專利名稱：獲得流感樣本中流感病毒核酸的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域中獲得流感樣本中流感病毒核酸的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
在歷史上有很多種瘟疫給人類帶來大量死亡和深重災(zāi)難。近百年來，由于醫(yī)學(xué)科學(xué)的發(fā)展和進(jìn)步，大多數(shù)瘟疫得到了控制，唯獨(dú)流感，人類還沒有找到制服它的有效途徑和方法。流感病毒屬于正黏病毒科，有甲型、乙型與丙型流感病毒三個(gè)屬。流感病毒因其具有較強(qiáng)的傳染性，被認(rèn)為是影響公共衛(wèi)生安全的重要危險(xiǎn)因素，其中以甲型流感危害最為嚴(yán)重。特別是2009年3月于墨西哥發(fā)現(xiàn)、并在世界范圍內(nèi)引起廣泛傳播的新甲型流感病毒 (swine H1N1)的暴發(fā)流行，更加重了人們對(duì)于流感病毒傳播的擔(dān)憂。流感由于其不斷變異而造成周期性流行，其中變異最為明顯的就是甲型流感病毒。該病毒抗原變異后，傳染性大，傳播迅速，易發(fā)生大范圍流行。因此，研究病毒抗原性、 致病性和耐藥性變異，分析新型流感流行病學(xué)規(guī)律、臨床特征、追蹤嚴(yán)重程度變化，科學(xué)評(píng)估流感大流行風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)全球依法科學(xué)規(guī)范有序地防控流感大流行具有重要意義。為了及時(shí)了解流感病毒的流行和變異情況，開展以實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)是必要的手段。但是，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行流感監(jiān)測(cè)中，如果采用細(xì)胞進(jìn)行病毒分離的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測(cè)，不但周期長而且對(duì)新發(fā)生的流感變異株需要更高的實(shí)驗(yàn)條件。這些因素造成了流感病毒分離的周期增加。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于擴(kuò)增流感病毒核酸的引物對(duì)。本發(fā)明所提供的用于擴(kuò)增流感病毒核酸的引物對(duì)，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物組成。所述流感病毒為甲型流感病毒。所述甲型流感病毒為甲型H3N2亞型流感病毒。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供獲得流感病毒核酸的方法。本發(fā)明所提供的獲得流感病毒核酸的方法，包括以下步驟以感染流感病毒的樣本的總RNA為模板，用所述引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即得到所述流感病毒的核酸。所述流感病毒為甲型流感病毒。所述甲型流感病毒為甲型H3N2亞型流感病毒。所述樣本為臨床流感樣病例的咽拭子。所述RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件如下42°C 60分鐘；94°C預(yù)變性2分鐘；然后按照下列參數(shù)進(jìn)行5次循環(huán)94°C變性30秒，45°C復(fù)性30秒，68°C延伸3分鐘；再按照下列參數(shù)進(jìn)行35次循環(huán)94°C變性30秒，57°C復(fù)性30秒，72°C延伸3分鐘；循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后在68°C保持7分鐘。所述獲得流感病毒核酸的方法在制備流感疫苗中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述獲得流感病毒核酸的方法在篩選預(yù)防和/或治療流感的藥物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。通過本專利的方法，不用進(jìn)行病毒分離工作直接從臨床樣本的核酸提取物中擴(kuò)增流感病毒的基因組，大大簡化流感病毒基因研究的程序、節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本?；诒痉椒?，通過設(shè)計(jì)流感病毒的片段擴(kuò)增引物，能夠直接成功擴(kuò)增出流感病毒的所有片段。


圖1為臨床樣品(具體為咽拭子)中流感病毒核酸的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、擴(kuò)增甲型H3N2亞型流感病毒核酸實(shí)驗(yàn)設(shè)備和儀器0. 2ml PCR反應(yīng)管或96孔或384孔反應(yīng)板；20 μ 1和200 μ 1可調(diào)節(jié)移液器及濾芯槍頭；無菌、無核酸酶的1. 5ml微量離心管；一次性無粉手套；微量離心機(jī)或反應(yīng)板離心機(jī)；漩渦振蕩器；PCR儀(ABI 9700PCR儀)。工作準(zhǔn)備工作臺(tái)、移液管、離心機(jī)必須清潔，用去污劑凈化，例如用5%的漂白劑、DNAzap 或者RNase AWAY 來減小核酸交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。1、樣本采集取臨床上已初步確認(rèn)為感染甲型H3N2亞型流感病毒的流感樣病例的咽拭子進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，臨床樣本的獲得均經(jīng)過患者同意。以甲型H3N2亞型流感疫苗株A/ Perth/16/2009(H3N2)(購自中國疾病預(yù)防控制中心)為陽性對(duì)照。陽性對(duì)照的病毒核酸為已知的，其基因組序列為 Genbank number GQ902806. 1 (PB2)、FJ913004. 1 (PBl)、 CY044513. 1 (PA)、FJ912976. 1 (HA)、CY038866 (NP)、HQ615653. 1 (NA)、CY080548. 1 (M)和 GU907116. 11 (NS)。2、樣本總RNA的提取樣本處理應(yīng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室完成。本專利使用核酸提取試劑盒^lIAamp MinElute Virus Spin Kit，貨號(hào)57704)提取。提取過程參考試劑盒說明書進(jìn)行。取200ul步驟1所采集的臨床樣本，加入含有200ulAL 裂解液、25ul蛋白酶K和6. 2ul Carrier RNA的EP管中，混勻后56°C孵育15min ；取出后簡單離心，加入250ul無水乙醇，混勻后室溫放置5min ；轉(zhuǎn)移液體進(jìn)入離心柱，6000g離心 Imin ；取出離心柱后于干凈離心管，加入500ulAWl洗液，6000g離心Imin ；再次取出離心柱后于干凈離心管，加入500ulAW2洗液，6000g離心Imin ；取出離心柱后于干凈離心管，加入 500ul無水乙醇，6000g離心Imin ；更換離心管后，20000g離心;3min。將離心柱轉(zhuǎn)移到新的核酸收集管，加入60ul AVE洗脫液或DEPC水(洗脫液的用量一般為20_150ul)，20000g離心lmin。離心后液體即為樣本總RNA溶液。
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3、RT-PCR 擴(kuò)增過程本專利采用一步法試劑盒(SuperScript HI One-Step RT-PCR System with Platinum iTaq DNA Polymerase，貨號(hào)12574-026)進(jìn)行 RT-PCR 片段擴(kuò)增。具體方法如下PCR擴(kuò)增的引物序列如下IFA-U-F :AGCRAAAGCAGG (序列表中序列 9)，IFA-U-R :AGTAGAAACAAGG (序列表中序列 10)。RT-PCR擴(kuò)增的體系為25ul
體系用量(ul)水5.5IOuMPrimers上0.5IOuMPrimers下0.52 X buffer12.5Super Script III1RNA5總體積25RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序如下42V 60分鐘；94°C預(yù)變性2分鐘；然后按照下列參數(shù)進(jìn)行5次循環(huán)94°C變性30 秒，45°C復(fù)性30秒，68°C延伸3分鐘；再按照下列參數(shù)進(jìn)行35次循環(huán)94°C變性30秒，57°C 復(fù)性30秒，72°C延伸3分鐘；循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后在68°C保持7分鐘。4、結(jié)果對(duì)RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示。圖1中，泳道3 為DNA Maker，泳道1為陽性對(duì)照株的擴(kuò)增結(jié)果，泳道2為提取臨床樣本(咽拭子)核酸使用本專利方法擴(kuò)增獲得的結(jié)果。各擴(kuò)增片段分別為PB2 (2. 3kp)、PBl (2. 3kp)、PA (2. 2kp)、 HA(1. 8kp)、ΝΡ(1· 6kp)、ΝΑ(1· 4kp)、Μ(1· Okp)、NS (0. 9kp)?；厥誔CR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，圖1所示的每個(gè)擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果分別為PB2的核苷酸序列如序列表中序列1所示；PBl的核苷酸序列如序列表中序列2所示；PA的核苷酸序列如序列表中序列3所示；HA的核苷酸序列如序列表中序列4所示；NP的核苷酸序列如序列表中序列5所示；NA的核苷酸序列如序列表中序列6所示；M的核苷酸序列如序列表中序列 7所示；NS的核苷酸序列如序列表中序列8所示。將以上樣本各擴(kuò)增片段的測(cè)序結(jié)果與已經(jīng)發(fā)布的甲型H3N2亞型流感病毒基因組序列比較，結(jié)果一致，證明本發(fā)明的方法結(jié)果正確、可靠。
權(quán)利要求
1.一種用于擴(kuò)增流感病毒核酸的引物對(duì)，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物對(duì)，其特征在于所述流感病毒為甲型流感病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的引物對(duì)，其特征在于所述甲型流感病毒為甲型H3N2亞型流感病毒。
4.獲得流感病毒核酸的方法，包括以下步驟以感染流感病毒的樣本的總RNA為模板，用權(quán)利要求1-3中任一所述引物對(duì)進(jìn)行 RT-PCR擴(kuò)增，得到RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即得到所述流感病毒的核酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述流感病毒為甲型流感病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述甲型流感病毒為甲型H3N2亞型流感病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述樣本為臨床流感樣病例的咽拭子。
8.權(quán)利要求3-7中任一所述的方法在制備流感疫苗中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3-7中任一所述的方法在篩選預(yù)防和/或治療流感的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了獲得流感樣本中流感病毒核酸的方法及其專用引物。本發(fā)明所提供的用于擴(kuò)增流感病毒核酸的引物對(duì)，由序列表中序列9所示的引物和序列表中序列10所示的引物組成。本發(fā)明所提供的獲得流感病毒基因組DNA的方法，包括以下步驟以感染流感病毒的樣本的總RNA為模板，用所述引物對(duì)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，得到RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，即得到所述流感病毒的核酸。通過本專利的方法，不用進(jìn)行病毒分離工作直接從臨床樣本的核酸提取物中擴(kuò)增流感病毒的基因組，大大簡化流感病毒基因研究的程序、節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本?；诒痉椒ǎㄟ^設(shè)計(jì)流感病毒的片段擴(kuò)增引物，能夠直接成功擴(kuò)增出流感病毒的所有片段。
文檔編號(hào)A61P31/16GK102180927SQ20111007421
公開日2011年9月14日 申請(qǐng)日期2011年3月25日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月25日
發(fā)明者劉瑋, 張小愛, 張磊, 曹務(wù)春, 辛忠濤, 馬麥卷, 魏茂提, 黎浩 申請(qǐng)人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所