專利名稱：森林腦炎病毒包膜E蛋白與人抗體Fc段融合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種森林腦炎病毒包膜E蛋白與人抗體Ig Gl Fc段融合蛋白，及其在制備森林腦炎疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
森林腦炎病毒也稱蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus，TBEV)，是一種毒力極強(qiáng)的嗜神經(jīng)病毒，主要侵犯人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起的森林腦炎為急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，病死率和致殘率相當(dāng)高。森林腦炎病毒為重要的病毒類生物戰(zhàn)劑之一，美國國家疾病控制中心將該病毒分類為C類病毒類生物武器。我國，森林腦炎是法定的由生物因素引起的職業(yè)病。森林腦炎疫苗是國家應(yīng)急儲備疫苗之一。森林腦炎病毒至少有三個(gè)亞型，即西歐亞型、遠(yuǎn)東亞型和西伯利亞亞型，主要分布于中國、俄羅斯、捷克、保加利亞、波蘭和奧地利等國。我國主要分布于東北、西北、西南三大疫區(qū)的長白山、大興安嶺、小興安嶺、天山、阿爾泰山及橫斷山六個(gè)自然疫源地，其中東北疫區(qū)最為嚴(yán)重。近幾年來疫情由林區(qū)向草原、丘陵、農(nóng)業(yè)區(qū)蔓延，另外隨著林區(qū)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和森林游、探險(xiǎn)游、野外生存游的興起以及林區(qū)生態(tài)環(huán)境的改變，進(jìn)入林區(qū)的人群逐年增加， 致使森林腦炎的流行范圍逐年上升，對疫苗接種的需要也逐年增大。目前的森林腦炎粗制疫苗和純化疫苗均屬于滅活疫苗，抗原成分復(fù)雜，有效抗原的含量較低，副作用較多，制備過程中涉及生物安全問題，大規(guī)模制備存在技術(shù)困難。森林腦炎病毒包膜E蛋白是森林腦炎病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，介導(dǎo)病毒與受體結(jié)合與膜融合的生物學(xué)功能，該蛋白誘導(dǎo)的中和抗體是機(jī)體抗森林腦炎病毒的主要免疫保護(hù)機(jī)制(司炳銀、祝慶余，森林腦炎病毒E蛋白研究的進(jìn)展，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，1998 ;22(4) 305-308)。開發(fā)基于包膜E蛋白為靶抗原的重組疫苗在理論上是可行的，是新一代森林腦炎疫苗的發(fā)展方向。目前尚無基于包膜E蛋白為靶抗原的重組疫苗的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種森林腦炎病毒包膜E蛋白與人抗體Ig Gl Fc段融合蛋白，以及所述蛋白在制備森林腦炎疫苗中的應(yīng)用。森林腦炎病毒包膜E蛋白是森林腦炎病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，位于病毒體的表面，能誘導(dǎo)保護(hù)性抗體，包膜E蛋白免疫動(dòng)物能保護(hù)動(dòng)物免受病毒的攻擊，因此發(fā)明人認(rèn)為該蛋白理論上可作為森林腦炎疫苗的重要抗原。為了使該蛋白能高水平表達(dá)，本發(fā)明對 E蛋白的編碼基因進(jìn)行了優(yōu)化，使用哺乳動(dòng)物偏愛密碼子合成E基因，可提高E蛋白的翻譯效率，從而提高其表達(dá)水平。抗體是由分化成熟的B細(xì)胞合成、分泌的一類能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的球蛋白，即免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)。免疫球蛋白可分為五類，即IgG、 IgA、IgM、IgD和IgE。其中IgG是最主要的免疫球蛋白，約占人血漿丙種球蛋白的70%。免疫球蛋白具有4條多肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)，其中2條較長、相對分子量較大的相同的重鏈(H 鏈)；2條較短、相對分子量較小的相同的輕鏈(L鏈)。重鏈和輕鏈間由二硫鍵和非共價(jià)鍵聯(lián)結(jié)形成一個(gè)由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子。免疫球蛋白分子可被許多蛋白酶水解，產(chǎn)生不同的片段。木瓜蛋白酶將IgG分子降解成兩個(gè)相同的Fab段和一個(gè)Fc段。Fab段即抗原結(jié)合片段(antigen binding fragment)，仍具有抗原結(jié)合活性。Fc段即可結(jié)晶片段 (crystallizable fragment)，在一定條件下可形成結(jié)晶，F(xiàn)c段不能與抗原結(jié)合，但具有許多其他生物學(xué)活性，如固定補(bǔ)體、親和細(xì)胞(巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞和粒細(xì)胞等)、介導(dǎo)與細(xì)菌蛋白(如金黃色葡萄球菌蛋白A和鏈球菌蛋白G)的結(jié)合等。多種基因工程藥物將抗體Fc段融合在活性蛋白的羧基端，能提高蛋白的表達(dá)和穩(wěn)定性，并方便蛋白的純化。本發(fā)明提供了一種融合蛋白，該融合蛋白是在森林腦炎病毒包膜E蛋白的羧基端融合了人抗體IgGl的Fc段，其中編碼森林腦炎病毒包膜E蛋白的基因序列如SEQ ID NO 1所示，編碼人抗體IgGl的Fc段的基因序列如SEQ ID NO 2所示。本發(fā)明提供的融合蛋白，編碼該融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:3所示。另外，發(fā)明人認(rèn)為，由于E蛋白為糖基化蛋白，會被宿主細(xì)胞加工修飾形成復(fù)雜的空間構(gòu)象。E蛋白的天然空間構(gòu)象對于介導(dǎo)病毒感染以及誘導(dǎo)中和抗體均有重要影響。選擇合適的宿主細(xì)胞表達(dá)E蛋白，使之具有天然的糖基化修飾和形成天然的功能性空間構(gòu)象， 是作為有效疫苗抗原的重要條件。因此，發(fā)明人認(rèn)為用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)E蛋白是可取的選擇。CHO細(xì)胞是目前常用的哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物能被修飾、加工形成天然的構(gòu)象和具有天然生物學(xué)功能和活性，是國際公認(rèn)可用于人用基因工程藥物生產(chǎn)的細(xì)胞株。與大腸桿菌相比，CHO細(xì)胞表達(dá)外源蛋白的總體水平較低，但抗體除外。目前每升CHO細(xì)胞培養(yǎng)體系中表達(dá)出克級的抗體在技術(shù)上已不是問題。本發(fā)明用分子克隆方法，利用哺乳動(dòng)物偏愛密碼子合成了我國森張株森林腦炎病毒包膜E基因，然后分別構(gòu)建了 E基因表達(dá)質(zhì)粒和E基因與人抗體IgGlFc段融合基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CH0細(xì)胞)，構(gòu)建成功穩(wěn)定分泌表達(dá)E蛋白或E-Fc融合蛋白的細(xì)胞株，用親和層析的方法純化蛋白，然后用ISA720為佐劑，免疫小鼠和家兔，檢測小鼠和家兔血清中的E抗體，并分析小鼠脾細(xì)胞在體外對于E蛋白刺激所分泌的細(xì)胞因子。本發(fā)明提供的融合蛋白，是通過以下方法得到的首先構(gòu)建含有如SEQ IDNO 3所示的基因的表達(dá)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞，分泌表達(dá)該融合蛋白，并分離純化。本發(fā)明具體技術(shù)方案如下1.我國森張株森林腦炎病毒包膜E基因胞外段的合成根據(jù)我國森張株森林腦炎病毒E基因編碼的氨基酸序列，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏愛的密碼子設(shè)計(jì)出優(yōu)化的E基因序列， 然后合成得到該基因(如SEQ ID NO 1所示)。2.人抗體IgGl Fc段基因的克隆從人外周血分離B細(xì)胞，抽提細(xì)胞總RNA，然后用逆轉(zhuǎn)錄(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)克隆得到人IgGl Fc段基因(如SEQ ID N0:2所示)。3.森林腦炎病毒包膜E與人IgGl Fc段融合基因的構(gòu)建用酶切、連接的方法將森林腦炎病毒包膜E基因與人IgGl Fc段拼接為一段融合基因(如SEQ IDNO :3所示)。E 基因羧基端是BamHI酶切位點(diǎn)，而IgGl Fc段氨基端也是BamHI酶切位點(diǎn)，該位點(diǎn)有6個(gè)核苷酸GGATCC，將兩段基因融合在一起后兩個(gè)BamHI酶切位點(diǎn)變成一個(gè)。4.森林腦炎病毒E基因和E-IgGl Fc融合基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建分別將E基因和E-IgGl Fc融合基因插入具有自主知識產(chǎn)權(quán)的CHO細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒pCIDA-GS-neo (見本申請人已授權(quán)的中國專利ZL 2006100M202.5，發(fā)明名稱為一種用哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效分泌表達(dá)丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，發(fā)明人為趙平、廖小玲、曹潔、戚中田。)，得到E蛋白以及E-Fc融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。5.穩(wěn)定表達(dá)E蛋白和E-IgGl Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株的構(gòu)建以及細(xì)胞培養(yǎng)與蛋白純化用脂質(zhì)體分別將上述兩種表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO-Kl細(xì)胞，用免疫印跡方法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的E蛋白。用甲硫氨酸亞砜(MSX)篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-Kl細(xì)胞克隆，然后進(jìn)行無血清培養(yǎng)。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心，超濾，然后用鎳柱親和純化E蛋白，用金黃色葡萄球菌蛋白A樹脂親和純化E-IgGl Fc融合蛋白。6.免疫小鼠和家兔分別將E蛋白和E-IgGl Fc融合蛋白聯(lián)合免疫佐劑ISA720， 免疫小鼠和家兔，免疫三次。7.小鼠和家兔血清抗體檢測用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測小鼠和家兔免疫血清中的E抗體。8.檢測小鼠脾細(xì)胞在體外對E蛋白的特異性反應(yīng)處死小鼠，無菌取小鼠脾臟，分離培養(yǎng)單個(gè)脾細(xì)胞，以重組表達(dá)的E蛋白刺激，用ELISA檢測小鼠脾細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子 IFN- y , IL-2 和 IL-12。結(jié)果顯示森林腦炎病毒E基因和人IgGl Fc段基因融合可顯著提高E蛋白的表達(dá)水平，且融合蛋白誘導(dǎo)的E抗體水平顯著高于E蛋白誘導(dǎo)的E抗體水平。融合蛋白可以用金黃色葡萄球菌A蛋白或鏈球菌G蛋白偶聯(lián)的樹脂進(jìn)行高效親和層析純化。該融合蛋白作為森林腦炎疫苗靶抗原具有應(yīng)用前景。本發(fā)明證明了人IgGl Fc段與森林腦炎病毒包膜E蛋白融合不僅有助于用親和層析的方法純化E蛋白，還能提高E蛋白的表達(dá)水平，并增強(qiáng)E蛋白的免疫原性，顯著提高E 蛋白誘導(dǎo)的抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答，為開發(fā)重組亞單位森林腦炎疫苗提供了一種有效的候選抗原。


圖1是質(zhì)粒pCIDA-E-Fc的結(jié)構(gòu)其中PCMV為巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子，introD為內(nèi)含子供體序列，GS為谷氨酰氨合成酶基因，introA為內(nèi)含子受體序列，E為森林腦炎包膜E基因，F(xiàn)c為人抗體IgGl Fc段基因，PolyA為SV40病毒多聚腺苷酸序列。圖2是質(zhì)粒pCIDA_E的結(jié)構(gòu)其中PCMV為巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子，introD為內(nèi)含子供體序列，GS為谷氨酰氨合成酶基因，introA為內(nèi)含子受體序列，E為森林腦炎包膜E基因，polyA為SV40病毒多聚腺苷酸序列。圖3是E蛋白和E-Fc蛋白的免疫印跡檢測用免疫印跡檢測質(zhì)粒pCIDA-E、pCIDA-E-Fc轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中的E蛋白， 用未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清作為對照。圖4是還原型E和E-Fc蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。圖5是還原型E-Fc蛋白和氧化型E-Fc蛋白的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。圖6是小鼠血清中E抗體的檢測
分別用E、E-Fc和牛血清白蛋白聯(lián)合ISA720佐劑免疫小鼠，于0、2、4周各免疫一次，在不同時(shí)間點(diǎn)用ELISA檢測小鼠血清中的E抗體(血清1 200稀釋，10只小鼠血清檢測值的平均值)。圖7是家兔血清中E抗體的檢測分別用E、E-Fc和牛血清白蛋白聯(lián)合ISA720佐劑免疫家兔，于0、2、4周各免疫一次，在不同時(shí)間點(diǎn)用ELISA檢測家兔血清中的E抗體(血清1 200稀釋，10只家兔血清檢測值的平均值)。圖8是ELISA檢測小鼠脾細(xì)胞針對E蛋白刺激所分泌的細(xì)胞因子第三次免疫后2周，處死小鼠，分離培養(yǎng)脾細(xì)胞，用E蛋白刺激，三天后用ELISA檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的細(xì)胞因子IL-2、IL-12和IFN-Y (5只小鼠脾細(xì)胞檢測值的平均值)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合本發(fā)明的實(shí)施例和附圖對本發(fā)明的實(shí)施作詳細(xì)說明，以下實(shí)施例是在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1.我國森張株森林腦炎病毒包膜E基因的合成根據(jù)我國森張株森林腦炎病毒E基因所編碼的氨基酸序列(GenbankAccession AY182009)，利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞偏愛的密碼子設(shè)計(jì)出優(yōu)化的E基因序列(如SEQ ID N0:1所示)，其5，端含NheI酶切位點(diǎn)GCTAGC和起始密碼子ATG，3’末端含BamHI酶切位點(diǎn)GGATCC， 委托上海捷瑞生物技術(shù)有限公司用常規(guī)重疊延伸聚合酶鏈反應(yīng)合成該基因，將該基因插入克隆載體T載體(美國Promega公司產(chǎn)品)，命名為pGEM_E。實(shí)施例2.人抗體IgGl Fc段基因的克隆用CD19單抗標(biāo)記的磁珠(德國Miltenyibiotec公司產(chǎn)品)從20ml新鮮人血漿中分離B細(xì)胞，操作參照使用說明進(jìn)行。用Trizol Reagent (美國^witrogen產(chǎn)品)抽提細(xì)胞總RNA，操作參照使用說明進(jìn)行。得到的細(xì)胞總RNA溶解于DEPC處理的滅菌雙蒸水。然后用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增人IgGlFc段基因。所用試劑為美國!Iomega 公司產(chǎn)品。取RNA2y 1(約5yg)，置于一 0.5毫升離心管內(nèi)，再加入以下各組分5μ 1 AMV 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液、1 μ 1 dNTP (濃度 10πιΜ)、1μ 1 oligo (dT) 15 (濃度 5pmol/μ 1)，于 70°C 熱水浴5分鐘，再迅速置于冰水浴，加入以下組分2μ 1 RNA酶抑制劑(30υ/μ 1)、1μ 1 AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(5U/ μ 1)，加DEPC處理的滅菌重蒸水至終體積25 μ 1?；靹?，于42°C水浴40分鐘， 再95°C 5分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，立即取5μ 1逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置于一只50 μ 1離心管內(nèi)，然后加入引物 FcF (5’-GGATCCGAACCCAAATCTTGTGACA-3’，下劃線為 BamHI 酶切位點(diǎn))和 FcR(5，-GTCG ACAACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG-3‘,下劃線為 SalI 酶切位點(diǎn))各 0. 1 μ 1，以及 5 μ 1 Pfu 聚合酶反應(yīng)緩沖液，1 μ 1 dNTP (濃度IOmM)和1 μ 1 Pfu聚合酶(3U/ μ 1)，補(bǔ)充雙蒸滅菌水至總反應(yīng)體積50 μ 1，用PCR儀進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，共30個(gè)循環(huán)，然后加入Taq酶1U，72°C 10 分鐘，然后溫度降至4°C結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶回收，與PCR 產(chǎn)物克隆載體T載體(美國Promega公司產(chǎn)品)連接，連接得到的克隆委托上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序鑒定，得到的正確克隆命名為pGEM-Fc。Fc基因序列見如SEQ ID NO 2 所示。
實(shí)施例3.森林腦炎病毒包膜E與人IgGl Fc段融合基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建用NheI和BamHI酶切質(zhì)粒pGEM_E，瓊脂糖凝膠電泳回收1400個(gè)堿基對的E基因片段。用BamHI和Mil酶切質(zhì)粒pGEM_Fc，瓊脂糖凝膠電泳回收700個(gè)堿基對的Fc基因片段。用NheI和MlI酶切本發(fā)明人構(gòu)建的具有自主知識產(chǎn)權(quán)的CHO細(xì)胞表達(dá)載體 pCIDA-GS-neo (構(gòu)建方法參見見本申請人已授權(quán)的中國專利ZL 200610024202. 5，發(fā)明名稱為一種用哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效分泌表達(dá)丙型肝炎病毒包膜蛋白E2的方法，發(fā)明人為趙平、廖小玲、曹潔、戚中田。)，瓊脂糖凝膠電泳回收線性化載體，將回收的線性化載體以及E 基因和Fc基因連接，得到的質(zhì)粒先用NheI和MlI酶切鑒定，然后委托上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序鑒定，序列正確的質(zhì)粒命名為pCIDA-E-Fc。E-Fc融合序列見如SEQ ID NO 3所示。質(zhì)粒pCIDA-E-Fc結(jié)構(gòu)如圖1所示:PCMV 為巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子，introD為內(nèi)含子供體序列，GS為谷氨酰氨合成酶基因，introA 為內(nèi)含子受體序列，E為森林腦炎包膜E基因，F(xiàn)c人IgGl Fc段基因，polyA為SV40病毒多聚腺苷酸序列。實(shí)施例4.森林腦炎病毒E基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以質(zhì)粒pGEM-E為模板，PCR擴(kuò)增E基因，上游引物中含NheI酶切位點(diǎn)(5’ -GCTA GCCGCCACCATGGAGAGCGTGGTGACCCGCGTG-3‘,下劃線為NheI酶切位點(diǎn))，下游引物中加入6 個(gè)組氨酸的編碼序列以及終止密碼子和Mil酶切位點(diǎn)，序列為5’ -GTCGACAACTCAGTGGTGG TGGTGGTGGTGGAAGGCGCCG CCCAGCACGG-3’，下劃線為MlI酶切位點(diǎn)和6個(gè)組氨酸的編碼序列)，PCR反應(yīng)體系以及熱循環(huán)條件參照實(shí)施例2中所述。PCR產(chǎn)物與克隆載體T載體連接，連接得到的克隆委托上海捷瑞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA測序鑒定，得到完全正確的克隆，命名為PGEM-E6H。用NheI和Mil酶切pGEM_E6H，切出E基因插入CHO細(xì)胞表達(dá)載體pCIDA-GS-neo，用酶切、測序鑒定質(zhì)粒，命名為pCIDA-E，結(jié)構(gòu)如圖2所示PCMV為巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子，introD為內(nèi)含子供體序列，GS為谷氨酰氨合成酶基因，introA為內(nèi)含子受體序列，E為森林腦炎包膜E基因，polyA為SV40病毒多聚腺苷酸序列。實(shí)施例5 穩(wěn)定表達(dá)E蛋白以及E-Fc融合蛋白的CHO細(xì)胞株的構(gòu)建以及蛋白純化用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液傳代培養(yǎng)CH0-K1細(xì)胞，以0. 25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，接種于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿，次日分別將4μ g pCIDA_E質(zhì)粒和pCIDA-E-Fc質(zhì)粒與10 μ 1 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine (美國hvitrogen產(chǎn)品)混勻，轉(zhuǎn)染CH0-K1細(xì)胞，操作按照使用說明進(jìn)行。8小時(shí)后加Iml含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。用免疫印跡法檢測培養(yǎng)上清中的E蛋白，操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》(科學(xué)出版社， 2002)進(jìn)行。將培養(yǎng)上清與含β巰基乙醇(破壞由兩個(gè)半胱氨酸形成的二硫鍵)的上樣緩沖液混合，煮沸，然后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，與含有10%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液室溫反應(yīng)1小時(shí)，然后與森林腦炎病毒E蛋白抗體(用森林腦炎純化滅活疫苗(長春生物制品研究所生產(chǎn)，批號為20070901-2。)免疫家兔，免疫三次，然后用親和層析純化兔IgG，用含有10%脫脂奶粉的磷酸鹽緩沖液1 1000稀釋) 室溫反應(yīng)1小時(shí)，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗兔IgG (美國Sigma公司產(chǎn)品)室溫反應(yīng) 1小時(shí)，用化學(xué)發(fā)光法檢測反應(yīng)條帶，操作參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》(科學(xué)出版社， 2002)進(jìn)行。
結(jié)果于圖3所示，兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清中均可檢測到E蛋白，E蛋白分子量在50kDa和70kDa之間，E-Fc蛋白分子量在70kDa和IOOkDa之間，與預(yù)期一致。 pCIDA-E-Fc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清中的E蛋白含量明顯高于pCIDA-E質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞上清中的E蛋白含量。將轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞以0. 25%胰蛋白酶消化，接種于5個(gè)IOOmm細(xì)胞培養(yǎng)皿，用含有10%透析的胎牛血清的GMEM-S培養(yǎng)液(美國Sigma公司產(chǎn)品)培養(yǎng)，加甲硫氨酸亞砜 (MSX)(美國Sigma公司產(chǎn)品)至終濃度25 μ mol/L，3_4天后細(xì)胞開始死亡，兩周后培養(yǎng)皿形成由單個(gè)細(xì)胞增殖而形成的克隆，挑單個(gè)克隆接種于96孔板，繼續(xù)用含25 μ mol/L MSX 的GMEM-S培養(yǎng)液培養(yǎng)，一周后培養(yǎng)上清用免疫印記法檢測E2蛋白的表達(dá)，對表達(dá)水平最高的克隆以胰蛋白酶消化，有限稀釋接種96孔板，繼續(xù)用25 μ mol/L MSX的GMEM-S培養(yǎng)液培養(yǎng)，二周后，將長有單克隆的孔內(nèi)細(xì)胞轉(zhuǎn)移至M孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞鋪滿孔板以后轉(zhuǎn)移至小方瓶內(nèi)放大培養(yǎng)，隨后用無血清培養(yǎng)基(美國Sigma公司產(chǎn)品)逐漸替代GMEM-S培養(yǎng)基，使細(xì)胞逐漸適應(yīng)完全無血清培養(yǎng)基，從貼壁生長轉(zhuǎn)變?yōu)閼腋∩L。將懸浮細(xì)胞改用搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)體積逐漸增大，當(dāng)體積增加至100毫升時(shí)轉(zhuǎn)移至WAVE生物反應(yīng)器(美國GE公司產(chǎn)品)中培養(yǎng)，并逐漸放大培養(yǎng)體積至4升。收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清，離心去除細(xì)胞，再以超濾進(jìn)行濃縮，隨后用鎳離子金屬鰲合層析的方法純化E蛋白，用金黃色葡萄球菌A蛋白親和層析的方法純化E-Fc蛋白，每一百毫升培養(yǎng)液中可得到E蛋白35毫克，E-Fc蛋白210毫克。 圖4為還原型E和E-Fc蛋白(上樣緩沖液中含β巰基乙醇，破壞二硫鍵)的聚丙烯酰胺凝膠電泳分析結(jié)果。兩個(gè)Fc單體可通過半胱氨酸形成分子間二硫鍵從而形成二聚體，氧化型(上樣緩沖液中不含β巰基乙醇，不破壞二硫鍵)和還原型(上樣緩沖液中含β巰基乙醇，破壞二硫鍵)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明E-Fc蛋白為二聚體，與預(yù)期一致，如圖5 所示。實(shí)施例6 用E和E-Fc蛋白免疫小鼠和家兔分別將重組表達(dá)的E和E-Fc蛋白用磷酸鹽緩沖液調(diào)整濃度至0. 25mg/ml，與等體積油/水乳劑型佐劑ISA720 (法國kppic公司產(chǎn)品)充分混勻，室溫放置30分鐘，然后于皮下多點(diǎn)注射免疫雌性BALB/c小鼠(體重20克)和雄性家兔(體重2.5公斤)，每只小鼠每次免疫劑量折合E或E-Fc蛋白5 μ g，每只家兔每次免疫劑量折合E或E-Fc蛋白20 μ g， 二周一次，共免疫三次。用同樣劑量牛血清白蛋白(美國Sigma公司產(chǎn)品)聯(lián)合ISA720佐劑免疫小鼠和家兔作為對照。每組小鼠15只，每組家兔10只。實(shí)施例7.小鼠和家兔血清中的抗體檢測每次免疫前一天(時(shí)間分別為0、2、4周，首次采血時(shí)間定為0周)以及末次免疫后每隔二周(共7次，時(shí)間分別為6、8、10、12、14、16、18周)從小鼠眼眶和家兔耳緣靜脈取血，用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測小鼠和家兔血清中的E抗體。E抗體檢測將純化的E蛋白用磷酸鹽稀釋至濃度0. 05mg/ml，加入酶標(biāo)微孔板，每孔0. Iml，置于4°C冰箱過夜，次日吸除E蛋白溶液，每孔用0. 2ml磷酸鹽緩沖液洗一次，然后每孔加入含3%牛血清白蛋白及0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖液(封閉液)0. 1ml，室溫放置2小時(shí)，然后吸除封閉液，每孔加入用封閉液稀釋的小鼠或兔血清0. 1ml，室溫放置40 分鐘，然后吸除血清，用含0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖液(洗液)洗孔5次，然后每孔加入用封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠或羊抗兔IgG (美國Sigma公司產(chǎn)品)0. Iml，室溫放置40分鐘，然后吸除抗體，用洗液洗孔5次，每孔加入含TMB的底物液0. Iml，室溫避光放置 10分鐘后，加入2M硫酸和30%過氧化氫溶液各0. 05ml，混勻，用酶標(biāo)儀檢測450nm波長的光吸收值，參考波長630nm。相同稀釋度下，E及E-Fc蛋白免疫血清光吸收值超過BSA免疫血清平均光吸收值的2. 1倍為抗體陽性。結(jié)果在第一次免疫后二周，E和E-Fc免疫的小鼠血清中E抗體的陽性率(血清以最低稀釋度1 50稀釋時(shí)的陽性率)分別為70%和100%，E和E-Fc免疫的家兔血清中E抗體的陽性率分別為80%和100%。隨后至第18周，E和E-Fc免疫的小鼠和家兔血清中E抗體陽性率均為100%。根據(jù)ELISA檢測結(jié)果(圖6、7)，E-Fc蛋白免疫的小鼠和家兔血清中的E抗體抗體水平均高于E蛋白免疫的小鼠和家兔，表明IgGl Fc段能顯著提高 E蛋白誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答。實(shí)施例8.檢測小鼠脾細(xì)胞在體外對E蛋白的特異性反應(yīng)第三次免疫后二周，E蛋白和E-Fc免疫的小鼠各取5只，頸椎脫臼處死小鼠，無菌取小鼠脾臟，于尼龍網(wǎng)上研磨，然后用淋巴細(xì)胞分離液(深圳達(dá)科為公司產(chǎn)品)為介質(zhì)，以梯度離心分離出單個(gè)淋巴細(xì)胞，懸浮于含15%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，接種于M孔板培養(yǎng)，每孔培養(yǎng)液lml，含有IO5細(xì)胞。同時(shí)加入重組表達(dá)的E蛋白，濃度20yg/ml。于 370C CO2孵箱培養(yǎng)，三天后取上清，用ELISA檢測上清中的細(xì)胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ， 檢測試劑為深圳達(dá)科為公司產(chǎn)品。結(jié)果如圖8所示，E-Fc融合蛋白免疫的小鼠脾細(xì)胞分泌的這三種細(xì)胞因子水平都顯著高于E蛋白免疫的小鼠脾細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子，表明與人IgGlFc段融合能增強(qiáng)E 蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。
權(quán)利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于該融合蛋白是在森林腦炎病毒包膜E蛋白的羧基端融合了人抗體IgGl的Fc段，其中編碼森林腦炎病毒包膜E蛋白的基因序列如SEQ ID NO=I所示，編碼人抗體IgGl的Fc段的基因序列如SEQ ID NO 2所不。
2.一種融合蛋白，其特征在于編碼該融合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:3所示。
3.一種融合蛋白，其特征在于該融合蛋白是通過以下方法得到的首先構(gòu)建含有如 SEQ ID NO :3所示的基因的表達(dá)質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染中國倉鼠卵巢細(xì)胞，分泌表達(dá)該融合蛋白， 并分離純化。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的融合蛋白在制備森林腦炎疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，森林腦炎病毒是一種毒力極強(qiáng)的嗜神經(jīng)病毒，引起的森林腦炎為急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病。目前的森林腦炎粗制疫苗和純化疫苗均屬于滅活疫苗，存在抗原成分復(fù)雜，有效抗原的含量較低，副作用較多等問題。包膜E蛋白是森林腦炎病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白誘導(dǎo)的中和抗體是機(jī)體抗森林腦炎病毒的主要免疫保護(hù)機(jī)制。本發(fā)明利用分子克隆方法構(gòu)建了森林腦炎病毒包膜E蛋白與人IgG1Fc段的融合基因，然后轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，表達(dá)出了重組的融合蛋白。本發(fā)明證明與人IgG1Fc段融合能明顯提高E蛋白的表達(dá)水平，并方便蛋白的純化；能明顯提高E蛋白的免疫原性，增強(qiáng)E蛋白誘導(dǎo)的E抗體和細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的融合蛋白作為森林腦炎疫苗抗原具有應(yīng)用前景。
文檔編號A61P31/14GK102212139SQ201110076640
公開日2011年10月12日 申請日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者任浩, 戚中田, 朱詩應(yīng), 趙平 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)