuTyr0106]657075800107]Leu Gln Met Asn SerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys0108]8590950109]Ala Arg Asp Asn TrpGlyPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrLeuVal0110]100105110
權(quán)利要求
1.一種抗Met人源Fab，其特征在于輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID No :1所示，重鏈的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。
2.一種抗Met人源Fab，其特征在于輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID No :3所示，重鏈的核苷酸序列如SEQ ID No :4所示。
3.權(quán)利要求1或2所述抗Met人源Fab與阿霉素偶聯(lián)后的產(chǎn)物。
4.制備權(quán)利要求3所述抗Met人源Fab與阿霉素偶聯(lián)后產(chǎn)物的方法，其特征在于步驟為聚乙二醇100在高錳酸鉀酸性溶液的氧化下生成聚乙二醇二酸，然后于80°C下酰氯化，得聚乙二醇酰氯，聚乙二醇酰氯與阿霉素反應(yīng)，生成聚乙二醇化的D0X;除去有機(jī)反應(yīng)溶劑，用PBS調(diào)整反應(yīng)溶液的pH為7. 2，用二氯乙烷活化后，與Met抗體反應(yīng)Mh，透析，濃縮，并用葡聚糖凝膠GlOO進(jìn)行分離，既得到抗Met人源Fab與阿霉素偶聯(lián)后產(chǎn)物。
5.權(quán)利要求3所述抗Met人源Fab與阿霉素偶聯(lián)后產(chǎn)物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
抗Met人源Fab及其阿霉素偶聯(lián)物和其制法及應(yīng)用，輕鏈的氨基酸序列如SEQ ID No1所示，重鏈的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。輕鏈的核苷酸序列如SEQ ID No3所示，重鏈的核苷酸序列如SEQ ID No4所示。體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果表明抗Met人源Fab與阿霉素的偶聯(lián)物與游離阿霉素均能有效殺傷Met陽(yáng)性表達(dá)肝癌細(xì)胞，而偶聯(lián)物對(duì)Met陰性表達(dá)細(xì)胞的毒性作用明顯小于游離阿霉素；體內(nèi)裸鼠皮下人肝癌細(xì)胞移植瘤治療實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明抗Met人源Fab與阿霉素的偶聯(lián)物與游離阿霉素均能有效抑制裸鼠皮下人肝癌移植瘤的生長(zhǎng)，且偶聯(lián)物能明顯減輕化療藥物所致的小鼠體重降低的不良反應(yīng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102174106SQ201110065209
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月17日
發(fā)明者馮振卿, 朱進(jìn) 申請(qǐng)人:馮振卿, 朱進(jìn)