專利名稱：富勒烯賴氨酸衍生物及其制備方法和防輻射用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是富勒烯賴氨酸衍生物(C6tl-Iys)及其制備方法和防輻射損傷用途。
背景技術(shù)：
富勒烯(fullerene, C60),又名球烯，它是由Kroto等1985年在研究激光蒸發(fā)石墨的過程中首先發(fā)現(xiàn)的。1990年克拉希姆(W. Kratschmer)等發(fā)明了合成克量級C6tl的方法以來，使宏觀量制備C6tl成為可能。由于C6tl獨特的結(jié)構(gòu)，賦予了其獨特的物理化學(xué)性質(zhì)。已有研究發(fā)現(xiàn)其在清除自由基、光動力學(xué)治療、抑制HIV病毒、抗菌、神經(jīng)保護(hù)和作為藥物載體等方面有著獨特的作用。迄今為止，C6tl的研究已經(jīng)涉及到物理、化學(xué)、材料科學(xué)以及 生命科學(xué)等眾多學(xué)科及相關(guān)應(yīng)用領(lǐng)域，并顯示出越來越大的潛力。但是由于C6tl水溶性很低，阻礙了其在生物學(xué)上的應(yīng)用。富勒烯賴氨酸衍生物(C6tl-Iys)是ー種主要含有C6tl的化合物，其水溶性較好，同時具備有C6tl的一系列結(jié)構(gòu)特點和生物活性，已有文獻(xiàn)報道C6tl-Iys在免疫調(diào)節(jié)(Hsu H, ChiangL, Chen J, et al, Water-Soluble Hexasulfobutyl Fullereneinhibits PiasmaLipid Peroxidation by Direct Association with Lipoproteins.Journal ofCardiovascular Pharmacology. 2000,36(4) :423-427)、腫瘤治療(Hu Z，Guan W, Wang W, et al, Synthesis of b—alanine C60 derivative and itsprotectiveeffect on hydrogen peroxide-induced apoptosis in ratpheochromocytoma cells，Cell Biology International. 2007，31 :798-804)、抗感染(Mashino T，Shimotohno K，Ikegami N，et al. Human immunodeficiency virus-reverse transcriptase inhioitionand hepatitis Cvirus RNA—dependent RNA polymerase inhibition activities offulIerenederivatives,Bioorg Med Chem Lett. 2005,15 (4) :1107-1109)等方面得到了應(yīng)用。但至今未見有關(guān)C6crIys在輻射損傷防護(hù)方面的應(yīng)用報道。所以我們將合成C6crIys,并對其表征進(jìn)行初步鑒定后，將C6crIys應(yīng)用于輻射防護(hù)中研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供C6tl-Iys的防輻射效應(yīng)的新用途。C6tl-Iys分子式如下
Ceo(HNCH2CH2OH^CH^CHrNH2)COONa)6(H)6
I I I I !本發(fā)明人在實驗中發(fā)現(xiàn)C6tl與賴氨酸直接反應(yīng)后，通過萃取、層析等方法提純，等到水溶性很高的C6(l-lys。通過對C6tl-Iys的細(xì)胞毒性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)C6tl-Iys在濃度低于1200mg/L時對人淋巴瘤母細(xì)胞(AHH-I)基本沒有毒性。而在濃度為1600mg/L時，細(xì)胞毒性増加，能降低細(xì)胞存活率；但在安全濃度范圍內(nèi)，其對細(xì)胞具有輻射防護(hù)效應(yīng)，其中800mg/L為C6tl-Iys輻射防護(hù)的最佳劑量，其能最大限度地提高照射后AHH-I細(xì)胞的存活率，減少細(xì)胞的凋亡，對細(xì)胞起輻射防護(hù)作用。此外，C60-Iys能降低輻射引起的AHH-I細(xì)胞的G2/M期阻滯，能減少輻射對AHH-I細(xì)胞的DNA損傷。本發(fā)明C6tl-Iys合成方法簡單，可以進(jìn)行大規(guī)模エ業(yè)化生產(chǎn)，制備輻射損傷防護(hù)藥物。


圖IC6tl-Iys 在 D2O 頻率 ^OOMHz)的 1H-NMR 譜。圖2C6(|-lys 在 D2O 頻率(600MHz)的 13C-NMR 譜。圖3C6Q-lys的紅外光譜。圖4細(xì)胞毒性試驗用C6tl-Iys處理后AHH-I細(xì)胞存活率曲線圖。圖5用不同濃度C6tl-Iys處理AHH-I細(xì)胞暴露于4Gy24h后存活率。 圖6用800mg/L的C6tl-Iys處理AHH-I細(xì)胞給予不同劑量照射，照后24h通過CCK8檢測其存活率。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述。實施例I制備富勒烯賴氨酸衍生物C6tl-Iys合成方程式H2N (CH2) 4CH (NH2) COOH+NaOH+C60 — C60 (HNCH2CH2CH2CH2CH (NH2) COONa) 6 (H) 6制備步驟I.制備富勒烯甲苯溶液將IlOmg富勒烯溶于70mL甲苯中，攪拌使其完全溶解，得富勒烯甲苯溶液，液體為紫羅蘭色；2.制備賴氨酸溶液將5. 6g賴氨酸和I. 7gNa0H溶于6mL水中，加入40mL無水こ醇,攪拌使其完全溶解，得賴氨酸溶液；3.制備 C60-IysI)將富勒烯甲苯溶液慢慢滴加入賴氨酸溶液中，室溫攪拌24h后靜置分層，分層后上層有機(jī)相近無色，下層水醇混合相棕黑色，用分液漏斗分出水醇混合相；2)用甲苯分兩次萃取以去除水醇混合相中的微量的C6tl ；3)用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得黒色粘稠固體；4)加3mL水使黑色粘稠固體完全溶解，再加40mL無水こ醇，振蕩得棕色沙狀沉淀；5)過濾，沉淀用無水こ醇洗兩遍，真空干燥得棕黑色固體粉末，即為C6(|-lyS。實施例2 C60-Iys的NMR核磁波譜分析以氘代水D2O為溶劑，用Bruker Avance 600NMR譜儀測試C6tl-Iys衍生物的1H NMR譜(圖I)。從圖I可見，2. 95ppm出現(xiàn)的多重峰為-CH2-(a)的吸收峰，I. 67ppm出現(xiàn)的多重峰為-CH2-(b)的吸收峰，I. 42ppm出現(xiàn)的多重峰為-CH2-(C)的吸收峰，I. 75ppm出現(xiàn)的多重峰為-CH2-(d)的吸收峰，3. 48ppm出現(xiàn)的多重峰為-CH2-(e)的吸收峰。由于以D2O為溶剤，1H NMR譜中看不到O-H和N-H的核磁共振峰(0-H和N-H上氫與溶劑D2O交換速度非?？?，觀察不到信號)。圖2為該產(chǎn)物的碳譜，從圖2可見，179. 87ppm為羰基碳的信號(-C00-)，56. 59ppm 為-CH- (e)的信號，40. 78ppm 為-CH2- (a)的信號，33. 22ppm 為-CH2- (d)的信號，28.28ppm為-CH2-(b)的信號，23. 23ppm為-CH2-(c)的信號。C6tl-Iys衍生物的氫譜和碳譜與賴氨酸的氫譜和碳譜相比對，均出現(xiàn)一定程度的變化，提示賴氨酸與C6tl發(fā)生反應(yīng)，且氫譜顯示無明顯干擾信號，所得產(chǎn)物純度較高。實施例3 C60-Iys的FTIR分析(傅里葉變換紅外光譜)分析采用Bruker Vector 22型FTIR紅外光譜儀對產(chǎn)物進(jìn)行了分析。Fig. 6為賴氨酸的紅外吸收光譜圖。3412. 9cm-l處對應(yīng)于N-H伸縮振動吸收峰，2999. 9cm_l附近峰為O-H拉伸振動峰，1583. 9cm-1處出現(xiàn)吸收峰為C = O伸縮振動峰，1400. 2cm_l、1101. 3cm-1等處為C-N的伸縮振動峰、899. Ocm-I、849. 5cm_l等處為伯胺(-NH2)吸收峰。圖3為C6。與賴氨酸直接反應(yīng)所得產(chǎn)物的紅外吸收光譜圖。3352. Ocm-I處對應(yīng)于伯胺N-H伸展振動吸收峰，2925. 8cm-l處對應(yīng)于仲胺N-H伸展振動吸收峰，2853. 9cm-1處為C-H伸展振動峰， 1577. 3cm-l處為離子化羧基-C00-振動峰，1454. 7cm_l、638. Icm-I等處為C60的特征吸收峰，1118. 8cm-l處為非共軛C-N伸展振動峰，864. 7cm_l、825. 3cm_l等處為伯胺吸收峰。556. 6cm-l吸收峰是取代C6tl的標(biāo)志。實施例4 C60-Iys對AHH-I的細(xì)胞毒性實驗取對數(shù)生長期的AHH-I細(xì)胞，種于96孔板，每孔體積100 μ 1，加富勒烯賴氨酸衍生物C6tl-Iys至終濃度分別0、200、400、800、1200、16001^/し孵育48h用CCK-8檢測，并計算細(xì)胞存活率。從圖4可以看出，在0-1200mg/L范圍內(nèi)，各給藥組AHH-I細(xì)胞存活率均無顯著差別(P > O. 05)。當(dāng)C6tl-Iys濃度為1600mg/L吋，AHH-I細(xì)胞存活率均明顯下降，為80. 4% (P < O. 01)。實施例5 C60-Iys對AHH-I細(xì)胞的輻射防護(hù)實驗取對數(shù)生長期的AHH-I細(xì)胞，種于24孔板，每孔體積1ml，AHH-I細(xì)胞照射劑量為4Gy,照前Ih加入C6tl-Iys,終濃度分別0、50、100、200、400、800mg/L，照后轉(zhuǎn)移到96孔板中，每孔100μ 1，孵育24h用CCK-8檢測，并計算細(xì)胞存活率。從圖5可以看出，在0-800mg/L范圍內(nèi)，隨著藥物濃度的増加AHH-I細(xì)胞存活率均有所上升，與單純照射組相比有顯著的差異(P < O. 05)。C6tl-Iys對AHH-I的最佳輻射防護(hù)劑量為800mg/L。實施例6使用800mg/LC6(|-lys處理AHH-I細(xì)胞后用不同劑量照，其存活率變化分別取對數(shù)生長期的AHH-I細(xì)胞，種于24孔板，每孔體積1ml，照后轉(zhuǎn)移到96孔板中，每孔100 μ 1，按照實驗要求設(shè)立各個單純照射組，不同照射劑量給藥組，孵育24h用CCK-8檢測，并計算細(xì)胞存活率。從圖6中可以看出，AHH-I細(xì)胞存活率均隨照射劑量增加而下降，照射劑量為4Gy吋，AHH-I細(xì)胞存活率為58. 5%。照射劑量為40Gy時，從圖中還可以看出，照前加入C6tl-Iys,終濃度為800mg/L的AHH-I細(xì)胞，隨著照射劑量的増加，細(xì)胞存活率也都依次下降。但照射給藥組細(xì)胞存活率都明顯高于單純照射組細(xì)胞存活率，有統(tǒng)計學(xué)差異(P < O. 01)，說明富C6tl-Iys對AHH-I細(xì)胞有一定輻射防護(hù)作用。
權(quán)利要求
1.富勒烯賴氨酸衍生物C6tl-Iys在制備輻射損傷防護(hù)藥物中的應(yīng)用，所說富勒烯賴氨酸衍生物分子式為 C60 (HNCH2CH2CH2CH2CH (NH2) COONa) 6 (H)60
全文摘要
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，是富勒烯賴氨酸衍生物C60-lys及其制備方法和防輻射損傷用途。富勒烯賴氨酸衍生物分子式為C60(HNCH2CH2CH2CH2CH(NH2)COONa)6(H)6。經(jīng)C60-lys對AHH-1的細(xì)胞毒性實驗和輻射防護(hù)實驗，其在濃度低于1200mg/L時對人淋巴瘤母細(xì)胞AHH-1基本沒有毒性，在安全濃度范圍內(nèi)，其對細(xì)胞具有輻射防護(hù)效應(yīng)，其中800mg/L為C60-lys輻射防護(hù)的最佳劑量，因此，C60-lys可用于制備輻射損傷防護(hù)藥物。本發(fā)明C60-lys合成方法簡單，可以通過進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)來制備輻射損傷防護(hù)藥物。
文檔編號A61P17/16GK102688225SQ20111007196
公開日2012年9月26日 申請日期2011年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月24日
發(fā)明者崔建國, 張超, 李百龍, 梅柯, 蔡建明, 高福, 黃越承 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)