專利名稱：眼鏡蛇毒物理改性方法和在制備鎮(zhèn)痛或免疫抑制藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于藥物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種改性眼鏡蛇毒及眼鏡蛇毒的物理改 性方法和在制備口服、外用和注射劑藥物中的用途。
背景技術(shù)：
蛇毒是由蛇的毒腺分泌的多種組分構(gòu)成的復(fù)雜混合物。蛇毒的干物質(zhì)中90%以上 是蛋白質(zhì)，是其毒性和其生物學(xué)活性的主要成分。祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為眼鏡蛇及其毒性成分 可通經(jīng)絡(luò)，祛風(fēng)濕，并具有強(qiáng)身健體之功效，早在二十世紀(jì)初，人們就開(kāi)始應(yīng)用蛇毒來(lái)緩解 惡性腫瘤疼痛、神經(jīng)痛和關(guān)節(jié)痛，隨后出現(xiàn)一系列關(guān)于蛇毒有類似嗎啡樣鎮(zhèn)痛作用的報(bào)道。 隨著研究的不斷深入，現(xiàn)在，蛇毒及其制品已應(yīng)用于臨床，除了鎮(zhèn)痛作用外，在抗炎、抗風(fēng) 濕、抗腫瘤以及在神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面都有很好的療效。中華眼鏡蛇毒(Najanaja atra) 和泰國(guó)眼鏡蛇毒(Naja Kaouthia)兩種眼鏡蛇毒所含成分接近，藥理作用和毒性十分相似， 兩者可以開(kāi)發(fā)成同類型的藥物和具有相同的臨床用途。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種改性眼鏡蛇毒，提供了一種新型的鎮(zhèn)痛藥物。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問(wèn)題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是一種改性眼鏡蛇毒，其特征在于所述眼鏡蛇毒來(lái)自中華眼鏡蛇毒或泰國(guó)眼鏡蛇 毒，所述改性眼鏡蛇毒是將眼鏡蛇毒60-100°C加熱5-120分鐘后冷卻后得到，且所述改性 眼鏡蛇毒用SDS-PAGE檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)特征性的小分子量蛋白的增加。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)該改性眼鏡 蛇毒藥效增強(qiáng)而毒性下降。本發(fā)明的另一目的在于提供一種含有改性眼鏡蛇毒的組合物，其特征在于所述組 合物以其組分重量百分比計(jì)含有改性眼鏡蛇毒0. 01 10重量分?jǐn)?shù)；藥學(xué)上可接受的載體90 99. 99重量分?jǐn)?shù)。優(yōu)選的，所述組合物的劑型選自口服劑型或外用劑型或注射劑。優(yōu)選的，所述口服劑型選自口服液、膠囊劑和口服藥膜；所述外用劑型選自涂劑、 巴布劑、噴霧劑，所述注射劑型選自粉針劑和水針劑。本發(fā)明的又一目的在于提供一種改性眼鏡蛇毒的改性方法，其特征在于所述改性 方法為物理改性方法，包括將眼鏡蛇毒在60-100°C加熱5-120分鐘后進(jìn)行冷卻的步驟。優(yōu)選的，所述改性方法中眼鏡蛇毒溶于0. 5M PBS緩沖液，調(diào)整溶液的PH值在7. 8 左右進(jìn)行。本發(fā)明的又一目的在于提供一種改性眼鏡蛇毒在制備鎮(zhèn)痛和免疫抑制藥物方面 的應(yīng)用。本發(fā)明涉及了一種眼鏡蛇毒的物理改性方法和在制備口服、注射和外用藥物中的用途。本發(fā)明的眼鏡蛇毒液經(jīng)過(guò)熱處理及其它輔助條件改變部分組分含量，達(dá)到增效減毒 目的；所述改性蛇毒藥物包括口服液、膠囊、藥膜、涂劑、巴布劑、噴霧劑和注射劑等各種劑 型。本發(fā)明眼鏡蛇毒來(lái)自于中華眼鏡蛇毒(Naja naja atra)和泰國(guó)眼鏡蛇毒(Naja Kaouthia)，通過(guò)以下方法可以得到眼鏡蛇毒從人工飼養(yǎng)的中華或泰國(guó)眼鏡蛇采集毒液， 或從市場(chǎng)購(gòu)買眼鏡蛇毒凍干粉。眼鏡蛇毒包括中華眼鏡蛇和泰國(guó)眼鏡蛇所產(chǎn)蛇毒。本發(fā)明的所述藥物還包括各種單方和復(fù)方制劑。盡管中華眼鏡蛇蛇毒在臨床上已 用于治療風(fēng)濕和緩解惡性腫瘤疼痛、神經(jīng)痛和關(guān)節(jié)痛等，但目前還沒(méi)有文獻(xiàn)報(bào)道中華眼鏡 蛇總毒(Naja naja atra)和泰國(guó)眼鏡蛇總毒(NajaKaouthia)在經(jīng)過(guò)熱處理后可以減毒增 效。也沒(méi)有報(bào)道這種改性的蛇毒可以通過(guò)口服、鼻(口)粘膜給藥、皮膚給藥和注射給藥途 徑進(jìn)行臨床用藥而發(fā)揮療效。眼鏡蛇毒的物理改性方法將眼鏡蛇毒溶液于0.5M PBS(pH7. 8)中，60-100°C加 熱120分鐘左右(范圍5-120分鐘)，將加熱的眼鏡蛇毒液快速置于冰中冷卻(或逐步冷 卻)。經(jīng)過(guò)這種熱處理后的蛇毒用SDS-PAGE檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)特征性的小分子量蛋白的增加。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)物理改性后中華眼鏡蛇毒的鎮(zhèn)痛作用明顯增強(qiáng)，并可以延遲 遲發(fā)型超敏反應(yīng)。蛇毒改性的另一個(gè)作用是毒性有所下降。這一發(fā)現(xiàn)，將對(duì)蛇毒的鎮(zhèn)痛作 用，免疫調(diào)節(jié)作用的研究和藥物開(kāi)發(fā)產(chǎn)生重大的影響，并有臨床實(shí)用價(jià)值，為中華眼鏡蛇毒 開(kāi)辟臨床新的用途。相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)中的方案，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明中眼鏡蛇毒(包括中華泰國(guó)眼鏡蛇毒和泰國(guó)眼鏡蛇毒)經(jīng)過(guò)物理改性后， 不僅鎮(zhèn)痛作用更有效而持久，還具有較好的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用。本發(fā)明眼鏡蛇毒(包括 中華泰國(guó)眼鏡蛇毒和泰國(guó)眼鏡蛇毒)經(jīng)過(guò)物理改性后用量少，有效范圍大，從IO-IOOOyg/ kg都有很好的鎮(zhèn)痛和免疫調(diào)節(jié)作用作用，安全范圍擴(kuò)大。本發(fā)明眼鏡蛇毒(包括中華泰國(guó) 眼鏡蛇毒和泰國(guó)眼鏡蛇毒)經(jīng)過(guò)物理改性后多種給藥途徑包括皮膚給藥、口服、口(鼻)粘 和注射等途徑給藥均有效。綜上所述，本發(fā)明公開(kāi)了一種眼鏡蛇毒(Naja naja atra)物理改性的方法，經(jīng)過(guò) 物理改性的眼鏡蛇毒，在鎮(zhèn)痛，抗炎抑制免疫方面的藥效增強(qiáng)，作用更持久。眼鏡蛇毒取自 人工繁殖飼養(yǎng)的中華或泰國(guó)眼鏡蛇的毒液。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)物理改性后的眼鏡蛇毒 (10-1000 μ g/kg)范圍內(nèi)鎮(zhèn)痛、抗炎抑制免疫作用明顯，具有用量小、安全、可口服、可注射、 可透過(guò)口鼻粘膜和皮膚給藥等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的臨床實(shí)用價(jià)值。


下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述圖1為本發(fā)明實(shí)施例眼鏡蛇毒加熱處理后蛋白組分的變化；圖2為本發(fā)明實(shí)施例眼鏡蛇毒30 μ g/kg經(jīng)物理改性與改性前痛閾值比較圖；圖3為本發(fā)明實(shí)施例眼鏡蛇毒100 μ g/kg經(jīng)物理改性與改性前痛閾值比較圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明
4本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件做 進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。實(shí)施例1中華眼鏡蛇毒的改性處理中華眼鏡蛇毒采集玻璃燒杯清潔后用薄膜封口，輻照消毒。將中華眼鏡蛇牙齒刺 破薄膜加力頂在燒杯壁上，輕輕擠壓毒腺部位，毒液將沿玻壁流入杯中。中華眼鏡蛇毒凍干 粉也可從江西鷹潭市彩虹蛇場(chǎng)購(gòu)得。用0. 5MPBS(pH7. 8)配制合適濃度的中華眼鏡蛇毒液，加入到500ml玻璃燒瓶中， 加蓋密封。置燒瓶于100°c水浴鍋中，煮沸5分鐘后，停止加熱，在水浴鍋中加入冰塊逐步 使溫度冷卻至20°C，降溫速度控制在每分鐘5°C。加熱處理的蛇毒用SDS-PAGE檢測(cè)改性結(jié) 果。應(yīng)該檢測(cè)到IOkD以下分子量組分的蛋白含量增加。實(shí)施例2泰國(guó)眼鏡蛇毒的改性處理泰國(guó)眼鏡蛇毒采集玻璃燒杯清潔后用薄膜封口，輻照消毒。將泰國(guó)眼鏡蛇牙齒刺 破薄膜加力頂在燒杯壁上，輕輕擠壓毒腺部位，毒液將沿玻壁流入杯中。泰國(guó)眼鏡蛇毒凍干 粉也可從江西鷹潭市彩虹蛇場(chǎng)購(gòu)得。用0. 5MPBS(pH7. 8)配制合適濃度的泰國(guó)眼鏡蛇毒液，加入到500ml玻璃燒瓶中， 加蓋密封。置燒瓶于100°c水浴鍋中，煮沸5分鐘后，停止加熱，在水浴鍋中加入冰塊逐步 使溫度冷卻至20°C，降溫速度控制在每分鐘5°C。加熱處理的蛇毒用SDS-PAGE檢測(cè)改性結(jié) 果。應(yīng)該檢測(cè)到IOkD以下分子量組分的蛋白含量增加。實(shí)施例3改性眼鏡蛇毒的藥理作用和機(jī)理考察以下以改性中華眼鏡蛇毒(Naja naja atra)為例進(jìn)行改性眼鏡蛇毒的藥理作用 和機(jī)理考察。眼鏡蛇毒加熱處理后，配制成lmg/ml濃度，混入flfestern blot加樣緩沖液。蛇毒 蛋白組分用15% SDS-PAGE膠分離，考馬氏亮藍(lán)染色，攝片。如圖1所示為眼鏡蛇毒加熱處 理后蛋白組分的變化，結(jié)果顯示加熱處理對(duì)分子量20kD以上的蛋白組分沒(méi)有影響，但是分 子量為ISkD左右的蛋白組分減少(實(shí)心箭頭所示)；分子量IOkD以下的蛋白組分增加(空 心箭頭所示)。眼鏡蛇短鏈神經(jīng)毒素的分子量為7kD左右。神經(jīng)毒素是眼鏡蛇毒中主要的 鎮(zhèn)痛和毒性成分，也是免疫調(diào)節(jié)的主要成分。如圖2所示為本發(fā)明實(shí)施例眼鏡蛇毒30 μ g/kg經(jīng)物理改性與改性前痛閾值比較。 與給藥前痛閾值相比*P< 0.05，**P< 0.01，***P< 0.001。即眼鏡蛇毒(30 μ g/kg)物 理改性組給藥后痛閾值與給藥前痛閾值相比較。在給藥后池產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用，且鎮(zhèn)痛 作用持續(xù)到給藥后8h。眼鏡蛇毒(30 μ g/kg)未處理組給藥后痛閾值與給藥前痛閾值相比， 在給藥后池起效，鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間都比經(jīng)加熱處理后形成的改性眼鏡蛇毒差?？?見(jiàn)，經(jīng)過(guò)物理改性的眼鏡蛇毒的鎮(zhèn)痛作用較未處理的藥效增強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)?？瞻捉M的痛 閾值可以排除隨時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)痛閾值的影響所產(chǎn)生的誤差。如圖3所示為眼鏡蛇毒100 μ g/kg經(jīng)物理改性與改性前痛閾值比較圖。結(jié)果與給 藥前痛閾值相比* P < 0. 05，〃 P < 0. 01，* 〃 P < 0. 001，即眼鏡蛇毒(100 μ g/kg)物理改 性組給藥后痛閾值與給藥前痛閾值相比，在給藥后: 產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)痛作用，且鎮(zhèn)痛作用持 續(xù)到給藥后llh。眼鏡蛇毒(100μ g/kg)未處理組給藥后痛閾值與給藥前痛閾值相比，在給 藥后4h起效，鎮(zhèn)痛作用強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間都比加熱處理的差。可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)物理改性的眼鏡蛇毒的鎮(zhèn)痛作用較未處理的藥效持續(xù)時(shí)間增長(zhǎng)，且鎮(zhèn)痛作用明顯增強(qiáng)?？瞻捉M的痛閾值可以 排除隨時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)痛閾值的影響所產(chǎn)生的誤差。遲發(fā)型超敏反應(yīng)是采用2，4-二硝基氯苯(DNCB)皮膚致敏，與致敏后第7天以 DNCB再次攻擊小鼠右耳誘發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，24h后，脫頸椎處死，分別剪下雙耳，用打孔器在兩 耳相同部位打下圓耳片，稱重，以左、右耳片重量差值作為腫脹度。結(jié)果提示，與生理鹽水對(duì)照組相比，眼鏡蛇毒(300yg/kg)經(jīng)物理改性后對(duì)小鼠 遲發(fā)型超敏反應(yīng)具有一定的延遲作用。遲發(fā)型超敏反應(yīng)的發(fā)生是一個(gè)炎癥因子的釋放過(guò) 程，可見(jiàn)，經(jīng)物理改性的眼鏡蛇毒具有一定的抗炎抗免疫作用。結(jié)果見(jiàn)表1。表1中華眼鏡蛇毒灌胃給藥后對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的影響
權(quán)利要求
1.一種改性眼鏡蛇毒，其特征在于所述改性眼鏡蛇毒來(lái)源于中華眼鏡蛇毒或泰國(guó)眼鏡 蛇毒，所述改性眼鏡蛇毒是將眼鏡蛇毒60-100°C加熱5-120分鐘后冷卻后得到，且所述改 性眼鏡蛇毒用SDS-PAGE檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)特征性的小分子量蛋白的增加。
2.一種含有改性眼鏡蛇毒的組合物，其特征在于所述組合物以其組分重量百分比計(jì)含有改性眼鏡蛇毒0. 01 10重量分?jǐn)?shù)； 藥學(xué)上可接受的載體90 99. 99重量分?jǐn)?shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的含有改性眼鏡蛇毒的組合物，其特征在于所述組合物的劑型 選自口服劑型或外用劑型或注射劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的含有改性眼鏡蛇毒的組合物，其特征在于所述口服劑型選自 口服液、膠囊劑和口服藥膜；所述外用劑型選自涂劑、巴布劑、噴霧劑，所述注射劑型選自供 肌肉或皮下注射給藥使用的粉針劑和水針劑。
5.一種改性眼鏡蛇毒的改性方法，其特征在于所述改性方法為物理改性方法，包括將 眼鏡蛇毒在60-100°C加熱5-120分鐘后進(jìn)行冷卻的步驟。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的改性方法，其特征在于所述改性方法中眼鏡蛇毒溶于0.5M PBS 緩沖液，調(diào)整溶液的PH值在7. 8左右進(jìn)行。
7.—種權(quán)利要求1所述的改性眼鏡蛇毒在制備鎮(zhèn)痛藥物或免疫抑制藥物方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種改性眼鏡蛇毒及其改性方法和在制備鎮(zhèn)痛和免疫抑制藥物方面的應(yīng)用，所述眼睛蛇毒來(lái)自中華眼鏡蛇毒或泰國(guó)眼鏡蛇毒，所述改性眼鏡蛇毒是將眼鏡蛇毒60-100℃加熱5-120分鐘后冷卻后得到，且所述改性眼鏡蛇毒用SDS-PAGE檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)特征性的小分子量蛋白的增加，藥效增強(qiáng)，毒性下降。該改性眼鏡蛇毒鎮(zhèn)痛、抗炎抑制免疫作用明顯，具有用量小、安全、可口服、可注射、可透過(guò)口鼻粘膜和皮膚給藥等優(yōu)點(diǎn)，具有較大的臨床實(shí)用價(jià)值。
文檔編號(hào)A61P37/06GK102133232SQ20111006563
公開(kāi)日2011年7月27日 申請(qǐng)日期2011年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月18日
發(fā)明者史高娜, 王進(jìn), 祝佳麗, 秦正紅 申請(qǐng)人:蘇州大學(xué)